CA2187406A1 - Temoin de revelation de contaminants et procede d'application a la realisation d'un antibiogramme directement effectue sur prelevement - Google Patents
Temoin de revelation de contaminants et procede d'application a la realisation d'un antibiogramme directement effectue sur prelevementInfo
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Abstract
Témoin de limite d'incubation destiné à révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement comprenant au moins une souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes sous forme déshydratée, et qui une fois régénérée sera présente à un taux de 10 3 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé pour la déshydration de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) incluant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance de la ou desdites bactéries, par exemple constitué par un indicateur coloré de changement de pH. L'invention concerne également un procédé de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture ou antibiogramme s'effectuant directement à partir du prélèvement du milieu infecté, en présence du témoin ci-dessus, utilisé comme signal limitant le temps de lecture de l'antibiogramme.
Description
- 1 2 1 ~7406 Témoin de révélation de contaminants et procédé
d'application à la réalisation d'un antibiogramme directement effectué sur prélèvement.
La présente invention concerne un procédé d'évaluation "in vitro" de la sensibilité aux antibiotiques des germes responsables d'une pathologie, procedé couramment désigné
sous le néologisme d'antibiogramme.
Elle vise également le témoin de révelation des contaminants mis en oeuvre dans ce procédé destiné à
indiquer les limites d'incubation de l'antibiogramme appelé, par conséquent, témoin limite d'incubation.
Pour le biologiste, le choix d'un antibiotique adapté au traitement d'une infection dépend, pour une large part :
- de l'étude "in vitro" de la sensibilité de la bactérie responsable de l'infection à divers agents antibactériens ou antibiotiques (réalisée par un antibiogramme) ;
- des propriétés pharmacologues des antibiotiques (diffusion dans le foyer infectieux, toxicité, etc...) et - de l'état immunitaire du patient.
Le role du laboratoire est de déterminer "in vitro" les concentrations d'antibiotiques nécessaires pour inhiber ou tuer les bactéries. Dans la pratique médicale, le choix des antibiotiques testés et des méthodes d'investigation mises en oeuvre dépendra de l'espèce bactérienne isolée, de la nature et de la gravité de l'état infectieux.
Dans des cas limités, il est possible de traiter une infection sans faire d'antibiogramme, si les données épidémiologiques permettent de suspecter la bactérie probablement responsable, et si la résistance de cette espèce évolue peu. Mais, dans le cas d'infections sévères ou récidivantes et d'infections nosocomiales dues à des bactéries fréquemment porteuses de résistances acquises (staphylocoques, entérobactéries, etc...), l'évaluation "in vitro" de la sensibilité des germes responsables est indispensable, ainsi que dans de nombreuses infections :
bactériemies, méningites, infections urinaires non compliquées, par exemple où la valeur prédictive de
d'application à la réalisation d'un antibiogramme directement effectué sur prélèvement.
La présente invention concerne un procédé d'évaluation "in vitro" de la sensibilité aux antibiotiques des germes responsables d'une pathologie, procedé couramment désigné
sous le néologisme d'antibiogramme.
Elle vise également le témoin de révelation des contaminants mis en oeuvre dans ce procédé destiné à
indiquer les limites d'incubation de l'antibiogramme appelé, par conséquent, témoin limite d'incubation.
Pour le biologiste, le choix d'un antibiotique adapté au traitement d'une infection dépend, pour une large part :
- de l'étude "in vitro" de la sensibilité de la bactérie responsable de l'infection à divers agents antibactériens ou antibiotiques (réalisée par un antibiogramme) ;
- des propriétés pharmacologues des antibiotiques (diffusion dans le foyer infectieux, toxicité, etc...) et - de l'état immunitaire du patient.
Le role du laboratoire est de déterminer "in vitro" les concentrations d'antibiotiques nécessaires pour inhiber ou tuer les bactéries. Dans la pratique médicale, le choix des antibiotiques testés et des méthodes d'investigation mises en oeuvre dépendra de l'espèce bactérienne isolée, de la nature et de la gravité de l'état infectieux.
Dans des cas limités, il est possible de traiter une infection sans faire d'antibiogramme, si les données épidémiologiques permettent de suspecter la bactérie probablement responsable, et si la résistance de cette espèce évolue peu. Mais, dans le cas d'infections sévères ou récidivantes et d'infections nosocomiales dues à des bactéries fréquemment porteuses de résistances acquises (staphylocoques, entérobactéries, etc...), l'évaluation "in vitro" de la sensibilité des germes responsables est indispensable, ainsi que dans de nombreuses infections :
bactériemies, méningites, infections urinaires non compliquées, par exemple où la valeur prédictive de
- 2 - 21~7406 l'antibiogramme et de la~CMI (concentration minimale inhibitrice) est nécessaire.
Pour définir la CMI, il doit être rappelé que l'action d'un antibiotique consiste à atteindre une cible moléculaire représentee par une étape précise du métabolisme bactérien.
Globalement, il en résulte des modifications de la croissance (bactér;ostase) et de la capacité de survie (bactéricidie) des bactéries, lorsque la concentration d'antibiotique parvenant a leur contact est suffisante. La détermination de cette concentration permet d'apprécier la - sensiblité des bactéries isolées en clinique. Différentes concentrations (ou points limites) définissent les effets bactériostatique et bactéricide : la CMI (concentration minimale inhibitrice) est la plus faible concentration d'antibiotique inhibant toute croissance visible après un temps d'incubation de 18 à 24 heures. C'est la référence universellement utilisée pour caractériser l'activité d'un antibiotique.
Par analogie avec la CMI, on définit arbitrairement la CMB (concentration minimale bactéricide) qui est la concentration d'antibiotique permettant d'obtenir après 18 heures de contact un taux de survivants inférieur ou égal à
0,01 % de l'inoculum initial.
L'activité "in vitro" d'un antibiotique est définie par ses valeurs de CMI et CMB qui peuvent être modifiées par de nombreux facteurs comme :
- 1/ La densité de l'inoculum ; en effet, plus l'inoculum est dense, plus il peut y avoir des sortes différentes de bactéries dont des bactéries inactivant l'antibiotique provoquant des différences de CMI.
- 2/ Le temps, la température et l'atmosphère d'incubation ;
en effet, la durée d'incubation est également un facteur de variabilité des CMI, qui peut dépendre de l'instabilité des antibiotiques en solution et de la "recroissance" tardive des bactéries persistantes. Une lecture après 16 à 18 heures d'incubation à 37 degrés Celsius donne des résultats les plus reproductibles.
Pour définir la CMI, il doit être rappelé que l'action d'un antibiotique consiste à atteindre une cible moléculaire représentee par une étape précise du métabolisme bactérien.
Globalement, il en résulte des modifications de la croissance (bactér;ostase) et de la capacité de survie (bactéricidie) des bactéries, lorsque la concentration d'antibiotique parvenant a leur contact est suffisante. La détermination de cette concentration permet d'apprécier la - sensiblité des bactéries isolées en clinique. Différentes concentrations (ou points limites) définissent les effets bactériostatique et bactéricide : la CMI (concentration minimale inhibitrice) est la plus faible concentration d'antibiotique inhibant toute croissance visible après un temps d'incubation de 18 à 24 heures. C'est la référence universellement utilisée pour caractériser l'activité d'un antibiotique.
Par analogie avec la CMI, on définit arbitrairement la CMB (concentration minimale bactéricide) qui est la concentration d'antibiotique permettant d'obtenir après 18 heures de contact un taux de survivants inférieur ou égal à
0,01 % de l'inoculum initial.
