DE10062244A1 - Sensor zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren, Sensoranordnung, Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren und Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren - Google Patents

Sensor zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren, Sensoranordnung, Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren und Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren

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radiation detector
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Johannes R Luyken
Franz Hofmann
Martin Streibl
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Infineon Technologies AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Abstract

Der Sensor zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen weist einen Strahlungsdetektor und eine über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordnete strahlungsdurchlässige Haftschicht auf, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können. DOLLAR A Anhand der Auswertung von Strahlungsdetektor-Ausgangssignalen kann auf die Existenz von zu der Struktur der Fängermoleküle komplementären bzw. spezifischen makromolekularen Biomolekülen in der zu untersuchenden Lösung geschlossen werden.

Description

Die Erfindung betrifft einen Sensor zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren, eine Sensoranordnung zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren sowie ein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren und ein Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren.
Ein solcher Sensor, eine solche Sensoranordnung sowie solche Verfahren sind aus [1] bekannt.
Fig. 1a und Fig. 1b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] beschrieben ist. Der Sensor 100 weist zwei Elektroden 101, 102 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 103 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 101, 102 sind Elektroden-Anschlüsse 104, 105 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 101, 102 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 101, 102 sind als Planarelektroden ausgebildet. Auf jeder Elektrode 101, 102 sind DNA-Fängermoleküle 106 immobilisiert (vgl. Fig. 1a). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold- Schwefel-Kopplung. Auf den Elektroden 101, 102 ist das zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 107, aufgebracht.
Sind in dem Elektrolyt 107 DNA-Stränge 108 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Fängermoleküle 106 komplementär ist, so werden diese DNA-Stränge 108 von den DNA-Fängermolekülen 106 hybridisiert (vgl. Fig. 1b).
Eine Hybridisierung eines DNA-Fängermoleküls 106 und eines DNA-Strangs 108 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Fängermoleküls 106 und des entsprechenden DNA- Strangs 108 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Fängermolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. zu hybridisieren.
Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig. 1b ersichtlich, der Wert der Impedanz zwischen den Elektroden 101 und 102. Diese veränderte Impedanz wird durch Anlegen einer Wechselspannung mit einer Amplitude von ungefähr 50 mV an die Elektroden-Anschlüsse 104, 105 und dem dadurch resultierenden Strom mittels eines angeschlossenen Messgeräts (nicht dargestellt) bestimmt.
Im Falle einer Hybridisierung verringert sich der kapazitive Anteil der Impedanz zwischen den Elektroden 101, 102. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sowohl die DNA-Fängermoleküle 106 als auch die DNA-Stränge 108, die eventuell mit den DNA- Fängermolekülen 106 hybridisieren, nicht-leitend sind und somit anschaulich die jeweilige Elektrode 101, 102 in gewissem Maße elektrisch abschirmen.
Zur Verbesserung der Messgenauigkeit ist es aus [2] bekannt, eine Vielzahl von Elektrodenpaaren 101, 102 zu verwenden und diese parallel zu schalten, wobei diese anschaulich miteinander verzahnt angeordnet sind. Die Abmessung der Elektroden und der Abstände zwischen den Elektroden liegen in der Größenordnung der Länge der zu detektierenden Moleküle, d. h. der DNA-Stränge 108 oder darunter, beispielsweise im Bereich von 200 nm und darunter.
Aus [3] ist eine weitere Vorgehensweise zum Untersuchen des Elektrolyt hinsichtlich der Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und aufgrund der Fluoreszenzeigenschaften der markierten Moleküle wird deren Existenz bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf das Elektrolyt gestrahlt und das von dem Elektrolyt, insbesondere von dem nachzuweisenden markierten DNA-Strang, infolge von Fluoreszenz reflektierte Licht wird detektiert. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d. h. insbesondere aufgrund der detektierten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyt enthalten ist oder nicht.
Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genau Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden DNA- Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist.
Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Detektionsmittels zum Detektieren der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt detektiert werden können.
Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Der Erfindung liegt somit das Problem zugrunde, makromolekulare Biopolymere auf einfache, kostengünstige und robuste Weise zu detektieren.
Das Problem wird durch den Sensor, die Sensoranordnung, das Verfahren zum Detektieren von makromolekularen Biopolymeren sowie durch das Verfahren zum Herstellen eines Sensors zum Detektieren von makromolekularen Biopolymeren mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen.
Ein Sensor zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen weist
  • - einen Strahlungsdetektor und
  • - eine über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordnete strahlungsdurchlässige Haftschicht auf, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können.
