CN106480160A - 微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒及装置 - Google Patents

微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒及装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒以及微生物检测装置。微生物检测装置的制造方法包括以下步骤：在基材上定义采样区以及反应区。设置纤维材料于基材的反应区，其中反应区与纤维材料接触的表面含有大量的羟基。添加反应试剂至纤维材料，以及以酸性溶液处理反应区的羟基以及纤维材料。本发明具有操作简易、安全及快速分析的优势。

Description

微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试 剂盒及装置
技术领域
本发明关于一种制造方法、检测方法、装置以及试剂盒，特别关于一种用于微生物检测的微生物检测装置的制造方法、检测方法、装置以及试剂盒。
背景技术
微生物检测在食品安全检验以及医疗处所的感染控制的重要性与日俱增。其起因于当食品在加工过程中因不当或是医疗人员在手术前未充分进行人员与器械消毒，均容易发生微生物污染，常见的食品加工所导致或饮用水中常发生的微生物污染例如大肠杆菌O157:H7型(E.coli O157:H7)污染，而医疗处所常见的院内感染例如抗药性金黄色葡萄球菌感染(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，前者会导致受感染者发生出血性腹泻，后者将导致患者延长住院时间，甚或导致患者死亡。
而在研究致病微生物对食品、饮用水的污染问题或是医疗处所感染控制时，对其数量与活性的检测是相当重要的。常见的微生物计数方法有比浊法、血球板计数法、平板菌落计数法等。
然而上述方法各有其缺点，其中比浊法和血球计数法均能较快的计算出微生物数量，但不能判断微生物的活性，易受测试溶液成分与待测微生物代谢物质影响而发生假阳性结果。平板菌落计数法则需将待测样本进行序列稀释后涂布于培养基上进行培养，虽可藉由检测结果回推算出活体的微生物数量，但其操作复杂、重复性差、耗时长，不适于大批量试验。并且，上述多种分析方法需仰赖高端的检测设备，因此必须耗费时间及人力，在实验室的环境下方可进行检测。
随着民众的健康意识及对于食品安全的重视逐渐提高，居家自我检测的概念已渐渐盛行。所谓居家自我检测是指民众可在家方便随时检测，通常可利用检测试剂的颜色转变，在简便仪器或不需仪器肉眼判读的条件下，可立即观察有无微生物污染或感染的征兆。此外当色差变大时，可再到适当处所进一步详细检查。因此，居家自我检测具有方便实时及节省支出的优势。目前应用于检测饮水或食品安全的居家自我检测方法主要是应用比色法或是光度计法的原理，并利用检测试纸添加检测试剂以进行检测。使用者可根据试纸的颜色与颜色表比对，即可判读样本中所含微生物含量。这种简易的量测方法，为民众带来了极大的便利性及安全性。然而现有的检测试纸多数皆经过多重的加工，在制造的过程中所添加的物质(例如含氯的漂白水或其他危险化学物质)则有可能使检测试纸的安全性产生疑虑。
因此，如何提供一种检测装置制造方法、检测方法、试剂盒及装置，其具有试纸相当的简易操作性，并同时具有检测速度的控制性及实际应用时安全性，已成为课题之一。
发明内容
有鉴于上述课题，本发明的目的为提供一种微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒以及装置，其具有试纸的简易操作性，并同时具有检测速度的控制性及实际应用时的安全性。
为达上述目的，依据本发明的一种微生物检测装置的制造方法，包括以下步骤：在基材上定义采样区以及反应区；设置纤维材料于基材的反应区，其中反应区与纤维材料接触的表面含有大量的羟基；添加反应试剂至纤维材料；以及以酸性溶液处理反应区的羟基以及纤维材料。
在一实施例中，反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenaziniummethosulfate)与硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)所组成的群组其中之一。
在一实施例中，纤维材料为α-纤维素颗粒。
在一实施例中，酸性溶液经由渗透纤维材料而后接触到反应区的所述表面以处理所述羟基。
在一实施例中，基材为纤维基材。
在一实施例中，反应区具有容置空间，容置空间形成于基材的表面，且纤维材料设置于容置空间中。
为达上述目的，依据本发明的一种微生物检测方法，包括以下步骤：准备检测装置，检测装置包含有第一基材，第一基材包含有采样区以及反应区，反应区具有纤维材料及反应试剂，其中，反应区与纤维材料接触的部分表面所含有的羟基与纤维材料经酸性溶液处理；以待测样本接触反应区并与反应试剂反应。
在一实施例中，纤维材料为α-纤维素颗粒。
在一实施例中，以待测样本接触反应区并与反应试剂反应的步骤，包括：以待测样本接触采样区，且待测样本自采样区移动至反应区与反应试剂反应。
在一实施例中，在以待测样本接触采样区且使待测样本自采样区移动至反应区的步骤后，还包括以下步骤：移除纤维材料；以及添加碱性溶液于反应区中。