L'activité "in vitro" d'un antibiotique est définie par ses valeurs de CMI et CMB qui peuvent être modifiées par de nombreux facteurs comme :
- 1/ La densité de l'inoculum ; en effet, plus l'inoculum est dense, plus il peut y avoir des sortes différentes de bactéries dont des bactéries inactivant l'antibiotique provoquant des différences de CMI.
- 2/ Le temps, la température et l'atmosphère d'incubation ;
en effet, la durée d'incubation est également un facteur de variabilité des CMI, qui peut dépendre de l'instabilité des antibiotiques en solution et de la "recroissance" tardive des bactéries persistantes. Une lecture après 16 à 18 heures d'incubation à 37 degrés Celsius donne des résultats les plus reproductibles.
- 3/ La nature du milieu de culture (constituant du milieu, ~ 3 ~ 21 8 74Uo ions, pH).
Dans le but de palier à ce dernier facteur influençant l'activite "in vitro" des antibiotiques, il a été comparé de nombreux milieux de culture, parmi eux, celui de Mueller-Hinton constitue le milieu universellement utilisé
pour déterminer l'activité "in vitro" des antibiotiques.
La reproductibilité des résultats implique donc une standardisation des méthodes d'investigation.
Le biologiste dispose de plusieurs méthodes standardisées pour évaluer l'activité antibactérienne des antibiotiques et guider le choix thérapeutique. La plus simple reste la détermination de la CMI ou son approximation par une méthode d'antibiogramme automatisée.
Les méthodes d'étude de la CMI sont également utilisées pour la réàlisation d'antibiogrammes. Elles s'effectuent selon les principes de la microbiologie dominée par l'école pasteurienne et consistent :
- à isoler sur la gélose, en premier lieu, la bactérie responsable de la pathologie sur un milieu de culture classique afin de se débarrasser notamment des contaminants presents géneralement à des concentrations inférieures à
10 UFC/ml (Unité Formant Colonies/ml équivalent germe/ml) qui sont ignorés sur la gélose et ainsi seules les bactéries présentes à des concentrations supérieuresà103 UFC/ml sont étudiées ;
- puis à tester la bacterie à une concentration donnée pour réaliser l'antibiogramme dans un milieu de réaction de type Mueller-Hinton selon les techniques couramment utilisées par le biologiste, à savoir par :
- la diffusion en milieu gélosé décrite notamment dans "ECCLS Standard for antimicrobial susceptibility testing by diffusion methods" ECCLS, 1985, 5:4, ainsi que dans "Report of an international collaborative study", Acta pathol.
Microbial. Scand, Sect B, 1971, Suppl. 217 : 1-90 par Ericsson HM, Sherris JC ;
- ou la méthode par dilution décrite dans l'article "NouvelLes approches de l'étude de sensibilite des bactéries aux antibiotiques" de la Revue Francaise du Laboratoire, ~ 4 ~ 2 1 87 4 0 6 1986, 151 ; 7-12 ;
- ou l'antibiogramme automatisé décrit également dans le document susmentionné.
En résumé, la méthode par diffusion en milieu gélosé
utilise pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens et le dosage microbiologique des antibiotiques, la propriété de diffusion de l'antibiotique (dépôt en surface d'un disque de papier buvard pré-imprégné) dans un milieu de culture gélose (contenant une bactérie à tester), en réalisant un gradient de concentration.
Après 3 à 4 heures, une zone d'inhibition peut être déterminée correspondant à la distance que la concentration inhibitrice d'antibiotique a pu parcourir avant que soit atteinte une certaine densité bactérienne.
L'antibiogramme par diffusion en milieu gélosé, ou méthode des disques, est un procédé largement répandu du fait de sa simplicité et de son faible coût. Cependant, la qualité des résultats peut varier en fonction de plusieurs paramètres qui vont influer sur la constitution de la zone d'inhibition. De sorte que pour une même souche bactérienne de sensibilité à un antibiotique donné, des résultats reproductibles ne sont obtenus que pour un inoculum, un milieu et des conditions d'incubation identiques.
Pour un même antibiotique, des souches d'espèces différentes avec des temps de latence (temps de latence avant la croissance exponentielle des bactéries) et de génération très différents mais une sensibilité identique, donnent des zones d'inhibition très différentes. C'est pourquoi, les bactéries qui présentent une importante variabilite de souche a souche, liée au taux de croissance, ne peuvent etre étudiées valablement dans les conditions standardisées des tests de diffusion, qui s'appliquent aux bactéries à croissance rapide (entérobactéries, staphyloco-ques, etc.) pour lesquelles les temps critiques varient dans des limites acceptables, influant peu sur la zone d'inhibition.
D'autre part, la diffusion de l'antibiotique dans la _ ~ 5 ~ 2187406 gélose n'est pas linéaire avec la concentration d'antibiotique au niveau de la source.
Les recommandations préconisées doivent être rigoureusement suivies pour garantir l'exactitude et la reproductibilité des résultats par cette méthode. En France, La méthode la plus utilisée répond aux normes édictées par l'OMS présentées dans le 28ème rapport, de la série de rapports techniques N, 610, OMS Genève, 1977, 106-138 du Comité OMS d'Experts de la Standardisation biologique.
La composition du milieu de Mueller-Hinton est standardisée, avec en particulier, un pH de 7,4, une concentration adaptée en ions Mg++ et Ca++ , et une concentration en thymidine inférieure à 50 ng/ml.
L'épaisseur de la gélose doit être de 4 mm. L'inoculum doit être préparé, de préférence, à partir d'une culturé agitée de 4 heures au bain marie, ajustée par dilution à 2-3 x 106 bactéries par ml (étalonnage photométrique). L'ensemencement est réalisé par inondation avec quelques millilitres de cette dilution.
Selon la méthode par dilution en milieu gélosé, l'antibiotique requis par le traitement est détermine ainsi que sa CMI en ensemençant 1 à 5 ~l de l'inoculum correspondant à chaque bacterie testée (104 bactérie par spot) dans un milieu liquéfié à 45 degrés Celsius contenant chacun une concentration d'antibiotique précise.
La CMI est définie par la concentration d'antibiotique ne laissant subsister aucune ou, au plus, 1 à 3 colonies après 18 heures d'incubation à 37 degrés Celsius. Il s'agit d'une méthode de référence permettant de tester simultanément un grand nombre de souches (25 à 96 selon le type d'inoculateur) vis-à-vis d'un même antibiotique.
Les méthodes de dilution en bouillon Mueller-Hinton sont réalisées elles en tubes (macrométhode) ou en plaques de microtitration (microméthode). Les microméthodes sont plus adaptées à la pratique de l'antibiogramme, grâce à une automatisation possible de la préparation des dilutions d'antibiotiques et de la lecture des CMI. Elles permettent la détermination ultérieure des CMB. Cependant, le _ - 6 2187406 dénombrement des survivants après subculture est plus aisé
en macrométhode qu'en microméthode (un inoculum de 106 bactéries/ml représente 2 x 106 bactéries par tube de 2 ml de milieu et 5 x 104 bactéries par cupule de 50 ~l), ce qui peut expliquer une CMB plus élevée en macrométhode.
