DE69431431T2

DE69431431T2 - Oberflächenvergrösserer

Info

Publication number: DE69431431T2
Application number: DE69431431T
Authority: DE
Inventors: Andrew Cornell; John Pace
Original assignee: Ambri Ltd
Current assignee: Ambri Ltd
Priority date: 1993-04-21
Filing date: 1994-04-20
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2014-04-21
Also published as: CA2161084A1; ATE225040T1; EP0695425A1; WO1994024562A1; EP0695425B1; AU681138B2; PT695425E; EP0695425A4; DK0695425T3; AU6532794A; US6573109B1; JPH08509807A; JP3424682B2; CA2161084C; ES2183837T3; DE69431431D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Membranen zur Verwendung beim Ermitteln des Vorhandenseins eines Analyten.
In der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO90/08783 ist offenbart, wie ein Biosensor mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität auf der Basis eines lateralen Segregationsprinzips konstruiert werden kann, bei dem Ionophoren in einer gestützten Doppelschichtmembran eingebaut werden. Die in dieser Anmeldung beschriebene, bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beinhaltete Gramicidin als das Ionophor, das bekannterweise nur dann einen leitenden Kanal bildet, wenn zwei Monomere, jeweils eines in jeder der beiden Doppelschichtebenen, sich selbst in angemessener Weise anordnen, um ein Doppelschichtüberspannendes Dimer zu formen. Die laterale Beweglichkeit der Monomere in einer Einzelschicht (genannt die "untere" Einzelschicht) wird durch chemische Quervernetzung in dieser Einzelschicht oder durch Verknüpfung über geeignete Verbindungsgruppen an ein darunter liegendes Substrat oder durch andere Mittel verhindert. Die Monomere in der anderen (genannt "oberen") Einzelschicht können innerhalb der Einzelschicht lateral frei diffundieren und bilden durch Anordnung mit den Monomeren der unteren Schicht durchlässige Kanäle. Mit den Monomeren der oberen Schicht sind Rezeptoranteile verknüpft, die dem Analyten in der löslichen Phase über der Membran zugänglich sind. Diese Rezeptoren können Beliebige aus der Reihe der früher beschriebenen allgemeinen Typen sein, wie beispielsweise polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, einschließlich mindestens eines Fab-Fragments, Antigene, etc. Eine andere Klasse (genannt "komplementär") von Rezeptoranteilen ist ebenfalls mit der Membranoberfläche verknüpft. Diese zweite Klasse von Rezeptoranteilen wird durch eine, bis zur unteren (immobilisierten) Schicht durchgehenden Verknüpfung an ihrer lateralen Beweglichkeit gehindert. Eine Ermittlung des Analyten erfolgt, wenn ein Analytmolekül an seinen komplementären Seiten an zwei Rezeptoren sowohl der mobilen als auch der immobilisierten Klasse gebunden wird. Dadurch wird verhindert, dass das mit einem Rezeptor verknüpfte Gramicidin-Monomer sich selbst mit einem Monomer in der unteren Schicht ausrichtet und damit ein Absenken der elektrischen Leitfähigkeit der Membran bewirkt, welche das Ermittlungsereignis darstellt.
Solche Biosensoren besitzen typischerweise vergleichbare Oberflächenkonzentrationen von mit dem Kanal verknüpften und immobilisierten Rezeptoranteilen. Als solches ist es erforderlich sicherzustellen, dass alle immobilisierten und mobilen Rezeptoren jeweils vom gleichen Typ sind, da eine durch den Analyten hervorgerufene Quervernetzung zwischen mobilen, mit dem Kanal verknüpften Rezeptoren typischerweise nicht zu einer effizienten Ionenkanalbildung führt. Außerdem wird die Ermittlungsempfindlichkeit einer solchen Vorrichtung innerhalb eines geeigneten Zeitraums (etwa 100 Sekunden) durch die bekannte Diffusionsgeschwindigkeitskonstante Kon (etwa 10&sup8; M&supmin;¹s¹) für die Bindung aus einer Lösung unter physiologischen Bedingungen bestimmt. Damit eine signifikante (etwa 50%) Fraktion von Ermittlungsstellen (hier im Sinne von Ionenkanalbildung) besetzt ist, muss die Analytkonzentration c folgender Formel genügen