在一实施例中，碱性溶液藉由第二基材以一传送方向传送至反应区，且所述传送方向实质上垂直于待测样本自采样区移动至反应区的移动方向。
在一实施例中，第一基材的亲水性高于第二基材的亲水性。
在一实施例中，第一基材进一步具有传送区，且所述传送区分别连接采样区及反应区，且反应区设置于所述传送区的截面上。
在一实施例中，反应区进一步具有第一反应部与第二反应部，且第一反应部与第二反应部分别设置于传送区的不同截面上。
在一实施例中，反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenaziniummethosulfate)与硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)所组成的群组其中之一。
为达上述目的，依据本发明的一种微生物检测试剂盒，包括：检测装置以及酸性溶液。检测装置包含有基材，基材包含有采样区以及反应区，反应区具有纤维材料及反应试剂。反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenazinium methosulfate)与硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)所组成的群组其中之一。酸性溶液用以处理反应区与纤维材料接触的部分表面所含有的羟基与纤维材料。
在一实施例中，纤维材料为α-纤维素颗粒。
在一实施例中，纤维材料先经酸性溶液处理后再置入反应区。
为达上述目的，依据本发明的一种检测装置，包含有一基材，所述基材包含有采样区以及反应区，该反应区具有纤维材料以及反应试剂。反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenazinium methosulfate)与硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)所组成的群组其中之一。并且，反应区与纤维材料接触的部分表面所含有的羟基与纤维材料经酸性溶液处理。
承上所述，本发明的微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒及装置，制出并应用包含有于反应区中设置有纤维材料以及反应试剂的微生物检测装置，以有效检测活体的微生物，例如是饮品或食物中备受关注的大肠杆菌生菌数或是葡萄球菌生菌数，或者是医疗处所为控制感染所进行的术前细菌检测或传染物筛检。并且，所使用的微生物检测装置更具有价格便宜、加工方便等优势。而反应区中设置有纤维材料可降低待测样本的传输速率并将增加反应面积，使反应速率增加并有较长的时间进行反应，可增强反应信号。而添加酸性溶液之后会使反应区中的纤维材料呈现糊状并保持潮湿状态，如此会使得待测样本更易于反应区中进行反应，而使最终反应信号更为明显。相较之下，本发明的微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒及装置，无需将待测样本进行培养，即可迅速检测出样本中是否带有一定量的活体微生物，因而具有操作简便的优势。除此之外，由于本发明的微生物检测装置的制造方法、微生物检测方法、微生物检测试剂盒及装置利用酸性溶液在进行检测反应前来处理纤维材料，可藉此中和基材中原本会妨碍后续MTT检测反应的羟基，因此能降低于检测的假阴性，增加检测的敏感度。
附图说明
图1A为本发明较佳实施例的微生物检测装置的制造方法的流程示意图。
图1B为图1A所示的制造方法所制得的微生物检测装置示意图。
图2为本发明另一较佳实施例的微生物检测方法的流程示意图。
图3为图1B所示的微生物检测装置沿A-A线的剖面示意图。
图4为图1B所示的微生物检测装置加入酸性溶液后反应区的示意图。
图5为图1B所示的微生物检测装置在移除α-纤维素颗粒与添加碱性溶液后其反应区的呈色状态示意图。
图6为本发明的另一种微生物检测装置示意图。
图7A为本发明的又一种微生物检测装置示意图。
图7B为本发明的又一种微生物检测装置示意图。
图8为以图1B所示的微生物检测装置进行大肠杆菌检测的相对强度结果示意图。
图9A为本发明的再一种微生物检测装置示意图。
图9B为本发明的再一种微生物检测装置示意图。
图9C为本发明的再一种微生物检测装置示意图。
图10为本发明实验例二的实验结果图。
具体实施方式
以下将参照相关附图，说明依本发明较佳实施例的一种检测装置，其中相同的组件将以相同的参照符号加以说明。
首先，请同时参考图1A、图1B、图3。图1A为本发明较佳实施例的一种微生物检测装置的制造方法的流程示意图。图1B为图1A所示的微生物检测装置的制造方法所制得的微生物检测装置的示意图。图3为图1B所示的微生物检测装置沿A-A线的剖面示意图。
本较佳实施例所提供的微生物检测装置制造方法所制得的微生物检测装置1并不限定应用于特定种类的待测样本，而是适用于食品安全检测装置以及生物医学检测。若以食品安全检测来说，本较佳实施例所制得的微生物检测装置可应用于检测食品中的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌等生菌数，以预防食物中毒。而于生物医学检测方面，本较佳实施例所制得的微生物检测装置1则可适用于检测患者的发炎反应是否为细菌感染所导致(例如：尿道感染、角膜感染、阴道发炎感染)，或者是于外科手术(例如：开放性骨折创伤修复或关节镜镜检手术)的术前细菌检测，或是传染性疾病筛检(例如：肺结核)等。而本较佳实施例中所称的“微生物”可为真核细胞、细菌、霉菌等。