D'autre facteurs techniques peuvent influencer l'évaluation de la CMB, comme l'adhésion des bactéries survivantes aux parois des tubes ou des plaques de microtitration, une agitation insuffisante avant réalisation des subcultures, ou un phénomène de transfert d'antibiotique sur le milieu de dénombrement lié a la prise d'une aliquote de milieu trop importante (en macromethode, le volume nécessaire aux subcultures ne doit pas dépasser 0,1 ml ; il est de 5 à 10 ~l en microméthode).
D'autre part, il existe diverses méthodes d'antibiogramme permettant une lecture automatisée des résultats telles que décrites dans l'article "Nouvelles approches de l'étude de sensibilité des bactéries aux antibiotiques" de FLANDROIS JP, CARRET G, de la Revue ZO française du Laboratoire, 1986, à savoir :
- Des systèmes utilisant deux concentrations d'antibiotiques (ex : ABAC, API-ATB). Ils permettent de classer les bactéries en catégories (sensible, intermédiaire, résistant) par mesure de croissance bactérienne en présence des deux concentrations critiques, haute et basse. La croissance aux deux concentrations définit les souches résistantes, l'absence de croissance les souches sensibles, la croissance à la concentration critique basse les souches "intermédiaires". La lecture photométrique du résultat est effectuée à la 24ème heure de croissance.
- Des systèmes rapides (ex : AUTOBAC, COBAS-BACT, RAPID-ATB, VITEK). Ils étudient la croissance bactérienne en présence d'une seule concentration d'antibiotique (independante des concentrations critiques), choisie pour permettre de discriminer au mieux les populations en catégories S, I, R, par référence aux CMI des germes. Ces systèmes automatisés donnent des résultats en 3 à 6 heures.
Toutefois, les évaluations récentes des divers systèmes ~ 7 ~ 2 1 8 74 06 _ d'antibiogrammes automatisés montrent que la concordance avec la CMI, méthode de référence, existe dans plus de 85 %
des cas. Ce pourcentage de concordance peut varier selon le systéme, et les discordances observées sont surtout le fa;t de certa;ns couples "bactérie-antibiotique" : staphylocoques vis-à-vis de la méticilline, de l'érythromicine et de la clindamycine ; entérocoques vis-à-vis de la céfalotine, de la tétracycline et du chloramphénicol ; enterobacter vis-à-vis de l'ampicilline, de la céfalotine et de la tétracycline ; Klebsiella vis-3-vis de l'ampicilline ;
Serratia vis-à-vis des polymyxines ; Pseudomonas vis-à-vis de la gentamicine et de l'amikacine. Ces discordances sont liées à l'espèce étudiée et au mode d'action de l'antibiotique. Ainsi, la croissance en micro-agglutinats, la lyse tardive des bactéries par certains antibiotiques, une recroissance tardive, un mécanisme de résistance inductible à l'antibiotique, sont les causes les plus fréquentes de discordances (faux sensibles et faux résistants) dues au système de lecture automatique et au temps de lecture (3-6 heures ou 24 heures). La difficulté de détecter certains mécanismes de résistances aux ~-lactamines, aux aminosides et aux macrolides, en raison de leur niveau ou de leur mode d'expression, constitue également une source d'erreur.
Tous les systèmes automatisés permettent d'étudier la sensibilité des seules bactéries non exigeantes et à
croissance rapide.
Au vu de la description des trois techniques susmentionnées, antibiogramme par diffusion en milieu gélosé, méthode par dilution, antibiogramme automatisé, il s'avère que chacune d'elles nécessite, pour sa mise en oeuvre, l'observance minutieuse d'un protocole (température, temps d'incubation, etc.) et ne peut être généralisée à tout type de bactérie.
Outre les inconvén;ents susment;onnés inhérents à chacun des systèmes decr;ts ci-dessus, l'antibiogramme conventionnel réalisé selon l'une quelconque de ces techniques présente principalement les trois inconvénients majeurs su;vants découLant du-fait qu'elles ne tiennent pas compte :
- de la pharmacologie particulière de chaque antibiotique ;
- de l'état immunitaire du patient au stade de l'infection et/ou de la présence de corps étrangers ;
- des infections plurimicrobiennes ;
d'où il résulte des discordances entre les tests "in vitro"
(les résultats de l'antibiogramme) et la réponse au traitement.
Le premier inconvénient est dû à l'utilisation d'un milieu de réaction type Mueller-Hinton annulant complètement l'effet du contexte culturel environnemental sur l'antibiothérapie. Or, il est connu que l'affinité du germe pour une humeur ou un tissu particulier n'est pas la meme d'une humeur 3 l'autre, l'adhésivité bactérienne, donc le pouvoir pathogène, varie en fonction de nombreux facteurs.
Face à cette multitude de sites anatomiques de nature différente (urine, LCR, sang, muqueuse, ...) sur lesquels la croissance bactérienne est variable, l'antibiogramme actuel 20, ne retient, pour l'expression de la sensibilité, qu'un milieu polyvalent : le milieu de Mueller-Hinton. Ce milieu très éloigné des conditions culturelles du germe donnant l'infection en un site déterminé, ne rend pas compte de la réelle activité de l'antibiotique dans-le site où a lieu l'infection. C'est ainsi qu'un antibiotique à vocation urinaire devrait etre étudié en milieu urinaire (effet du pH, effet du NaCl, effet des ions, ...).
Certains pharmacologues ont montré que le Pseudomonas présente vis-à-vis des quinolones, des CMI variant de 1 à
100 suivant que l'on utilisait un milieu Mueller-Hinton ou un milieu à base d'urine.
Le deuxième inconvénient susmentionné est du au fait que la bactérie, après avoir été isolée, est testée à une concentation déterminée arbitraire. Or, il est connu que suivant le site d'infection, l'état immunitaire du malade, et suivant le stade de cette infection, la concentration du germe responsable peut varier.
C'est ainsi que d'un germe/ml (cas des hémocultures dans les fièvres thyphoides) les germes peuvent atteindre 104 germes/ml dans les prostatites, 106 dans les infections urinaires et 108 dans les pus profonds et méningites purulentes. IL va de soi comme on l'a déjà souligné, que le résultat de l'antibiogramme dépend de cet effet inoculum.
Le troisième inconvénient susmentionné résulte de l'isolement de la bactérie pathogène du prélèvement pour réaliser l'antibiogramme. Ainsi on ne tient pas compte de la présence de plusieurs bactéries sur le même site d'infection qui peuvent présenter des interactions dont certaines sont très connues, à savoir :
- 1/ Synergie entre différents germes (exemple de certains écosystèmes) :
- association fuso-spirillaire dans l'angine de Vincent (présence de Fusobacterium nucleatum et de spirochètes) - mycoplasmes et anaérobies dans les vaginoses (par effet pH).
- 2/ Antagonisme :
- Saccharomices cerivisiae et Clostridium difficile (par compétition) - Proteus mirabilis et Streptococcus faecalis (par effet pH).
- Par les méthodes classiques d'antibiogramme, l'étude de la sensibilite "in vitro" des antibiotiques pour des germes d'une infection plurimicrobienne est alors forcément différente de la réalité "in vivo", car les germes sont testés isolément à partir de plusieurs colonies pures.
Autrement dit, l'étude de la sensibilité des antibiotiques pour des germes d'une infection plurimicrobienne sera forcément différente si les germes sont étudiés simultanément dans le meme milieu (antibiogramme effectué directement sur l'écouvillon) ou si les germes sont testés isolément à partir de plusieurs colonies pures (antibiogramme conventionnel). Pour ces raisons, il semble évidemment préférable d'effectuer une étude de sensibilité, aux antibiotiques directement à partir de l'écouvillon dans un milieu qui pourra exprimer pour un ant;biotique donné la synergie ou l'antagonisme des differentes bactéries présentes dans le prélèvement plurimicrobien.
