JP3775799B2 - 酵素検出バイオセンサー - Google Patents
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Description
本発明は、バイオセンサーと、酵素活性を検出することによって酵素の存在を検出することにおけるバイオセンサーの使用を伴う方法に関する。
免疫学的診断のアナライト(analytes)および疾患マーカーとして使用できる多くのタンパク質は、特にプロテアーゼ活性等の酵素活性の付加的な特性を有する。さらに、別のクラスのタンパク質はヌクレアーゼ活性を示す。
前立腺特異的抗原(Prostate Specific Antigen)（ＰＳＡ）、すなわち前立腺ガンの診断マーカーは、プロテアーゼ活性を示すタンパク質の一例であり、セリンプロテアーゼとして知られるタンパク質のクラスに属する。重要な免疫学的診断マーカーである他のプロテアーゼの例には、血液凝固酵素、エラスターゼ、カテプシンＢが含まれる。
また、ズブチリシン、パパインおよびα-アミラーゼ等の多くの工業的に重要な酵素もある。
重要なヌクレアーゼの例は、BamH1、HindIII等の制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのようにある条件下ではヌクレアーゼとして作用するポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨのようにある条件下ではＲＮアーゼとして作用する逆転写酵素、並びにＳ１ヌクレアーゼのようなエキソ-およびエンド-ヌクレアーゼである。
現行の診断試験は、ＰＳＡを検出するためのイムノアッセイを用いている（例えば、Abbott's AXsym、Boehringer Mannheim's ElecsysおよびCIBA-Corning's ACS-180等の多くの分析装置であり、いずれもＥＬＩＳＡをベースとしたＰＳＡ試験を備える）。これらの試験は、ＰＳＡ分子に対抗して生じた抗体を利用し、係る抗体は当該タンパク質分子内の特異的エピトープ部位を認識する。
これらの手法の変形は、国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＡＵ９５／００５３６に開示されている。この参考文献には、ＰＳＡによって特異的に切断された一連の基質が開示されている。また、この参考文献には、プロテアーゼの活性を利用したＰＳＡ等のプロテアーゼのアッセイ系も開示されている。このアッセイ系は、ＰＳＡを捕獲するリガンドの使用と、その後のＰＳＡの基質の使用を含む。
本願発明者らは、タンパク質のプロテアーゼ活性を利用した酵素の検出装置並びに方法を開発した。これらの装置並びに方法は、膜をベースとしたバイオセンサーの使用を含む。これらのバイオセンサーに関する情報は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／００２７３、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２，ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０、ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２およびＰＣＴ／ＡＵ９５／００７６３に見出すことができる。これらの出願の開示を参照としてここに含める。
本発明は、検出すべき酵素の基質を提供すること、並びに酵素による基質の分解を検知することを含む。これは多くの方法で達成されうるが、例えば基質の分解によりイオノフォアからある基が除去されてイオノフォアを放出することにより当該イオノフォアが膜内を横方向に拡散するか、あるいは単に“立体”障害の減少によってイオノフォアを経由するイオンの通過能力の増加を引き起こしてもよい。もしくは、基質が膜間成分(a membrane spanning component)に取り付けられた場合には、基質の分解によりイオノフォアの放出が引き起こされることによって、イオノフォアが膜内を横方向に拡散してもよい。明らかに、このことはイオノフォアと膜間成分の両方に取り付けられた基質の分解によって達成することもできる。
他の変更としては、基質の分解が、プローブを含むイオノフォアの放出を引き起こし、次いで膜内にそれ自身を挿入する。
従って、本発明の第一の態様は、サンプル中の酵素の存在を検出するのに使用するためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピーダンスを検出するための手段を含み、当該膜はイオノフォアを備え、当該イオノフォアにリンカーが取り付けられており、当該リンカーは検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカーの切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる。
本発明の好ましい態様では、リンカーが膜に取り付けられることにより、イオノフォアが膜内を横方向に拡散することができない。リンカーは膜に設けられた膜間成分に取り付けられていることが好ましい。この取り付けは共有結合等の多くの方法で行うことができるが、現在のところ、リガンド結合対の一方をリンカーと膜間成分の両方に設けることによって取り付けることが好ましい。好ましいリガンド結合対はビオチン ストレプトアビジンである。他の好ましい変更では、膜間成分とリンカーの両方が、同一の分子に結合した部分を備えており、例えばビオチンが膜間成分とリンカーの両方に設けられ、ストレプトアビジンを介して架橋結合したものである。
膜間成分の当該部分は、リンカーを介して取り付けられてもよい。これは、イオノフォアに設けられたものと同じリンカーであっても異なるものであってもよい。
さらに好ましい態様では、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列(a closely packed array)の第一層および第二層、膜において横方向に拡散できない複数のイオノフォアと複数の膜間脂質を含み、イオノフォアは第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられている。第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、第二半膜間モノマーはリンカーを介して膜間脂質に結合されている。酵素によるリンカーの切断後に、第二半膜間モノマーは、第一半膜間モノマーとは別の第二層内を横方向に拡散することができる。
