KR20060094315A - 환경 유해 미생물 검출 장치 및 방법 - Google Patents

환경 유해 미생물 검출 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지; 및 발생된 신호를 검출하는 검출기를 포함하는 휴대용 미생물 검출 장치 및 상기 장치를 이용한 미생물 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 형광 및 전기화학적인 신호를 검출할 수 있는 휴대용 장치를 이용하여 단일 세포 수준의 환경 유해 미생물을 현장에서 실시간으로 1시간 이내로 쉽게 검출할 수 있다.

Description

환경 유해 미생물 검출 장치 및 방법{Device and method for detection of environmental pathogens}
도 1은 환경 유해 미생물 검출 장치의 일예를 나타내는 모식도이다.
본 발명은 환경 유해 미생물 검출 장치 및 방법에 관한 것이다.
최근의 BT(biotechnology)와 NT(nanotechnology)가 결합하는 추세는 특이적으로 결합할 수 있는 바이오물질의 성질을 이용한 혼성 나노재료(hybrid nanomaterial)의 개발을 촉진시켰다.
이렇듯, 서로 다른 분야의 결합은 새로운 기술(frontier technology)을 창출하고 있다. 특히 IT(information technology), NT 및 BT의 결합은 필요 불가결한 분야가 되었다. 이로부터 전기화학적인 또는 광학적 검출법이라는 빠르고 정확한 디지털 정보를 바이오물질의 존재 유무와 반응성 등과 같은 아날로그 데이터 측정에 이용할 수 있게 되었다(Chen, J. et al., JACS, 122:657-660, 2000; Dahne, L. et al., JACS, 123:5431-5436, 2001).
최근 21세기에는 급속한 산업발달로 인하여 오염정도가 날로 심각해지고 있 고 특히 생활 환경에서의 질병 유해 미생물에 의한 오염정도의 진단 분야인 바이오 환경 산업의 비중이 커질 것으로 판단된다. 현재로서의 검출 방법은 기존의 형광물질과 동위원소 등을 이용하는 방법이 가장 보편적이나(Toriba, A. et al., Biomed. Chromatography:BMC., 17:126-132, 2003; Raj, S.U. et al., Anal. Chim. Acta, 484:1-14, 2003; Peggy, A.T. et al., J. Microbiol. Meth., 53:221-233, 2003; Dickert F. L. et al., Anal. Bioanal. Chem., 377:540-549, 2003), 좀더 손쉽고 정확하게 측정할 수 있는 새로운 방법에 대한 필요성이 더욱 높아지고 있다.
환경 유해 미생물 검출은 일반적으로 원인균을 선택적으로 배양하고, 이어서 그 생물학적 성상을 기초로 하여 동정하는 배양 동정법; 원인균의 특이적 유전자 서열상에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 등으로 증폭시켜 DNA chip 등을 이용한 원인균을 검출하는 유전자 진단방법 (Dennis P., et al., Appl. Environ. Microbiol., 69(2): 769-778, 2003; Jung W., et al., Material Sci. Eng. C, 24:47-51, 2004); 또는 항체와 원인균의 표면 항원 마커와의 특이적 반응을 이용하여 검출하는 면역학적 방법으로 크게 분류될 수 있다 (Kim M., et al., J. Microbiol. Biotechnol., 13:509-516, 2003; Aurell H., et al., Appl. Environ. Microbiol., 70(3): 1651-1657, 2004). 그러나, 배양 동정법 또는 유전자 진단방법은 그 결과를 얻는데 4시간 이상의 시간이 소요되어 기술적 한계를 가지고 있다. 따라서, 원인균이 단시간 내에 높은 선택성으로 검출될 수 있으며 편리하게 측정될 수 있는 면역학적 방법에 의한 진단이 일반적으로 이용된다. 또한 신속하고 특이성이 높은 유해미생물 검출법은 최근 생물산업, 의약진단, 바이오 테러리즘에 있어 필수적인 특성이 되었다. 현재 초감도의 특이성과 신속성을 갖춘 분석법 개발의 필요성이 절실해지고 있다. 이에 따라, 배양 및 유전자 증폭 과정이 없이 감도를 향상시키기 위해 리포좀 면역분석법, SPR, 나노입자를 이용한 연구가 보고되었다 (Ho J. A. and Hsu H., Anal. Chem., 75:4330-4334, 2003; Zhao X. et al., PNAS, 101:15027-15032, 2004; Oh B., et al., Biosens. Bioelectron., 19:1497-1504. 2004).
그러나 종래의 면역학적 기법 또한 환경 유해 미생물의 검출에 필수적인 낮은 농도 (10 CFU/ml)의 원인균 검출에 있어 한계성을 가지고 있으며, 최근 이를 극복하기 위한 단일 세포 수준 농도 검출 개념을 기초로 한 장치는 아직 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 단일 세포 수준의 환경 유해 미생물을 검출할 수 있는 환경 유해 미생물 검출 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지; 및
발생된 신호를 검출하는 검출기를 포함하는 휴대용 미생물 검출 장치를 제공한다.
본 발명은 환경유해 미생물 검출 및 면역 진단을 가능하게 하는 장치에 관한 것이다. 도 1은 환경 유해 미생물 검출 장치의 일예를 나타내는 모식도이다. 구체적으로, 원인균에 대한 특이적인 항체(제1항체)를 카트리지에 선택적으로 고정한 후, 상기 제1항체가 고정된 카트리지를 미생물, 특히 환경 유해 미생물이 포함된 검체에 반응시켜 원인균을 상기 카트리지에 고정한다. 이어서 이를 샌드위치 방식(즉, 제1항체와 제2항체 사이에 표적 미생물을 위치시킴)으로 신호 발생 물질(형광체, 형광체가 도핑된 나노 입자, 효소)이 접합된 제2항체를 반응시킨 후 상기 제2항체가 결합된 상기 카트리지를 신호 검출기인 장치에 접합시킴으로써 미량의 신호를 검출할 수 있는 것이다. 따라서, 상기 장치에 의해 용이하게 단일 세포 수준의 농도를 검출할 수 있는 것이다. 이와 같은 방법으로 제조된 환경유해 미생물 검출 장치는 휴대용이며 높은 특이성을 가지게 되는 것을 특징으로 한다. 이러한 경우 현장에서 실시간으로 1시간 이내로 쉽게 검출할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 장치는 표적 미생물을 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 제1항체가 고정된 카트리지를 표적 미생물을 포함하는 용액에 접촉시킬 때, 표적 미생물을 포함하는 용액이 상기 장치 외부에 존재할 수도 있지만, 상기 장치 내에 표적 미생물을 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 부착하는 것도 가능할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 장치는 신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 포함하는 용액을 상기 장치와 별도로 구비하는 것도 가능하지만, 상기 장치 내에 신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 부착하는 것도 가능할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 표적 미생물은 세균, 효모, 곰팡이, 방선균 (Actinomyces), 리켓치아 (richettsia) 등을 비롯한 모든 미생물종을 포함하며, 특히 호흡기계 감염증의 원인 미생물인 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophila), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylcoccus aureus), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뉴모이에, 클라미디아 뉴모이에, 미코플라즈마 뉴모이에 (Mucoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모이에 (Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코커스 종 그룹 A, 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 아스퍼질러스 종 (Aspergillus spp.)