- 2 1 ~37406 Toutefois, malgré cette év;dence, il n'existe pas de technique fiable d'antibiogramme directement sur le prélèvement.
Par ailleurs, la lecture interprétative de l'antibiogramme conventionnel conditionne également les chances de succès thérapeutique. Il faut savoir "lire entre les lignes" d'un antibiogramme et déceler un méc.anisme de résistance qui ne s'exprime que faiblement "in vitro", mais qui est inscrit dans l'ADN bactérien et peut entra;ner une mauvaise réponse du traitement. Ceci implique une connaissance rigoureuse de ces mécanismes et des phénotypes qu'ils entra;nent. Cette connaissance ne doit pas rester l'apanage de quelques spécialistes, il est probable que dans un proche avenir, le développement de systèmes experts contribuera à une meilleure validation des techniques d'antibiogramme.
Un objet de l'invention est donc de remédier aux inconvénients des antibiogrammes classiques ou conventionnels en testant la croissance (qui se visualise par une zone trouble) ou l'absence de croissance des bactéries pathogènes prélévées directement du milieu infecté
à traiter et inoculées dans des milieux contenant chacun un antibiotique différent présent à une concentration égale à
sa CMI.
Selon le procédé de l'invention, ce but est atteint grâce au fait que l'évaluation de la sensibilité du prélèvement aux différents antibiotiques (ou antibiogramme) s'opère en présence d'un témoin de révélation des contaminants, appelé témoin limite d'incubation.
Ce témoin de limite d'incubation comprend au moins une souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes sous forme déshydratée, et qui,une fois régénérée,sera présente à un taux de 10 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé
pour la déshydratation de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) comprenant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance, de préférence constitué par un indicateur de virage de pH.
'~ 2 1 8 7 4 0 6 Selon une variante de réalisation, le substrat et l'indicateur de croissance tel que, par exemple, l'indicateur de virage de pH sont contenus dans le milieu de rehydratation ou régénération de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s).
L'utilisation du témoin limite d'incubation (ou TLI) pour la réalisation d'antibiogramme effectué directement sur le prélèvement permet de détecter précisément le moment où
les contaminants présents dans ce témoin (en général également présents à des concentrations inférieures ou égales a 103 UFC/ml dans le prélèvement) poussent en créant une modification dudit témoin TLI (virage d'un indicateur coloré, apparition d'un trouble ou variéte de l'activité
ATPéasique).
A ce moment précis, la lecture de l'antibiogramme doit etre stoppée car la croissance révélée par ce dernier ne correspond plus uniquement à celle des bactéries pathogènes mais egalement à celle des contaminants présents dans ledit prélèvement ce qui fausse les résultats de l'antibiogramme.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, ce moment précis est signalé et visualisé, de préférence, par le virement d'un indicateur coloré agissant comme révélateur de la croissance des bactéries contaminantes.
Grace au fait que la croissance des contaminants est dépendante de la température du milieu, l'antibiogramme peut alors s'effectuer à plusieurs vitesses en jouant sur la température.
L'antibiogramme selon l'invention, réalisé directement sur le prélèvement procure notamment les avantages suivants :
- de donner, et c'est un avantage majeur, des resultats "in vitro" plus en accord avec la réalité "in vivo" car - il garantit d'avoir dans le milieu de culture des eléments culturels venant du prélèvement lui-meme, à la différence de l'antibiogramme conventionnel effectué à
partir d'une colonie pure ;
- il tient compte de l'effet inoculum ; en effet, le milieu inocule et testé envers différents antibiotiques - 12 - 21 874!J6 comporte les concentrations et proportions de micro-organismes présents dans le site infecté et la réponse aux antibiotiques a été obtenue dans des conditions comparables à celles du milieu naturel infecté et non plus à une concentration arbitraire ;
- il tient compte des intéractions bactériennes existantes dans le cadre des infections plurimicrobiennes ; l'étude de sensibilité aux antibiotiques directement à partir du prélèvement se fait en effet dans un milieu qui peut exprimer pour un antibiotique donné la synergie ou l'antagonisme des différentes bactéries présentes dans le prélèvement plurimicrobien, ce qui n'est pas possible dans le mil;eu type Mueller-Hinton, dans lequel seule la bactérie isolée est testee.
- d'être rapide et facile a mettre en oeuvre ; en effet, les étapes d'isolation de la bactérie pathogène sont supprimées et les conditions expérimentales de l'antibiogramme sont simplifiées (températures variables, temps variable... ;
- d'être d'une lecture facile.
Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus et d'autres encore ressortiront mieux de la description qui suit dans laquelle des exemples non limitatifs de composition du témoin limite d'incubation sont décrits ainsi que son procédé d'utilisation à la réalisation d'un antibiogramme directement effectué sur le prélèvement.
Le témoin de révélation des contaminants ou TLI est remarquable par le fait qu'il comporte, d'une part, au moins une catégorie de bactérie classiquement contaminante présente à un taux maximum, par exemple égal ou inférieur à
103 UFC/ml avec son substrat approprié et, d'autre part, un révélateur de la croissance des contaminants, de préférence, un indicateur coloré de changement de pH dans un milieu standard à pH determiné.
La bactérie classiquement contaminante peut etre de différentes catégories suivant qu'il s'agit d'une bactérie qui dégrade l'urée (bactérie uréase +~ comme par exemple Coryne Bactérium, staphylococcus intermedius, etc, et/ou le - 13 - 2 1 ~7406 -glucose (bactérie glucose +) comme par exemple Escherichia Coli, staphylococcus intermedius, etc. De très nombreuses espèces de bactéries (environ 90 % des espèces) dégradent le glucose, comme la famille des bacilles gram - et gram +, ce qui permet d'avoir un choix important pour la bactérie classiquement contaminante du témoin limite d'incubation.
Le choix de cette bactérie peut de façon avantageuse être guidé par le type de l'infection où le prélèvement est effectué et qui présente des contaminants qui peuvent être connus Le substrat est fonction de la bactérie contaminante et peut notamment être du glucose, de l'urée, etc.
Le pH du milieu est maintenu acide dans le cas où l'urée est le substrat, et basique dans le cas où il s'aglt du glucose.
A titre indicatif, le témoin limite d'incubation contenant la bactérie uréase + : staphylococcus intermedius, comporte également de l'urée, un indicateur de virage dans un milieu à pH acide (5,5).
Afin de permettre une meilleure conservation de la bactérie contaminante, cette derniere est présente, au depart, dans le temoin limite d'incubation sous forme déshydratée, de façon a être, une fois régénérée, à un taux de 103 UFC/ml maximum.
Selon une première forme de mise en oeuvre de l'invention, le milieu de réhydratation de la bactérie contaminante déshydratée est un milieu de culture conventionnel à un pH détermine (acide dans le cas d'une bactérie urease + et basique dans le cas d'une bacterie glucose +) et contenant alors :
- le substrat - et/ou l'indicateur de virage de pH.