本発明の第二の態様では、サンプル中の酵素の存在を検出することに使用するためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段を含み、この膜は複数のイオノフォアと複数の膜間成分を備え、当該膜間成分にはリンカー分子が取り付けられ、当該リンカー分子にイオノフォアが連結され、当該リンカー分子は検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカー分子の切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる。
好ましい実施態様では、前記膜は、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層を含み、膜間成分は膜内において横方向に拡散することができない。好ましくは、イオノフォアが第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層に設けられ、第一半膜間モノマーが第一層において横方向に拡散することができない。第二半膜間モノマーは、リンカー分子を介して膜間成分に連結されている。
これら両方の態様におけるイオノフォアは、好ましくはグラミシジン又はその類似体である。
一連の酵素は、本発明のバイオセンサーを用いて検出することができるが、このバイオセンサーは、プロテアーゼ、特にＰＳＡ、フィブリノーゲン等の臨床的に重要なプロテアーゼの検出に特に使用できる。
本発明の第三の態様は、第一領域および第二領域、並びに酵素を含むことが疑われるサンプルを第一領域に添加させる手段を備え、前記第一領域は酵素によって切断されうるリンカーを介してキャリアーに連結されたプローブと、第一領域から第二領域へ非結合プローブを通過させる手段とを含む、酵素の検出のためのバイオセンサーであり、前記第二領域は膜および当該膜のインピーダンスを測定する手段を含み、そのインピーダンスはプローブの存在又は不在に依存する。
本発明のこの態様における好ましい実施態様では、前記膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、および第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含む複数のイオノフォアを備え、前記第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられ、第二半膜間モノマーは第一半膜間モノマーとは独立の第二層内を横方向に拡散することができ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、リガンドが少なくとも第二半膜間モノマーに設けられており、前記リガンドはプローブ又はその一部と反応性を有し、プローブのリガンドへの結合が第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとの間の関係に変化を引き起こすことによって、イオノフォアを介して膜を通過するイオンが流れるかまたは妨げられる。
好ましい実施態様では、プローブがストレプトアビジンを含み、リガンドがビオチンを含む。
さらに別の好ましい実施態様では、プローブがイオノフォアを含むことにより、プローブが膜と接触した際に、イオノフォアが自身を膜内に挿入し、膜のインピーダンスを変化させる。このような変更の例として、プローブは、膜内に自身を挿入するバリノマイシンを含んでもよい。
本発明の好ましい実施態様では、検出すべき酵素はプロテアーゼであり、特に前立腺特異的抗原である。この場合、リンカーもしくはリンカー分子は、配列Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含むことが好ましい。
当業者であれば理解できるように、使用される実際のリンカーは検出すべき酵素に依存する。ある酵素及び対応する基質の例は、WhittakerらによるAnalytical Biochemistry: 220, 238-243(1994)に記述されており、その開示を相互参照として含める。
さらに別の態様としては、本発明は、本発明の第一、第二もしくは第三の態様のバイオセンサーにサンプルを添加すること、および膜のインピーダンスの変化を測定することを含む、サンプル中の酵素の存在を検出する方法である。
明白なことではあるが、本発明のバイオセンサーと方法は、全体の酵素を検出するのではなく、活性酵素のみを検出する。多くの状況において、関心が向けられるのは、単に標準的なサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定されるような存在する酵素の全体量ではなく、存在する活性酵素の量であることから、これは重要なことである。
また、本発明のセンサーは広範囲の酵素を検出するのに使用されることも明らかである。これらの酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む。このセンサーは、リンカーの作製を調節することによって、検出すべき特定の酵素に適合される。例えばプロテアーゼを検出するために、リンカーは酵素によって切断されるペプチド部位を一般的に含む。特異的プロテアーゼによって切断されるペプチド配列についての情報は、上記Whittakerらの参照文献に開示されている。検出すべき酵素がヌクレアーゼであれば、リンカーは一般的に核酸配列を含む。特異的酵素によって切断される特異的配列に関する情報は、“Current Protocols in Molecular Biology”Ausebelら（1987）John Wiley & Sons, NYに開示されている。
本発明のセンサーは、ＤＮＡ−薬剤結合部位を決定するための薬剤開発において使用してもよい。このセンサーは、ＤＮＡ−タンパク質結合部位を決定する際にも使用することもできる。また、このセンサーは、感染を診断する際に使用してもよい。例えば、病原体と特異的に関連する酵素活性を検出するために使用することができる。
産業上かつ臨床上適切なプロテアーゼと基質は、トロンビンとＰＳＡを含むセリンプロテアーゼを含む。溶解酵素の一覧は、“タンパク質分解の特異性（Specificity of Proteolysis）”Borivoj Keil（1992）Springer Verlag NY pp.283-323に開示されている。有益なものはセリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼである。“タンパク質分解酵素（Proteolytic Enzymes）”実用的な手法（a Practical Approach）R.J.Benyon & J.S.Bond（eds）1989 Oxford University Press NY p232, pp.241-249も参照。本発明の技術に適した商業上重要なプロテアーゼとプロテアーゼインヒビターは、セリン、システイン、アスパラギン酸並びにメタロ(metallo)タイプが利用できる。セリンプロテアーゼは、エンドプロテイナーゼ−Ａｒｇ−Ｃ、−Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子(factor Xa)、プロテイナーゼＫ、ズブチリシンおよびトリプシンを含み、かつエキソペプチダーゼ アシルアミノ酸遊離酵素、カルボキシペプチダーゼＰ、およびカルボキシペプチダーゼＹを含む。システインプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ ブロメライン、カテプシンＢ、クロストリパイン、パパインおよびエキソペプチダーゼ カテプシンＣおよびピログルタマートアミノペプチダーゼ(pyroglutamate aminopeptidase)を含む。アスパラギン酸プロテアーゼは、エンドペプチダーゼ カテプシンＤおよびペプシンを含む。メタロプロテアーゼ(metallo proteases)は、エンドペプチダーゼ サーモリシンおよびエキソペプチダーゼ アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼ−Ａ、−Ｂおよびロイシンアミノペプチダーゼを含む。この一覧は排他的なものではなく、本願発明の広い実用性を示す。他の商業上使用できるプロテアーゼは、先に引用された文献に掲載されており、これらを参照としてここに含む。例えば、既知の種類のエンドペプチド エンドプロテイナーゼ−Ａｓｐ−Ｎも含む。
本発明の性質をより明確に理解するために、以下の実施例および添付図面を参照しながら以下にその好ましい形態を記述する。
図１は、本発明の第三の態様の装置の実施態様の図式的描写を示す。この図から判るように、装置１０は第一領域１１と第二領域１２とを含む。第一領域１１には、ペプチドリンカー１５を介してストレプトアビジン１４（プローブ）に結合したポリマービーズ１３（キャリアー）が設けられている。このペプチドリンカー１５はプロテアーゼ１６によって切断される。
この図に示すように、プロテアーゼ（またはヌクレアーゼ）１６の添加により、ストレプトアビジン１４が遊離され、第二領域１２に流れる。第二領域１２は、ストレプトアビジン１４の存在を検出するバイオセンサー膜１７を含む。バイオセンサー膜１７に到達したストレプトアビジン１４は、膜のインピーダンスに変化を引き起こす。
図２は、本発明の第一および／または第二態様の実施態様を示す。図２に示すようにバイオセンサー膜２０は膜２１と電極２２とを含む。膜２１は、両親媒性分子の列の第一層２３と第二層２４とを備える。膜内を横方向に拡散することができない第一半膜間モノマー２５が層２４に含まれている。層２３は第二半膜間モノマー２６を含む。この膜は、膜内を横方向に拡散することができない膜間脂質２７も含む。第二半膜間モノマー２６は、ペプチド２８を介して膜間脂質２７に連結されている。ペプチド２８はプロテアーゼ２９で切断される。プロテアーゼ２９によるペプチド２８の切断により、半膜間モノマー２６は自由に膜内を横方向に拡散する。この結果、膜のインピーダンスに変化が生じる。
実施例
実施例１：
ストレプトアビジン−グラミシジン結合のプロテアーゼ切断
第一層：９．３ｎＭ リンカーグラミシジンＢ(Linker Gramicidin B)（図３）
１．１μＭ 膜間脂質Ｄ(Membrane Spanner Lipid D)（図４）
３７μＭ ＭＡＡＤ（図５）
７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A)（図６）
第二層：エタノール中に１０ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ（図７）：ＧＤＰＥ（図８）=７：３）：ビオチニル化グラミシジンＥ(Biotinylated Gramicidin E)（図９）=６６６７７：１
クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金（１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶液中に浸し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ2に限定したテフロン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。
５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（６．２６ｍＭ ＮａＣｌ、５９．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4．２Ｈ2Ｏ、２．５３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を添加した。電極をＰＢＳで４回洗浄し、３０分間以上６０℃まで温度を上げた。ストレプトアビジンをセンサーウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５μＬ）、インキュベートした。ストレプトアビジンのビオチニル化グラミシジンＥへの結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少した（図１０）。１５分後に過剰のストレプトアビジンをＰＢＳで洗浄した。ストレプトアビジンを添加していないウェルを対照として用いた。
プロテイナーゼＫを検出ウェルおよび対照ウェルに添加して、１２．５ｍｇ／ｍｌの最終的なウェル濃度とした（ＰＢＳ中に調製されたBoehringer Mannheim D-68298)。対照ウェルへのプロテイナーゼＫの添加では、膜アドミタンス特性に著しい変化を生じなかった。ストレプトアビジンが結合したセンサー膜は、最小位相におけるアドミタンスの増加を示した（図１１）。最小位相におけるアドミタンスの増加の量および速度は、試験溶液中に存在するプロテイナーゼＫの量に関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活性を調べるために用いることができる。
実施例２：
ＤＮＡ結合チャネルのＤＮアーゼ１切断
第一層：９．３ｎＭ リンカーグラミシジンＢ（Linker Gramicidin B）
１．１μＭ 膜間脂質Ｄ(Membrane Spanner Lipid D)
２７．５ｎＭ 膜間脂質Ｃ(Membrane Spanner Lipid C)（図１２）
３７μＭ ＭＡＡＤ
７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A)
第二層：エタノール中に１４ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ：ＧＤＰＥ=７：３）：ビオチニル化グラミシジンＥ=５００００：１
クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金（１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶液中に浸し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ2に限定したテフロン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。