本较佳实施例的微生物检测装置的制造方法包括以下步骤：步骤S11：在基材11上定义采样区12以及反应区13。由于本实施例中的基材11可为纤维基材、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)。而纤维基材可为木质纤维基材、棉花或纸。其中，所称的“木质纤维基材”意指植物的木质化纤维组织。木质化组织为植物形成层向内部所发展的植物组织的统称。较佳地，本实施例所使用的木质化组织包括其内的纤维素、半纤维素、果胶质和/或木质素，且上述物质对于水分子有较佳的吸附力；因此，来自采样区12的待测样本可经由木质纤维基材内部的孔道，以毛细作用将待测样本依序经传送区14至反应区13运送。当然，本实施例并不限制待测样本输入微生物检测装置1的方式，例如亦可将待测样本直接接触反应区13并与反应试剂反应，从而减少检测所需耗费的时间，并降低待测样本在传输过程中的消耗量。
本较佳实施例中的微生物检测装置1的基材11若为木质纤维材料时，其来源可为木材或竹材，较佳可以选自木质化组织较为发达的木本植物，如灌木或乔木。因此，在实际应用及制造时，以木质化组织所制成的搅拌棒、木筷或牙签。此外，当基材11为玻璃或是聚二甲基硅氧烷时，其在本步骤中则会一并加工制备出流道或微流道结构，以利后续检测时藉由毛细作用来传输待测样本。
此外，若本实施例的微生物检测装置1的基材11为木质纤维基材时，指基材11为至少部分由木质纤维基材组成的结构。在实际制造成形时，基材11较佳地整体皆以木质纤维基材组成；当然，本发明的概念亦涵盖仅有基材11为供待测样本流经的部分区域以木质纤维基材组成，藉以形成如“流道”的概念。
在某些实施方式中，基材11上可进一步设置有传送区14，且传送区14分别连接采样区12及反应区13。在实施上，各区的形状、大小原则上并未限制，因此可依检测样本或检测标的来进行设计，实际应用的形状包括但不限于圆柱、长方体、板状等，对此本发明没有限制。
接着进行步骤S12：设置纤维材料于基材11的反应区13。所称“纤维材料”可为天然纤维或合成纤维。较佳地是包含纤维素且亲水性佳的纤维材料，而本实施例的纤维材料则是以α-纤维素颗粒131为例说明。本实施例中的α-纤维素颗粒(particles)131，其粒径大小没有限制(由较大粒径的颗粒到微米粒径的粉末均可)，且不只限于纯α-纤维素颗粒，亦可包含内部部分掺杂或表面涂布α-纤维素的颗粒。由于反应区13与α-纤维素颗粒131接触的表面132本身含有大量的羟基，其存在会干扰后续检测样本与反应试剂的反应；因此，需在后续步骤进行处理，以降低使用制得的微生物检测装置1进行检测所得到的检测结果的不稳定性。
请再参考图3。在本较佳实施例中，反应区13可具有一容置空间，容置空间形成于基材11的表面111，且含有α-纤维素颗粒131设置于容置空间之中。另外，于本实施例中，容置空间如图3所示为一V型凹槽的形状。凹槽的形状、大小并未特别限制，可视检测需求而设置。而图1B及图3所示的凹槽的形状仅为示意而非用以限制本发明。实际应用时，容置空间的形状可包含但不限于长方体、正方体、圆柱、半球体、V型或上述之外其余的形状组合。反应区13的位置亦可视不同检测的需求而做弹性设置，本发明对此没有限制。
接着，进行步骤S13：添加反应试剂至纤维材料(α-纤维素颗粒131)。反应试剂包含至少两种试剂所组成。其中第一种试剂为5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenaziniummethosulfate)或硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)其中之一。第二种试剂则为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Watersoluble tetrazolium salts，WSTs)或是2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)其中之一。而水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)包含但不限于WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑)、WST-3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑)、WST-4(2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四氮唑)、WST-5(2,2’-二苯并噻唑基-5,5’-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3’-(3,3’-二甲氧基4,4’-亚联苯基)二四氮唑)、WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四氮唑)、WST-9(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-3-[4-(4-磺基苯偶氮基)-2-磺苯基]-2H-四氮唑，一钠盐)、WST-10(2,5-二-(4-硝基苯基)-3-[4-(4-磺基苯偶氮基)-2-磺苯基]-2H-四氮唑，一钠盐)、WST-11(2-(4-硝基苯基)-5-(2-磺苯基)-3-[4-(4-磺基苯偶氮基)-2-磺苯基]-2H-四氮唑)；而在本实施例中，又以WST-1或WST-8为较佳的选择。