Die Haftschicht kann beispielsweise durch Epoxid- Hydroxyl-, Amin-, oder Acetoxyreste gebildet werden, die gemäß bekannten Verfahren zur Aufnahme von DNA-Fängermolekülen oder auch von Molekülen zum Halten weiterer makromolekularer Biopolymere immobilisiert werden können. Die Haftschicht kann auch Glas (SiO2) aufweisen.
Die Haftschicht kann ferner beispielsweise mit einem Beschichtungsmaterial mit Epoxid-, Hydroxyl-, Amin-, oder Acetoxyresten versehen werden, die dazu verwendet werden können, um DNA-Fängermoleküle oder auch Liganden, die imstande sind, weitere makromolekulare Biopolymere spezifisch zu binden, auf der Oberfläche des Haltebereichs zu binden.
Die Haftschicht kann außerdem durch eine Schicht gebildet werden, die vorzugsweise Gold aufweist, so dass mittels der bekannten Gold-Schwefel-Kopplung ein Binden der Fängermoleküle auf der Goldschicht möglich wird.
Der Sensor zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen zeichnet sich durch einen besonders einfachen Aufbau aus und kann in einer kompakten Baugröße realisiert werden.
Weiterhin ist eine Anordnung zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen vorgesehen, aufweisend
  • - einen Sensor mit einem Strahlungsdetektor,
  • - eine über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschicht, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
  • - eine Strahlungsquelle, welche relativ zu dem Strahlungsdetektor derart angeordnet ist, dass die von der Strahlungsquelle emittierte Strahlung auf die strahlungsempfindliche Seite des Strahlungsdetektors trifft.
Die Verwendung einer Strahlungsquelle, deren Strahlungscharakteristik, insbesondere Wellenlänge, Intensität und/oder Raumwinkel bezüglich eines Sensors optimiert werden kann, schafft ein besonders hohes Signal-zu- Rausch-Verhältnis, wodurch die Sensitivität des Sensors verbessert wird.
Weiterhin ist ein Verfahren vorgesehen zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen mittels eines Sensors mit
  • - einem Strahlungsdetektor,
  • - einer über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschicht, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
  • - einer vorgegebenen Sorte von Fängermolekülen, welche an die Haftschicht gebunden und derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen komplementäre Nukleinsäuren, spezifische Peptide, spezifische Proteine und/oder spezifische niedermolekulare Verbindungen gebunden werden können,
bei dem
  • - die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben wird,
  • - der Strahlungsdetektor bestrahlt wird, und
  • - das Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen gestattet eine zuverlässige, weitgehend unproblematische Detektion von makromolekularen Biopolymeren.
Weiterhin ist ein Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren vorgesehen,
  • - bei dem auf einem Substrat ein Strahlungsdetektor gebildet wird,
  • - bei dem über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors eine strahlungsdurchlässige Haftschicht ausgebildet wird, und
  • - bei dem Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden.
Das Verfahren zur Herstellung eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen zeichnet sich durch einen besonders einfachen Ablauf aus. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können Sensoren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen geschaffen werden, die in einer sehr kompakten Baugröße realisiert werden können.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung sind bei dem Sensor Fängermoleküle an die Haftschicht gebunden, wobei die Fängermoleküle derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen komplementäre Nukleinsäuren, spezifische Peptide, spezifische Proteine und/oder spezifische niedermolekulare Verbindungen gebunden werden können.
Der Sensor ermöglicht das Binden bzw. das Hybridisieren von Fängermolekülen unmittelbar über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors, so dass im Falle der Detektion von zu den Fängermolekülen komplementären Molekülen eine signifikante Änderung des Sensorsignal erzeugt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung sind die Fängermoleküle Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und/oder niedermolekulare Verbindungen.
Da mit dem Sensor jeweils zu den Fängermolekülen komplementäre Makromoleküle detektiert werden können, ermöglichen als Fängermoleküle ausgebildete Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und/oder niedermolekulare Verbindungen die Detektion von Nukleinsäuren, Peptiden, Proteinen und/oder niedermolekularen Verbindungen.
Ferner kann die Haftschicht Hydroxylreste, Epoxidreste, Aminreste, Acetoxyreste, SiO2 und/oder Gold aufweisen.
Derartige Bestandteile in der Haftschicht verbessern das Binden bzw. Immobilisieren von einer Vielzahl von unterschiedlichen Fängermolekülen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht eine Oxidschicht ausgebildet.
