DE69029060T2

DE69029060T2 - Biosensoren, die elektrische, optische und mechanische Signale verwenden

Info

Publication number: DE69029060T2
Application number: DE69029060T
Authority: DE
Inventors: Hans O Ribi
Original assignee: Biocircuits Corp
Current assignee: Biocircuits Corp
Priority date: 1989-06-15
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2010-06-14
Also published as: JP2874964B2; ATE145064T1; EP0402917A3; EP0402917A2; DE69029060D1; JPH03128449A; CA2019039A1; US5156810A; EP0402917B1

Description

Technisches Gebiet

Das Gebiet des Gegenstandes der Erfindung sind Biosensoren, bei denen elektrisch leitende Polymer-Surfactant-Schichten zur Detektion der Analyte verwendet werden.

Hintergrund

In den letzten zwei Jahrzehnten ist ein zunehmendes Bewußtsein für die Notwendigkeit entstanden, auf die Anwesenheit einer großen Anzahl verschiedener Typen von Analyten zu prüfen, sowie in vielen Fällen in der Lage zu sein, einen bestimmten Analyt quantitativ zu erfassen. Während der 70iger Jahre wurde eine Anzahl verschiedener Chemikalien entwikkelt, um die Notwendigkeit, Radioisotope zu verwenden, zu vermeiden, wobei RIA die erste Technik zur Detektion eines spezifischen Liganden oder Rezeptors war. Eine breite Vielfalt an Labeln ist entwickelt worden, die scheinbar ihren endgültigen Grad an Sensitivität in Verbindung mit den verfügbaren Anleitungen und Instrumentierungen erreicht haben. Während viele Bemühungen auf die Entwicklung von Instrumentierung gerichtet wurden, die eine große Anzahl an Proben in einer im wesentlichen automatisierten Weise behandeln können, ist der Markt für Proben mit geringem Volumen für eine Vielzahl verschiedener Liganden zunehmend expandiert. Für diesen Markt ist es notwendig, in der Lage zu sein, eine umfangreiche Anzahl an Assays für verschiedene Liganden in relativ geringer Anzahl von jedem Liganden und mit einem Minimum an technischer Kompetenz bereitzustellen. Darum sollte die Anleitung zur Herstellung der Probe in vielen Fällen einfach sein und die Vorbehandlung der Probe sollte routinemäßig erfolgen.
Um den zunehmenden Bedarf zur Detektion von Liganden zu decken, wurden zahlreiche Entwicklungen zur Verbesserung der Instrumentierung in Verbindung mit speziellen Chemikalien gemacht. So gibt es eine Anzahl verfügbarer Instrumente, die ausreichend empfindlich sind und einen relativ geringen Anspruch an die technische Kompetenz stelien, und die neueren Instrumentierungen sind weniger kostspielig als frühere Instrumentierungen. Trotzdem bleibt für viele Aspekte des Marktes noch ein bedeutender Bedarf an einer einfachen, effizienten und preiswerten Einrichtung, die eine empfindliche Detektion eines geringen Gehalts an Liganden in einer Vielzahl an Medien ermöglicht.