c > 1/(Kon · 100) (1)
Diese allgemeine Voraussetzung beschränkt alle Ermittlungsvorrichtungen, die unter den obigen Voraussetzungen arbeiten und keine zusätzlichen Mittel der Ermittlungsamplifikation besitzen, und legt ungefähr 10&supmin;¹&sup0; M als Ermittlungsgrenze der Analytkonzentration fest.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden heraus, dass eine Verbesserung der Empfindlichkeit von Membranen zur Verwendung zum Ermitteln des Vorhandenseins eines Analyten durch Erhöhen des Verhältnisses von fixierten Rezeptormolekülen zu mobilen Rezeptormolekülen über ein Verhältnis von 1 : 1 erhalten werden kann.
Dem gemäß besteht die vorliegende Erfindung aus einer Membran zur Verwendung zum Ermitteln des Vorhandenseins eines Analyten, wobei die Membran eine Anordnung eng gepackter selbst-assemblierender amphiphiler Moleküle und eine Vielzahl von ersten und zweiten Rezeptormolekülen aufweist, wobei die ersten Rezeptormoleküle mit einer Seite auf dem Analyten und die zweiten Rezeptormoleküle mit einer anderen Seite des Analyten reaktiv sind, wobei die ersten Rezeptormoleküle an einer lateralen Diffusion innerhalb der Membran gehindert werden, während die zweiten Rezeptormoleküle innerhalb der Membran lateral frei diffundieren können, wobei die Membran dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verhältnis von ersten Rezeptormolekülen zu zweiten Rezeptormolekülen 10 : 1 oder größer ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Verhältnis von ersten Rezeptormolekülen zu zweiten Rezeptormolekülen im Bereich von 10 : 1 bis 10&sup5; : 1 und beträgt vorzugsweise etwa 1.000 : 1.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden die ersten und zweiten Rezeptormoleküle an verschiedene Epitope auf dem Analyten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Membran eine Doppelschicht und beinhaltet eine Vielzahl von Ionophoren, die in einer Schicht erste Halbmembran-überspannende Monomere umfassen und in der anderen Schicht zweite Halbmembran-überspannende Monomere umfassen, wobei die ersten Halbmembran-überspannenden Monomere an einer lateralen Diffusion innerhalb der Membran gehindert sind, während die zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere innerhalb der Membran für eine laterale Diffusion frei sind, wobei die zweiten Rezeptormoleküle so an die zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere gebunden sind, dass das Binden des Analyten an die ersten und zweiten Rezeptormoleküle eine Veränderung der Leitfähigkeit der Membran verursacht.
Die ersten und zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere kann jedes der aus dem Stand der Technik bekannten Moleküle sein, es wird derzeit jedoch bevorzugt, dass die ersten und zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere Gramicidin oder eines seiner Derivate sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Membran membranüberspannende Lipide. Es wird weiters bevorzugt, dass die ersten Rezeptormoleküle mit den membranüberspannenden Lipiden verknüpft sind.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem ein neuartiges Verfahren zum Erhöhen der Anzahl der ersten Rezeptormoleküle durch Verwenden eines losen, mit der Membran verknüpften Polymernetzwerks entwickelt. Demgemäß sind in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lineare Polymerketten mit einem Bewegungsradius von etwa 100 bis 300 Å mit der Oberfläche der Membran verknüpft, wobei die ersten Rezeptormoleküle mit den linearen Polymerketten verknüpft sind.