最后，进行步骤S14：以酸性溶液处理反应区13的羟基以及纤维材料(α-纤维素颗粒131)。请再同时参考图4，图4为反应区13加入酸性溶液后呈现潮湿糊状的α-纤维素颗粒131’的示意图。本步骤S14中所使用的酸性溶液较佳为盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、柠檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、或是磷酸(phosphoricacid，H3PO4)。如前所述，由于α-纤维素颗粒131所带有的羟基(hydroxyl group)在侦测反应过程中会妨碍反应试剂的反应，例如干扰5-甲基吩嗪硫酸甲酯与3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐以及待测菌体中琥珀酸脱氢酶的反应，故本步骤S14中添加前述酸性溶液的目的，即在于藉由酸性溶液中的氢离子(H+)来中和α-纤维素颗粒131所带有的羟基，抑制纤维素上的羟基对待测样本与反应试剂反应的影响，以减低未与微生物反应时的反应；最终目的是降低在检测中的假阴性，藉此增加检测的敏感度(sensitivity)。此外，添加酸性溶液之后，会使反应区13中含有α-纤维素颗粒131’呈现糊状并保持潮湿状态。相较于完全干燥的状态，反应区13中包含呈现湿润糊状的α-纤维素颗粒131’会使得待测样本更易于反应区13中与反应试剂中的反应试剂(例如5-甲基吩嗪硫酸甲酯与3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)进行反应，而使最终反应信号更为明显。
此外，本发明亦提供一种微生物检测方法。请参考图2，为本发明另一较佳实施例的微生物检测方法的流程示意图。本实施例所例示的微生物检测方法为利用前述较佳实施例所制得的微生物检测装置1进行微生物检测的检测方法，包含以下步骤：首先，进行步骤S21：准备检测装置，检测装置如图1B所示的微生物检测装置1，包含有基材11。基材11中包含有羟基，亦即构成基材11的材质其化学结构中包含有羟基(hydroxyl group)。基材11上设置有采样区12以及反应区13，在某接些实施方式中，基材11上可进一步设置有传送区14，且传送区14分别连接采样区12及反应区13。于实施上，各区的形状、大小原则上并未限制，因此可依检测样本或检测标的来进行设计，实际应用的形状包括但不限于圆柱、长方体、板状等，对此本发明没有限制。
反应区13具有α-纤维素颗粒131以及反应试剂，并且反应区13与α-纤维素颗粒131接触的部分表面132所含有的羟基与α-纤维素颗粒131经酸性溶液处理。所适用的反应试剂种类如前一较佳实施例所述，在此不再赘述。进一步而言，将前述的反应试剂固定(immobilized)于反应区13和/或α-纤维素颗粒131的手段包括但不限于以反应试剂的部分特定官能基与反应区13和/或α-纤维素颗粒131形成共价键的方式进行连接；而非固定的手段则可例如应用涂布或其他类似(例如吸附)的方式以将化学检测试剂设置于反应区13内和/或α-纤维素颗粒131。关于反应试剂吸附于反应区13和/或α-纤维素颗粒131的方法，可藉由将反应区13和/或α-纤维素颗粒131浸泡于对应的化学试剂溶液中以完成制备。
此外，本步骤S21中将酸性溶液添加于反应区13中含有α-纤维素颗粒131的时间点，可以在使用者欲进行微生物检测前再行添加，以保持反应区13中的α-纤维素颗粒131’呈现潮湿状态。或者，也可以由微生物检测装置1的制造商在制作过程中即将酸性溶液添加于反应区13中含有α-纤维素颗粒131，亦即在微生物检测装置1出厂前，反应区13中含有α-纤维素颗粒131所带有的羟基已经过酸性溶液的“预处理(pre-treating)”而被中和掉；而为了要同时保留反应区13中的α-纤维素颗粒131’的潮湿状态，制造商可以在添加酸性溶液于反应区13后将微生物检测装置1以真空包装方式进行保存及销售。藉此，让使用者可直接使用微生物检测装置1来检测微生物，而无需在进行微生物检测前再添加酸性溶液于反应区13，亦无碍于α-纤维素颗粒131’呈现潮湿状态所提供的有利检测反应的条件。
此外请再同时参考图3，同前一实施例所述，由于α-纤维素颗粒131所带有的羟基在侦测反应过程中会妨碍反应试剂与待测样本间的化学反应，故本步骤S21中添加酸性溶液的目的，即在于降低在检测中的假阴性，藉此增加检测的敏感度，并且使得待测样本更易于已为湿润环境的反应区13中与反应试剂进行反应，而使最终反应信号更为明显。