Relevante Literatur

U.S. Patent No. 4,489,133 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen, die geordnete Arrays von Proteinmolekülen, die an Surfactanten gebunden sind, betreffen. Thomas et al., Electron. Letters (1984) 20:83-84 beschreiben ein GaAs/LB-Film MISS Schaltelement, das ω-Tricosansäure als Surfactant-Doppelschicht zur Herstellung eines dünnen Isolators verwendet. Lochner et al., Phys. Status Solidi (1978) 88:653-661 beschreiben Photoleiffähigkeit in mehrschichtigen Polydiacetylen Strukturen und Einkristallen. Sugi, J. Molecular Electronics (1985) 1:3-17 liefert einen Übersichtsartikel über die Verwendung des Langmuir- Blodgett-Films in der Elektronik. Reynolds, ibid (1986) 2:1-21 beschreibt leitende organische Polymere. Wilson, Electron. Letters (1983)19:237 beschreibt die Prinzipien eines dreidimensionalen molekularen, elektronischen Gedächtnisses unter Verwendung von Polydiacetylenkristallen oder mehrschichtigen Langmuir-Blodgett-Filmen. Zu den Beschreibungen elektronischer Einrichtungen unter Verwendung von geordneten makromolekularen Aggregaten, die durch Surfactant-Schicht Kristallisation gebildet werden, gehören Arrhenius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5355-5359; Haddon und Lamola ibid (1985) 82:1874- 1878; und Paleos, Chem. Soc. Rev. (1985) 14:45-67; Vandevyer et al., J. Chem. Phys. (1987)87:6754-6763; US. Patent No. 4,624,761; Fujiki et al., Amer. Chem. Society (1988) 4:320-326; Biegajski et al., Amer. Chem. Society (1988) 4:689-693; Pecherz et al., Journal of Molecular Electronics (1987) 3:129-133; Lando et al., Synthetic Metals (1984) 9:317-327; Day et al., Journal of Applied Polymer Science (1981) 26:1605-1612; Shutt et al., Amer. Cem. Society (1987) 3:460-467; Dhindsa et al., Thin Solid Films (1988)165: L97-L100; Metzger et al., Amer. Chem. Society (1988) 4:298-304; Fujiki et al., Amer. Chem. Society (1988) 4:320-326; Wohltjen et al., IEEE Transactions on Electron. Devices (1985) 32:1170- 1174; Wernet et al., Semiconducting L-B Films (1984) 5:157-164; Sugi et al., Thin Solid Films (1987) 152:305-326; Peterson, Journal of Molecular Electronics (1986) 2:95-99. Zu den Beschreibungen von Verfahren zur Immobilisierung biologischer Makromoleküle an polymerisierten Surfactant-Filmen gehören: O'Shannessey et al., J. Appl. Biochem. (1985) 7:347-355; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; Packard et al., Biochem. (1986) 25:3548-3552; Laguzza et al., J. Med. Chem. (1989) 32:548-555; Jimbo et al., Journal of Molecular Electronics (1988) 4:111-118; Hanifeld, Science (1987) 236:450-453; Goundalkar, Communications (1984) 36:465-466; Cress et al., Amer. Biotec. Lab. (Februar 1989)16-20. Biosensoren, die Surfactant-Schichtkristallisation verwenden, sind von Owen, Ann. Clin. Biochem. (1985) 22:555-564 und Thompson und Krull, Trends in Anal. Chem. (1984) 3(7):173- 178 beschrieben. Bader et al., Advances in Polymer Sci. (1985) 64:1-62 beschreiben polymere Monoschichten in Liposomen als Modelle für Biomembranen.
EP-A 0 274 824 offenbart Gegenstände, zu denen eine polymerisierte Surfactant-Schicht und eine Proteinschicht, die an die Surfactant-Schicht gebunden ist, gehören. Dieses Zitat enthält eine Bemerkung, daß diese Gegenstände in elektronischen Einrichtungen verwendet werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden Biosensoren bereitgestellt, die ein elektrisch inertes Substrat, eine elektrisch leitende Surfactant-Schicht und an die Surfactant-Schicht gebundene Elemente eines spezifischen Bindungspaares aufweisen. Die Elemente des spezifischen Bindungspaares können als eine einheitlich orientierte Schicht vorliegen. Analyte werden durch Binden an die gebundenen spezifischen Bindungspaarelemente detektiert, was zu einer Änderung des elektrischen Signals, der Lichtmodulation oder strukturellen Modulation als Folge einer Veränderung in der Surfactant-Schicht führt. Spezifische Verfahren der Herstellung und Anwendung werden für den Biosensor beschrieben.
Ein Verfahren gemäß der Erfindung zum Detektieren eines Analyten in einem Probemedium verwendet einen Biosensor nach Anspruch 1 und weist die folgenden Schritte auf:
Hinzufügen eines Probenmediums, das im Verdacht steht, einen Analyten zu enthalten, der das komplementäre Element des spezifischen Bindungspaares ist, zu der organischen Molekülschicht unter der Bedingung, daß das Binden des Analyten an die organische Molekülschicht in einer Störung der polymerisierten Surfactant-Schicht resultiert oder ein Reagenz hinzugefügt wird, das an den Analyt oder die organische Molekülschicht proportional zu der Menge von Analyt in dem Probenmedium bindet und eine Störung in der polymerisierten Sufactant-Schicht bewirkt, wobei diese Störung in einer Veränderung der elektrischen oder optischen Eigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht resultiert; und Detektieren der Veränderung der elektrischen oder optischen Eigenschaften der polymensierten Surfactant-Schicht als Indikator der Gegenwart des Analyten in dem Probenmedium.
Das verwendete Reagenz bei diesem Verfahren können Partikel sein, die eine Mehrzahl von mit dem Analyt kreuzreaktiven Molekülen aufweisen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines Verfahrens zur Herstellung eines Biosensors; und
Fig. 2 ist ein Diagramm eines Stromkreises und Biosensors.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Biosensoreinrichtungen und mit derartigen Einrichtungen verbundene Zusammensetzungen werden zur Detektion von Analyten bereitgestellt. Die Biosensoren weisen ein festes Substrat auf, auf dem ein hochgradig orientierter Surfactant-Film gebildet wird, der als Folge einer Polymerisation mehrfach ungesättigter Gruppen im Surfactant elektrisch leitend ist. Mit den Surfactant-Molekülen verbunden und distal zum Substrat befinden sich Elemente eines spezifischen Bindungspaares, das direkt oder indirekt mit dem interessierenden Analyt wechselwirkt. Das Binden des interessierenden Analyten stört die Surfactant-Schicht und ermäglicht so die Detektion der Anwesenheit des Analyten durch eine Änderung eines elektrischen, strukturellen oder Lichtsignals. Obwohl keine Beschränkung auf irgendeine Theorie gewünscht wird, scheint es, als ob eine Konformationsänderung der Surfactant-Schicht auftritt.
Die an die Surfactant-Schicht gebundenen Elemente können eine einheitlich orientierte Schicht sein, in der die Moleküle im wesentlichen benachbart, wenn nicht sogar kristallin, sind oder sie können getrennt sein, um eine nicht-kontinuierliche Schicht zu bilden, so lange das Binden des Analyten an die spezifischen Bindungselemente eine Veränderung in der Surfactant-Schicht liefert, die eine Detektion der Gegenwart des Analyten ermöglicht.
Abhängig von der bestimmten Anleitung kann das Substrat viele verschiedene Formen annehmen. Das Substrat kann eine halbleitende Schicht aufweisen, die die Detektion von Photonen ermöglicht. Die halbleitende Schicht wird gewöhnlich von der Surfactant-Schicht durch eine transparente Schicht getrennt sein. Diese transparente Schicht kann allein als Träger für die Surfactant-Schicht und Trennung zwischen der Surfactant-Schicht und der halbleitenden Schicht, als ein Filter, um den Wellenlängenbereich des Lichtes, das durch das Substrat tritt, zu begrenzen, oder dergleichen dienen. Das Substrat kann ein reflektierendes Substrat sein, das die Reflektion des Lichtes durch die Surfactant-Schicht auf die Substratoberfläche und dann zurück durch die Surfactant-Schicht ermöglicht. In einer anderen Ausführungsform kann das Substrat allein als elektrisch isolierender Träger für die Surfactant-Schicht dienen, der einen Schutz und mechanische Festigkeit für die Surfactant- Schicht bereitstellt.
Verschiedene Substrate können verwendet werden, insbesondere isolierende Materialien. Das Substrat muß inert sein und gute elektrisch isolierende Eigenschaften haben. Es sollte auf molekularer Ebene weich sein und gute Anlagerungsseigenschaften haben. Das einsatzbereite Substrat muß zugänglich und preiswert sein. Vormarkieren und in Würfel schneiden könnte notwendig sein, um das Gerät herzustellen. Das Substrat kann aus verschiedenen Materialien hergestellt sein, z.B. Glas, Kunststoff, Silizium, Kohlenwasserstoffen, Wachs, alkylierten Oberflächen oder dergleichen. Die Materialien der Wahl sind Gläser oder Polymere mit hohem elektrischen Widerstand. Zu den Gläsern gehören Borsilikate, Gläser geringer Expansion, wie Corning Nr.7095, Tempax und andere Gläser mit hohem Widerstand. Eine breite Vielfalt organischer Polymere kann verwendet werden, insbesondere Polymere aus Kohlenwasserstoffen, wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol usw. oder kondensierte Polymere, wie Polyterephthalat, Polyacrylat, Polyformaldehyd oder dergleichen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Träger oder das Substrat transparent und die gegenüberliegende zweite Fläche reflektierend.
Die Dicke des Substrats kann breit variieren, abhängig von der absoluten Anzahl an Schichten und deren Dicke und Beschaffenheit, der Struktur des Biosensorchipelements, der Architektur und dergleichen. Gewöhnlich wird die Dicke mindestens ungefähr 0,127 mm (5 Tausendstel Inch) und nicht mehr als ungefähr 12,7 mm (500 Tausendstel Inch) betragen, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 2,54 mm (100 Tausendstel Inch). Die besondere Dicke wird jedoch gewöhnlich nicht kritisch sein, so lange sie nicht mit der Arbeitsweise des Chips überlagert und den gewünschten strukturellen Träger bereitstellt. Die Oberfläche des Substrats, die zum Aufnehmen der Surfactant-Schicht dient und in Kontakt mit der Surfactant-Schicht sein wird, sollte sauber und frei von Dreck und Staub sein, um ein Minimum an Unvollkommenheiten bei der Bildung der Schicht zu erhalten. Für das Transferieren des polymerisierten Surfactant-Films auf das Substrat durch Aufbringen der hydrophoben Oberfläche des Films auf das Substrat ist es erforderlich, daß das Substrat hydrophob gemacht wird. Ein Verfahren, Glas hydrophob zu machen, verwendet die Alkylierung. Ein Beispiel für die Alkylierung ist die Verwendung einer 5% Lösung eines alkylierenden Mittels in Hexan. Das Mittel kann eine Kohlenstoffkette von 1-50 Kohlenstoffatomen sein, gewöhnlich 1-18, die eine Methylalkylhalogenidsilangruppe enthält. Zum Beispiel kann Dimethyloctadecylchlorsilan verwendet werden. Nach dem Eintauchen und Lufttrocknen wird das Glas mehrere Male in Chloroform gewaschen, luftgetrocknet, für mehrere Minuten in hochgradig reinem Wasser gespült und dann wieder luftgetrocknet. Die Reinigungsschritte können mehrere Male wiederholt werden.