５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１８０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ；ＰＢＳ）を添加した。電極をＰＢＳで４回洗浄した。これらの工程は室温で行われた。以下の全ての工程は３０℃で行われた。ストレプトアビジンを全てのウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５μＬ）、ビオチニル化グラミシジンＥと１０−１５分間反応させ、過剰の非結合のストレプトアビジンをＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡプローブＦ（２００ｎＭ）：ＤＮＡプローブＧ（ＰＢＳ中に２００ｎＭ）の１：１混合物５μＬをセンサーウェルに添加した。ＤＮＡ非特異的結合プローブＨ（ＰＢＳ中に４００ｎＭを５μＬ）を対照ウェルに添加した。結合プローブＨは対象の標的ＤＮＡに非相補的であるため、標的ＤＮＡは結合しない。前記プローブを１０−１５分間ストレプトアビジンと反応させ、過剰の非結合プローブをＰＢＳで洗い流した。ＰＢＳ中の１００μＬのＤＮＡ標的Ｉ（１０ｎＭ）を各ウェルに添加した。ＤＮＡ標的Ｉのセンサーウェルに対する結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少したが、対照ウェルにおける膜アドミタンスでは著しい変化はなかった（図１３）。１５分後に、非結合ＤＮＡ標的ＩをＤＮアーゼ１活性化バッファーで洗浄した。ＤＮアーゼ１活性化バッファーは、５０ｎＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｎＭ ＭｇＣｌ2、１０ｎＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。ＤＮアーゼ１をセンサーウェルと対照ウェルに添加した（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌの５０％ ｗ／ｖグリセロール溶液、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2中に１ｍｇ／ｍＬを２μＬ）。ＤＮアーゼ１の添加により、センサーウェルの最小位相におけるアドミタンスは増大したが、対照ウェルには顕著な変化が見られなかった（図１４）。最小位相におけるアドミタンスの増加の量および速度は、試験溶液中に存在するＤＮアーゼ１の量と関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活性を調べるために用いることができる。
ＤＮＡプローブＦ：
ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイト(phosphoramidite)リンカー基を備えた５’ビオチニル化リステリア(listeria)プローブＤＮＡ
ＤＮＡプローブＧ：
ビオチンとＤＮＡとの間に１３原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ビオチニル化コレラ毒素プローブＤＮＡ
ＤＮＡ非特異的結合プローブＨ：
ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ビオチニル化１５マーオリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡ配列のあらゆる部分に対して非相補的である。
ＤＮＡ標的Ｉ：
１９塩基リステリア配列、１０塩基“スペーサー”および２３塩基コレラ毒素配列を含む５２塩基ＤＮＡ
広く記載された本発明の精神もしくは範囲から離れることなく、特定の実施態様に示したように、多数の変更および／または修正を本発明に加えてもよいことは、当業者に理解されるところである。しかして、上記の実施態様は、あらゆる点において例示的なものであって、限定的なものではないと考えるべきである。
免疫学的診断のアナライト(analytes)および疾患マーカーとして使用できる多くのタンパク質は、特にプロテアーゼ活性等の酵素活性の付加的な特性を有する。さらに、別のクラスのタンパク質はヌクレアーゼ活性を示す。
前立腺特異的抗原(Prostate Specific Antigen)（ＰＳＡ）、すなわち前立腺ガンの診断マーカーは、プロテアーゼ活性を示すタンパク質の一例であり、セリンプロテアーゼとして知られるタンパク質のクラスに属する。重要な免疫学的診断マーカーである他のプロテアーゼの例には、血液凝固酵素、エラスターゼ、カテプシンＢが含まれる。
また、ズブチリシン、パパインおよびα-アミラーゼ等の多くの工業的に重要な酵素もある。
重要なヌクレアーゼの例は、BamH1、HindIII等の制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのようにある条件下ではヌクレアーゼとして作用するポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨのようにある条件下ではＲＮアーゼとして作用する逆転写酵素、並びにＳ１ヌクレアーゼのようなエキソ-およびエンド-ヌクレアーゼである。
現行の診断試験は、ＰＳＡを検出するためのイムノアッセイを用いている（例えば、Abbott's AXsym、Boehringer Mannheim's ElecsysおよびCIBA-Corning's ACS-180等の多くの分析装置であり、いずれもＥＬＩＳＡをベースとしたＰＳＡ試験を備える）。これらの試験は、ＰＳＡ分子に対抗して生じた抗体を利用し、係る抗体は当該タンパク質分子内の特異的エピトープ部位を認識する。
これらの手法の変形は、国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＡＵ９５／００５３６に開示されている。この参考文献には、ＰＳＡによって特異的に切断された一連の基質が開示されている。また、この参考文献には、プロテアーゼの活性を利用したＰＳＡ等のプロテアーゼのアッセイ系も開示されている。このアッセイ系は、ＰＳＡを捕獲するリガンドの使用と、その後のＰＳＡの基質の使用を含む。
本願発明者らは、タンパク質のプロテアーゼ活性を利用した酵素の検出装置並びに方法を開発した。これらの装置並びに方法は、膜をベースとしたバイオセンサーの使用を含む。これらのバイオセンサーに関する情報は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／００２７３、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２，ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０、ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２およびＰＣＴ／ＡＵ９５／００７６３に見出すことができる。これらの出願の開示を参照としてここに含める。