De façon avantageuse, on peut ajouter dans ce milieu de réhydratation, divers réactifs améliorant la pousse des coccies gram + (comme des staphylocoques) qui présentent une croissance moins rapide que les bacilles gram - en milieu conventionnel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre de l'invention, le substrat, l'indicateur de pH et les réactifs sont contenus dans le milieu de déshydratation correspondant à un milieu de culture conventionnel à pH déterminé (acide dans le cas d'une bactérie uréase + et basique dans le cas d'une bactérie glucose +) contenant des élements essentiels connus en soi pour la stabilité de la bactérie déshydratée, par exemple : gélatine à 1 % final, sérum de poulain à 68 %
final, polyol à 1,2 % final. D'autre part, dans ce déshydratat, divers réactifs qui améliorent la croissance des coccies gram + comme les statphylocoques, sont ajoutes.
Ces réactifs peuvent être également ajoutés dans le milieu de réhydratation : Arg a 0,05 % final, Cyst à 0,05 % final, Thiamine 0,1 % final, acide nicotinique 0,1 % final. Ces réactifs supplementaires ont pour but d'ameliorer la pousse des coccies gram + qui présentent une croissance moins rapide que les bacilles gram - en milieu conventionnel.
Le milieu défini pour notre test comporte donc les elements essentiels pour une croissance des bacilles gram -et des coccies gram +, et ne favorise aucun micro-organisme des deux groupes plus qu'un autre.
Ce milieu est également adapté à la croissance des contaminants que l'on rencontre dans les infections externes : otites, pyodermites.
En effet, le substrat, l'indicateur de virage de pH et les reactifs susmentionnés peuvent être présents de façon interchangeable dans le milieu de déshydratation ou dans le milieu de réhydratation, comme indique ci-dessus.
Le principe mis en oeuvre dans le témoin limite d'incubation consiste à révéler la croissance des bactéries contaminantes par le changement de pH du milieu qui en résulte.
En effet, la croissance par exemple d'une bactérie uréase + nécessite la dégradation de l'urée qui provoque une alcalinisation du milieu. L'alcalinisation du milieu est due lors de la dégradation de l'urée au dégagement d'ammoniac selon la réaction suivante :
~ NH2 H20 + 0 = C \ ~ C~2 + 2NH3 Alors que la croissance d'une bacterie glucose +, grace à la dégradation du glucose, provoque l'acidification du milieu.
De façon préférentielle, l'indicateur du pH est le rouge de phénol, de couleur rouge à pH alcalin et jaune à pH
acide.
Selon une caractéristique importante de l'invention, le virage du témoin limite d'incubation se fait avec une cinétique :
- proportionnelle à la concentration de bactérie contaminante du départ ; et - proportionnelle à la temperature environnante de 24 heures a 40 degrés Celsius à 4 jours à 20 degres Celsius.
Selon l'invention, la concentration de bactérie contaminante est constante, 103 UFC/ml, de sorte que le virage dépend uniquement de la température environnante. En effet, la chaleur apportee au temoin limite d'incubation favorise alors les réactions biochimiques de dégradation du substrat par la bacterie contaminante. Le changement de pH
et sa révélation avec l'indicateur colore se fait, par conséquent, de façon plus ou moins rapide, selon la température apportée au témoin limite d'incubation.
Les travaux et expérimentations ayant abouti à la présente invention ont essentiellement porté sur l'utilisation de ce témoin de révélation des contaminants pour la réalisation d'un antibiogramme effectué directement sur le prélèvement.
Il ne s'agit cependant pas d'une application limitative.
En effet, ce tèmoin limite d'incubation, de par sa composition et sa destination, permet de révéler tous contaminants et peut être utilisé de façon plus générale dans le cadre d'expériences et de tests pratiqués directement sur tout prélèvement de tissus ou de milieux infectieux, en vue de déterminer et de visualiser la croissance des contaminants pouvant etre présents dans le - 16 - 2 1 a7406 prélèvement.
De façon particulière, ce témoin limite d'incubation peut également etre utilise dans le cadre de l'identification des bactéries à taux suprapathologique (supérieur à 10 UFC/ml) effectue directement à partir d'un prelèvement. Ces dernières sont détectées par leur croissance formant un trouble dans le milieu avant que le témoin limite d'incubation ne vire.
Selon l'invention, la realisation d'un antibiogramme consiste en premier lieu, à prélever du milieu infecte contenant les bactéries pathogènes à tester, sous forme d'écouvillon du tissu infecté ou sous forme de liquides biologiques (liquide d'épanchement infecté...), à l'inoculer dans des milieux de culture contenant différents antibiotiques à leur CMI. De façon preférentielle, on dilue le milieu prélevé à 102 UFC/ml, dans un milieu de transport qui garde viable toutes les espèces bactériennes aux memes concentrations que celles du prélèvement, puis on ensemence dans un milieu de culture et on inocule ensuite ce milieu de culture ensemencé à différents antibiotiques présents, à
leur CMI.
A titre indicatif, et dans notre cas d'etude 200 ~l de ce milieu ont été distribués dans divers puits ou autres réceptacles contenant différents antibiotiques, à leur CMI
dans un m;lieu de culture conventionnel.
Gr3ce au milieu de transport utilise qui garde stable 10 heures à la température ambiante et 24 heures à 4 - 8 degrés Celsius le milieu de transport ensemence, le technicien de laboratoire ou de façon plus générale le manipulateur n'est pas contraint d'inoculer rapidement après l'ensemencement.
Il est nécessaire pour que les résultats de l'antibiogramme soit correct que le témoin limite d'incubation soit réhydraté ou préparé lorsque que le prélèvement est inoculé aux différentes concentrations d'antibiotiques. Ce moment determine le point de départ (T = 0) des différentes réactions s'effectuant entre bacteries, antibiotiques, contaminants et substrats du prélèvement présents dans les diffèrents puits ou réceptables contenant les différents antibiotiques ainsi que la réaction de dégradation du substrat par la bactérie contaminante dans le témoin limite d'incubation.
La lecture de cet antibiogramme est simple en ce sens qu'il suffit de voir avant le changement de couleur du témoin limite d'incubation dans quel puits ou réceptable aucune bactérie s'est développée (aucun trouble) pour savoir quel est ou quels sont les antibiotiques requis pour le traitement de l'infection où s'est effectué le prélèvement.
Cette lecture est conditionnée au changement de couleur du témoin limite d'incubation.
Par exemple, la lecture de l'antibiogramme est stoppée des que le temoin d'incubation limite initialement jaune (pH
5,5) vire au rouge lorsque le témoin limite d'incubation contient la bactérie uréase + ; staphylococcus intermedius, de l'uree et du rouge de phénol.
Selon une caracteristique avantageuse de l'invention, le virage du temoin d'incubation limite est uniquement proportionnel à la température environnante de 18 à 24 heures à 40 degrés Celsius, de 36 à 44 Heures à 25 degrés Celsius et 4 jours à 20 degrés Celsius.
La réalisation d'un antibiogramme directement sur le prélèvement à des températures variables d'un test à l'autre ou variables dans le temps pour une température constante est ainsi possible. En effet, tant que le témoin d'incubation limite ne vire pas, la lecture de l'antibiogramme est possible sans risque d'interférence des contaminants. L'effet de la température sur la croissance des bactéries aura lieu aussi bien sur le témoin d'incubation limite que sur le système d'antibiogramme dans lequel se retrouvent les germes responsables de l'infection.
Quelle que soit la temperature, les bactéries pathogènes présentes sur le site de l'infection poussent avant que le témoin limite d'incubation ne vire. Seul le temps que met le temoin limite dlincubation à virer dépend de la température ambiante, généralement :
- 40 degrés Celsius - 18 à 24 heures - 25 degrés Celsius - 36 à 44 heures - 20 degrés Celsius - 4 jours (96 heures) Cette sécurité permet de réaliser des antibiogrammes non seulement directement à partir du prélèvement mais de ne pas se soucier des conditions de température, donc de réaliser ces tests en ambulatoire, soit par les vétérinaires, soit par des médecins eloignés d'une unité de laboratoire. On peut en effet pratiquer l'antibiogramme sans étuve et sans régulation de température.