Surfactant-Filme werden auf der Oberfläche einer wäßrigen Subphase mit Standard-Lipid- Monoschicht-Techniken gebildet. Eine Lösung, die eine in einem organischen Lösungsmittel gelöste monomere Surfactant-Zusammensetzung enthält, wird auf die Oberfläche der Subphase durch eine Mikropipette aufgetragen. Zu den Lösungsmitteln können Kohlenwasserstoffe wie Pentan, Hexan, Heptan und Dekan gehören. Die Kohlenwasserstoffe können geradkettig, verzweigt oder ungesättigt sein. Zu den Lösungsmitteln können chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Mono-V Di-, Tri- oder Tetrachlormethan gehören. Die Zugabe von polareren Lösungsmitteln wie von Alkoholen, Furanen, Ethern, Estern oder dergleichen kann hinzugenommen werden, um die Löslichkeit der Surfactant-Zusammensetzung zu verstärken.
Die Zusammensetzung der Subphase gibt die physikalischen Eigenschaften der Surfactant- Schicht, die gebildet wird, vor. Die Subphase kann aus reinem Wasser, Glycerin, Polyethylenglykol oder anderen polaren organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, wozu DMF, DMSO, Aceton, Alkohole, Ketone, Furane, Dioxan, Ethanolamin, Phenole, allein oder in Kombination, oder dergleichen gehört, bestehen. Lösungsmittel mit hohem Siedepunkt, wie Glycerin, werden das Verdampfen während des Erhitzens verhindern, wogegen Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt das Verdampfen verstärken werden. Andere organische Lösungsmittel können verwendet werden, um den Surfactant-Film zu stabilisieren, insbesondere solche, die vorzugsweise mit den polaren Kopfgruppen, Linkern und Liganden des Surfactanten wechselwirken. Die Subphase kann auch organische oder anorganische Säuren oder Basen enthalten, die durch ionische Wechselwirkungen auf den Sufactant-Film wirken, d.h. Ladungsstabilisierung. Zu den ionischen Komponenten können mono- und polyvalente Ionen und Kationen und Mono- und Oligosaccharide gehören.
Monomere polymerisierbare Surfactanten werden auf der Subphase in einer Konzentration, die von 0,01 bis 50 Milligramm/Millimeter des Spreitungs-Lösungsmittels reicht, gespreitet. Typischerweise sind 0,1 bis 1,0 Milligramm/Millimeter am gebräuchlichsten. Filme werden gewöhnlich mit einem Gemisch aus polymerisierbaren Surfactanten, zu denen mit Liganden verbunde Sufactanten gehören, und Füllsurfactanten, an die keine Liganden gebunden sind, gebildet. Die polymerisierbare Einheit des Füllsurfactanten ist typischerweise ähnlich oder identisch mit der der Liganden enthaltenden Surfactanten. Der Füllsurfactant kann alle chemischen Eigenschaften des Liganden-Surfactanten haben. Er sollte polare Kopfgruppen haben, die biologisch inert und elastisch gegenüber nicht spezifischen Bindungen sind. Zum Beispiel kann der Füllsurfactant eine Hydroxyl-, Polyhydroxyl- oder Polyethylenoxidkopfgruppe haben, die so wirkt, daß sie nicht spezifisches Anlagern von biologischer Materie verhindert. Das Fülllipid kann auch einen Chromophor enthalten zur Verstärkung der optischen Visualisierung des Films und um das photoelektrische Einbringen von Licht zu verstärken. Der Mol-Prozentsatz der Integration des Liganden-Surfactanten gegenüber dem Füllsurfactanten spielt eine Rolle in der Trägermatrix. Er beträgt im allgemein von 0,01 bis 90%, eher üblich von 0,1-10%, und liegt gewöhnlich im Bereich von 1,0 bis 5%. Die Zusammensetzung der polaren Kopfgruppen des Fülllipids kann die spezifische Bindung des biologischen Materials modulieren. Sterische Verschiebung kann die Proteinbindung verstärken und sterische Hinderung kann die Proteinbindung inhibieren. Die Zusammensetzung der polaren Kopfgruppe des Fülllipids kann so einen Kontrollmechanismus zum Regulieren der Bindungsaffinitäten und Wechselwirkungen bereitstellen.
Zur Filmbildung gehört die Anwendung einer Subphase auf eine Oberfläche oder Vertiefung. Eine den monomeren Surfactant enthaltende Lösung wird auf die Subphasenoberfläche aufgetragen, bis die Oberfläche im wesentlichen gesättigt ist. Getrocknete Inseln des Surfactanten werden normalerweise offensichtlich. Das wäßrige Medium wird dann erhitzt, um den Surfactant zu schmelzen, gewöhnlich auf eine Temperatur von nicht mehr als ungefähr 100ºC, was zu einem Verschwinden der Inseln führt. Wenn sich die Inseln gelöst haben, läßt man das Medium auf Raumtemperatur abkühlen, gefolgt von weiterem Kühlen unter Raumtemperatur, gewöhnlich auf ungefähr 2ºC. Die Bildung von Filmen hoher Qualität erfordert, daß der monomere Surfactant hochgradig kristallin am Gas/Subphase-Interface ist. Kristalline Filme bestehen häufig aus dicht gepackten Einkristalldomänen. Große Domänen sind für das Herstellungsverfahren wünschenswert. Faktoren, von denen gefunden wurde, daß sie die Domänengröße beeinflussen, sind die Kristallisationstemperatur, die Zusammensetzung des Spreitungslösungsmittels und die Menge an Spreitungslösungsmittel. Das Kristallwachstum kann durch Verwendung einer Anzahl an Verfahren eingeleitet und kontrolliert werden, wie dem Zonenschmelzen, anschließendem Filmdruck, Kristall-Retemper-Verfahren, ortsspezifischer Keimbildung, der Verwendung von Impfkristallen, kontrollierten atmosphärischen Bedingungen, epitaaxialen Kristallisation, Variation der Zusammensetzung der Subphase oder dergleichen. Keime für große Einkristalle können durch anfängliches Kristallisieren eines Surfactant-Films und anschließendes Bestrahlen eines engen Bereichs des Films unter Verwendung einer intensiven UV-Laser-Quelle gebildet werden. Wenn die Temperatur der Subphase über die Surfactant-Schmelztemperatur angehoben wird, werden die nicht polymerisierten Bereiche des Films flüssig. Wenn die Subphase unter den Schmelzübergang des Surfactanten zurückgekühlt wird, bilden sich Kristallkeime der Monomeren aus dem kristallinen Polymerbereich.
Der Surfactant wid dann unter Verwendung irgendeines zweckmäßigen initiierenden Systems, z.B. ultraviolettem Licht, polymerisiert. Zu anderen inituerenden Systemen gehören Kombinationen aus Licht und lichtempfindlichen Initiatoren, hitzeunbeständige chemische Initiatoren oder dergleichen. Derartige Initiatoren sind allgemein bekannt und müssen hier nicht beschrieben werden. Die Aktivierung wird beibehalten, bis zumindest im wesentlichen vollständige Polymerisation erreicht ist. Polymerisation kann auch unter Verwendung von hochenergetischem Licht, wozu Elektronenstrahlen, Röntgenquellen und andere Synchrotronstrahlung gehören, durchgeführt werden. Ein Verfahren zur Polymerisation schließt örtlich lokalisierte Polymerisierung unter Verwendung von fokussiertem Laserlicht und einem XY-kontrollierten Stellwerk mit ein, mit dem Ziel, Muster von Stromkreisen in den Film zu prägen (Ogawa et al., Langmuir (1988) 4:195).
Die Filmqualität kann optisch unter Verwendung von Verfahren wie der Polarisations- Doppelbrechung, lateralen Diffusionstechniken, wozu lateraler Filmdruck gehört, oder Fluoreszenzmessungen, wie der Wiederherstellung der Fluoreszenz nach Photobleichen, kontrolliert werden. Filme werden auf Defekte, Kristalldomänengröße und -form und Integrität geprüft. Zu den Defekten gehören Punktdefekte, Stufendefekte, Brüche und Frakturen. Die Kristalldomänengröße und -form wird durch verschiedene Kristallmerkmale wie dem Dendritenmuster, großen intakten defektfreien Domänen, kristalliner Kompaktheit und kristalliner Orientierung charakterisiert. Der Film kann auf verschiedene Substrate zur Herstellung des Biosensors transferiert werden. Transfer wird durch Anwendung von Standard-Langmuir- Blodgett Verfahren erreicht [George L. Gaines Jr.: Insoluble Monolayers at Liquid Gas Interfaces, Interscience Publishers, I. Prigogine Editor, John Wiley and Sons (1964)].
Das Substrat mit den Elektroden an der Oberfläche wird so in Kontakt mit dem Polymerfilm plaziert, daß die hydrophobe Oberfläche des Substrats mit der hydrophoben Oberfläche des polymerisierten Sufactant-Films wechselwirkt. Ein guter Kontakt zwischen dem Substrat und dem Surfactant-Film führt zu einem stabilen Komplex. Der Transfer kann durch vertikales Eintauchen des Substrates durch die Subphasenoberfläche stattfinden oder indem das Substrat horizontal von oben auf die Subphasenoberfläche plaziert wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Surfactant-Film so transferiert werden, daß seine hydrophile Oberfläche in engen Kontakt zu einem hydrophilen Substrat plaziert wird. Diese Annäherung erfordert, daß das Substrat von unterhalb der Subphasenoberfläche angehoben wird und so herausgezogen wird, daß der Film das Substrat bedeckt. Multischichten des Polymerfilms können auf dem Substrat für verschiedene Zwecke abgeschieden werden, bspw. Filme für nichtlineare optische Einrichtungen gehören, zunehmende elektrische Leiffähigkeit durch viele Filme und der Aufbau von komplexen Schichten aus Proteinfilmen und Surfactant- Filmen für molekulare elektronische Einrichtungen.
Die polymerisierbaren Surfactanten sind früher ausführlich in der Literatur beschrieben worden, wie es aus dem beschriebenen Stand der Technik hervorgeht. Die Zusammensetzung der Surfactant-Schicht kann homogen sein, wobei der Surfactant polymierisierbar ist und ein polares Ende hat, das als Ligand für ein komplementär bindendes Protein dient, oder heterogen, wobei ein Gemisch von Surfactanten verwendet wird, von denen einige polymerisierbar und andere nicht polymerisierbar sind. Die polymerisierbaren und/oder die nicht polymerisierbaren Surfactanten können der Ort für die Bindung zu einem Liganden sein.
Das Surfactant-Molekül kann eine einzelne Lipidkette z.B. eine Diynsäure (diynoic acid) aufweisen oder eine Vielzahl an Lipidketten, z.B. Diesterglyceride, vorzugsweise eine einzelne Kette und im allgemeinen nicht mehr als zwei Lipidketten.
Zu den beispielhaften Surfactanten gehören 6,8-Hexadecadiynsäure, 2-Hydroxyethyloctadeca-8-10-diynoat, Eicosa-12,14-diynyl-10,12-phosphatidylserin, Pentaeicosa-10,12- diynsäure, Tricosa-10,12-diynsäure, Acetylenverbindungen mit mehreren Diyngruppen und andere Polymersurfactanten, einschließlich polymerisierbarer Surfactanten mit einzelner Acylkette.
Verschiedene andere Surfactanten können als Verdünner für den polymerisierbaren Surfactant anwesend sein. Diese Surfactanten können natürlich vorkommen, synthetisch oder Kombinationen davon sein und können durch Laurat, Stearat, Arachidonat, Cholesterin, Gallensäuren, Ganglioside, Sphingomyeline, Cerebroside oder dergleichen illustriert werden. Verschiedene funktionelle Gruppen können in dem Film anwesend sein, um für die Polymerisation bereitzustehen und einen Elektronentransfer zu ermöglichen. Für den größten Teil werden die funktionellen Gruppen Monoyne und Diyne aufweisen, obwohl auch andere polyungesättigte Moleküle Verwendung finden können, wie aktivierte Monoyne z.B. α-Ketomonoyn.