Die linearen Polymerketten sind vorzugsweise durch geeignet funktionalisierte Lipide in der oberen Schicht an einer oder an zwei Stellen mit der Membran verknüpft. Diese können membranüberspannende Lipide sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt der Bewegungsradius der linearen Polymerketten etwa 200 Å. Alle daraufhin an die Polymerkette gehefteten Antikörper befinden sich innerhalb von zirka 500 Å von der Oberfläche der Membran.
Es ist bevorzugt, dass das Verhältnis von linearen Polymerketten zu Lipiden in der Membran zirka 1 : 10&sup4; ist. Dadurch sollte es auf der Oberfläche der Membran zu einer Verdichtung der Polymere mit "losem Kontakt" kommen, was eine freie Diffusion der ersten Halbmembran-überspannenden Monomere erlaubt.
Die Polymerketten sind vorzugsweise kondensiertes Polyethylenglykol.
Der Bewegungsradius, S&sub0;, ist gegeben durch
= 1/3a²l²n, für eine Kette, die vierflächige Bindungen der Länge 1 enthält, n ist die Anzahl der Bindeglieder und a² ist eine für das Polymer kennzeichnende Konstante. Für PEO (-CH&sub2;-CH&sub2;-O-)ml beträgt die durchschnittliche Länge der -CH&sub2;-CH&sub2;- oder der CH&sub2;-O- Bindungen ~ 1,5 Å und a² ~2.
n = 3 m für PEO (d. h. ~ 3-mal die Anzahl der Monomereinheiten).
Ist S&sub0; ~ 200 Å, dann ist n ~ 25.000 (MW ~ 400.000).
Der mittlere Masseanteil an Polymeren in der 500 Å-dicken Schicht ist ~ 4 · 10&sup5;/6 · 10²³ · (5 · 10&supmin;&sup6;)³ ~ 0,005, d. h. < 1%.
Dies sollte noch immer eine einigermaßen einfache laterale Bewegung der Antikörper- Ionenkanal-Komplexe auf der Oberfläche ermöglichen.
Die sofort verfügbare Form von PEO ist PEG, Polyethylenglykol. OH-CH&sub2;-CH&sub2;-(CH&sub2;- CH&sub2;-O)mCH&sub2;-CH&sub2;-OH. Dieses besitzt an jedem Kettenende Hydroxylgruppen. Daher kann eine Kette mit n ~ 25.000 und ~ 10 operationalen Verknüpfungspunkten zur Membranverankerung oder Antikörperbindung gebildet werden, indem PEG mit kürzeren Ketten (n 2.500) zur Verknüpfung von Antikörpern/Lipiden mit einem geeignet zweifunktionalen (z. B. Dicarboxylsäure) Molekül, das ebenfalls eine Seitenkette (z. B. Hydrazid) enthält, kondensiert wird.
Es ist denkbar, dass für die Verknüpfung von Antikörpern und für Membranverknüpfungslipide eine allgemein gebräuchliche Verknüpfungschemie (z. B. Hydrazinverknüpfung an Aldehyde) verwendet wird. Das Polymer wird zuerst an die Membranoberfläche geheftet (indem es als ~ 1%ige Lösung in Salzlösung zugegeben wird) und der nicht in Reaktion getretene Überschuss entfernt. Dann wird der geeignet aktivierte Antikörper zugegeben und in Reaktion gebracht.
Dieses Verknüpfungsverfahren hat mehrere mögliche Vorteile gegenüber den früher vorgeschlagenen Verfahren zur Verankerung von Proteinen direkt an der Oberfläche durch kurze Verkettung mit membranüberspannenden Lipiden.
1) Die Antikörper besitzen nun eine viel höhere lokale Orientierungsfreiheit für eine Quervernetzungsreaktion. Dies sollte in etwa den Bedingungen entsprechen, wie sie in einem ELISA-Assay erhalten werden. Ist die Dichte des an die innere Schicht gebundenen Gramicidins nicht höher als ~ 1 : 10&sup4;, so sollte das statistische Auftasten durch Torschaltung eines jeden Antikörpers, der durch analytinduzierte Quervernetzung von Kanal und Polymer gebunden wird, noch immer zutreffen. Selbst bei einer Einzelpunktverknüpfung der Polymerketten mit den mobilen Lipiden der oberen Schicht sollte die leicht überlappende Masse von Polymer"kugeln" einer lateralen Beweglichkeit auf einer Längenskala von hunderten Å oder größer widerstehen.