再接着，进行步骤S22：以待测样本(未图标)接触反应区13并与反应试剂反应。在步骤S22中，待测样本同样可自采样区12移动至反应区13，或者不经由基材11的传输，待测样本直接接触反应区13的反应试剂，而其原理及方式，则与前述实施例相同，在此不再赘述。
最后，进行步骤S23：侦测待测样本在反应区13中的反应。举例而言，若使用的反应试剂包含5-甲基吩嗪硫酸甲酯与3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，则因活的微生物所携带的琥珀酸脱氢酶会将3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的四氮唑(tetrazolium)环开裂，使MTT还原为呈现紫色或蓝色的甲臜(formazan)结晶，而5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)则作为中介电子接收者(intermediate electronacceptor)来协助上述还原反应。然而，死的微生物细胞不会产生琥珀酸脱氢酶，故不会与MTT及PMS发生上述还原反应。因此，若待测样本中含有微生物活体，则会与反应区13中的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐及5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)等反应试剂发生反应而产生紫色或蓝色的甲臜(formazan)结晶，使用者则可藉由观察反应区13中是否发生蓝色或紫色等呈色反应，来判断待测样本是否具有微生物。而由于反应区13中含有α-纤维素颗粒131，对于待测样本来说，会降低在微生物检测装置1中的传输速率。亦即α-纤维素颗粒131降低了待测样本在反应区13中的传输速度，也增加了反应面积，使前述的还原反应速率增加，也有较长的时间来进行反应，故有助于增强反应信号。
请再参考图2及图5，图5为执行下述步骤S221及S222后，生物检测装置1中反应区13的状态示意图。此外，为了要使使用者更易于察反应的呈色，在其他实施方式中，在进行步骤S22使待测样本自采样区12传送至反应区13进行反应后，可更进行步骤S221：移除含有纤维材料(α-纤维素颗粒131)，以及步骤S222：提供碱性溶液，添加于反应区13中。碱性溶液可为氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氢氧化钙(Ca(OH)2)溶液，但本发明并不以此为限。
由于活的微生物所携带的琥珀酸脱氢酶与PMS及MTT进行还原反应会产生紫色或蓝色的甲臜(formazan)结晶。而此种甲臜(formazan)结晶会沉积在V型凹槽的反应区13邻近流动方向(亦即沿微生物检测装置1的长轴方向，如图5中实线箭头所示)的斜侧表面132a(亦为反应区13与α-纤维素颗粒131所接触的表面132)；因此，移除α-纤维素颗粒131后将使使用者更易于观察在表面132a上所呈现的呈色反应。并且，添加前述碱性溶液，则是提供氢氧离子(hydroxyl cation)来协助电子移转，可进一步协助沾附于表面132a上的PMS与MTT等反应试剂与移动至该处的微生物的琥珀酸脱氢酶进行还原反应，故有放大信号(增强在表面132a的呈现颜色深度)的功能。
请参考图6，为可适用于本较佳实施例的另一种微生物检测装置示意图。如图所示，微生物检测装置2具有与前述的微生物检测装置1实质上相同的结构，但微生物检测装置2是额外进行表面处理以增加基材21的稳定性，亦即在微生物检测装置2的基材21的上表面211以及下表面212上铺设有疏水层25，且反应区23为疏水层25所定义。其中，表面处理例如但不限于疏水处理，疏水试剂包含但不限于以PDMS(聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane)涂布于至少部分的基材21的上表面211及下表面212。透过上述的处理可进一步界定及缩小反应区23包含的亲水区域，以使待测样本可准确地经由未被疏水性表面处理而保留亲水性的基材21的其余区域传送至反应区23，并与反应试剂进行反应。
关于疏水处理的方式本发明没有限制。在实际应用时，亦可藉由于微生物检测装置2的上表面211和/或下表面212上涂布指甲油或光阻层；具体而言，例如当使用负型光阻SU-8负环氧树脂(SU-8epoxy-based negative photoresist)时，以UV光照射的区域不会溶于光阻显影液，即可形成疏水层25，而未以UV光照射的区域则维持其亲水的特性。然而类似的形成方式为本发明所属技术领域的通常知识者所能理解者，在此不再赘述。
请再参考图7A与7B，各为可适用于本较佳实施例的又一种微生物检测装置示意图。如图7A所示，微生物检测装置3具有与前述的微生物检测装置1实质上相同的结构，但微生物检测装置3的反应区33呈现一开放凹槽，设置于传送区34的截面341上。亦即，反应区33设置于基板31的末端，而α-纤维素颗粒331则涂布传送区34的截面341上。