本発明は、検出すべき酵素の基質を提供すること、並びに酵素による基質の分解を検知することを含む。これは多くの方法で達成されうるが、例えば基質の分解によりイオノフォアからある基が除去されてイオノフォアを放出することにより当該イオノフォアが膜内を横方向に拡散するか、あるいは単に“立体”障害の減少によってイオノフォアを経由するイオンの通過能力の増加を引き起こしてもよい。もしくは、基質が膜間成分(a membrane spanning component)に取り付けられた場合には、基質の分解によりイオノフォアの放出が引き起こされることによって、イオノフォアが膜内を横方向に拡散してもよい。明らかに、このことはイオノフォアと膜間成分の両方に取り付けられた基質の分解によって達成することもできる。
他の変更としては、基質の分解が、プローブを含むイオノフォアの放出を引き起こし、次いで膜内にそれ自身を挿入する。
従って、本発明の第一の態様は、サンプル中の酵素の存在を検出するのに使用するためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピーダンスを検出するための手段を含み、当該膜はイオノフォアを備え、当該イオノフォアにリンカーが取り付けられており、当該リンカーは検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカーの切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる。
本発明の好ましい態様では、リンカーが膜に取り付けられることにより、イオノフォアが膜内を横方向に拡散することができない。リンカーは膜に設けられた膜間成分に取り付けられていることが好ましい。この取り付けは共有結合等の多くの方法で行うことができるが、現在のところ、リガンド結合対の一方をリンカーと膜間成分の両方に設けることによって取り付けることが好ましい。好ましいリガンド結合対はビオチン ストレプトアビジンである。他の好ましい変更では、膜間成分とリンカーの両方が、同一の分子に結合した部分を備えており、例えばビオチンが膜間成分とリンカーの両方に設けられ、ストレプトアビジンを介して架橋結合したものである。
膜間成分の当該部分は、リンカーを介して取り付けられてもよい。これは、イオノフォアに設けられたものと同じリンカーであっても異なるものであってもよい。
さらに好ましい態様では、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列(a closely packed array)の第一層および第二層、膜において横方向に拡散できない複数のイオノフォアと複数の膜間脂質を含み、イオノフォアは第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられている。第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、第二半膜間モノマーはリンカーを介して膜間脂質に結合されている。酵素によるリンカーの切断後に、第二半膜間モノマーは、第一半膜間モノマーとは別の第二層内を横方向に拡散することができる。
本発明の第二の態様では、サンプル中の酵素の存在を検出することに使用するためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段を含み、この膜は複数のイオノフォアと複数の膜間成分を備え、当該膜間成分にはリンカー分子が取り付けられ、当該リンカー分子にイオノフォアが連結され、当該リンカー分子は検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカー分子の切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる。
好ましい実施態様では、前記膜は、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層を含み、膜間成分は膜内において横方向に拡散することができない。好ましくは、イオノフォアが第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層に設けられ、第一半膜間モノマーが第一層において横方向に拡散することができない。第二半膜間モノマーは、リンカー分子を介して膜間成分に連結されている。
これら両方の態様におけるイオノフォアは、好ましくはグラミシジン又はその類似体である。
一連の酵素は、本発明のバイオセンサーを用いて検出することができるが、このバイオセンサーは、プロテアーゼ、特にＰＳＡ、フィブリノーゲン等の臨床的に重要なプロテアーゼの検出に特に使用できる。
本発明の第三の態様は、第一領域および第二領域、並びに酵素を含むことが疑われるサンプルを第一領域に添加させる手段を備え、前記第一領域は酵素によって切断されうるリンカーを介してキャリアーに連結されたプローブと、第一領域から第二領域へ非結合プローブを通過させる手段とを含む、酵素の検出のためのバイオセンサーであり、前記第二領域は膜および当該膜のインピーダンスを測定する手段を含み、そのインピーダンスはプローブの存在又は不在に依存する。
本発明のこの態様における好ましい実施態様では、前記膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、および第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含む複数のイオノフォアを備え、前記第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられ、第二半膜間モノマーは第一半膜間モノマーとは独立の第二層内を横方向に拡散することができ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、リガンドが少なくとも第二半膜間モノマーに設けられており、前記リガンドはプローブ又はその一部と反応性を有し、プローブのリガンドへの結合が第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとの間の関係に変化を引き起こすことによって、イオノフォアを介して膜を通過するイオンが流れるかまたは妨げられる。
好ましい実施態様では、プローブがストレプトアビジンを含み、リガンドがビオチンを含む。
さらに別の好ましい実施態様では、プローブがイオノフォアを含むことにより、プローブが膜と接触した際に、イオノフォアが自身を膜内に挿入し、膜のインピーダンスを変化させる。このような変更の例として、プローブは、膜内に自身を挿入するバリノマイシンを含んでもよい。