2) Es ist eine wesentlich höhere Oberflächendichte von "immobilisierten" Antikörpern möglich.
3) Das lose, "biokompatible" Polymernetz an der Oberfläche verringert wahrscheinlich ein unspezifisches Binden von Protein an die Membran.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Membran über Verbindungsmoleküle so mit einer Elektrode verknüpft, dass zwischen der Membran und der Elektrode ein Spalt existiert. Bevorzugte Verbindungsmoleküle sind die in Anmeldung Nr. PCT/AU92/00132 und PCT/AU93/00509 offenbarten. Die Offenbarung einer jeden dieser Anwendungen ist hierin durch Hinweis enthalten.
Die ersten Halbmembran-überspannenden Monomere können durch Verwenden einer beliebigen der bekannten Techniken am lateralen Diffundieren in der Membran gehindert werden, es wird jedoch derzeit bevorzugt, dass die ersten Halbmembran-überspannenden Monomere über Verbindungsgruppen mit der Elektrode verknüpft sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein fluoreszierender Quencher mit dem ersten Rezeptormolekül verknüpft, und eine fluoreszierende Spezies ist mit dem zweiten Rezeptormolekül verknüpft.
In einer solchen Anordnung ist die Membran durch die anregende Wellenlänge der fluoreszierenden Spezies illuminiert. Nach Zugabe des Analyten wird der Analyt an die Rezeptoren gebunden. Aufgrund des größeren Anteils an gebundenem ersten Rezeptor ist es wahrscheinlicher, dass der Analyt an das erste Rezeptormolekül bindet. Der mobile, durch die Membran diffundierende Rezeptor kommt dann in Kontakt mit dem an das erste Rezeptormolekül gebundenen Analyten. Dann bindet das zweite Rezeptormolekül an den Analyten und die fluoreszierende Gruppe wird gequenched und die emittierte Fluoreszenz wird schwächer. Durch Verwendung dieses Ansatzes wird das Vorhandensein des Analyten durch ein Schwächerwerden der Fluoreszenz erkannt.
Der Ausdruck "Rezeptormolekül", wie hierin verwendet, wird in seinem weitesten Sinn verwendet. Das Rezeptormolekül kann jede chemische Einheit sein, die zum Binden an den gewünschten Analyten fähig ist. Das Rezeptormolekül ist eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zum Erkennen eines anderen Moleküls fähig ist. Natürliche Rezeptoren beinhalten Antikörper, Enzyme, Lektine, Farbstoffe und dergleichen. Der Rezeptor für ein Antigen ist beispielsweise ein Antikörper, während der Rezeptor für einen Antikörper entweder ein Anti-Antikörper oder vorzugsweise das von diesem speziellen Antikörper erkannte Antigen ist.
Die ersten und zweiten Rezeptormoleküle können dieselben oder unterschiedliche sein, und sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, Fragmenten davon, einschließlich mindestens einem Fab-Fragment, Antigenen, Lektinen, Haptenen und Farbstoffen. Am meisten wird bevorzugt, dass die Rezeptormoleküle Antikörper oder Fragmente davon sind.
Einem Fachmann ist klar, dass die Membran der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Anzahl von Lipiden und Verbindungszusammensetzungen, beschrieben in PCT/AU93/00509, enthalten kann. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen, und die Offenbarung dieser gleichzeitig anhängigen Anmeldung ist hierin durch Hinweis inkorporiert.
Damit das Wesen der vorliegenden Erfindung besser verstanden wird, wird nun eine bevorzugte Form derselben unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel beschrieben.