此外，请参考图7B，适用欲同时针对一待测样本中的不同微生物进行测试时的装置。如图所示，生物检测装置3’具有与前述的微生物检测装置1实质上相同的结构，但微生物检测装置3’的反应区33’包含两个呈现开放凹槽构型的第一反应区33a与第二反应区33b，分别对应设置于传送区34’的截面341a及341b上，亦即，反应区33’设置于基板31’的末端，而α-纤维素颗粒331a与331b则涂布传送区34’的截面341a及341b上。而在截面341a及341b上的α-纤维素颗粒331a与331b及第一反应区33a与第二反应区33b上，可各自添加不同种类的反应试剂，以侦测待测样本中的不同微生物。
此外，请参考图9A至9C，各为可适用本实施例的再一种微生物检测装置示意图。请先参考图9A。为增进检测时进行添加碱性溶液步骤S222的操作便利性，本实施例中亦提供第二基材4，而微生物检测装置1的基材11于反应区13的下方进一步设置有凹陷部16。第二基材4包含有凸部41，凸部41的构型则以对应凹陷部16为佳，原则上使凸部41与凹陷部16两者可对应卡合即可。第二基材4可利用浸泡(soaking)等方式事先载有(loading)前述的碱性溶液。而此时，当基材11与第二基材4接触卡合后，碱性溶液会沿着第二基材4的长轴方向移动(即移动方向X2)，并经由第二基材4以传送方向Y1通过凹陷部16传送至反应区13，且传送方向Y1实质上垂直于待测样本自采样区(本图中未绘出)移动至反应区13移动方向X1。并且，若基材11的亲水性高于第二基材4的亲水性时，则可加速碱性溶液通过凹陷部16传送至反应区13的速率，有助于加快在表面132上的呈色反应。
请再参考图9B，图中所示的第二基材4’与前述的第二基材4的差异仅在于图9B中所示的第二基材4’实质上仅包含凸部41’以及由凸部41’些许延伸的本体，亦即不包含图9A中所示的第二基板4的长轴延伸本体，然其余第二基材4’与基材11的特征与构件对应连接关系则与前段所述相同，在此不再赘述。而此时，当基材11与第二基材4’接触卡合后，碱性溶液直接以传送方向Y1’通过凹陷部16传送至反应区13，且传送方向Y1’实质上垂直于待测样本自采样区(本图中未绘出)移动至反应区13的移动方向X1，增进表面132上的呈色反应。
请再参考图9C，图中所示的第二基材4”与前述图9A的第二基材4的差异仅在于图9C中所示的第二基材4”的凸部41”为方型，其所对应的基材11’的凹陷部16’亦为方形构型，然其余第二基材4”与基材11’的特征与构件对应连接关系则与前段所述相同，在此不再赘述。亦即此时，基材11’与第二基材4”接触卡合后，碱性溶液会沿着第二基材4’的长轴方向移动(即移动方向X2”)，并经由第二基材4”以传送方向Y1”通过凹陷部16’传送至反应区13’，且传送方向Y1”实质上垂直于待测样本自采样区(本图中未绘出)移动至反应区13’的移动方向X1’，增进表面132’上的呈色反应。
特别需说明的是，图9A～图9C所述的第二基材4、4’、4”皆可于部分的表面进行疏水处理，较佳地是在第二基材4、4’、4”的凸部41、41’、41”与基材11、11’的凹陷部16、16’接触处以外的表面接近进行疏水处理，以进一步界定及缩小碱性溶液由第二基材4、4’、4”传送至基材11、11’的位置，使待测样本可准确地经由未被疏水性表面处理而保留亲水性的区域传送至反应区13、13’，增进表面132、132’上的呈色反应。其中，疏水试剂的实施方式同前方实施例所述，在此不再赘述。
本发明亦提供另一较佳实施例，为一种微生物检测试剂盒，包括微生物检测装置以及酸性溶液。微生物检测装置包括基材，基材包含有采样区以及反应区，反应区具有α-纤维素颗粒及反应试剂。酸性溶液则用以处理反应区与α-纤维素颗粒接触的部分表面所含有的羟基与α-纤维素颗粒。反应试剂包含至少两种试剂，其一为5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenazinium methosulfate)或硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)其中之一，其二为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Watersoluble tetrazolium salts，WSTs)或2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)其中之一。而本较佳实施例中微生物检测试剂盒各部件的细部组成、变化方式与其他部件的连接关系，以及酸性溶液的添加方式与时机，则同于前面较佳实施例中所述，在此不再赘述。
另外，本发明亦提供一种微生物检测装置，包含有基材，基材包含有采样区以及反应区，反应区具有α-纤维素颗粒以及反应试剂。并且反应区与α-纤维素颗粒接触的部分表面所含有的羟基与α-纤维素颗粒经酸性溶液处理。而反应试剂包含至少两种试剂，其一为5-甲基吩嗪硫酸甲酯(5-Methylphenazinium methosulfate)或硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase，又称黄递酶)其中之一，其二为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、碘硝基氯化四氮唑蓝(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchloride，INT)、水溶性四氮唑盐(Water-soluble tetrazolium salts，WSTs)或2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT)其中之一。本较佳实施例中微生物检测装置各部件的细部组成、变化方式与其他部件的连接关系，则同于前面较佳实施例中所述，在此不再赘述。