Dans des conditions opératoires simplifiées (à partir du prélèvement, sans souci de température) cet antibiogramme peut etre non seulement pratique par un personnel non spécialisé, mais de plus par le malade lui-meme (dans le cadre d'infections urinaires de la femme enceinte éloignée d'un centre médical, plaie de blessure de guerre, ...), donc dans le cadre de la médecine humanitaire ou de la médecine de guerre.
Le vétérinaire ou autre utilisateur de cet antibiogramme a ainsi la certitude que l'antibiotique révélé efficace "in vitro" par cet antibiogramme aboutira plus certainement à un rèsultat thérapeutique. Compte tenu de l'exposé qui precède, les moyens permettant de réaliser les antibiogrammes, selon l'invention, peuvent etre avantageusement executes sous forme de kits.
Outre la connaissance du type ou des types d'antibiotiques requis pour le traitement, l'antibiogramme exécuté selon l'invention, permet également de connaître si le taux de bactérie prélevé et testé est ou non suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un pouvoir pathologique probable) quelle que soit la température dans laquelle l'antibiogramme est porté.
En effet, si une croissance bactérienne se produit dans les tubes contenant un antibiotique précis à sa concentration CMI et du prélévement (se visualisant sous la forme de trouble) avant que le témoin d'incubation limite ne vire du jaune au rouge, l'on est sûr que la bactérie présente sur le site de l'infection est présente à un taux supérieur à 10 UFC/ml donc qu'elle correspond à un taux dit suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un pouvoir pathologique probable).
Inversement, si aucune croissance bactérienne ne se produit avant que le témoin d'incubation limite ne vire, cela signifie qu'aucune bactérie n'est présente sur le site d'infection à des concentrations inférieures à 103 UFC/ml.
Si après que le témoin d'incubation limite ait viré au rouge une croissance bactérienne apparaît, il peut s'agir :
- d'un contaminant si le prélèvement est un prélèvement externe (muqueuse, pus, urines...) ;
- d'un germe d'une humeur profonde à un taux supérieur à
103 UFC/ml (ex : Hémoculture ou LCR : milieu ne présentant jamais de contaminant).
Dans le but de palier à ce dernier facteur influençant l'activite "in vitro" des antibiotiques, il a été comparé de nombreux milieux de culture, parmi eux, celui de Mueller-Hinton constitue le milieu universellement utilisé
pour déterminer l'activité "in vitro" des antibiotiques.
La reproductibilité des résultats implique donc une standardisation des méthodes d'investigation.
Le biologiste dispose de plusieurs méthodes standardisées pour évaluer l'activité antibactérienne des antibiotiques et guider le choix thérapeutique. La plus simple reste la détermination de la CMI ou son approximation par une méthode d'antibiogramme automatisée.
Les méthodes d'étude de la CMI sont également utilisées pour la réàlisation d'antibiogrammes. Elles s'effectuent selon les principes de la microbiologie dominée par l'école pasteurienne et consistent :
- à isoler sur la gélose, en premier lieu, la bactérie responsable de la pathologie sur un milieu de culture classique afin de se débarrasser notamment des contaminants presents géneralement à des concentrations inférieures à
10 UFC/ml (Unité Formant Colonies/ml équivalent germe/ml) qui sont ignorés sur la gélose et ainsi seules les bactéries présentes à des concentrations supérieuresà103 UFC/ml sont étudiées ;
- puis à tester la bacterie à une concentration donnée pour réaliser l'antibiogramme dans un milieu de réaction de type Mueller-Hinton selon les techniques couramment utilisées par le biologiste, à savoir par :
- la diffusion en milieu gélosé décrite notamment dans "ECCLS Standard for antimicrobial susceptibility testing by diffusion methods" ECCLS, 1985, 5:4, ainsi que dans "Report of an international collaborative study", Acta pathol.
Microbial. Scand, Sect B, 1971, Suppl. 217 : 1-90 par Ericsson HM, Sherris JC ;
- ou la méthode par dilution décrite dans l'article "NouvelLes approches de l'étude de sensibilite des bactéries aux antibiotiques" de la Revue Francaise du Laboratoire, ~ 4 ~ 2 1 87 4 0 6 1986, 151 ; 7-12 ;
- ou l'antibiogramme automatisé décrit également dans le document susmentionné.
En résumé, la méthode par diffusion en milieu gélosé
utilise pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens et le dosage microbiologique des antibiotiques, la propriété de diffusion de l'antibiotique (dépôt en surface d'un disque de papier buvard pré-imprégné) dans un milieu de culture gélose (contenant une bactérie à tester), en réalisant un gradient de concentration.
Après 3 à 4 heures, une zone d'inhibition peut être déterminée correspondant à la distance que la concentration inhibitrice d'antibiotique a pu parcourir avant que soit atteinte une certaine densité bactérienne.
L'antibiogramme par diffusion en milieu gélosé, ou méthode des disques, est un procédé largement répandu du fait de sa simplicité et de son faible coût. Cependant, la qualité des résultats peut varier en fonction de plusieurs paramètres qui vont influer sur la constitution de la zone d'inhibition. De sorte que pour une même souche bactérienne de sensibilité à un antibiotique donné, des résultats reproductibles ne sont obtenus que pour un inoculum, un milieu et des conditions d'incubation identiques.
Pour un même antibiotique, des souches d'espèces différentes avec des temps de latence (temps de latence avant la croissance exponentielle des bactéries) et de génération très différents mais une sensibilité identique, donnent des zones d'inhibition très différentes. C'est pourquoi, les bactéries qui présentent une importante variabilite de souche a souche, liée au taux de croissance, ne peuvent etre étudiées valablement dans les conditions standardisées des tests de diffusion, qui s'appliquent aux bactéries à croissance rapide (entérobactéries, staphyloco-ques, etc.) pour lesquelles les temps critiques varient dans des limites acceptables, influant peu sur la zone d'inhibition.
D'autre part, la diffusion de l'antibiotique dans la _ ~ 5 ~ 2187406 gélose n'est pas linéaire avec la concentration d'antibiotique au niveau de la source.
Les recommandations préconisées doivent être rigoureusement suivies pour garantir l'exactitude et la reproductibilité des résultats par cette méthode. En France, La méthode la plus utilisée répond aux normes édictées par l'OMS présentées dans le 28ème rapport, de la série de rapports techniques N, 610, OMS Genève, 1977, 106-138 du Comité OMS d'Experts de la Standardisation biologique.
La composition du milieu de Mueller-Hinton est standardisée, avec en particulier, un pH de 7,4, une concentration adaptée en ions Mg++ et Ca++ , et une concentration en thymidine inférieure à 50 ng/ml.
L'épaisseur de la gélose doit être de 4 mm. L'inoculum doit être préparé, de préférence, à partir d'une culturé agitée de 4 heures au bain marie, ajustée par dilution à 2-3 x 106 bactéries par ml (étalonnage photométrique). L'ensemencement est réalisé par inondation avec quelques millilitres de cette dilution.
Selon la méthode par dilution en milieu gélosé, l'antibiotique requis par le traitement est détermine ainsi que sa CMI en ensemençant 1 à 5 ~l de l'inoculum correspondant à chaque bacterie testée (104 bactérie par spot) dans un milieu liquéfié à 45 degrés Celsius contenant chacun une concentration d'antibiotique précise.