Meistens wird der hydrophobe Anteil des Surfactanten eine Kette von mindestens 6 aliphatischen Kohlenstoffatomen, gewöhnlich eine gerade Kette von mindestens 6 aliphatischen Kohlenstoffatomen und im allgemeinen nicht mehr als insgesamt ungefähr 100 Kohlenstoffatome, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 30 Kohlenstoffatome aufweisen. Vorzugsweise wird die Anzahl an Kohlenstoffatomen von ungefähr 12 bis 26, mehr üblich von 14 bis 26 und am meisten bevorzugt von 16 bis 24 Kohlenstoffatomen variieren. Die organische polymerisierte Surfactant-Schicht kann Surfactanteinheiten von mindestens 12 Kohlenstoffatomen aufweisen und kann eine im wesentlichen orientierte Proteinschicht sein.
An den Kohlenwasserstoffen können fluoreszierende Farbstoffe, Elektronendonor- oder - akzeptorgruppen und Gruppen, die die Polymerkette dotieren, damit die elektrische Leitfähigkeit zunimmt, befestigt sein. Mit dem Ziel, die Filmstabilität zu verstärken, kann die Kohlenwasserstoffkette fluoriert oder mono- oder polyhalogeniert werden. Es ist bekannt, daß die Halogenierung die Packung der Kohlenwasserstoffketten beeinflußt und den Schmelzübergang des Films erhöht.
Die Lipidmoleküle werden mit einer hydrophilen Einheit enden, kationisch, anionisch oder neutral (nicht ionisch), wobei zu den funktionelle Gruppen nicht-oxo-Carbonylgruppen, z.B.
Carbonsäuren, Ester und Amide, oxo-Carbonylgruppen, wie Aldehyde und Ketone, Oxygruppen, wie Ether, Polyether, und Hydroxylgruppen, Aminogruppen wie primäre, sekundäre und tertiäre Amine und Ammonium, Phosphorsäureester und -amide wie Phosphat, Phosphonat und Phosphonamid und funktionelle Schwefelgruppen wie Thioether, Sulfonate, Sulfate und Sulfonamide und dergleichen gehören. Zu den hydrophilen Gruppen können Arzneimittel oder Chromophore gehören. Gewöhnlich wird die polymerisierbare funktionelle Gruppe von den polaren und nicht polaren Enden durch wenigstens ein Kohlenstoffatom getrennt sein, im allgemeinen von ungefähr 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, mehr üblich von ungefähr 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. Die polymerisierbare Gruppe ist typischerweise in das hydrophobe Innere des Surfactant-Films eingegliedert. Zu den Beispielen für polymerisierte Gruppen gehören Polypyrrol, Polyamine, Polythiophen, Poly(isothianaphthen), Poly(alkylthiophen), Polydiacetylen, Polyacetylen oder dergleichen. Diacetylengruppen können auch in die Kohlenwasserstoffkette des Surfactanten eingegliedert sein, so daß mehr als eine Gruppe zur Polymerisation anwesend ist. Indem zwei oder mehr polymerisierbare Gruppen in der Surfactantkette vorliegen, kann eine Vielfalt elektrisch leitender Polymere erhalten werden. Diese Konfiguration führt zu Filmen mit höherer Leitfähigkeit und mechanischer Festigkeit. Die individuellen polymerisierbaren Gruppen können in regulären Intervallen von 1-50 Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sein, typischerweise 2-10 Kohlenstoffatome. Es können so viele von diesen Gruppen in der Kette vorhanden sein, wie ihre Länge zuläßt. Variationen der Kopfgruppe stellen verbesserte Filmqualitäten bereit, wie Stabilität des Films, Oberflächenladung, Verminderung von nicht spezifischen Bindungen oder Flüssigmatrixeffekten und Erleichterung der chemischen Modifikationen. Der Kohlenwasserstoffschwanz des Surfactanten kann auch mit einer hydrophilen Gruppe enden, so daß der Surfactant bipolar ist [Sher, Justus Liebigs Ann. Chem. (1954) 589:234 und Akimoto et al., Angew. Chem. (1981) 20(1):91].
Abhängig von der gewünschten Dichte an Liganden, die an den Surfactant gebunden sind, kann der Ligand in von ungefähr 1 bis 100 Mol% des Surfactanten, mehr üblich wenigstens ungefähr 5 Mol% und vorzugsweise wenigstens ungefähr 20 Mol%, im allgemeinen nicht mehr als ungefähr 80 Mol%, anwesend sein. Das Molverhältnis wird von der Größe und Art des Liganden abhängen, ob aneinandergrenzende Liganden in der Schicht gewünscht sind und dergleichen. Die Liganden können durch irgendeine geeignete funktionelle Gruppe angefügt werden, wozu Ester, z.B. Carboxylat und Phosphat V Ether, entweder Oxy- oder Thioether, Aminogruppen, zu denen Ammonium, Hydrazine, Amide, wie Carbonsäureamid, Sulfonamid oder Phosphoramid, Kombinationen davon oder dergleichen gehören. Zu den spezifischen Gruppen können Saccharide, sowohl Mono- als auch Polysaccharide, gehören, einschließlich Aminosacchariden, Carboxysacchariden, reduzierten Sacchariden oder dergleichen. Zu den spezifischen Gruppen gehören Zwitterionen, z.B. Betaine, Zucker, wie Glucose, Glucuronsäure, β-Galactosamin, Sialinsäure usw., Phosphatidylester, wie Phosphatidyl-Glycerin-Serin, Inosit usw.
Der Ligand kann irgendein kleines Molekül sein, das eine reaktive Gruppe enthält. Typische Liganden können Biotin, Arzneimittel wie Alkabide, Antigene, Polysaccharide, Polypeptide, Polynukleotide, ionische Gruppen, polymerisierbare Gruppen, Linker-Gruppen, Elektronendonor- oder Akzeptorgruppen, hydrophobe Gruppen oder hydrophile Gruppen sein. Der Ligand kann auch als eine Stelle dienen, die weiter chemisch modifiziert werden kann, um neue physikalische Merkmale oder Filmeigenschaften hervorzubringen.
Der Ligand kann auch eine photoaktivierbare oder photospaltbare Gruppe sein und in diesem Fall werden die Möglichkeit für Biosensoren für Testfelder sehr attraktiv. Unter Verwendung von Photoaktivierung oder Photospaltung und Maskierung kann man selekti, verschiedene Rezeptoren, Antikörper, Arzneimittel oder dergleichen an den gleichen Biosensor binden, was enorme Vorteile für Testfelder oder ein Screening darstellt. Einige der Vorteile wären die Erleichterung des Screening durch simultanes Prüfen ohne zusätzliche Schritte und Kosten. Diese Felder könnten in der Forschung oder in der Industrie zum Püfen auf Rezeptoren, zum Screening monoklonaler Antikörper, zum Entdecken therapeutischer Arzneimittel, in der Diagnostik zum Screening auf Krebs, zum Prüfen auf Arzneimittelmißbrauch oder auf therapeutische Arzneimittel, Infektionen der Harnwege und zum Prüfen auf sexuell übertragbare Krankheiten verwendet werden. Der Biosensor kann auch für Umweltprüfungen, in der Lebensmittelindustrie und dergleichen verwendet werden. Ein wiederverwertbares Biosensorfeld könnte in ein Durchfluß-Cytometrie-Instrument oder ein anderes derartiges Instrument eingegliedert werden.
Die Gegenstände dieser Erfindungen können zum größten Teil hergestellt werden, indem konventionelle Techniken unter Verwendung besonderer Bedingungen, um die gewünschten Schichten zu erhalten, angewendet werden. Für den größten Teil werden Langmuir-Blodgett Techniken angewendet, wie in den vorstehend zitierten Referenzen beschrieben. Beim Anwenden der erfindungsgemäßen Verfahren sollte dem experimentellen Teil als Anleitung zu dem besonderen Bereich Aufmerksamkeit geschenkt werden, der für das gewünschte Ergebnis mit irgendwelchen besonderen Parametern verwendete werden sollte.
Eine große Anzahl von Parametern ist verfügbar, die verwendet werden können, um die Art des Produktes zu beeinflussen. Zu diesen Parametern gehören der Puffer, einschließlich des pH-Wertes, die Ionenstärke, die verwendeten Kationen, z.B. mono- oder polyvalent, die Zusammensetzung des Surfactanten, sowohl die des polymerisierbaren Surfactanten als auch die des nicht-polymerisierbaren Surfactanten, einschließlich Betrachtungen hinsichtlich der Kettenlänge, des Statuses der polymerisierbaren funktionellen Gruppen, der Art der polymerisierbaren funktionellen Gruppe als auch der Art der polaren Kopfgruppen gehören; die Art, in der die Surfactant-Schicht gebildet wird, wozu die Konzentration von Surfactanten und Lösungsmittel , die Art des Lösungsmittels, das Spreitungsverfahren und die Menge des verwendeten Surfactanten, die die Bildung von multilamellären Schichten beeinflußt, gehören; und physikalische Parameter, wie die Filmspannung, Kristallisationszeit, Temperatur, Feuchtigkeit, E-(elektrisches) Feld und M-(magnetisches) Feld (Protein Dipolmoment).
Die Liganden, die kovalent an den Surfactant gebunden sind, werden normalerweise ein Element eines spezifischen Bindungspaares sein. So können die Liganden breit variiert werden, die gewöhnlich Moleküle von weniger als ungefähr 2 kD sind, mehr üblich weniger als ungefähr 1 kD. Für den größten Teil wird angenommen, daß die Liganden haptenisch sind, wozu kleine organische Moleküle gehören können, einschließlich Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Sacchariden oder Oligosacchariden oder dergleichen. Trotzdem kann der an den Surfactant gebundene Ligand in machen Fällen ein Makromolekül sein, das gewöhnlich ungefähr 500 kD nicht übersteigt, mehr üblich ungefähr 200 kD nicht übersteigt. So können Proteine, Nucleinsäuren oder andere polymere oder nicht polymere Verbindungen mit hohem Molekulargewicht auch verwendet werden. Es besteht auch die Möglichkeit, Kronenether, die an besondere Ionen binden, zu verwenden. Die besondere Art, in der ein oder mehrere Surfactanten an den Liganden gebunden sein können, ist bei dieser Erfindung nicht kritisch und wird zum größten Teil von der Zweckmäßigkeit, Leichtigkeit der Synthese, Stabilität, von den zugänglichen funktionellen Gruppen und dergleichen abhängen. Synthetische makrocyclische Komplexe können in die Surfactant-Schicht mit dem Ziel der molekularen Wiedererkennung verschiedenster natürlicher und nicht natürlicher Verbindungen eingegliedert werden.
Der Ligand kann ein Molekül sein, das eine kovalente Bindung zu einem anderen Molekül bereitstellen kann. Carboxygruppen können mit Carbodiimid aktiviert werden, um mit Alkoholen, Phenolen und Ammen zu reagieren. Hydrazine können mit Carbonsäuren, Ketonen und Aldehyden, besonders unter reduzierenden Bedingungen, reagieren. Thiole können mit aktivierten Olefinen reagieren, wie Maleinimid, Acrylaten usw. oder aktivierten Halogeniden, z.B. α-Chloroacetyl, und dergleichen. Für eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung können einige Enzymsubstrate, Inhibitoren oder Suicidinhibitoren mit dem komplementären Enzym verwendet werden.
In vielen Fällen werden besondere Liganden für eine Vielzahl an Zwecken verwendet. Zum Beispiel wird Biotin verwendet, um Avidin oder Streptavidin zu binden, wobei das komplementäre Element dann verwendet werden kann, um eine breite Vielfalt anderer Moleküle anzubinden. Verschiedene Lectine können verwendet werden, um eine Vielfalt an Zuckern zu binden, die an interessierenden Molekülen festgemacht sein können. Spezifische Liganden können verwendet werden, die an komplementäre Rezeptoren binden, wie Rezeptoren der Oberflächenmembran, lösliche Rezeptoren oder dergleichen.