接下来将以实验例具体说明本发明的前述较佳实施例的微生物检测方法及经由前述实施例所制得的微生物检测装置1的实际操作方式及效果。然需注意的是，以下的说明是用来详述本发明以使此本领域技术人员能够据以实现，且同样可应用本发明其他实施例的微生物检测装置或微生物检测试剂盒来进行，但并非用以限定本发明的范围。
实验例1：以微生物检测装置进行大肠杆菌的测试
首先，将0.023至0.026克(gram)的α-纤维素颗粒添加于反应区13的容置空间S中。以微量滴管将15.63毫摩尔浓度(mM)的4微升(μL)盐酸滴入反应区13中的α-纤维素颗粒131上，进行预处理。接着，将混合有3.26毫摩尔浓度的PMS(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)与6.03毫摩尔浓度的MTT(Invitrogen Life Sciences,Carlsbad,CA.)的反应试剂4微升滴入反应区13中的α-纤维素颗粒131。完成上述试剂的添加后，将微生物检测装置1于25摄氏度环境下风干2分钟。
接着，将经过上述步骤处理后的微生物检测装置1以采样区12的一端浸入含有经序列稀释所制备出的不同浓度(每毫升0、4×103、4×104、4×105、4×106、4×107、以及4×108菌落形成单位(colony forming unit,cfu/ml)，各样本进行9重复(N＝9))大肠杆菌菌液中，浸置时间为8分钟，使大肠杆菌菌液移动至反应区13。
之后，移除反应区13中的α-纤维素颗粒131’，将微生物检测装置1于25摄氏度环境下风干45分钟。接着，以微量滴管将31.25毫摩尔浓度(mM)的4微升(μL)氢氧化钠溶液滴入反应区13中，以增强反应区13中的呈色反应。最后以数字相机(EOS 5D Mark III,Canon,Japan)拍摄反应区13的呈色反应情况，并利用影像分析软件(ImageJ Software,NIH,USA)计算反应区13中呈色反应的强度，并将呈色反应的强度进行线性回归分析。
请参考图8，为以微生物检测装置依上述流程进行大肠杆菌检测的相对强度结果示意图。结果如图所示，在大肠杆菌浓度为0至每毫升107菌落形成单位的范围间，微生物检测装置1的呈色反应强度与大肠杆菌浓度大致成线性正相关(R2＝0.99)。
实验例二：添加HCl与未添加HCl对于PMS及MTT反应试剂的影响结果比较
首先，将0.023至0.026克(gram)的α-纤维素颗粒添加于反应区13的容置空间S中。以微量滴管将15.63毫摩尔浓度(mM)的4微升(μL)盐酸滴入反应区13中的α-纤维素颗粒131上，进行预处理。此外，同步准备另一微生物检测装置，但不将盐酸滴入反应区13中。接着同样地，将混合有3.26毫摩尔浓度的PMS(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)与6.03毫摩尔浓度的MTT(Invitrogen Life Sciences,Carlsbad,CA.)的反应试剂4微升滴入反应区13中的α-纤维素颗粒131。完成上述试剂的添加后，将微生物检测装置1于25摄氏度环境下风干2分钟。
结果如图10所示，添加有盐酸的反应区无反应产生(无变色)，说明了盐酸有效地抑制了反应试剂(PMS、MTT)与α-纤维素颗粒131的反应，而未添加盐酸的反应区则产生了颜色变化，显示添加酸性溶液于反应区13中的α-纤维素颗粒131中的确可以抑制纤维素上的羟基对反应试剂反应的影响，以减低未与微生物反应时的反应，以进一步使最终反应信号更为明显。
综上所述，本发明的检测装置及其制造方法，应用包含有化学检测试剂的反应区，以有效检测特定的检测标的，例如是食品安全中备受关注的亚硝酸盐或硝酸盐检测。由于本发明的检测装置包含有以木质纤维基材形成的结构，因此能藉由木质纤维基材对于水分子较佳的吸附性，从而增强液体样本在检测装置中的毛细作用，提升检测的速度。再者，因传统的检测试纸需要经额外加工，且在加工过程中可能使用到禁用于食品或对人体有危害的化学试剂，故若于检测时与待测食品直接接触将导致检测后的待测物品无法食用；相较之下，由于本发明的检测装置可使用天然的木质纤维基材，故在检测时，可直接接触甚或部分插入待测样本中进行检测，而检测后的待测食品仍可继续食用。除此之外，更具有价格便宜、加工方便等优势。更佳地是，由于木质纤维基材具有强韧的机械结构并相对耐酸碱，因此可较传统上使用的滤纸更具有结构强度方面的优势。
以上所述仅为举例性，而不是限制性的。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于所附的权利要求中。

Claims (19)

1.一种微生物检测装置的制造方法，包括：
在基材上定义采样区以及反应区；
设置纤维材料于所述基材的所述反应区，其中所述反应区与所述纤维材料接触的表面含有大量的羟基；
添加反应试剂至所述纤维材料；以及