이 바람직하나, 여기에 제한되지는 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 센서용 카트리지의 항체를 고정하는 영역은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금이 표면 처리된 재질로 되어 있다. 또한, 고정하는 항체의 방향성을 주기 위해 항체의 Fc 영역에 결합하는 Protein G, Protein A 또는 Protein L을 고정한 후 목적 항체를 고정하여 방향성을 줄 수 있게 되어 있다. 본 발명에서 "환경유해 미생물과 특이적으로 반응하는 항체"라 함은 미생물의 종 또는 속과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 의미한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 신호 발생 물질은 항체에 접합시킬 수 있는 나노입자, 형광성 화학물질, 효소 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 신호를 발생시킬 수 있는 물질이라면 어느 것도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 발생된 신호를 검출하는 방법은 형광검출법, 전기 화학적 방법, 효소 활성법 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는 다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지에 표적 미생물을 포함하는 용액을 접촉시키는 단계;
결합되지 않은 미생물을 세정하는 단계;
신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 접촉시키는 단계; 및
발생된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 상기 미생물 검출 장치를 이용하여 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지에 표적 미생물을 포함하는 용액을 접촉시키는 단계를 포함한다. 표적 미생물에 대한 특이적인 항체(제1항체)를 카트리지에 선택적으로 고정한 후, 상기 제1항체가 고정된 카트리지를 미생물, 특히 환경 유해 미생물이 포함된 검체에 반응시켜 표적 미생물을 상기 카트리지에 항원-항체 반응에 의해 고정시킨다. 환경유해 미생물과 특이적으로 반응하는 항체는 미생물의 종 또는 속과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 의미한다. 반응 온도, 반응 시간, 사용되는 완충액 등은 항원-항체 반응에 통상적으로 이용되는 조건을 이용할 수 있으며, 표적 미생물에 따라 상기 조건은 변할 수 있다.
본 발명은 또한, 결합되지 않은 미생물을 세정하는 단계를 포함한다. 상기 제1항체가 결합된 카트리지에 표적 미생물이 결합된 후에, 상기 카트리지에 결합되 지 않은 미생물을 Tris-HCl(pH, 7.2, 50mM)과 같은 세정액을 이용하여 세정한다. 세정액은 상기 카트리지와 표적 미생물의 결합을 방해하지 않고, 결합되지 않은 미생물을 세정할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 접촉시키는 단계를 포함한다. 표적 미생물을 상기 제1항체가 고정된 카트리지에 결합시킨 후, 여기에 샌드위치 방식, 즉, 제1항체와 제2항체 사이에 표적 미생물을 위치시켜, 신호 발생 물질(형광체, 형광체가 도핑된 나노 입자, 효소)이 접합된 제2항체를 반응시킨다. 제1항체는 신호 발생 물질이 없으며, 제2항체는 신호 발생 물질이 접합되어 있으므로, 표적 미생물이 결합된 카트리지는 항원-항체 반응에 의해 특이적으로 제2항체와 결합하여 신호를 발생할 수 있으나, 표적 미생물이 결합되지 않은 카트리지는 제2항체와 결합할 수 없으므로, 신호를 발생할 수 없게 된다. 즉, 신호의 발생 여부에 따라 표적 미생물을 검출할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한, 발생된 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 표적 미생물이 결합된 카트리지와 제2항체가 결합하면 신호가 발생하는데, 이러한 신호는 본 발명의 장치 내의 검출기에 의해 검출된다. 즉, 반응이 완료된 카트리지를 신호 검출용 장치에 삽입하여 형광 또는 전기적 신호를 측정함으로써 유해 미생물을 검출할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 표적 미생물은 세균, 효모, 곰팡이, 방선균 (Actinomyces), 리켓치아 (richettsia) 등을 비롯한 모든 미생물종을 포함하며, 특히 호흡기계 감염증의 원인 미생물인 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophila), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylcoccus aureus), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뉴모이에, 클라미디아 뉴모이에, 미코플라즈마 뉴모이에 (Mucoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모이에 (Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코커스 종 그룹 A, 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 아스퍼질러스 종 (Aspergillus spp.)이 바람직하나, 여기에 제한되지는 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 센서용 카트리지의 항체를 고정하는 영역은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금이 표면 처리된 재질로 되어 있다. 또한, 고정하는 항체의 방향성을 주기 위해 항체의 Fc 영역에 결합하는 Protein G, Protein A 또는 Protein L을 고정한 후 목적 항체를 고정하여 방향성을 줄 수 있게 되어 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 신호 발생 물질은 항체에 접합시킬 수 있는 나노입자, 형광성 화학물질, 효소 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 신호를 발생시킬 수 있는 물질이라면 어느 것도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 발생된 신호를 검출하는 방법은 형광검출법, 전기 화학적 방법, 효소 활성법 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 형광 및 전기화학적인 신호를 검출할 수 있는 휴대용 장치를 이용하여 단일 세포 수준의 환경 유해 미생물을 현장 에서 실시간으로 1시간 이내로 쉽게 검출할 수 있다.