本発明の好ましい実施態様では、検出すべき酵素はプロテアーゼであり、特に前立腺特異的抗原である。この場合、リンカーもしくはリンカー分子は、配列Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含むことが好ましい。
当業者であれば理解できるように、使用される実際のリンカーは検出すべき酵素に依存する。ある酵素及び対応する基質の例は、WhittakerらによるAnalytical Biochemistry: 220, 238-243(1994)に記述されており、その開示を相互参照として含める。
さらに別の態様としては、本発明は、本発明の第一、第二もしくは第三の態様のバイオセンサーにサンプルを添加すること、および膜のインピーダンスの変化を測定することを含む、サンプル中の酵素の存在を検出する方法である。
明白なことではあるが、本発明のバイオセンサーと方法は、全体の酵素を検出するのではなく、活性酵素のみを検出する。多くの状況において、関心が向けられるのは、単に標準的なサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定されるような存在する酵素の全体量ではなく、存在する活性酵素の量であることから、これは重要なことである。
また、本発明のセンサーは広範囲の酵素を検出するのに使用されることも明らかである。これらの酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む。このセンサーは、リンカーの作製を調節することによって、検出すべき特定の酵素に適合される。例えばプロテアーゼを検出するために、リンカーは酵素によって切断されるペプチド部位を一般的に含む。特異的プロテアーゼによって切断されるペプチド配列についての情報は、上記Whittakerらの参照文献に開示されている。検出すべき酵素がヌクレアーゼであれば、リンカーは一般的に核酸配列を含む。特異的酵素によって切断される特異的配列に関する情報は、“Current Protocols in Molecular Biology”Ausebelら（1987）John Wiley & Sons, NYに開示されている。
本発明のセンサーは、ＤＮＡ−薬剤結合部位を決定するための薬剤開発において使用してもよい。このセンサーは、ＤＮＡ−タンパク質結合部位を決定する際にも使用することもできる。また、このセンサーは、感染を診断する際に使用してもよい。例えば、病原体と特異的に関連する酵素活性を検出するために使用することができる。
産業上かつ臨床上適切なプロテアーゼと基質は、トロンビンとＰＳＡを含むセリンプロテアーゼを含む。溶解酵素の一覧は、“タンパク質分解の特異性（Specificity of Proteolysis）”Borivoj Keil（1992）Springer Verlag NY pp.283-323に開示されている。有益なものはセリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼである。“タンパク質分解酵素（Proteolytic Enzymes）”実用的な手法（a Practical Approach）R.J.Benyon & J.S.Bond（eds）1989 Oxford University Press NY p232, pp.241-249も参照。本発明の技術に適した商業上重要なプロテアーゼとプロテアーゼインヒビターは、セリン、システイン、アスパラギン酸並びにメタロ(metallo)タイプが利用できる。セリンプロテアーゼは、エンドプロテイナーゼ−Ａｒｇ−Ｃ、−Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子(factor Xa)、プロテイナーゼＫ、ズブチリシンおよびトリプシンを含み、かつエキソペプチダーゼ アシルアミノ酸遊離酵素、カルボキシペプチダーゼＰ、およびカルボキシペプチダーゼＹを含む。システインプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ ブロメライン、カテプシンＢ、クロストリパイン、パパインおよびエキソペプチダーゼ カテプシンＣおよびピログルタマートアミノペプチダーゼ(pyroglutamate aminopeptidase)を含む。アスパラギン酸プロテアーゼは、エンドペプチダーゼ カテプシンＤおよびペプシンを含む。メタロプロテアーゼ(metallo proteases)は、エンドペプチダーゼ サーモリシンおよびエキソペプチダーゼ アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼ−Ａ、−Ｂおよびロイシンアミノペプチダーゼを含む。この一覧は排他的なものではなく、本願発明の広い実用性を示す。他の商業上使用できるプロテアーゼは、先に引用された文献に掲載されており、これらを参照としてここに含む。例えば、既知の種類のエンドペプチド エンドプロテイナーゼ−Ａｓｐ−Ｎも含む。
本発明の性質をより明確に理解するために、以下の実施例および添付図面を参照しながら以下にその好ましい形態を記述する。
図１は、本発明の第三の態様の装置の実施態様の図式的描写を示す。この図から判るように、装置１０は第一領域１１と第二領域１２とを含む。第一領域１１には、ペプチドリンカー１５を介してストレプトアビジン１４（プローブ）に結合したポリマービーズ１３（キャリアー）が設けられている。このペプチドリンカー１５はプロテアーゼ１６によって切断される。
この図に示すように、プロテアーゼ（またはヌクレアーゼ）１６の添加により、ストレプトアビジン１４が遊離され、第二領域１２に流れる。第二領域１２は、ストレプトアビジン１４の存在を検出するバイオセンサー膜１７を含む。バイオセンサー膜１７に到達したストレプトアビジン１４は、膜のインピーダンスに変化を引き起こす。
図２は、本発明の第一および／または第二態様の実施態様を示す。図２に示すようにバイオセンサー膜２０は膜２１と電極２２とを含む。膜２１は、両親媒性分子の列の第一層２３と第二層２４とを備える。膜内を横方向に拡散することができない第一半膜間モノマー２５が層２４に含まれている。層２３は第二半膜間モノマー２６を含む。この膜は、膜内を横方向に拡散することができない膜間脂質２７も含む。第二半膜間モノマー２６は、ペプチド２８を介して膜間脂質２７に連結されている。ペプチド２８はプロテアーゼ２９で切断される。プロテアーゼ２９によるペプチド２８の切断により、半膜間モノマー２６は自由に膜内を横方向に拡散する。この結果、膜のインピーダンスに変化が生じる。
実施例
実施例１：
ストレプトアビジン−グラミシジン結合のプロテアーゼ切断
第一層：９．３ｎＭ リンカーグラミシジンＢ(Linker Gramicidin B)（図３）
１．１μＭ 膜間脂質Ｄ(Membrane Spanner Lipid D)（図４）