Eine derartige Oxidschicht, die z. B. Kupferoxid, Glas (SiO2), Aluminiumoxid und/oder Zinkoxid aufweist, kann den Strahlungsdetektor sowohl vor mechanischen als auch vor chemischen Einwirkungen schützen, so dass die Lebensdauer des Strahlungsdetektors erhöht wird.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht eine weitere Schicht angeordnet, welche Fluoreszenzfarbstoffe aufweist.
Mittels einer derartigen, Fluoreszenzfarbstoffe aufweisenden Zwischenschicht kann die Wellenlänge der von dem Strahlungsdetektor nachzuweisenden Strahlung umgewandelt werden. Auf diese Weise kann für die Detektion der Strahlung durch den Strahlungsdetektor ein Wellenlängenbereich ausgewählt werden, der sich von dem Wellenlängenbereich der Strahlung unterscheidet, die von den detektierten Biomolekülen absorbiert wird. Die Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht somit zum einen, dass die von den detektierten Biomolekülen absorbierte Strahlung in einem Wellenlängenbereich liegt, in dem die detektierten Biomoleküle eine hohe Absorption aufweisen und zum anderen, dass die Wellenlänge der von dem Strahlungsdetektor detektierten Strahlung in einem Bereich liegt, in dem der Strahlungsdetektor eine hohe Empfindlichkeit aufweist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Strahlungsdetektor eine Photodiode.
Da eine Photodiode, vorzugsweise eine pn-Photodiode, ein sehr preiswertes optoelektronisches Bauelement ist, kann der erfindungsgemäße Sensor kostengünstig realisiert werden.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist der Strahlungsdetektor ein Array mit mehreren Strahlungsdetektoren auf.
Auf diese Weise wird ein Sensor mit einem ortsauflösenden Strahlungsdetektor geschaffen. Ein derartiger Strahlungsdetektor stellt eine Voraussetzung für einen Sensor dar, mit dem simultan mehrere Detektionen von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden können.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist der Strahlungsdetektor eine CCD-Kamera oder eine CMOS-Kamera.
Eine CCD-Kamera bzw. eine CMOS-Kamera stellt einen preiswerten Strahlungsdetektor dar, der eine Vielzahl von einzeln auslesbaren Detektorfeldern aufweist. Somit kann auf kostengünstige Weise ein Sensor mit einem ortsauflösenden Strahlungsdetektor geschaffen werden. Ein ortsauflösender Strahlungsdetektor stellt eine Voraussetzung für einen Sensor dar, mit dem simultan mehrere Detektionen von verschiedenen Arten von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden können.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist über jedem einzelnen Detektorelement des Strahlungsdetektors jeweils eine vorgegebene Sorte von Fängermolekülen angeordnet, so dass gleichzeitig verschiedene makromolekulare Biomoleküle detektiert werden können.
Diese Weiterbildung ermöglicht den gemeinsamen Aufbau von mehreren erfindungsgemäßen, parallel angeordneten Sensoren, so dass bei geeigneter Wahl und Anordnung von unterschiedlichen Arten von Fängermolekülen mehrere Arten von makromolekularen Biopolymeren gleichzeitig detektiert werden können.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Strahlungsquelle eine Leuchtdiode oder ein Laser.
Die Verwendung einer Leuchtdiode hat den Vorteil, dass die Strahlungsquelle sehr kostengünstig realisiert werden kann. Zudem zeichnet sich eine Leuchtdiode durch eine lange Lebensdauer aus. Die Verwendung eines Laser hat den Vorteil, dass die emittierte Strahlung mit einer großen Intensität auf den Sensor gerichtet werden kann, wodurch ein besonders hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erzielt und somit die Sensitivität der Sensoranordnung zusätzlich verbessert werden kann.
Ferner können aus einer Vielzahl von erhältlichen optoelektronischen Bauelementen geeignete Leuchtdioden bzw. Laser ausgewählt werden, wobei die Wellenlänge der emittierten Strahlung an einen Bereich erhöhter Empfindlichkeit, vorzugsweise an das Maximum der Empfindlichkeit des verwendeten Strahlungsdetektors angepasst ist. Damit wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zusätzlich verbessert.
Gemäß einer Ausgestaltung des Verfahrens wird, nachdem die vorgegebenen Fängermoleküle komplementäre Nukleinsäuren, spezifische Peptide, spezifische Proteine und/oder spezifische niedermolekulare Verbindungen gebunden haben und bevor der Strahlungsdetektor bestrahlt wird, die zu untersuchende Lösung von dem Sensor entfernt.