BEISPIEL

Elektroden:

Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung von Elektroden zur Verwendung in Biosensoranwendungen. Die Elektrode besteht aus einem Glassubstrat und einem gemusterten dünnen unterteilten Goldfilm mit einer Adhäsionsschicht aus Chrom. Die Gegenelektrode ist extern in der Biosensorvertiefung angebracht.
1. Wie unten beschrieben, werden saubere Mikroskop-Objektträger aus Glas verwendet (Lomb Scientific Katalog-Nr. 7101, Maße 26 · 76 · 1,0-1,2 mm). Beim Umgang mit den Objektträgern werden puderfreie Plastikhandschuhe verwendet.
2. Alle Objektträger werden aus der Schachtel, in der sie geliefert werden, genommen und 10 Minuten lang in eine frisch zubereitete Lösung von H&sub2;O&sub2; (1 Vol.) und H&sub2;SO&sub4; (3 Vol.) getaucht.
3. Alle Objektträger werden mit teflonbeschichteten Pinzetten aus der Lösung entfernt, in entionisiertes Wasser getaucht und dann 10 Minuten lang in laufendem entionisiertem Wasser gespült. Danach werden sie in einem Strom aus reinem Stickstoff, der aus der Verdampfungsphase eines Speichertanks für flüssigen Stickstoff stammt, trocken geblasen.
4. Die sauberen Objektträger werden nicht aufbewahrt, sondern sofort in den Verdunstungsapparat gegeben.
5. Die erforderliche Maske für die Musterung der Objektträger wurde gereinigt, indem das gesamte überflüssige Material mit Hilfe des unter Druck stehenden, hoch reinen Stickstoffs wie oben beschrieben weggeblasen wurde.
6. Die gereinigten Glasobjektträger werden innerhalb der lokalisierenden Vertiefungen auf der Maske positioniert, und sowohl Maske als auch Objektträger werden in eine Hochvakuumkammer gegeben.
7. Das Vakuumsystem wird über einen Zeitraum von etwa 45 Minuten auf einen Druck von weniger als 5 · 10&supmin;&sup6; Torr gepumpt.
8. Mit einem elektrischen Heizelement wird 99,9% Chrom von Balzers, Deutschland, aus einem Wolfram-Behälter auf die Glasoberfläche gedampft. Die Stärke der Folie wird gemessen und die abgelagerte Schicht bei einer Endstärke von 20 nm kontrolliert, abgelagert mit einer Geschwindigkeit von 0,1-9,3 nm/s.
9. Mit einem ähnlichen, aber getrennten Wolfram-Behälter, der von dem Chrom- Behälter über einen beweglichen Flügel isoliert ist, wird 99,99% Gold von Johnson Mathey (Australien) Ltd mit 0,1 nm/s bis zu einer Stärke von 100 nM aufgedampft.
10. Die Kammer und die Elektroden können etwa 10 Minuten lang abkühlen und werden dann auf atmosphärischen Druck gebracht, indem Stickstoffgas in die Kammer geleitet wird.
11. Unter nochmaliger Verwendung von puderfreien Handschuhen wird die Maske, welche die sauberen Objektträger enthält, aus der Kammer entnommen, und die Objektträger werden mit Hilfe der teflonbeschichteten Pinzetten von der Maske entfernt und in einen Aufbewahrungsbehälter gegeben oder direkt auf chrombeschichtete Messinganordnungen platziert.
12. Die in die Aufbewahrungsbehälter gegebenen Elektroden werden dann mit Hilfe einer Heißsiegelmaschine in Plastikbehälter mit geringem Anteil an flüchtigen Bestandteilen verpackt, nachdem die Luft aus den Behältern entfernt worden ist.
13. Elektroden sollten innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Präparation verwendet werden.

Material und Methoden:

1. Die oben beschriebenen goldbeschichteten Mikroskopobjektträger aus Glas werden direkt aus dem Verdampfer genommen und in einer chrombeschichteten Messingzwinge befestigt, die 16 Teflonvertiefungen enthält, welche so angeordnet sind, dass jede Vertiefung einen abdichtenden Kontakt mit der Goldoberfläche bildet und den Rückhalt von etwa 200 ul phosphatgepufferter (pH 7,4) Salzlösung über der Gold-Elektrodenoberfläche erlaubt.
2. Vor der Zugabe der Salzlösung wurde eine Reihe von ethanolischen Lösungen in die Vertiefungen und damit auf die frische Goldoberfläche gegeben, um die Membran zu bilden.
3. Während dieser Vorgehensweise wird eine Gesichtsmarke getragen, um eine Kontamination der frischen Goldoberfläche durch den Atem der Bedienungsperson zu vermeiden.
4. Die ethanolischen Lösungen werden in zwei Stufen zugegeben, eine, um eine innere oder "untere" Schicht der Membran zu bilden und die zweite, um die äußere oder "obere" Schicht der Membran zu bilden.

Untere Schicht:

3 ul einer ethanolischen Lösung, enthaltend:
10 mM Glycerinmonophytanyläther (GMPE) (die Synthese dieser Verbindung ist in PCT/AU93/00509 auseinander gesetzt)

Verbindung I (gezeigt in Fig. 1)

1 mM Ditetraethylenglycoldiphytanylbenzyldisulphid (DLP)

Verbindung II (gezeigt in Fig. 2)

0,1, 1,0 & 10 uM membranüberspannende Lipide, verknüpft, mit biotinyliertem Diaminocapryl (MSLXXB)

Verbindung III (gezeigt in Fig. 3)

0,3 mM Mercaptoessigsäuredisulphid (MAAD)

Verbindung IV (gezeigt in Fig. 4)

0,1 uM Ditetraethylenglycol-Gramicidin-Benzyldisulphid (GaYYSSBn)

Verbindung V (gezeigt in Fig. 5)

wird in jede Vertiefung gegeben, unmittelbar gefolgt von der Zugabe von weiteren 20 ul EtOH. Die Elektroden und Lösungen werden 5 Minuten lang inkubiert, zweimal mit destilliertem AR-Ethanol gewaschen und in Parafilm versiegelt bei Raumtemperatur aufbewahn. Diese Aufbewahrungsdauer kann Minuten bis Wochen sein und scheint unwichtig zu sein.