Von besonderem Interesse ist die Bindung eines Rezeptors, entweder direkt oder indirekt, an den Surfactant. Direkte Bindungen sind gewöhnlich kovalent, während indirekte Bindungen gewöhnlich nicht kovalent sein werden. Rezeptoren von besonderem Interesse werden Antikörper sein, zu denen IgA, IgD, IgE, IgG und IgM gehören, die monoklonal oder polyklonal sein können. Die Antikörper können intakt sein, ihre Schwefelwasserstoffbrücken können ganz oder teilweise gespalten sein, sie können zu Fab&sub2; oder Fab fragmentiert sein oder dergleichen. Die intakten und vollständig gespaltenen Antikörper können verwendet werden, um ein rekombinantes Protein-A-Antikörperhybrid herzustellen, um in die Probe eingebaut bzw. eingegliedert zu werden. Kopplung durch die Oligosaccharideinheit der Antikörper an Hydrazine kann mit dem intakten, teilweise und vollständig gespaltenen Antikörper erzielt werden. Maleinimid-Kopplungen des Maleinimids können für die intakten, partiell und vollständig gespaltenen Antikörper und das Fab&sub2;-Fragment verwendet werden, wohingegen das Fab- Fragment in ein Antikörperhybrid eingegliedert werden kann. Andere Beispiele der Antikörperkopplung an Polymerfilme werden die Verwendung rekombinanter Hybrid-Linker-Proteine und rekombinanter Antikörpermoleküle einschließen. Die Antikörper können am Fc-Teil funktionalisiert sein, um die Verfügbarkeit der bindenden Stellen für weitere Bindungen zu gewährleisten.
Das Elektrodensubstrat kann kleiner als 1 µm² und 10 cm² groß sein, die Größe ist nicht kritisch. Eine große Platte, die markierte Bereiche hat, kann verwendet werden, bei der die einzelnen Wafer nach der Bearbeitung getrennt werden können. Das Elektrodensubstrat, das die Surfactant-Schicht aufnimmt, kann mit einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Üblicherweise kann Abscheiden aus der Gasphase oder Sputtering von Metallelekroden verwendet werden, indem eine vorgeschriebene Metallschablone mit der gewünschten Elektrodenkonfiguration über einem isolierenden Substrat plaziert wird. Das von der Schablone bedeckte Substrat wird in ein Vakuum-Sputtergerät plaziert, in dem Gold, Silber, Platin, Aluminium oder eine Kombination von Metallen in das Verdampfungsschiffchen gegeben werden, und das Gerät auf geringen Druck evakuiert wird, im allgemeinen ungefähr 10&supmin;&sup6; Torr. Schablonen zur Elektrodenabscheidung können durch chemisches Fräsen hergestellt werden. Zuerst kann ein optisches Transparent unter Verwendung linographischer Verfahren, photographischer Verfahren, Photolaser-Plotter-Verfahren oder dergleichen hergestellt werden. Das optische Transparent weist eine schwarze Umgrenzung des Elektrodenarrays auf. Das Transparent kann über der Metalplatte plaziert werden, die zuvor mit einer positiven Photoresistemulsion beschichtet wurde. Der Transparent-Emulsions-Metaii-Sandwich wird dann mit Licht bestrahlt und in einem Säurebad geätzt. Alternative Verfahren zur Herstellung von Elektroden auf isolierenden Substraten schließen das Auftragen von Silberfarbe, Versiberungsverfahren und Siebdruckverfahren ein.
Zur Herstellung von Elektroden durch Auftragen von Silber gehört das direkte Auftragen von Elektrodenpaaren auf ein mit Polymer beschichtetes isolierendes Substrat. Vor dem Auftragen wird die Qualität des Films mittels Fluoreszenzmikroskopie geprüft. Intakte Polymerfilme erscheinen bei Verwendung eines Rhodaminfilters hellorange. Zum Beispiel kann man auf 10-15 mm des mittleren Teils eines hölzernen Applikators Silberfarbe dünn auftragen. Man hält die Enden des Applikators mit dem Finger und Daumen und rollt die Farbportion leicht über den Film, um eine Elektrode mit einer Breite von ungefähr 2 mm zu erzeugen. Der Applikator wird nochmal verwendet, um eine parallele Elektrode in ungefähr 3 mm Entfernung zu erzeugen. Stücke eines Kupferhaftstreifens können dann zum Anschließen eines Stromkreises für elektrische Messungen an die Silberelektroden verwendet werden. Das obere Ende des Kupferstreifens, der Kontakt zu den Silberelektroden hat, kann dann mit Silberfarbe bedeckt werden.
Zu einem anderen Verfahren zur Herstellung von Elektroden gehört das Beschichten eines Glassubstrats mit einem Metall, um eine vordere Oberfächenbeschichtung zu erzeugen. Zu typischen Metallen gehören Chrom, Silber, Gold, Platin, Nickel, Legierungen, Oxide, wie Indiumzinnoxid, leitende Polymere und anorganische Substanzen. Ein Photoresistfilm, negativ oder positiv, wird durch Sprühen, Lameieren, Eintauchen oder dergleichen über der Beschichtung auf der Metallobeäche abgeschieden. Eine Vorlage für die Maske wird durch computergestütztes Design unter Verwendung hochauflösender Techniken erzeugt. Bestrahlung oder Photoaktivierung mit UV- oder weißem Licht kann, abhängig von der Filmzusammensetzung, verwendet werden. Der Photoresist wird dann unter Verwendung von Entwicklungsreagenzien, wie kaustischer Soda entwickelt, um die unbelichteten Flächen eines negativen Photoresists zu entfernen. Chemisches Ätzen wird das ungeschütze Metall anschließend entfernen. Entfernen von rückständigem Photoresistmaterial kann unter Verwendung von 10% NaOH für 3-5 Minuten vervollständigt werden. Die Spüsch ritte beinhalten 10% Detergentien, 2-3 Mal Spülen in Wasser mit 10-20 Megaohm Wasser und dann Spülen in Wasser hoher Reinheit und in organischen Lösungsmitteln. Die Elektrode kann erhitzt werden, um irgendwelches Oberflächenwasser zu entfernen. Das Erhitzen wird unter Verwendung eines staubfreien Ofens bei Temperaturen, die von 30 - 150ºC reichen, für zwischen 30 Sekunden bis zu einer Stunde durchgeführt. Der Polymerfilm, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wird dann auf die Substratelektrode transferiert, um die Elektroden zu überdecken. Der Transfer wird durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erreicht.
Die Metallelektroden können gegen Kontakt mit Wasser abgedichtet werden. Mehrere Materialien können verwendet werden, um eine Isolierung gegenüber Wasser bereitzustellen, wie Parafilm, Herneseal, Gummisilicon, Gummizement, UV-härtbare Materialien, wozu Acrylate, Cyanoacrylate, Wachse, fluorierte aliphatische Verbindungen, Klebstoffe, Teflonverbindungen oder andere kommerziell zugängliche Dichtmassen gehören. Für einen Parafilm wird der Film über den Elektroden plaziert, der Film wird komprimiert, um alle Luftblasen zu entfernen und der Wafer wird erwärmt, um dem Parafilm zu ermöglichen, zu erweichen und die Elektroden zu bedecken. Die Elektroden können mit den anderen Dichtmassen bedeckt werden und, sofern erforderlich, kann der Chip erwärmt werden, um eine Reduktion der Viskosität zu ermöglichen. Hochauflösende abgedichtete Elektroden können durch Abscheidungsverfahren aus der Gasphase (Aufdampfen), Sputtering oder dergleichen geschaffen werden. Zum Abscheiden aus der Gasphase wird eine Schablone mit Öffnungen, die symmetrisch zu den Linien der Metalleletroden auf dem Substrat, aber geringfügig breiter als die Metallinien sind, über der polymerbeschichteten Elektrodenoberfläche plaziert. Das Substrat und die Maske werden in einer Aufdampfapparatur plaziert, und dann wird ein isolierendes Material, wie Siliziumoxid, derart aufgedampft, daß die Elektrode vollständig mit dem isolierenden Material beschichtet ist. Das isolierende Material sollte sich etwas weiter als der Elektrodenrand ausdehnen, so daß es die Elektroden vollständig von der Umgebung isoliert und den Polyrnerfilm zwischen den Elektroden unbedeckt läßt.
Nach Vervollständigung der Isolierung kann dann der Lipidfilm aktiviert werden. Die Aktivierung wird von der Art des Moleküles, das an das Lipid gekoppelt ist, und dem zu bindenden Molekül abhängen. Zu diesem Zeitpunkt weist der trockene Biosensorwafer das isolierende Substrat, den Polymerfilm, an dem das Moleküle für Bindungen befestigt ist, z.B. der Ligand, parallele Metallelekroden, die gegen Feuchtigkeit abgedichtet sind, und metallene elektrisch leitende Anschlüsse auf.
Der Sensor wird durch spezifisches Koppeln, entweder direkt oder indirekt, des spezifischen Bindungspaarelements an die Lipide des Polymers auf der Elektrodensubstratoberfläche aktiviert. Ist das komplementäre Element ein Antikörper, wird das Koppeln des Antikörpers an den Sensor vollendet, so daß die bindenden Stellen des Antikörpers frei bleiben, um mit spezifischen Antigenen zu assozieren.
Eine große Anzahl an Kopplungspaaren kann verwendet werden, bei denen die Bindung kovalent oder nicht kovalent sein kann. Verschiedene Proteine, die spezifisch an einen komplementären Liganden binden, können verwendet werden, wie Enzyme, Lectine, Toxine, lösliche Rezeptoren und dergleichen. Zu beispielhaften Proteinen gehören DHFR, Streptavidin, Avidin, Cholera-Toxin, Lectine, das c-H-ras Onkogenprodukt und Nukeasen. Für Kopplungen mit Oligosacchariden können Hydrazine verwendet werden, für sich allein oder an ein Polymer gebunden, z.B. Poly(acrylhydrazid). In einer anderen Ausführungsform können Biotin, Nukleotide oder andere molekular erkennende Analoga oder dergleichen verwendet werden. Nukleinsäuren, wie ssDNA oder RNA, können verwendet werden. Maleinimidkopplungen können verwendet werden, um an ein einen Thioalkohol enthaltendes Molekül zu koppeln, das ein Biotin, Avidin, irgendein Ligand oder bindendes Protein, ein Schwefelwasserstoff enthaltendes Polymer, eine Nukleinsäure oder molekular erkennende Analoga sein können. Zum Beispiel kann ein intakter Antikörper mit einer funktionalen Oligosaccharideinheit mit Perjodsäure gespalten werden und der entstehende Aldehyd mit dem Hydrazin unter reduktiven Bedingungen umgesetzt werden, um eine stabile Kohlenstoff-Stickstoffbindung zu bilden. Zur Bereitstellung von Schwefelwasserstoffguppen, die mit einem Maleinimid reagieren, kann der Antikörper in der Gelenkregion reduziert werden, partiell in der Gelenkregion gespalten werden oder proteolytisch nahe der Gelenkregion gespalten werden, um mit dem aktivierten Olefin einen Thioether zu bilden. In jedem Fall wird Sorge beim Auswählen des Verfahrens zur Kopplung getragen, um sicherzustellen, daß die gewünschten Stellen für Bindungen an das komplementäre Element des spezifischen Bindungspaares für Bindungen verfügbar sind. In einer anderen Ausführungsform können Schwefelwasserstoffsurfactanten an Schwefelwasserstoffgruppen auf den Antikörpermolekülen befestigt werden.