Durch das Entfernen der zu untersuchenden Lösung wird in dem Bereich vor dem Strahlungsdetektor ein sowohl Strahlung absorbierendes als auch streuendes Medium entfernt und somit die Intensität der auf den Strahlungsdetektor auftreffenden Strahlung erhöht. Dies stellt eine weitere Maßnahme dar, mit der das Signal-zu-Rausch-Verhältnis weiter verbessert werden kann.
Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen vorgesehen, bei dem
  • - die makromolekularen Biomoleküle Nukleinsäure-Moleküle sind und,
  • - nachdem die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben worden ist, eine Abbaulösung zu der zu untersuchenden Lösung zugegeben wird, wobei die Abbaulösung derart ausgebildet ist, dass selektiv alle Nukleinsäure- Moleküle abgebaut werden, welche sich nicht mit komplementären Molekülen zu doppelstrangigen Nukleinsäure-Molekülen verbunden haben.
Damit wird erreicht, dass insbesondere die Fängermoleküle, welche nicht mit komplementären Molekülen zu doppelstrangigen Nukleinsäure-Molekülen verbunden sind, abgebaut werden. Somit wird für den Fall, das die zu untersuchende Lösung keine zu den Fängermolekülen komplementäre Moleküle aufweist, die auf den Strahlungsdetektor auftreffende Lichtintensität erhöht, wodurch auf eine weitere Weise das Signal-zu-Rausch- Verhältnis weiter verbessert wird.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist fein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen vorgesehen, bei dem, nachdem das Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen worden ist,
  • - alle an die Haftschicht gebundenen Moleküle von der Haftschicht entfernt werden,
  • - Fängermoleküle einer weiteren Sorte an die Haftschicht gebunden werden,
  • - die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben wird,
  • - der Strahlungsdetektor bestrahlt wird,
  • - ein weiteres Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen wird und
  • - anhand der Auswertung der beiden gemessenen Ausgangssignale auf die Existenz der den beiden Sorten von Fängermolekülen entsprechenden makromolekularen Biomolekülen in der zu untersuchenden Lösung geschlossen wird.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen können mit einem einzigen Sensor mehrere Arten von makromolekularen Biomolekülen detektiert werden.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen vorgesehen, bei dem mittels eines Sensors mit
  • - zwei Strahlungsdetektoren,
  • - zwei über den strahlungsempfindlichen Seiten der beiden Strahlungsdetektoren angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschichten, die derart ausgebildet sind, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
  • - zwei Sorten von Fängermolekülen, welche jeweils an eine der beiden Haftschichten gebunden und derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen komplementäre Nukleinsäuren, spezifische Peptide, spezifische Proteine und/oder spezifische niedermolekulare Verbindungen gebunden werden können,
bei dem die beiden Ausgangssignale der beiden Strahlungsdetektoren zusammen gemessen und anhand der Auswertung der beiden gemessenen Ausgangssignale auf die Existenz der den beiden Sorten von Fängermolekülen entsprechenden makromolekularen Biomolekülen in der zu untersuchenden Lösung geschlossen wird.
Diese Ausführungsform der Erfindung schafft die vorteilhafte Möglichkeit, mehrere Arten von makromolekularen Biomolekülen gleichzeitig zu detektieren.
Zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht kann eine Oxidschicht ausgebildet werden.
Das Ausbilden einer derartigen Oxidschicht, die z. B. Kupferoxid, Glas (SiO2), Aluminiumoxid und/oder Zinkoxid aufweist, führt zu einem Strahlungsdetektor, der sowohl vor mechanischen als auch vor chemischen Einwirkungen geschützt ist, so dass die Lebensdauer des Strahlungsdetektors erhöht wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im Weiteren näher erläutert.