Claims (14)

  1. 표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지; 및
    발생된 신호를 검출하는 검출기를 포함하는 휴대용 미생물 검출 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 표적 미생물을 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 미생물은 세균, 효모, 곰팡이, 방선균 (Actinomyces), 및 리켓치아 (richettsia)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 표적 미생물은 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophila), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylcoccus aureus), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뉴모이에, 클라미디아 뉴모이에, 미코플라즈마 뉴모이에 (Mucoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모이에 (Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코커스 종 그룹 A, 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 아스퍼질러스 종 (Aspergillus spp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 센서용 카트리지의 항체를 고정하는 영역은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 표면 처리된 재질로 되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 신호 발생 물질은 나노입자, 형광성 화학물질, 및 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 방법은 형광검출법, 전기화학적 방법, 및 효소활성법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  9. 표적 미생물에 대한 제1항체가 고정된 센서용 카트리지에 표적 미생물을 포함하는 용액을 접촉시키는 단계;
    결합되지 않은 미생물을 세정하는 단계;
    신호 발생 물질이 접합된 표적 미생물에 대한 제2항체를 접촉시키는 단계; 및
    발생된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용하여 미생물을 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 표적 미생물은 세균, 효모, 곰팡이, 방선균 (Actinomyces), 및 리켓치아 (richettsia)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 표적 미생물은 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophila), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylcoccus aureus), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뉴모이에, 클라미디아 뉴모이에, 미코플라즈마 뉴모이에 (Mucoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모이에 (Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코커스 종 그룹 A, 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 아스퍼질러스 종 (Aspergillus spp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 센서용 카트리지의 항체를 고정하는 영역은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 표면 처리된 재질로 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 신호 발생 물질은 나노입자, 형광성 화학물질, 및 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 검출 방법은 형광검출법, 전기화학적 방법, 및 효소활성법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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