３７μＭ ＭＡＡＤ（図５）
７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A)（図６）
第二層：エタノール中に１０ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ（図７）：ＧＤＰＥ（図８）=７：３）：ビオチニル化グラミシジンＥ(Biotinylated Gramicidin E)（図９）=６６６７７：１
クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金（１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶液中に浸し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ2に限定したテフロン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。
５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（６．２６ｍＭ ＮａＣｌ、５９．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4．２Ｈ2Ｏ、２．５３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を添加した。電極をＰＢＳで４回洗浄し、３０分間以上６０℃まで温度を上げた。ストレプトアビジンをセンサーウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５μＬ）、インキュベートした。ストレプトアビジンのビオチニル化グラミシジンＥへの結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少した（図１０）。１５分後に過剰のストレプトアビジンをＰＢＳで洗浄した。ストレプトアビジンを添加していないウェルを対照として用いた。
プロテイナーゼＫを検出ウェルおよび対照ウェルに添加して、１２．５ｍｇ／ｍｌの最終的なウェル濃度とした（ＰＢＳ中に調製されたBoehringer Mannheim D-68298)。対照ウェルへのプロテイナーゼＫの添加では、膜アドミタンス特性に著しい変化を生じなかった。ストレプトアビジンが結合したセンサー膜は、最小位相におけるアドミタンスの増加を示した（図１１）。最小位相におけるアドミタンスの増加の量および速度は、試験溶液中に存在するプロテイナーゼＫの量に関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活性を調べるために用いることができる。
実施例２：
ＤＮＡ結合チャネルのＤＮアーゼ１切断
第一層：９．３ｎＭ リンカーグラミシジンＢ（Linker Gramicidin B）
１．１μＭ 膜間脂質Ｄ(Membrane Spanner Lipid D)
２７．５ｎＭ 膜間脂質Ｃ(Membrane Spanner Lipid C)（図１２）
３７μＭ ＭＡＡＤ
７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A)
第二層：エタノール中に１４ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ：ＧＤＰＥ=７：３）：ビオチニル化グラミシジンＥ=５００００：１
クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金（１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶液中に浸し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ2に限定したテフロン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。
５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１８０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ；ＰＢＳ）を添加した。電極をＰＢＳで４回洗浄した。これらの工程は室温で行われた。以下の全ての工程は３０℃で行われた。ストレプトアビジンを全てのウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５μＬ）、ビオチニル化グラミシジンＥと１０−１５分間反応させ、過剰の非結合のストレプトアビジンをＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡプローブＦ（２００ｎＭ）：ＤＮＡプローブＧ（ＰＢＳ中に２００ｎＭ）の１：１混合物５μＬをセンサーウェルに添加した。ＤＮＡ非特異的結合プローブＨ（ＰＢＳ中に４００ｎＭを５μＬ）を対照ウェルに添加した。結合プローブＨは対象の標的ＤＮＡに非相補的であるため、標的ＤＮＡは結合しない。前記プローブを１０−１５分間ストレプトアビジンと反応させ、過剰の非結合プローブをＰＢＳで洗い流した。ＰＢＳ中の１００μＬのＤＮＡ標的Ｉ（１０ｎＭ）を各ウェルに添加した。ＤＮＡ標的Ｉのセンサーウェルに対する結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少したが、対照ウェルにおける膜アドミタンスでは著しい変化はなかった（図１３）。１５分後に、非結合ＤＮＡ標的ＩをＤＮアーゼ１活性化バッファーで洗浄した。ＤＮアーゼ１活性化バッファーは、５０ｎＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｎＭ ＭｇＣｌ2、１０ｎＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。ＤＮアーゼ１をセンサーウェルと対照ウェルに添加した（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌの５０％ ｗ／ｖグリセロール溶液、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2中に１ｍｇ／ｍＬを２μＬ）。ＤＮアーゼ１の添加により、センサーウェルの最小位相におけるアドミタンスは増大したが、対照ウェルには顕著な変化が見られなかった（図１４）。最小位相におけるアドミタンスの増加の量および速度は、試験溶液中に存在するＤＮアーゼ１の量と関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活性を調べるために用いることができる。
ＤＮＡプローブＦ：
ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイト(phosphoramidite)リンカー基を備えた５’ビオチニル化リステリア(listeria)プローブＤＮＡ