Fig. 1a und 1b zeigen einen Sensor zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren mit zwei planar­ ausgebildeten Elektroden, mittels derer die Existenz von zu detektierenden DNA-Strängen in einem Elektrolyt (Fig. 1b) bzw. deren Nicht-Existenz (Fig. 1a) mithilfe einer Kapazitätsmessung nachgewiesen werden kann;
Fig. 2a, 2b und 2c veranschaulichen ein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 3 zeigt einen Sensor zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 2a, Fig. 2b und Fig. 2c zeigen ein Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen, insbesondere zur Detektion von Nukleinsäuren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. In Fig. 2a ist zunächst ein erfindungsgemäßer Sensor 200 zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren dargestellt. Der Sensor 200 weist ein Substrat 201 auf, welches z. B. mittels eines Siliziumwafers realisiert werden kann. In das Substrat 201 sind Strahlungsdetektoren 202, 203 eingebettet. Die beiden dargestellten Strahlungsdetektoren 202, 203 sind ein Teil eines Feldes von einzelnen Strahlungsdetektoren. Die Strahlungsdetektoren 202, 203 sind gemäß diesem Ausführungsbeispiel Photodioden. Die Anordnung aus dem Substrat 201 und den darin eingebetteten Strahlungsdetektoren 202, 203 kann zum Beispiel eine herkömmliche CMOS-Kamera, wie z. B. eine CCD-Kamera sein. Das Substrat 201 und die darin eingebetteten Strahlungsdetektoren 202, 203 sind von einer dünnen Oxidschicht 204 bedeckt. Verwendet man als Substrat 201 einen Siliziumwafer, so bietet sich die Verwendung von Siliziumoxid zur Ausbildung der Oxidschicht 204 an. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel weist die Oxidschicht 204 eine Dicke von ungefähr 2 bis 20 nm auf.
Die Oxidschicht 204 ist derart ausgebildet, dass die von den Strahlungsdetektoren 202, 203 zu detektierende Strahlung im wesentlichen durchgelassen wird. Die Ausleseelektronik, mit der die Ausgangssignale der Strahlungsdetektoren 202, 203 gemessen wird, ist in Fig. 2a nicht dargestellt. Oberhalb der Strahlungsdetektoren 202, 203 sind auf der Oxidschicht 204 ferner Haftschichten 205, 206 ausgebildet. Die Haftschichten 205, 206 sind derart ausgebildet, dass an ihnen sogenannte DNA-Fängermoleküle 207, 208 binden können.
Die Haftschichten 205, 206 weisen zumindest eines der folgenden Materialien auf: Hydroxylreste, Epoxidreste, Aminreste, Acetoxyreste und/oder Gold.
Alternativ können die Haftschichten 205, 206 aus Siliziumoxid sein, und mit einer Beschichtung gebildet werden, die Epoxid-, Hyrdoxyl-, Amin-, oder Acetoxyreste aufweist. Für die Beschichtung können z. B. bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie
  • - 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
  • - 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
  • - 3-Aminopropyltriethoxysilan,
  • - 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
  • - 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, oder
andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Fängermolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy-, Acetoxy-, Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten. Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Haftschichten
205
,
206
immobilisiert.
An die Haftschichten 205, 206 ist jeweils eine bestimmte Art von Fängermolekül gebunden. Die Fängermoleküle 207, 208 sind z. B. Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und/oder niedermolekulare Verbindungen.
Wie aus Fig. 2a ersichtlich, sind oberhalb des ersten Strahlungsdetektors 202 die erste Haftschicht 204 und auf der ersten Haftschicht 204 eine erste Art von Fängermolekülen 207 angeordnet.
Entsprechend sind oberhalb des zweiten Strahlungsdetektors 203 die zweite Haftschicht 206 und auf der zweiten Haftschicht 206 eine zweite Art von Fängermolekülen 208 angeordnet. Die Funktion der Fängermoleküle 207, 208 besteht darin, dass an die Fängermoleküle 207, 208 makromolekulare Biopolymere, insbesondere DNA-Moleküle binden können, deren räumliche Strukturen zu den räumlichen Strukturen der DNA-Fängermoleküle 207, 208 komplementär sind. Die zu untersuchende Lösung 209 ist üblicherweise ein Elektrolyt, in dem die zu detektierenden Nukleinsäuren/DNA-Moleküle vorhanden sind.
Die zu untersuchende Lösung 209 wird auf den Sensor 200 gegeben. Die weitere Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von makromolekularen Biomolekularen beruht auf der Annahme, dass in der zu untersuchenden Lösung 209 mindestens eine Art von Nukleinsäuren nicht vorhanden ist, deren Struktur zu der Struktur von einer Art von Fängermolekül komplementär ist. Beispielhaft wird angenommen, dass die zu untersuchende Lösung 209 keine Nukleinsäuren enthält, deren Struktur zu der zweiten Art von Fängermolekül 208 komplementär ist.
Wie aus Fig. 2b ersichtlich, verbinden sich diejenigen Nukleinsäuren, die in der zu untersuchenden Lösung 208 enthalten sind und deren räumliche Struktur zu der Struktur der DNA-Fängermoleküle erster Art 207 komplementär ist, zu sogenannten Nukleinsäure-Doppelsträngen 220. Dieses Verbinden wird als Hybridisieren bezeichnet. Da in der zu untersuchenden Lösung 209 keine Nukleinsäuren enthalten sind, deren Struktur zu den oberhalb des Strahlungsdetektors 203 angeordneten DNA- Fängermolekülen 208 komplementär ist, hybridisieren die zweite Art von Fängermoleküle 208 nicht, d. h. sie bleiben unverändert.