La CMI est définie par la concentration d'antibiotique ne laissant subsister aucune ou, au plus, 1 à 3 colonies après 18 heures d'incubation à 37 degrés Celsius. Il s'agit d'une méthode de référence permettant de tester simultanément un grand nombre de souches (25 à 96 selon le type d'inoculateur) vis-à-vis d'un même antibiotique.
Les méthodes de dilution en bouillon Mueller-Hinton sont réalisées elles en tubes (macrométhode) ou en plaques de microtitration (microméthode). Les microméthodes sont plus adaptées à la pratique de l'antibiogramme, grâce à une automatisation possible de la préparation des dilutions d'antibiotiques et de la lecture des CMI. Elles permettent la détermination ultérieure des CMB. Cependant, le _ - 6 2187406 dénombrement des survivants après subculture est plus aisé
en macrométhode qu'en microméthode (un inoculum de 106 bactéries/ml représente 2 x 106 bactéries par tube de 2 ml de milieu et 5 x 104 bactéries par cupule de 50 ~l), ce qui peut expliquer une CMB plus élevée en macrométhode.
D'autre facteurs techniques peuvent influencer l'évaluation de la CMB, comme l'adhésion des bactéries survivantes aux parois des tubes ou des plaques de microtitration, une agitation insuffisante avant réalisation des subcultures, ou un phénomène de transfert d'antibiotique sur le milieu de dénombrement lié a la prise d'une aliquote de milieu trop importante (en macromethode, le volume nécessaire aux subcultures ne doit pas dépasser 0,1 ml ; il est de 5 à 10 ~l en microméthode).
D'autre part, il existe diverses méthodes d'antibiogramme permettant une lecture automatisée des résultats telles que décrites dans l'article "Nouvelles approches de l'étude de sensibilité des bactéries aux antibiotiques" de FLANDROIS JP, CARRET G, de la Revue ZO française du Laboratoire, 1986, à savoir :
- Des systèmes utilisant deux concentrations d'antibiotiques (ex : ABAC, API-ATB). Ils permettent de classer les bactéries en catégories (sensible, intermédiaire, résistant) par mesure de croissance bactérienne en présence des deux concentrations critiques, haute et basse. La croissance aux deux concentrations définit les souches résistantes, l'absence de croissance les souches sensibles, la croissance à la concentration critique basse les souches "intermédiaires". La lecture photométrique du résultat est effectuée à la 24ème heure de croissance.
- Des systèmes rapides (ex : AUTOBAC, COBAS-BACT, RAPID-ATB, VITEK). Ils étudient la croissance bactérienne en présence d'une seule concentration d'antibiotique (independante des concentrations critiques), choisie pour permettre de discriminer au mieux les populations en catégories S, I, R, par référence aux CMI des germes. Ces systèmes automatisés donnent des résultats en 3 à 6 heures.
Toutefois, les évaluations récentes des divers systèmes ~ 7 ~ 2 1 8 74 06 _ d'antibiogrammes automatisés montrent que la concordance avec la CMI, méthode de référence, existe dans plus de 85 %
des cas. Ce pourcentage de concordance peut varier selon le systéme, et les discordances observées sont surtout le fa;t de certa;ns couples "bactérie-antibiotique" : staphylocoques vis-à-vis de la méticilline, de l'érythromicine et de la clindamycine ; entérocoques vis-à-vis de la céfalotine, de la tétracycline et du chloramphénicol ; enterobacter vis-à-vis de l'ampicilline, de la céfalotine et de la tétracycline ; Klebsiella vis-3-vis de l'ampicilline ;
Serratia vis-à-vis des polymyxines ; Pseudomonas vis-à-vis de la gentamicine et de l'amikacine. Ces discordances sont liées à l'espèce étudiée et au mode d'action de l'antibiotique. Ainsi, la croissance en micro-agglutinats, la lyse tardive des bactéries par certains antibiotiques, une recroissance tardive, un mécanisme de résistance inductible à l'antibiotique, sont les causes les plus fréquentes de discordances (faux sensibles et faux résistants) dues au système de lecture automatique et au temps de lecture (3-6 heures ou 24 heures). La difficulté de détecter certains mécanismes de résistances aux ~-lactamines, aux aminosides et aux macrolides, en raison de leur niveau ou de leur mode d'expression, constitue également une source d'erreur.
Tous les systèmes automatisés permettent d'étudier la sensibilité des seules bactéries non exigeantes et à
croissance rapide.
Au vu de la description des trois techniques susmentionnées, antibiogramme par diffusion en milieu gélosé, méthode par dilution, antibiogramme automatisé, il s'avère que chacune d'elles nécessite, pour sa mise en oeuvre, l'observance minutieuse d'un protocole (température, temps d'incubation, etc.) et ne peut être généralisée à tout type de bactérie.
Outre les inconvén;ents susment;onnés inhérents à chacun des systèmes decr;ts ci-dessus, l'antibiogramme conventionnel réalisé selon l'une quelconque de ces techniques présente principalement les trois inconvénients majeurs su;vants découLant du-fait qu'elles ne tiennent pas compte :
- de la pharmacologie particulière de chaque antibiotique ;
- de l'état immunitaire du patient au stade de l'infection et/ou de la présence de corps étrangers ;
- des infections plurimicrobiennes ;
d'où il résulte des discordances entre les tests "in vitro"
(les résultats de l'antibiogramme) et la réponse au traitement.
Le premier inconvénient est dû à l'utilisation d'un milieu de réaction type Mueller-Hinton annulant complètement l'effet du contexte culturel environnemental sur l'antibiothérapie. Or, il est connu que l'affinité du germe pour une humeur ou un tissu particulier n'est pas la meme d'une humeur 3 l'autre, l'adhésivité bactérienne, donc le pouvoir pathogène, varie en fonction de nombreux facteurs.
Face à cette multitude de sites anatomiques de nature différente (urine, LCR, sang, muqueuse, ...) sur lesquels la croissance bactérienne est variable, l'antibiogramme actuel 20, ne retient, pour l'expression de la sensibilité, qu'un milieu polyvalent : le milieu de Mueller-Hinton. Ce milieu très éloigné des conditions culturelles du germe donnant l'infection en un site déterminé, ne rend pas compte de la réelle activité de l'antibiotique dans-le site où a lieu l'infection. C'est ainsi qu'un antibiotique à vocation urinaire devrait etre étudié en milieu urinaire (effet du pH, effet du NaCl, effet des ions, ...).
Certains pharmacologues ont montré que le Pseudomonas présente vis-à-vis des quinolones, des CMI variant de 1 à
100 suivant que l'on utilisait un milieu Mueller-Hinton ou un milieu à base d'urine.
Le deuxième inconvénient susmentionné est du au fait que la bactérie, après avoir été isolée, est testée à une concentation déterminée arbitraire. Or, il est connu que suivant le site d'infection, l'état immunitaire du malade, et suivant le stade de cette infection, la concentration du germe responsable peut varier.
C'est ainsi que d'un germe/ml (cas des hémocultures dans les fièvres thyphoides) les germes peuvent atteindre 104 germes/ml dans les prostatites, 106 dans les infections urinaires et 108 dans les pus profonds et méningites purulentes. IL va de soi comme on l'a déjà souligné, que le résultat de l'antibiogramme dépend de cet effet inoculum.