以酸性溶液处理所述反应区的羟基以及所述纤维材料。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯与硫辛酰胺脱氢酶所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐、碘硝基氯化四氮唑蓝、水溶性四氮唑盐以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐所组成的群组其中之一。
3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述纤维材料为α-纤维素颗粒。
4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述酸性溶液经由渗透所述纤维材料而后接触到所述反应区的所述表面以处理所述羟基。
5.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述基材为纤维基材。
6.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述反应区具有容置空间，所述容置空间形成于所述基材的表面，且所述纤维材料设置于所述容置空间中。
7.一种微生物检测方法，包括：
准备检测装置，其中所述检测装置包含有第一基材，所述第一基材包含有采样区以及反应区，所述反应区具有纤维材料及反应试剂，且所述反应区与所述纤维材料接触的部分表面所含有的羟基与所述纤维材料经酸性溶液处理；以及
以待测样本接触所述反应区并与所述反应试剂反应。
8.如权利要求7所述的微生物检测方法，其特征在于，所述纤维材料为α-纤维素颗粒。
9.如权利要求7所述的微生物检测方法，其特征在于，以待测样本接触所述反应区并与所述反应试剂反应的步骤，包括：
以待测样本接触所述采样区，且所述待测样本自所述采样区移动至所述反应区与所述反应试剂反应。
10.如权利要求9所述的微生物检测方法，其特征在于，在以所述待测样本接触所述采样区且使所述待测样本自所述采样区移动至所述反应区的步骤后，还包括：
移除所述纤维材料；以及
添加碱性溶液于所述反应区中。
11.如权利要求10所述的微生物检测方法，其特征在于，所述碱性溶液藉由第二基材以一传送方向传送至所述反应区，且所述传送方向实质上垂直于所述待测样本自所述采样区移动至所述反应区的移动方向。
12.如权利要求11所述的微生物检测方法，其特征在于，所述第一基材的亲水性高于所述第二基材的亲水性。
13.如权利要求7所述的微生物检测方法，其特征在于，所述第一基材进一步具有传送区，且所述传送区分别连接所述采样区及所述反应区，且所述反应区设置于所述传送区的截面上。
14.如权利要求13所述的微生物检测方法，其特征在于，所述反应区进一步具有第一反应部与第二反应部，且所述第一反应部与所述第二反应部分别设置于所述传送区的不同截面上。
15.如权利要求7所述的微生物检测方法，其特征在于，所述反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯与硫辛酰胺脱氢酶所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐、碘硝基氯化四氮唑蓝、水溶性四氮唑盐以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐所组成的群组其中之一。
16.一种微生物检测试剂盒，包括：
检测装置，包含有：
基材，所述基材包含有采样区以及反应区，所述反应区具有：纤维材料；及
反应试剂，所述反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯与硫辛酰胺脱氢酶所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐、碘硝基氯化四氮唑蓝、水溶性四氮唑盐以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐所组成的群组其中之一；以及
酸性溶液，用以处理所述反应区与所述纤维材料接触的部分表面所含有的羟基与所述纤维材料。
17.如权利要求16所述的微生物检测试剂盒，其特征在于，所述纤维材料为α-纤维素颗粒。
18.如权利要求16所述的微生物检测试剂盒，其特征在于，所述纤维材料先经所述酸性溶液处理后再置入所述反应区。
19.一种微生物检测装置，包括：
基材，所述基材包含有采样区以及反应区，所述反应区具有：
纤维材料；以及
反应试剂，所述反应试剂包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯与硫辛酰胺脱氢酶所组成群组其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐、碘硝基氯化四氮唑蓝、水溶性四氮唑盐以及2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺内盐所组成的群组其中之一；
其中，所述反应区与所述纤维基材接触的部分表面所含有的羟基与所述纤维基材经酸性溶液处理。
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