In einem nächsten Schritt wird eine Abbaulösung zu der zu untersuchenden Lösung 209 zugegeben. Die Abbaulösung weist eine Mehrzahl an Nukleinsäure-Nukleasen auf. Nukleinsäure- Nukleasen sind bestimmte Enzyme, die sich dadurch auszeichnen, dass sie die einzelnen Nukleotide aus einzelstrangigen Nukleinsäuren herauslösen, so dass im Ergebnis alle einzelstrangigen Nukleinsäure-Moleküle vollständig abgebaut werden. Doppelstrangige Nukleinsäure-Moleküle werden von der Abbaulösung nicht angegriffen und bleiben unverändert. Somit bleiben nach dem Zugeben der Abbaulösung nur noch doppelstrangige Nukleinsäure-Moleküle 220 zurück. Alle anderen Molekülbestandteile sind in der Abbaulösung aufgelöst, welche nunmehr mit der zu untersuchenden Lösung 209 vermischt ist.
In einem weiteren Schritt wird das Gemisch aus zu untersuchender Lösung 209 und Abbaulösung von dem Sensor 200 entfernt.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass das Entfernen dieses Gemisches nicht unbedingt erforderlich ist. Das Entfernen des Gemisches aus zu untersuchender Lösung 208 und Abbaulösung verbessert allerdings das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Messsignals, da zumindest ein Strahlungsdetektor (in dem dargestellten Beispiel der Strahlungsdetektor 203) nicht von den zu detektierenden Makromolekülen bedeckt ist.
Der nächste Schritt ist in Fig. 2c verdeutlicht.
In diesem Schritt wird der Sensor 100 beleuchtet. Das Beleuchten ist durch die Pfeile 240 symbolisiert. Die Wellenlänge des Lichts, mit welchem der Sensor 200 bestrahlt wird, ist derart gewählt, dass sie in dem Bereich des Absorptionsmaximums der detektierten Nukleinsäure-Moleküle liegt. Auf diese Weise unterscheidet sich in besonderem Maße die auf die beiden Strahlungsdetektoren 201, 202 auftreffende Lichtintensität.
Da, wie aus Fig. 2c ersichtlich, oberhalb des Strahlungsdetektors 202 doppelstrangige Nukleinsäure-Moleküle
220 vorhanden sind, ist die auf den Strahlungsdetektor 202 auftreffende Lichtintensität aufgrund der Abschattung durch die doppelstrangige DNA-Moleküle 220 deutlich geringer als die Lichtintensität, die auf den Strahlungsdetektor 202 trifft, oberhalb dessen keine Moleküle mehr vorhanden sind, welche die einfallende Strahlungsintensität schwächen. Durch den Vergleich der Signale der beiden Strahlungsdetektoren 202, 203 kann nachgewiesen werden, auf welchem der Strahlungsdetektoren 202, 203 Nukleinsäure-Moleküle gebunden, d. h. hybridisiert wurden.
In Fig. 3 ist eine andere Ausführungsform eines Sensors 300 zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren dargestellt.
Der Sensor 300 weist ein Substrat 301 auf, welches z. B. als Siliziumwafer realisiert werden kann. In das Substrat 301 sind Strahlungsdetektoren eingebettet. Diese Strahlungsdetektoren sind als Photodioden 302, 303 ausgebildet. Oberhalb des Substrates 301 ist an der strahlungsempfindlichen Seite der Photodioden 302, 303 eine Oxidschicht 304 derart ausgebildet, dass die Photodioden 302, 303 bedeckt werden. Verwendet man als Substrat 301 einen Siliziumwafer, so bietet sich die Verwendung von Siliziumoxid zur Ausbildung der Oxidschicht 304 an.
Auf der Oxidschicht 304 sind im Bereich oberhalb der Photodioden 302, 303 Fluoreszenzschichten 305, 306 ausgebildet. Auf den Fluoreszenzschichten 305, 306 sind Haftschichten 307, 308 aufgetragen.
Die Haftschichten 307, 308 weisen zumindest eines der folgenden Materialien auf: Hydroxylreste, Epoxidreste, Aminreste, Acetoxyreste und/oder Gold.