ビオチンとＤＮＡとの間に１３原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ビオチニル化コレラ毒素プローブＤＮＡ
ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ビオチニル化１５マーオリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡ配列のあらゆる部分に対して非相補的である。
１９塩基リステリア配列、１０塩基“スペーサー”および２３塩基コレラ毒素配列を含む５２塩基ＤＮＡ
Claims (26)
- 膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段とを含み、当該膜はリンカーが取り付けられたイオノフォアを備え、当該リンカーは検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカーの切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる、サンプル中の酵素の存在を検出することに使用するためのバイオセンサー。
- リンカーが膜に取り付けられたことにより、イオノフォアが膜内を横方向に拡散することができない、請求項１記載のバイオセンサー。
- リンカーが膜に設けられた膜間成分に取り付けられた、請求項２記載のバイオセンサー。
- リンカーがリガンド結合対を介して膜間成分に取り付けられた、請求項３記載のバイオセンサー。
- 膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、膜において横方向に拡散することができない複数のイオノフォアおよび複数の膜間脂質を含み、前記イオノフォアは第一半膜間モノマーおよび第二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、第二半膜間モノマーはリンカーを介して膜間脂質に結合された、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- イオノフォアがグラミシジン又はその類似体である、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- プロテアーゼがＰＳＡである、請求項７記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がヌクレアーゼである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段を含み、当該膜は複数のイオノフォアと複数の膜間成分を備え、当該膜間成分にはリンカー分子が取り付けられ、当該リンカー分子にイオノフォアが連結され、当該リンカー分子は検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカー分子の切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる、サンプル中の酵素の存在を検出することに使用するためのバイオセンサー。
- 膜が両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層を含み、膜間成分が膜において横方向に拡散することができない、請求項１０記載のバイオセンサー。
- イオノフォアが第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとを含み、第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層に設けられ、第一半膜間モノマーが第一層において横方向に拡散することができない、請求項１０または１１に記載のバイオセンサー。
- イオノフォアがグラミシジン又はその類似体である、請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- プロテアーゼがＰＳＡである、請求項１４記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- 第一領域および第二領域、並びにプロテアーゼを含むことが疑われるサンプルを第一領域に添加させる手段を備え、前記第一領域は酵素によって切断されうるリンカーを介してキャリアーに連結されたプローブと、第一領域から第二領域へ非結合プローブを通過させる手段とを含み、前記第二領域は膜および当該膜のインピーダンスを測定する手段を含み、当該インピーダンスはプローブの存在又は不在に依存する、酵素を検出するためのバイオセンサー。
- 膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、および第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含む複数のイオノフォアを含み、前記第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層に設けられ、第二半膜間モノマーは第一半膜間モノマーとは独立の第二層内を横方向に拡散することができ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、リガンドが少なくとも第二半膜間モノマーに設けられ、前記リガンドはプローブ又はその一部と反応性を有し、プローブのリガンドへの結合により第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとの間の関係に変化が引き起こされることによって、イオノフォアを介して膜を通過するイオンが流れるかまたは妨げられる、請求項１７記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１７または１８に記載のバイオセンサー。
- プロテアーゼがＰＳＡである、請求項１９記載のバイオセンサー。
- 検出されるべき酵素がヌクレアーゼである、請求項１７または１８に記載のバイオセンサー。
- 半膜間モノマーがグラミシジンまたはその類似体である、請求項１７ないし２１のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
- プローブがイオノフォアを含む、請求項１７記載のバイオセンサー。
- 請求項１ないし２３のいずれか一項に記載のバイオセンサーにサンプルを添加し、かつ膜のインピーダンスにおける変化を測定することを含む、サンプル中の酵素の存在を検出する方法。
- 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項２４記載の方法。
- プロテアーゼがＰＳＡである、請求項２５記載の方法。
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