Wenn das bindende Molekül in einer wäßrigen Umgebung gehalten werden soll, hat sich die nachstehend beschriebene Prozedur als nützlich erwiesen und kann als beispielhaft angesehen werden. Ein wäßriges Medium wird gebildet, daß normalerweise auf einen pH-Wert in dem Bereich von ungefähr 4 bis 9 gepuffert ist, vorzugsweise von ungefähr 5 bis 9. Die Salzkonzentration wird im allgemeinen in dem Bereich von ungefähr 10 mmol bis 1 molar liegen. Zu beispielhaften Puffern gehören Phosphat, Borat, Barbitron, Carbonat, Tris, MOPS, MES usw. Zu beispielhaften Pufferzusammensetzungen gehören mit Phosphat gepufferte Kochsazlösung, 138 mmol NaCl, 50 mmol Kaliumphosphat, pH-Wert 7,2; 200 mmol Natriumborat, pH-Wert 8,2. Es wude herausgefunden, daß PBS Monoschichten begünstigt und Cadmium die Schicht stabilisiert. Die Konzentration der multivalenten Kationen wird zu einem gewissen Grad von der Art der Kationen abhängen, die im allgemeinen von ungefähr 0,1 bis 200 mmol reicht, eher üblich von ungefähr 10 bis 100 mmol und wird bei der Bestimmung der absoluten Salzkonzentration berücksichtigt. Nach dem Eintauchen der Polymeroberfläche in einen wäßrigen Puffer, der von ungefähr 10-140 mmol NaCl, 4-40 mmol tris pH-Wert 6,5-7,5, sowie irgenwelche zusätzliche passende Kopplungsreagenzien und Rezeptoren enthält, läßt man das Reaktionsgemisch lange genug stehen, damit die Reaktion vollständig abläuft und wäscht anschließend.
Nach der Aktivierung mit dem komplementären Paareement, wird der Biosensor normalerweise zur Aufbewahrung abgedeckt. Die Abdeckung wird wieder enifembar sein und wird vor dem Gebrauch wieder entfernt. Verschiedene Filme können zur Abdichtung des Biosensors in einer geschützten Umgebung verwendet werden.
Um einen Assay durchzuführen, kann die Probe durch direkte Injektion auf die Biosensoroberfläche in einen Speicher-Puffer, der die Sensoroberfäche bedeckt, durch Kapilarvorgänge in einer flachen Durchflußzelle, die den Sensor bedeckt, mit einer Flüssigkeit, die durch eine Durchflußzelle gepumpt wird, durch Gasphasenadsorption und Diffusion auf eine angefeuchtete Oberfäche, die die Sensoroberfläche bedeckt, oder dergleichen eingeführt werden. Zum Detektieren extrem geringer Analytkonzentrationen, zum Beispiel weniger als ungefähr 10&supmin;¹² mol, wird das Verfahren mit Durchflußzelle bevorzugt, da es einem großen Volumen der Probe ermöglicht, die Sensoroberfäche zu passieren, um die spezifischen bindenden Elemente auf der Oberfläche zu konzentrieren. Bei höheren Konzentrationen ist die Konfiguration mit Speichersensor nützlich, da die Diffusionsrate eine geringere Rolle spielen wird.
On-line Überwachung verschiedener biologischer Prozesse, von in vitro Ereignissen und kommerzieller Prozesse wird durch das Plazieren eines Apparates mit Durchflußzelle über der Sensoroberfläche vervollständigt. Wenn das Fluid die Sensoroberfläche passiert, bindet der Analyt aus der Lösung an spezifische Rezeptoren auf dem Sensor.
Zu den Verfahren zur Signalerzeugung wird direkte und competitive Antikörper/Antigen Bindung gehören. Signale werden zum Beispiel durch Antigenbindungen an Biosensoren erzeugt, bei denen die Antikörper auf der Biosensoroberfläche immobilisiert worden sind, so daß ihre Antigen-bindenden Stellen frei für Bindungen sind. Assays mit competitiver Bindung werden für kleine, gewöhnlich monovalente Analyte, wozu Proteine, Peptide, Oligosaccharide, Oligonukleotide, Arzneimittel und andere kleine Liganden gehören, verwendet. An competitiven Assays beinhalten die Verwendung von mono- oder multivalenten Liganden zur Signalverstärkung.
Die zellulären Expressionssysteme können benutzt werden, um natürlich vorkommende, mit Surfactant gekoppelte Proteine, die direkt in den Surfactant-Film eingegliedert werden können, zu bilden. Bakterien- oder Säugetierzellen können mit nicht natürlichen, polymerisierbaren Surfactanten gefüttert werden, wie diacetylenischer Myristinsäure, anstatt mit natürlichen Surfactanten. Eines dieser Beispiele eines zellulären Expressionssystems ist der Myristioy- lierungs-Weg, bei dem einzelne Acylketten biochemisch mit Polypeptiden gekoppelt werden. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung des Phosphatidylinosit-Expressionsweges. Dieser Weg kann verwendet werden, um lösliche Formen von Proteinrezeptoren , die an Phosphatidylinosit durch eine Oligosaccharideinheit befestigt sind, zu exprimieren. Wenn Zellen mit nicht natürlichen, polymerisierbaren Phosphatidylinositen oder polyrnerisierbaren Fettsäuren gefüttert werden, kann das isolierte Protein/Rezeptor-Oligosaccharid-Linker-Phosphatidylinosit direkt in dem polymerisierbaren Surfactant-Film verwendet werden.
Abhängig von der besonderen Kombination, die an die Oberfläche gebunden ist, kann eine breite Vielfalt verschiedener physikalischer Ereignisse erfolgen, die die Detektion eines Signals ermöglichen. Das Signal wird aus der Störung der polymerisierten Surfactant-Schicht resultieren, die in einer Änderung der elektrischen, optischen oder strukturellen Eigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht resultiert. Wenn der Analyt klein ist und seine Bindung an ein Analyt bindendes Molekül eine kleine Wirkung auf die Polymerschicht haben kann, mit geringer oder keiner Störung, und so die genaue Detektion verhindert, können verschiedene Verfahren zur Signaverstärkung verwendet werden. Zum Beispiel kann Signalverstärkung durch Optimierung der Elektrodenkonfiguration erzielt werden oder durch Steigern der Anzahl an Sensoren in einem Array für zunehmende statistische Genauigkeit. Von den Sensorarrays können bis zu Tausend pro Quadratzoll zusammengefaßt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Abstand zwischen den zwei Elektroden verringert werden. Eine Zunahme des Verhältnisses der Länge der Fläche zwischen zwei Elektroden zur Breite zwischen den Elektroden entspricht einer linearen Zunahme der Leitfähigkeit des Films.
Verschiedene Typen von Assays können konstruiert werden. Im Fall von DNA-Assays wird eine einzelstrangige DNA im Film immobilisiert, in dem ein oder zwei Punkte zur Befestigung verwendet werden. Die Befestigung kann kovalent oder nicht kovalent sein, z.B. Biotin, Avidin, Hybridisierung usw. Wenn die Probe, die einen komplementären DNA-Strang enthält, hinzugefügt wird, führt die DNA-Duplikation zur Signalerzeugung. Im Falle viraler Proben, kann die Viruscapsid oder -hülle direkt an einen immobilisierten Antikörper binden. Makromoleküle werden in einer ähnlichen Art wie der virale Assay geprüft. Für die Serologie sind die gleichen Grundsätze anzuwenden, aber ein Antigen ist immobilisiert und ein Antikörper wird gemessen. Alpha-Galactose-1,4-beta-galactose, die in einem Polymerfilm immobilisiert ist, kann an Rezeptoren der P. Fimbriea Bakterien binden. Competitive Assays können für kleine Moleküle in einem Verdrängungmodus verwendet werden, wobei die Konkurrenz direkt an der Filmoberfläche auftritt oder in einer direkteren Art, wobei eine polyvalente kreuzreaktive Einheit und der competitive Analyt gleichzeitig zum Biosensor hinzugefügt werden.
Verschiedene Systeme können zum Detektieren einer Vielzahl von Analyten verwendet werden. Zum Beispiel kann man mit einem an dem Polymer befestigten Antigen einen competitiven Assay zwischen dem Antigen auf dem Polymer und dem Analyt-Antien für den Rezeptor, z.B. einen Antikörper, bereitstellen. In einer anderen Ausführungsforrn können Po- lyethylenglykolpackungen um das an den Film gebundene Analytmolekül herum verwendet werden, wenn eine Bindung des Analyten das Glykol ersetzt, um eine Störung des Films zu verursachen. Dieser Assay vermeidet die Notwendigkeit der Konkurrenz. Wenn Polyethylengykolketten als polares Ende des Surfactanten vorliegen, können diese Moleküle sich ausrichten, um einen geordneten Assay zu bilden. Bindung des Analyten kann die regelmäßige Packung stören und zu einer strukturellen Änderung in der Polyrnerschicht führen. Mit polyvalenten Antigenen kann Spannung erreicht werden, wobei durch die Spannung beabsichtigt ist, daß die Bindung des polyvalenten Antigens mit Beugen des Films und einer Änderung der Konformation des Polymers einhergeht. Die multivalenten Antigene können durch chemisch kreuz-gekoppelte Antigene an beads polymerisierte Liposomen, Ansammlungen von Makromolekülen, chemisch kreuz-gekoppelten Molekülen, chemisch synthetisierten polyvalenten Molekülen oder dergleichen hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform können Widerstands/Strömungspartikel beteiligt sein, wobei die Partikel mit dem Analyt um Bindung an die Oberfläche konkurrieren. Wenn ein Flüssigkeitsstrorn entlang der Partikel stattfindet, kann die Polymerordnung unter Signaländerung modifiziert werden. Eine andere Technik kann Komplexe, die dotierende Substanzen freisetzen, beteiligen, wie Mikronschwämme, polymerisierte Liposomen, makromolekulare Komplexe oder selbstdotierende Polymere. Die Gegenwart der mit dem Surfactant-Polymer wechselwirkenden dotierenden Substanzen wird eine Änderung im Signal bereitstellen. Verschiedene Spannungs- Einrichtungen können verwendet werden, die auf der Verwendung von Actin und Myosin basieren. So können Spannfäden oder traversierende Actinfäden, die zu einer Veränderung in der Konformation des Surfactant-Polymers führen, verwendet werden.
Die piezoelektrischen Eigenschaften von Protein/Surfactant-Filmen können mit dem Ziel der Detektion des Analyten ausgenutzt werden. Makromolekulare kristalline Ansammlungen haben spezifische Resonanzfrequenzen, die von der Masse der Ansammlung, der Symmetrie der kristallinen Raumgruppe und den elektrischen Feldern, in die die Anordnungen plaziert werden, abhängen. Überwachen der Schwingungsfrequenz kann mit dem Ziel, die Frequenzshifts zu bestimmen, bevor und nachdem Analytmoleküle an die makromolekulare Ansammlung binden, verwendet werden.
Antiidiotypen können als divalente und gespannte Sonden, bei denen Antikörper an das Surfactant-Polymer gebunden sein können, verwendet werden und die Bindung des Liganden an den Antikörper würde die Bindung des Antiidiotypen verhindern. Die Polyvalenz des Antiidiotypen würde in Kreuz-Kopplung des Antikörpers, der an den Surfactant gebunden ist und Modifizierung der Konformation des Polymers resultieren.