Alternativ können die Haftschichten 307, 308 aus Siliziumoxid sein, und mit einer Beschichtung gebildet werden, die Epoxid-, Hyrdoxyl-, Amin-, oder Acetoxyreste aufweist. Für die Beschichtung können z. B. bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie
  • - 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
  • - 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
  • - 3-Aminopropyltriethoxysilan,
  • - 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
  • - 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, oder
andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Fängermolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy-, Acetoxy-, Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten. Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Haftschicht
205
,
206
gebunden bzw. immobilisiert.
An die Haftschichten 307, 308 ist jeweils eine bestimmte Art von Fängermolekül gebunden. Die Fängermoleküle sind z. B. Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und/oder niedermolekulare Verbindungen.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich, befindet sich oberhalb der ersten Photodiode 302 eine erste Art von Fängermolekül 309. Oberhalb der zweiten Photodiode 303 befindet sich eine zweite Art von Fängermolekül 310.
Der Sensor 300 zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren wird mit der zu untersuchenden Lösung 311 in Kontakt gebracht.
An dieser Stelle wird darauf hingewiesen, dass die Verwendung der Fluoreszenzschichten 305, 306 optional ist. Der Vorteil der Verwendung der Fluoreszenzschichten 305, 306 besteht unter anderem darin, dass für die Bestrahlung des Sensors 300 Licht verwendet werden kann, dessen Wellenlänge im Bereich des Absorptionsmaximum der zu detektierenden makromolekularen Biopolymeren liegt.
Bei der Auswahl der Wellenlänge des für die Bestrahlung des Sensors 300 verwendeten Lichts muss dabei die Wellenlängenabhängigkeit der Empfindlichkeit der Photodioden 302, 303 nicht berücksichtigt werden. Dies kann durch die Wahl eines geeigneten Materials für die Fluoreszenzschichten 305, 306 berücksichtigt werden, welche die Wellenlänge des auf die Fluoreszenzschichten 305, 306 auftreffenden Lichts derart umwandelt, dass die von den Fluoreszenzschichten 305, 306 reemittierte und von den Photodioden 302, 303 detektierte Strahlung eine Wellenlänge aufweist, die in einem empfindlichen Wellenlängenbereich der Photodioden 302, 303 liegt.
In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] R. Hintsche et al., Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al., Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267-283, 1997
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[3] P. Cuatrecasas, Affinity Chromatography, Annual Revision Biochem, Vol. 40, S. 259-278, 1971
Bezugszeichenliste
100
Sensor
101
Elektrode
102
Elektrode
103
Isolatorschicht
104
Elektroden-Anschluss
105
Elektroden-Anschluss
106
DNA-Sondenmoleküle
107
Elektrolyt
108
DNA-Stränge
200
Sensor
201
Substrat
202
erster Strahlungsdetektor
203
zweiter Strahlungsdetektor
204
Oxidschicht
205
erste Haftschicht
206
erste Haftschicht
207
Fängermolekül, erste Art
208
Fängermolekül, zweite Art
209
zu untersuchende Lösung
220
DNA-Doppelstränge
240
Beleuchtung
300
Sensor
301
Substrat
302
Photodiode
303
Photodiode
304
Oxidschicht
305
Fluoreszenzschicht
306
Fluoreszenzschicht
307
Haftschicht
308
Haftschicht
309
Fängermolekül, erste Art
310
Fängermolekül, zweite Art
311
zu untersuchende Lösung

Claims (20)

1. Sensor zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen mit
einem Strahlungsdetektor und
einer über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschicht, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können.
2. Sensor nach Anspruch 1, bei dem an die Haftschicht Fängermoleküle gebunden sind, welche derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen
komplementäre Nukleinsäuren,
spezifische Peptide,
spezifische Proteine und/oder
spezifische niedermolekulare Verbindungen
gebunden werden können.
3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Fängermoleküle
Nukleinsäuren,
Peptide,
Proteine und/oder
niedermolekulare Verbindungen
sind.
4. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Haftschicht zumindest eines der folgenden Materialien aufweist:
Hydroxylreste,
Epoxidreste,
Aminreste,
Acetoxyreste,
SiO2,
Gold.
5. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht eine Oxidschicht ausgebildet ist.
6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht eine weitere Schicht angeordnet ist, welche Fluoreszenzfarbstoffe aufweist.
7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Strahlungsdetektor eine Photodiode ist.
8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Strahlungsdetektor ein Array mit mehreren Strahlungsdetektoren aufweist.
9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Strahlungsdetektor eine CCD-Kamera oder eine CMOS-Kamera ist.