Obere Schicht:

Nach der Aufbewahrung werden 3 ul einer ethanolischen Lösung zugegeben, enthaltend:
28 mM GMPE
0,28 uM biotinyliertes Bis-Diaminocapryl-Gramicidin (Ga6X)

Verbindung VI (gezeigt in Fig. 6)

Die Elektroden werden dann zweimal mit 500 ul 0,1 N phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7; 4, 5 mM PO&sub4;&spplus; aus einer 500 ul-Glasspritze abgespült und die Impedanz der durch diesen Prozess geformten Membran relativ zu einem Silberdraht gemessen, der sich in Kontakt mit der Salzlösung in der 200 ul-Vertiefung über der Elektrode befindet.

Impedanzmessungen:

Die Impedanz wird gemessen unter Verwendung einer Anregungs-Wechselstromspannung von 10-100 mV in einer Reihe von Frequenzen von 1000 Hz bis 0,1 Hz. Das aus diesen Messungen erhaltene Impedanzspektrum wird interpretiert in Bezug auf:
Das Widerstandselement in einem äquivalenten elektrischen Schaltkreis, der einen Kondensator, der die Membran darstellt parallel zu einem Widerstand, der die Ionenkanäle darstellt, enthält, wobei sich beide in Serie mit einem Kondensator befinden, der die Helmholtzkapazität der Elektrode darstellt.
Den Phasenwinkel zwischen der angelegten Spannung und dem resultierenden Stromfluss durch die Membran, welcher zwischen der Goldelektrode und der Referenzelektrode strömt. Der Aspekt der in diesem Zusammenhang angewandten Phasenmessung ist die Frequenz (fmin), bei welcher ein Phasenminimum auftritt und welche die Frequenz angibt, bei der die Membran den größten Widerstand besitzt, und deshalb in ihrer Impedanz von den durchlässigen Ionenkanälen dominiert wird.

Experimentelles:

Impedanzmessungen wurden bei 23ºC mit Gruppen von je 4 Vertiefungen in Blöcken von je 16, die sich eine Goldelektrode teilten, durchgeführt. Die zusammengesetzten Blöcke enthielten den oberen Bereich von gebundenen Rezeptoren (MSLXXB) bei einer gleich bleibenden Konzentration an mobilen Rezeptoren (Ga6XB).
Das Verhältnis von gebundenen/mobilen Rezeptoren, gezeigt in dem beiliegenden Schaubild, betrug 0-1000. Dieses Verhältnis kann aus dem Verhältnis [DLP]/[MSLXXB] berechnet werden mit:
1 mM DLP bis:-
10 uM, 1 uM, 0,1 uM oder 0 uM MSLXXB,
bei Zahlenverhältnissen von
100, 1000, 10.000 & unendlich,
unter der Annahme, dass die Lösungskonzentrationen dieser Spezies auf die Zahlenverhältnisse auf der Goldoberfläche übertragen werden können. Obgleich zwischen den Lösungs- und den Oberflächenwerten quantitative Unterschiede bestehen können, ist der qualitative Trend in Fig. 7 offensichtlich.
Aus den Zahlenverhältnissen der gebundenen Rezeptoren und der bekannten Konzentration der mobilen Rezeptoren der oberen Schicht (1 : 100.000, relativ zu GMPE) kann das Verhältnis von gebundenen/mobilen Rezeptoren geschätzt werden auf:
1000, 100, 10 & 0, respektive. Das Verhältnis der Anzahl an durchlässigen Kanälen vor und nach der Ionenkanalbildung ist in Fig. 7 als Funktion des Verhältnisses von gebundenen/mobilen Rezeptoren gezeigt.
Die Ionenkanalbildung wurde durch Zugabe von 2 ul 0,01 mg/ml Streptavidin direkt in jede Vertiefung erreicht. Nach der Zugabe wurde die Frequenz (fmin), bei der ein Phasenminimum auftrat, beobachtet und das Ionenkanalbildungsverhältnis durch Dividieren von fmin vor der Ionenkanalbildung durch fmin nach Abschluss der Ionenkanalbildung bestimmt.