Divalente koppelnde Moleküle (Linkermoleküle) mit natürlichen Liganden, die am Ende der Kopplungseinheit befestigt sind, können verwendet werden, um die Rezeptor/organisch leitende Schicht vorzuspannen. Divalente Bindung resultiert in einer sterisch gespannten Oberfläche, wenn die Verbindung zwischen den Liganden etwas unflexibel ist, z.B. bei cyclischen Molekülen, insbesondere aromatischen Linkern. Die Spannung an der polymerisierten Surfactant-Schicht nimmt zu, wenn die Festigkeit des Linkers und die Affinität zwischen dem Liganden und Rezeptor zugenommen haben. Divalente Moleküle können in competitiven Analytassays verwendet werden, wobei der monovalente interessierende Analyt auf eine vorgespannte Oberfläche eluiert wird. Wenn die divalente Einheit durch den monovalenten Analyt ersetzt wird, läßt die Spannung nach und die elektrischen und optischen Eigenschaften des Films verändern sich meßbar.
Leitende Partikel können verwendet werden, bei denen entweder ein Antigen an dem leitenden Partikel befestigt sein kann oder Antikörper können an Käfiggoldverbindungen gebunden sein oder es handelt sich um Metalpartikel, wie Metalkomplexe, z.B. Gold oder Wolfram.
Angebundene Antikörper können verwendet werden, bei denen der Antikörper an ein mit einem Antigen verbundenen Film über seine Bindungsstelle bindet und chemisch durch eine funktionelle Gruppe an den Antikörper gekoppelt ist. Die Bindung des Antikörpers an das Antigen resultiert in einer Änderung der Konformation des Polymers. Wo das an den Film gebundene Antigen mit einem Antigen in der Probe konkurriert, wird ein anderer Bindungsgrad des Surfactant-Film-gekoppelten Antigens an den Antikörper auftreten, abhängig von der Menge an Antigen in der Probe.
Eine Spannung auf das Polymer kann durch Bereitstellen von am Polymer befestigten Anti- genen erzeugt werden, insbesondere da, wo ein molekularer Ausleger durch Mikrofabrikationstechniken erzeugt werden kann. Miniaturausleger können mikromaschinell hergestellt werden, so daß die Spitze des Auslegers dicht an der Protein/Polymer Oberfläche plaziert ist. Wenn eines der bindenden Elemente an der Ausegerspitze befestigt ist und das zweite Element an dem Protein/Polymer Film befestigt ist, tritt direkte Bindung zwischen der Spitze und der Oberfläche auf. Der Ausleger wirkt wie eine Spannungsfeder, die, wenn sie an den Protein/Polymerfilm gebunden ist, eine intensive Spannung auf den Film erzeugt. Die Spannung läßt nach, wenn der Analyt auf die Filmoberfläche eluiert wird und um die Bindung mit einem der Bindungspaarelemente konkurriert. In einer anderen Ausführungsform kann eine Trommelmembran durch eine ähnliche Methode erzeugt werden. Lichtpulssysterne können verwendet werden, um die Filmleitfähigkeit zu erhöhen, die Qualität des Polyrnerfilms während des Herstellungsverfahrens zu prüfen, Signale zu stabilisieren oder transientes Rauschen zu unterdrücken.
Störungen, z.B. Änderung der Konformation der polymerisierten Schicht, können durch Änderungen der elektrischen Eigenschaften des Films detektiert werden. So können durch Anlegen eines Spannungsabfalles über der Surfactant-Schicht, Änderungen der Spannung mit einem Galvanometer, Hochimpedanz-Ohmmeter, Ampererneter oder Voltmeter detektiert werden. Zu anderen elektrischen Eigenschaften, die detektiert werden können, gehört "time domain reflectometry", wozu die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Hochfrequenzradarpulsen und Frequenzdomänenantworten gehört, wobei spektrale Frequenzmuster als Funktion der Analytbindung an die Filmoberfläche überwacht werden können. Wechselstrommessungen sind praktisch, um Untergrundrauschen auf Grund nicht spezifischer Matrixeffekte herauszufiltern. Eine nützliche Schaltung weist einen Anschluß zum Einfügen des Biosensorchips auf, ferner eine Energieversorgung, einen elektrischen Verstärker, einen Analog/Digital Wandler, ein Kanalmultiplexsystem, Computerinterfacekomponenten, wozu Software und Platinen, ein Computer, ein Anzeigeterminal und ein Drucker gehören. Zu den Konstruktionen für die Instrumentierung gehören Taschengeräte, die die gesamten Signalverarbeitungsmöglichkeiten aufweisen, die für akkurate Datenanalyse notwendig sind.
Eine Anzahl von sowohl auf linearer als auch auf nichtlinearer Optik basierenden Techniken können in den Messaufbau eingegliedert werden. Die Techniken beruhen auf einer geordneten Polymerschicht in Verbindung mit einer gebundenen Schicht als ein Mittel zur Signalverstärkung, die kristallin oder nicht kristallin, insbesondere eine Proteinschicht, sein kann. So können entweder geordnete oder nicht geordnete Proteinschichten verwendet werden.
Linearoptische Einrichtungen können auf Änderungen in den Fluoreszenzabsorptions- und Refexionseigenschaften des dünnen Films bei der Analytbindung, Photoinjektion von Ladungsträgern oder dergleichen basieren. Zusätzlich können Änderungen in der optischen Doppelbrechung und den Eigenschaften des Circulardichroismus überwacht werden. Bei Shifts in der Fluoreszenzabsorption oder Reflexivität ist zu beachten, daß das hochgradig konjugierte Polydiacetylenpolymerhauptgerüst einheitliche spektrale Eigenschaften aufweist, die von der lokalen elektronischen Umgebung bestimmt werden. Durch Überwachen des Fluoreszenzabsorptionsshifts, der durch die Bindung eines Analyten an Liganden, die spezifisch am Polymer befestigt sind, induziert wird, kann eine quantitative Korrelation zur Analytkonzentration hergestellt werden. Bei der Photoinjektion von Ladungsträgern erzeugt das Bestrahlen eines leitenden Polymerfilms mit einem Vor-Lichtpuls einen transienten elektrischen Decay, der charakteristisch für die mittlere freie Wegänge der Ladungsträger vor der Rekombination ist. Die Bindung eines Analyten und anschließendes Wellen des Films reduziert die mittlere freie Wegänge der Träger. Diese Änderung kann empfindlich unter Verwendung einer transienten Standardphotoleitfähigkeitsmessung oder Durchführung der Fourier-Transformation des transienten elektrischen Decays überwacht werden.
Bei der Doppelbrechung ist ein System von ausgerichteten Molekülen optisch doppelbrechend und die Polarisation der einfallenden Strahlung wird in einem definierten Ausmaß drehen. Die Bindung der Analytmoleküle an den Polyrner/Proteinfilm ändert die molekulare Ausrichtung der analytbindenden Moleküle innerhalb des Films. Die molekulare Reorientierung resultiert in einer Änderung der Doppelbrechung, was dann wieder als eine einheitliche Rotation des linear polarisierten Lichts manifest wird.
Circulardichroismus (CD) kann zur Detektion des Analyten verwendet werden. Während bei der optischen Doppelbrechung die Änderung des Realteils des Brechungsindexes überwacht wird, kann der CD verwendet werden, um den Imaginärteil des Brechungsindexes zu messen. CD kann verwendet werden, indem der Grad der Elliptizität des Lichtes, nachdem es durch den Protein/Polymerfilm passiert ist, bestimmt wird. Das CD-Spektrum des Films kann vor, während und nach dem die Bindung des Analyten entsteht, gemessen werden. Die Bindung des Analyten moduliert die optischen Anisotropieeigenschaften des Films, was dann wieder zu beobachtbaren Shifts im CD-Spektrum führt.
Für nichtlineare optische Einrichtungen können laserinduzierte Phononenspektroskopie (LIPS), Erzeugung der Oberfächenwelle oder der optische Kerr-Effekt verwendet werden. Zur LIPS-Technik gehört eine Technik mit transienter holographischer Beugung, die eine Form der Vier-Wellen-Mischung ist, und ultrasensitive Informationen über die makromechanische und Schwingungsstruktur von Flüssigkeiten und Festkörpern bereitstellt. Bindung des interessierenden Analyten entweder an den Protein/Polymerfilm oder an makromolekulare Komplexe in Lösung wird die Phononenstruktur des Materials signifikant ändern und sich damit direkt in der transienten Beugungsobservablen manifestieren. Erzeugung der Oberflächenwelle ist eine Folge einer fundamentalen nichtlinearen Licht-Materie Wechselwirkung in nicht-zentrosymmetrischen Kristallen, die in der Umwandlung der einfallenden Strahlung in Strahlung mit der doppelten Frequenz resultiert. Diese Technik ist inhärent oberflächenempfindlich, da der Oberflächenbereich nicht-zentrosymmetrisch sein muß. Bindung eines Analyten an die Oberfläche eines Films ändert die nichtlinearen optischen Eigenschaften, um die Intensität des Signals der zweiten Harmonischen signifikant zu ändern, das mit einem Photodetektor beobachtet werden kann.
Schließlich kann der optische Kerr-Effekt verwendet werden, um den optischen Kerr-Effekt mit Zeitauflösung im Nanosekundenbereich zu überwachen. Die Dynamik der Reorientierung der Moleküle (in der flüssigen Phase) beim Binden des Analyten manifestierte sich direkt in der transienten Beugungsobservablen.
Messungen zur Analytdetektion können auch unter Verwendung neuer mikroskopischer Techniken, wie der Atomkraftmikroskopie [O. Marti, H.O. Ribi, B. Drake, T.R. Albrecht, C.F. Quate und P.K. Hansma, Science (1988) 239:50-52] und Scanning-Tunnel-Mikroskopie [C.F. Quate, Phys. Today (1986) 39:26] ausgeführt werden. Diese Verfahren können verwendet werden, um Oberfläche und elektronische Strukturen der Protein/Polymerfilme zu untersuchen. Die Analytdetektion wird durch visuelles Beobachten der Filmstruktur bevor, während und nachdem der Analyt an die Oberfläche bindet, ausgeführt. Optische Filterverfahren können verwendet werden, um die sichtbaren Strukturänderungen im Film zu verstärken.
Zum weiteren Verständnis der Erfindung werden nun die Zeichnungen betrachtet.
In Fig. 1 wird eine schematische Ansicht des Herstellungsverfahrens eines Biosensors in Übereinstimmung mit der Erfindung dargestellt. Der erste Schritt betrifft Abscheiden der Metallelektroden aus der Gasphase auf einer isolierenden Oberfläche, wobei auf einen Wafer 10 Metallelektroden 12 aus der Gasphase abgeschieden werden, wobei der Ort der Abscheidung durch den Schirm 14 kontrolliert wird. Mit dem ultradünnen leitenden Polymer 16 wird dann über den Elektroden 12 und dem Zwischenraum 18 auf dem Wafer 10 beschichtet. Eine Isolierung wird dann durch Beschichten des Bereichs um die Elektroden 12 mit isolierendem Material 20 erreicht, wobei der Schirm 22 auf die Bereiche ausrichtet, die mit der Dichtmasse 20 beschichtet werden. Der Surfactant-Polymerfilm 16 wird dann mit den Rezeptoren 24 aktiviert, gefolgt vorn schützenden Abdichten mit Film 26.
In Fig. 2 ist ein Diagramm des Stromkreises und des Biosensors dargestellt. Der isolierende Träger 30 trägt Elektroden 32 und Elektroden-Abdichtungs- und Wasserbarrieren 34. An die Surfactant-Polymerschicht 36 sind die Proteinrezeptoren 38 gebunden. Die Elektroden 32 werden durch Leitungen 40 und 42 mit einer Energiequelle 44 und einem Meßgerät 46 zum Messen der Änderungen des elektrischen Signals verbunden. Der Puffer 48 wird in den Bereich, der durch die Wasserbarriere 34 und das Protein 38 definiert ist, plaziert, um den Analyt aufzunehmen.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und beschränken den Schutzbereich nicht.