10. Sensor nach Anspruch 8 oder 9, bei dem über jedem einzelnen Detektorelement des Strahlungsdetektors jeweils eine vorgegebene Sorte von Fängermolekülen angeordnet ist, so dass gleichzeitig verschiedene makromolekulare Biomoleküle detektiert werden können.
11. Anordnung zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen aufweisend
einen Sensor mit
einem Strahlungsdetektor und
einer über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschicht, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
eine Strahlungsquelle, welche relativ zu dem Strahlungsdetektor derart angeordnet ist, dass die von der Strahlungsquelle emittierte Strahlung auf die strahlungsempfindliche Seite des Strahlungsdetektors trifft.
12. Anordnung zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen nach Anspruch 11, bei dem die Strahlungsquelle eine Leuchtdiode oder ein Laser ist.
13. Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen mittels eines Sensors mit
einem Strahlungsdetektor,
einer über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschicht, die derart ausgebildet ist, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
einer vorgegebenen Sorte von Fängermolekülen, welche an die Haftschicht gebunden und derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen
komplementäre Nukleinsäuren,
spezifische Peptide,
spezifische Proteine und/oder
spezifische niedermolekulare Verbindungen
gebunden werden können,
bei dem
die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben wird,
der Strahlungsdetektor bestrahlt wird, und
das Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen wird.
14. Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen nach Anspruch 13, bei dem
nachdem die vorgegebenen Fängermoleküle komplementäre Nukleinsäuren, spezifische Peptide, spezifische Proteine und/oder spezifische niedermolekulare Verbindungen gebunden haben und bevor der Strahlungsdetektor bestrahlt wird
die zu untersuchende Lösung von dem Sensor entfernt wird.
15. Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen nach Anspruch 13 oder 14, wobei
die makromolekularen Biomoleküle Nukleinsäure-Moleküle sind, bei dem
nachdem die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben worden ist
eine Abbaulösung zu der zu untersuchenden Lösung zugegeben wird, wobei die Abbaulösung derart ausgebildet ist, dass selektiv alle Nukleinsäure-Moleküle abgebaut werden, welche sich nicht mit komplementären Molekülen zu doppelstrangigen Nukleinsäure-Molekülen verbunden haben.
16. Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem,
nachdem das Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen worden ist,
alle an die Haftschicht gebundenen Moleküle von der Haftschicht entfernt werden,
Fängermoleküle einer weiteren Sorte an die Haftschicht gebunden werden,
die zu untersuchende Lösung dem Sensor zugegeben wird,
der Strahlungsdetektor bestrahlt wird,
ein weiteres Ausgangssignal des Strahlungsdetektors gemessen wird und
anhand der Auswertung der beiden gemessenen Ausgangssignale auf die Existenz der den beiden Sorten von Fängermolekülen entsprechenden makromolekularen Biomolekülen in der zu untersuchenden Lösung geschlossen wird.
17. Verfahren zur Detektion von makromolekularen Biomolekülen nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem mittels eines Sensors mit
zwei Strahlungsdetektoren,
zwei über den strahlungsempfindlichen Seiten der beiden Strahlungsdetektoren angeordneten strahlungsdurchlässigen Haftschichten, die derart ausgebildet sind, dass Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden können, und
zwei Sorten von Fängermolekülen, welche jeweils an eine der beiden Haftschichten gebunden und derart ausgebildet sind, dass daran zu den Fängermolekülen
komplementäre Nukleinsäuren,
spezifische Peptide,
spezifische Proteine und/oder
spezifische niedermolekulare Verbindungen
gebunden werden können,
bei dem
die beiden Ausgangssignale der beiden Strahlungsdetektoren zusammen gemessen und
anhand der Auswertung der beiden gemessenen Ausgangssignale auf die Existenz der den beiden Sorten von Fängermolekülen entsprechenden makromolekularen Biomolekülen in der zu untersuchenden Lösung geschlossen wird.
18. Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren,
bei dem auf einem Substrat ein Strahlungsdetektor gebildet wird,
bei dem über der strahlungsempfindlichen Seite des Strahlungsdetektors eine strahlungsdurchlässige Haftschicht ausgebildet wird, und
bei dem Fängermoleküle an der Haftschicht gebunden werden.
19. Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren nach Anspruch 18, bei dem der auf dem Substrat gebildete Strahlungsdetektor eine Photodiode ist.
20. Verfahren zum Herstellen eines Sensors zur Detektion von makromolekularen Biopolymeren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem zwischen dem Strahlungsdetektor und der Haftschicht eine Oxidschicht ausgebildet wird.
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