Vorteile von höheren Verhältnissen von gebundenen/mobilen Spezien

Ein Erhöhen des Verhältnisses von gebundenen/mobilen Rezeptoren verursacht, eine Erhöhung des Verhältnisses der vor und nach der Zugabe von Streptavidin durchlässigen Kanäle. Dies ist auf die höhere Anzahl der gebundenen Rezeptoren zurückzuführen, die eine effektivere Quervernetzung und eine Unterbrechung der Ionenkanäle und deshalb eine empfindlichere Antwort auf den Analyten verursachen.
Dies bedeutet, dass die Erkennungsempfindlichkeit der Vorrichtung mit dem Verhältnis von gebundenem/mobilen Rezeptor ansteigt, da die kleinste zuverlässige und erkennbare Veränderung der Population an durchlässigen Kanälen (etwa 10%) mit kleineren Analytkonzentrationen erreicht wird.

Claims

1. Membran zur Verwendung zum Ermitteln des Vorhandenseins eines Analyten, wobei die Membran eine Anordnung von dicht gepackten selbstassernblierenden amphiphilen Molekülen und eine Vielzahl von ersten und zweiten Rezeptormolekülen aufweist, wobei die ersten Rezeptormoleküle mit einer Seite des Analyten reaktiv sind und die zweiten Rezeptormoleküle mit einer anderen Seite des Analyten reaktiv sind, wobei die ersten Rezeptormoleküle an einer lateralen Diffusion innerhalb der Membran gehindert sind, während die zweiten Rezeptormoleküle innerhalb der Membran lateral frei diffundieren können, wobei die Membran dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verhältnis von ersten Rezeptormolekülen zu zweiten Rezeptormolekülen 10 : 1 oder größer ist.

2. Membran nach Anspruch 1, bei welcher das Verhältnis von ersten Rezeptormolekülen zu zweiten Rezeptormolekülen im Bereich 10 : 1 bis 105 : 1 liegt.

3. Membran nach Anspruch 2, bei welcher das Verhältnis von ersten Rezeptormolekülen zu zweiten Rezeptormolekülen etwa 1.000 : 1 ist.

4. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher die ersten und zweiten Rezeptormoleküle an unterschiedliche Epitope auf dem Analyten binden.

5. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher die Membran eine Doppelschicht ist und eine Vielzahl von Ionophoren beinhaltet, die in einer Schicht erste Halbmembran-überspannende Monomere umfassen und in der anderen Schicht zweite Halbmembran-überspannende Monomere umfassen, wobei die ersten Halbmembran-überspannenden Monomere an einer lateralen Diffusion innerhalb der Membran gehindert sind, während die zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere innerhalb der Membran für eine laterale Diffusion frei sind, wobei die zweiten Rezeptormoleküle so an die zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere gebunden sind, dass das Binden des Analyten an die ersten und zweiten Rezeptormoleküle eine Veränderung der Leitfähigkeit der Membran verursacht.

6. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher die Membran membranüberspannende Lipide beinhaltet.

7. Membran nach Anspruch 6, bei welcher der das erste Rezeptormolekül mit dem membranüberspannenden Lipid verknüpft ist.

8. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher lineare Polymerketten mit einem Drehungsradius von etwa 100 bis etwa 300 Å mit der Oberfläche der Membran verknüpft sind, wobei die ersten Rezeptormoleküle mit den linearen Polymerketten verknüpft sind.

9. Membran nach einem der Ansprüche 4 bis 8, bei welcher die ersten und zweiten Halbmembran-überspannenden Monomere Gramicidin oder Derivate davon sind.

10. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welcher die Membran über Verbindungsmoleküle so mit einer Elektrode verknüpft ist, dass zwischen der Membran und der Elektrode ein Spalt existiert.

11. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der ein fluoreszierender Quencher an das erste Rezeptormolekül angeheftet ist und eine fluoreszierende Spezies mit dem zweiten Rezeptormolekül verknüpft ist.