Beispiele

Die Biosensoreinrichtung wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Für verschiedene Experimente wurden Surfactant-gekoppelte Liganden unter Verwendung von Kondensationsreaktionen hergestellt, indem eine aktivierte Carbonsäuregruppe und ein nukleophiles Amin oder Hydroxyl beteiligt wurden. 10,12-Pentacosadiynsäure wurde mit Trimethylacetylchlorid unter anhydrierenden Bedingungen aktiviert, um das aktive unsymmetrische Anhydrid zu bilden. Das Anhydrid wurde mit einem Überschuß Ethylendiamin oder Ethanolamin (in situ) behandelt, um Ethylendiamino-10,12-Pentacosadiynamid EDA-PDA oder Ethanolamin-10,12-Pentacosadiynamid EA-PDA zu bilden. 1,5 Mol-Äquivalente des Diethylamin wurden als katalytische Base hinzugefügt. Die Reaktionen liefen für 3 Stunden bei Raumtemperatur ab. EDA-PDA oder EA-PDA wurden chromatographisch unter Verwendung einer Silicagelsäule und eines Chloroform/Methanol Gradienten gereinigt. EDA-PDA oder EA-PDA wurden mit freier Carbonsäure, die Liganden enthält (chemisch wie vorstehend beschrieben aktiviert), kondensiert, um die mit Liganden gekoppelten polyrnerisierbaren Surfactanten zu bilden. Zu repräsentativen Beispielen ligandengekoppelter Surfactanten, die mit diesem Verfahren mit dem Ziel der Biosensorfabrikation hergestellt wurden, gehören:
2,4-Dinitrophenylaminocaproyl-EDA-PDA; Theophyllin-8-butyroyl-EDA-PDA; α-Galactose- 1,4-β-galactose-diethyienoxid-aminosuccinyl-EDA-PDA; Biotin-aminocaproyl-EDA-PDA; N- Dimethylrifampicin-succinyl-EDA-PDA; und dATP-EDA-PDA.
2,4-Dinitrophenylaminocaproyl-EDA-PDA wurde zur Herstellung eines Biosensors, der spezifisch für anti-Dinitrophenylantikörper ist, dargestellt. Theophyllin-8-butyroyl-EDA-PDA wurde zur Herstellung eines Biosensors, der spezifisch für anti-Theophyllin Antikörper und Theophillin Assays ist, dargestellt. Biotin-aminocaproyl-EDA-PDA wurde mit dem Ziel, Biosensoren herzustellen, die Streptavidin als ein bindendes Element für verschiedene Assays verwenden, dargestellt. N-Dimethylrifampicin-succinyl-EDA-PDA wurde mit dem Ziel, Biosensoren zum Detektieren von RNA-Polymerase herzustellen, dargestellt. DATP-EDA-PDA wurde mit dem Ziel, Biosensoren zum Detektieren von Enzymen und anderen Proteinen, die an dATP binden, herzustellen, dargestellt. α-Gaiactose-1,4-β-galactose-diethylenoxid-aminosuccinyl-EDA-PDA wurde mit dem Ziel, Biosensoren zum Detektieren von P. Fimbrial Stämmen von E. coli herzustellen, dargestellt.
Ethanolamino-10,12-pentacosadiynamid (EA-PDA) wurde auch mit dem Ziel hergestellt, gemischte polymerisierte Filme zu bilden. Filme wurden gewöhnlich mit 1-10% EA-PDA und 90-99% irgendeines ligandengekoppelten Surfactanten hergestellt.
Ein Assay umfaßte an den Surfactant gebundenes Dinitrophenyl zur Detektion eines Antikörpers gegen Dinitrophenyl. Der Biosensor wurde in folgender Weise hergestellt. Eine Glasmikroskopdeckglas (22 mm × 22 mm) wurde durch Eintauchen in eine Lösung von 5% Dimethyhlorsilan und 95% Hexan für 5 Minuten bei Raumtemperatur alkyliert. Die Abdeckplatte wurde zweimal mit reinem Chloroform gewaschen und dann dreimal mit glasbidestilliertem Wasser gespült. Die Abdeckplatte wurde luftgetrocknet und dann mit einem Strom sauberen, trockenen Stickstoffgases entstaubt.
Eine polymerisierte Monoschicht, die 2,4-Dinitrophenyl (DNP) als Antigen enthält, wurde hergestellt und auf die alkylierte Abdeckplatte wie folgt übertragen. Ein Glasobjektivträger (vorgereinigt und dann mit einem Stickstoffstrom entstaubt) wurde auf eine Kupferplatte (quadratisch von 10 cm × 10 cm und 0,4 cm dick) plaziert. 2,0 ml Glas-bidestilliertes Wasser wurden auf ein Ende des Glasträgers aufgebracht. 2,0 Mikroliter einer Lösung, die 1,0 Milligram/Milliliter des Monomeren (2,5 Mol% 2,4 Dinitrophenylaminocaproyl-ethylendiamin-10,12-pentacosadiynamid und 97,5 Mol% Ethanolamino- 10,12-pentacosadiynamid) enthält, wurden auf die wäßrige Oberfläche aus einer 5 Mikroliter Mikropipette bei Raumtemperatur in zwei gleichen Aliquots aufgetragen. Beim Verdampfen des Lösungsmittels trocknet das Monomer zu kleinen sichtbaren Inseln auf der Wasseroberfläche. Die Kupferplatte wurde auf eine vorgeheizte heiße Platte (ungefähr 200ºC Oberfächentemperatur) transferiert. Die Kupferplatte, der Objektivträger und das Wasser wurden erhitzt, bis die Inseln des Monomeren geschmolzen und auf der Wasseroberfläche gelöst waren. Die Kupferplatte wurde nach 3 - 5minütigem Erhitzen auf einen vorgekühlten, in Eis eingebetteten Aluminiumblock transferiert. Die Kupferplatte, der Träger und das Wasser kühlten auf 4ºC ab.
Die Monoschicht wurde mit einer 254 nm UV-Kurzwellenlampe (4 Watt, 200 Mikrowatt Leistungsabgabe bei 20,32 cm (8 Inch)) in einer Entfernung von 5,08 cm (2 Inch) für 4 Minuten polymerisiert. Die Monoschicht erschien fürs Auge rosa. Der Transfer des polymerisierten Films auf das alkylierte Deckglas wurde durch horizontales Halten des Deckglases mit einer feinen Pinzette und durch langsames Absenken des Deckgases, so das der hydrophobe Teil des Films (der an der Luft liegenden Seite) direkt kontaktiert, ausgeführt. Sekunden nachdem der Kontakt zwischen dem Deckglas und der wäßrigen Oberfläche hergestellt wurde, wurde das Deckglas weggezogen und an der Luft getrocknet. Das alkylierte Deckglas erschien nach dem Transfer homogen rosa.
Silberelektroden wurden direkt auf das mit einer Monoschicht bedeckte Deckglas durch direktes Auftragen von Silberfarbe auf die rosa Polyrneroberfläche aufgetragen. Die Silberfarbe (Elektronikqualität) wurde mit Hilfe einer dünnen Glasmikropipette aufgetragen, um zwei parallele Elektroden (jede mit 8 mm Länge und 2 mm Breite) mit einem 2 mm Spalt zwischen den Elektroden zu erzeugen. Die endgültige Größe der Oberfläche zwischen den Elektroden betrug 16 mm². Kupferkebestreifen wurden mit den Elektroden kontaktiert. Elektrischer Kontakt zwischen den Elektroden und den Kupferstreifen wurde durch Auftragen einer kleinen Abdeckung mit Silberfarbe sichergestellt. Die Silberfarbe trocknete an der Luft bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Die Elektroden wurden elektrisch gegenüber Wasser unter Verwendung einer dünnen Paraffinbeschichtung (Parafilm) isoliert. Ein Streifen des Parafilms (1,4 cm x 2,0 mm) wurde über jeder Elektrode plaziert, um einen Kanal zwischen den Elektroden zu erzeugen, und so, daß keine sichtbaren Anzeichen der Silberfarbe, die innerhalb des Kanals der Luft ausgesetzt war, auftraten. Die Parafilmstreifen wurden sorgfältig unter Verwendung eines dünnen zylindrischen Glasstabs (4,0 mm Durchmesser) auf die Elektroden gepreßt. Der Parafilm wurde auf der Oberfläche der Elektroden und des Polymers geschmolzen, indem die Einrichtung für 2 Minuten in einen Ofen (125º C) plaziert wurde. Nach dem Abkühlen der Einrichtung auf Raumtemperatur bildet der verfestigte Parafilm eine wasserdichte Barriere über den Elektroden.
Die Biosensoreinrichtung wurde getestet, indem ein Kupfertestanschluß an dem positiven Ausgang einer 10 Volt Gleichstromquelle und der andere an eine von drei Eingangsanschlüssen eines Elektrometers (Kelthly 640) befestigt wurden. Die Schaltung wurde vervollständigt, indem die anderen Eingangsanschlüsse des Elektometers mit der Erdung und den negativen Spannungsausgängen der Energieversorgung verbunden wurden. Die Leistungsabgabe des Elektrometers (negativ 1,0 Volt bis positiv 1,0 Volt) wurde mit einer A/D- Wandlerkarte verbunden, die wiederum über ein Interface mit einem Desktop-Computer verbunden war. Die Ausgangssignale des Elektrometers wurden digitalisiert und in Ampere- Einheiten umgewandelt, wie sie von dem Elektrometer gemessen wurden und auf einem Farbgraphikbildschirm dargestellt.
Vor dem Durchführen eines Biosensorassays wurden die Elektrometereinstellungen auf einen Bereich von 1,0 × 10&supmin;&sup8; Ampere eingestellt. Das Elektrometer wurde mit dem Null-Testschalter kalibriert. Die Empfindlichkeit wurde auf die Einstellung 2 gesetzt. Der Grundlinienstrom der Biosensoreinrichtung war 4,0 Picoampere. Die elektrische Leitfähigkeit der Einrichtung wurde durch Blitzen mit intensiven sichtbaren Lichtpulsen auf die Polymeroberfläche mit einem Abstand von 7,62 cm (3 Inch) überprüft.
Puffer wurde auf dem Biosensor plaziert (tris pH-Wert 7,0 mit 140 mmol NaCl). Zum Verfahren des Assays gehörte das Plazieren von 100 Mikrolitern des Puffers auf den Biosensor zwischen die Elektroden und in den Kanal. Die Zuverlässigkeit des Sensors wurde durch Blitzen mit intensiven sichtbaren Lichtpulsen mit 2,54 cm (1 Inch) Abstand von der Sensoroberfläche getestet. Jeder Lichtpuls ergab eine 100fache Zunahme des Stroms über den Untergrund. Als die Integrität des Films gesichert war, wurden Antidinitrophenyl-Antikörper (ein Mikroliter einer Lösung von einem Milligramm/Milliliter an Antikörpern) in die gepufferte Lösung mikroinjiziert. Anfänglich wurde eine gerade Grundlinie bei 4,0 Picoampere beobachtet. Die Grundlinie blieb für mehrere Sekunden stabil und dann wurde ein deutlicher, unmittelbarer Anstieg des Stroms auf 9,0 Picoampere aufzeichnet.
Ein zweiter Assay betraf an den Surfactant gebundenes Theophyllin zur Detektion eines Antikörpers gegen Theophyllin. 100 Mikroliter des Puffers (10 mmol tris pH-Wert 7,0, 120 mmol NaCl) wurden auf den Sensor plaziert. Die Photoreaktionen wurden wie vorstehend beschrieben überwacht. Eine Stromzunahme auf das 100fache über den Untergrund wurde aufzeichnet. Als die Integrität des Films gesichert war, wurden Antitheophyllin-Antikörper (ein Mikroliter einer Lösung von einem Milligramm Protein/Milliliter) in die gepufferte Lösung mikroinjiziert. Anfänglich wurde eine gerade Grundlinie bei 3,0 Picoampere beobachtet. Die Grundlinie blieb für mehrere Sekunden stabil und dann wurde ein deutlicher, unmittelbarer Anstieg des Stroms auf 8,0 Picoampere innerhalb von 2 Minuten aufgenommen. Die neue Grundlinie blieb für weitere 30 Minuten stabil, zu diesem Zeitpunkt wurde der Assay beendet.
Ein dritter Assay betraf an den Surfactant gebundenes Biotin zur Detektion von Avidin. 100 Mikroliter des Puffers (der gleiche wie vorstehend beschrieben) wurden auf den Sensor plaziert. Die Photoreaktionen wurden wie vorstehend beschrieben überwacht. Eine Stromzunahme von Picoampere auf Nanoampere wurde registriert. Als die Integrität des Films gesichert war, wurde Avidin (ein Mikroliter einer Lösung von einem Milligramm Protein/Milliliter) in die gepufferte Lösung mikroinjiziert. Anfänglich wurde eine gerade Grundlinie im Picoamperebereich beobachtet. Die Grundlinie blieb für mehrere Sekunden stabil und dann wurde ein deutlicher, unmittelbarer 3facher Anstieg des Stroms über den Untergrund innerhalb von einer Minute aufgenommen. Die neue Grundlinie blieb für 30 weitere Minuten stabil, zu diesem Zeitpunkt wurde der Assay beendet.
Ein vierter Assay betraf die Verwendung von Fluoreszenzmessungen zur Detektion von Antitheophyllin-Antikörpern auf einem Sensor mit an den Polymerfilm gebundenem Theophyllin.
Der Sensor wurde unter einem Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops plaziert, so daß der Polymerfilm bei 75facher Vergrößerung unter Verwendung eines Rhodaminfilters beobachtet werden konnte. 500 Mikroliter einer Pufferlösung wurden auf dem Film so plaziert, daß das Mikroskopobjektiv in den Puffer eintauchte. Die Farbe und Intensität des Films erschien matt orange. 3 Mikroliter einer Lösung von 1,0 Milligramm/Milliliter Antitheophyllin-Antikörpern wurden in den Puffer mikroinjiziert. Unverzüglich nahm die Intensität der Fluoreszenz während der Injektion um 75% zu und der mattorange Film wurde heller in der Erscheinung. Ein Kontrollfilm, der kein Theophyllin enthielt, wurde durch die Antitheophyllin-Antikörper nicht beeinflußt.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Ergebnisse ist es offensichtlich, daß eine empfindliche Technik zur Detektion eines breiten Bereichs von Analyten bereitgestellt wird. Zahlreiche verschiedene Techniken können zur Detektion eines elektrischen oder Lichtsignals verwendet werden, das mit einer Änderung der Eigenschaften eines mehrfach ungesättigten Surfactant-Polymers verbunden ist. Durch Verwendung verschiedener Anleitungen können die interessierenden Analyten von Haptenen und Antigenen bis zu Aggregaten wie Viren, Zellen oder dergleichen reichen.

Claims

1. Biosensor, der eine Mehrzahl von Schichten aufweist:

einen ersten elektrisch nicht leitenden Träger, der dem Biosensor mechanische Festigkeit verleiht und wenigstens zwei voneinander beabstandete elektrische Anschlüsse auf einer ersten Oberfläche des Trägers aufweist;

eine elektrisch leitende, organische polymerisierte Surfactant-Schicht in elektrischem Kontakt mit den elektrischen Anschlüssen, die die erste Oberfläche zwischen den Anschlüssen bedeckt;

eine abdichtende Beschichtung zum Schutz der elektrischen Kontakte vor der Berührung mit Wasser;

eine organische Molekülschicht, die an die polymerisierte Surfactant-Schicht gebunden ist und ein Element eines spezifischen Bindungspaars zum Binden an ein komplementäres Element in einem wäßrigen Medium aufweist.

2. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem das gebundene organische Molekül ein Rezeptor ist.

3. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die organische polymerisierte Surfactant-Schicht aus Surfactantdiynen besteht.

4. Biosensor nach Anspruch 3, bei dem die Surfactantdiyne eine aliphatische Kette mit 6 bis 100 Kohlenstoffatomen aufweisen.

5. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem der Träger transparent ist und die gegenüberliegende zweite Fläche reflektierend ist.

6. Biosensor nach Anspruch 3, bei dem die organische polymerisierte Surfactant-Schicht Surfactant-Komponenten mit wenigstens 12 Kohlenstoffatomen enthält.

7. Biosensor nach Anspruch 6, bei dem die organische Moleküschicht eine im wesentlichen orientierte Schicht von Proteinen ist.

8. Verfahren zum Detektieren eines Analyten in einem Probenmedium, das als Biosensor eine Einrichtung nach Anspruch 1 verwendet, wobei das Verfahren aufweist:

Hinzufügen eines Probenmediums, das im Verdacht steht, einen Analyt zu enthalten, der das komplementäre Element des spezifischen Bindungspaares ist, zu der organischen Molekülschicht, unter der Bedingung, daß das Binden des Analyt an die organische Molekülschicht in einer Störung der polymerisierten Surfactant-Schicht resultiert oder ein Reagenz hinzugefügt wird, das an den Analyt oder die organische Molekülschicht proportional zu der Menge von Analyt in dem Probenmedium bindet und eine Störung in der polymerisierten Surfactant-Schicht bewirkt, wobei diese Störung in einer Veränderung der elektrischen oder optischen Eigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht resultiert;

Detektieren der Veränderung der elektrischen oder optischen Eigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht als Indikator der Gegenwart des Analyt in dem Probenmedium.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Analyt ein Protein ist und das spezifische Bindungspaarelement ein Hapten ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Reagenz Partikel sind, die eine Mehrzahl von mit dem Analyt kreuzreaktiven Molekülen aufweisen.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Änderung der optischen Eigenschaften eine Änderung der Absorptionseigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Änderung der optischen Eigenschaften eine Änderung der Emissionseigenschaften der polymerisierten Surfactant-Schicht ist.