Le troisième inconvénient susmentionné résulte de l'isolement de la bactérie pathogène du prélèvement pour réaliser l'antibiogramme. Ainsi on ne tient pas compte de la présence de plusieurs bactéries sur le même site d'infection qui peuvent présenter des interactions dont certaines sont très connues, à savoir :
- 1/ Synergie entre différents germes (exemple de certains écosystèmes) :
- association fuso-spirillaire dans l'angine de Vincent (présence de Fusobacterium nucleatum et de spirochètes) - mycoplasmes et anaérobies dans les vaginoses (par effet pH).
- 2/ Antagonisme :
- Saccharomices cerivisiae et Clostridium difficile (par compétition) - Proteus mirabilis et Streptococcus faecalis (par effet pH).
- Par les méthodes classiques d'antibiogramme, l'étude de la sensibilite "in vitro" des antibiotiques pour des germes d'une infection plurimicrobienne est alors forcément différente de la réalité "in vivo", car les germes sont testés isolément à partir de plusieurs colonies pures.
Autrement dit, l'étude de la sensibilité des antibiotiques pour des germes d'une infection plurimicrobienne sera forcément différente si les germes sont étudiés simultanément dans le meme milieu (antibiogramme effectué directement sur l'écouvillon) ou si les germes sont testés isolément à partir de plusieurs colonies pures (antibiogramme conventionnel). Pour ces raisons, il semble évidemment préférable d'effectuer une étude de sensibilité, aux antibiotiques directement à partir de l'écouvillon dans un milieu qui pourra exprimer pour un ant;biotique donné la synergie ou l'antagonisme des differentes bactéries présentes dans le prélèvement plurimicrobien.
- 2 1 ~37406 Toutefois, malgré cette év;dence, il n'existe pas de technique fiable d'antibiogramme directement sur le prélèvement.
Par ailleurs, la lecture interprétative de l'antibiogramme conventionnel conditionne également les chances de succès thérapeutique. Il faut savoir "lire entre les lignes" d'un antibiogramme et déceler un méc.anisme de résistance qui ne s'exprime que faiblement "in vitro", mais qui est inscrit dans l'ADN bactérien et peut entra;ner une mauvaise réponse du traitement. Ceci implique une connaissance rigoureuse de ces mécanismes et des phénotypes qu'ils entra;nent. Cette connaissance ne doit pas rester l'apanage de quelques spécialistes, il est probable que dans un proche avenir, le développement de systèmes experts contribuera à une meilleure validation des techniques d'antibiogramme.
Un objet de l'invention est donc de remédier aux inconvénients des antibiogrammes classiques ou conventionnels en testant la croissance (qui se visualise par une zone trouble) ou l'absence de croissance des bactéries pathogènes prélévées directement du milieu infecté
à traiter et inoculées dans des milieux contenant chacun un antibiotique différent présent à une concentration égale à
sa CMI.
Selon le procédé de l'invention, ce but est atteint grâce au fait que l'évaluation de la sensibilité du prélèvement aux différents antibiotiques (ou antibiogramme) s'opère en présence d'un témoin de révélation des contaminants, appelé témoin limite d'incubation.
Ce témoin de limite d'incubation comprend au moins une souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes sous forme déshydratée, et qui,une fois régénérée,sera présente à un taux de 10 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé
pour la déshydratation de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) comprenant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance, de préférence constitué par un indicateur de virage de pH.
'~ 2 1 8 7 4 0 6 Selon une variante de réalisation, le substrat et l'indicateur de croissance tel que, par exemple, l'indicateur de virage de pH sont contenus dans le milieu de rehydratation ou régénération de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s).
L'utilisation du témoin limite d'incubation (ou TLI) pour la réalisation d'antibiogramme effectué directement sur le prélèvement permet de détecter précisément le moment où
les contaminants présents dans ce témoin (en général également présents à des concentrations inférieures ou égales a 103 UFC/ml dans le prélèvement) poussent en créant une modification dudit témoin TLI (virage d'un indicateur coloré, apparition d'un trouble ou variéte de l'activité
ATPéasique).
A ce moment précis, la lecture de l'antibiogramme doit etre stoppée car la croissance révélée par ce dernier ne correspond plus uniquement à celle des bactéries pathogènes mais egalement à celle des contaminants présents dans ledit prélèvement ce qui fausse les résultats de l'antibiogramme.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, ce moment précis est signalé et visualisé, de préférence, par le virement d'un indicateur coloré agissant comme révélateur de la croissance des bactéries contaminantes.
Grace au fait que la croissance des contaminants est dépendante de la température du milieu, l'antibiogramme peut alors s'effectuer à plusieurs vitesses en jouant sur la température.
L'antibiogramme selon l'invention, réalisé directement sur le prélèvement procure notamment les avantages suivants :
- de donner, et c'est un avantage majeur, des resultats "in vitro" plus en accord avec la réalité "in vivo" car - il garantit d'avoir dans le milieu de culture des eléments culturels venant du prélèvement lui-meme, à la différence de l'antibiogramme conventionnel effectué à
partir d'une colonie pure ;
- il tient compte de l'effet inoculum ; en effet, le milieu inocule et testé envers différents antibiotiques - 12 - 21 874!J6 comporte les concentrations et proportions de micro-organismes présents dans le site infecté et la réponse aux antibiotiques a été obtenue dans des conditions comparables à celles du milieu naturel infecté et non plus à une concentration arbitraire ;
- il tient compte des intéractions bactériennes existantes dans le cadre des infections plurimicrobiennes ; l'étude de sensibilité aux antibiotiques directement à partir du prélèvement se fait en effet dans un milieu qui peut exprimer pour un antibiotique donné la synergie ou l'antagonisme des différentes bactéries présentes dans le prélèvement plurimicrobien, ce qui n'est pas possible dans le mil;eu type Mueller-Hinton, dans lequel seule la bactérie isolée est testee.
- d'être rapide et facile a mettre en oeuvre ; en effet, les étapes d'isolation de la bactérie pathogène sont supprimées et les conditions expérimentales de l'antibiogramme sont simplifiées (températures variables, temps variable... ;
- d'être d'une lecture facile.
Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus et d'autres encore ressortiront mieux de la description qui suit dans laquelle des exemples non limitatifs de composition du témoin limite d'incubation sont décrits ainsi que son procédé d'utilisation à la réalisation d'un antibiogramme directement effectué sur le prélèvement.
Le témoin de révélation des contaminants ou TLI est remarquable par le fait qu'il comporte, d'une part, au moins une catégorie de bactérie classiquement contaminante présente à un taux maximum, par exemple égal ou inférieur à
103 UFC/ml avec son substrat approprié et, d'autre part, un révélateur de la croissance des contaminants, de préférence, un indicateur coloré de changement de pH dans un milieu standard à pH determiné.
La bactérie classiquement contaminante peut etre de différentes catégories suivant qu'il s'agit d'une bactérie qui dégrade l'urée (bactérie uréase +~ comme par exemple Coryne Bactérium, staphylococcus intermedius, etc, et/ou le - 13 - 2 1 ~7406 -glucose (bactérie glucose +) comme par exemple Escherichia Coli, staphylococcus intermedius, etc. De très nombreuses espèces de bactéries (environ 90 % des espèces) dégradent le glucose, comme la famille des bacilles gram - et gram +, ce qui permet d'avoir un choix important pour la bactérie classiquement contaminante du témoin limite d'incubation.
Le choix de cette bactérie peut de façon avantageuse être guidé par le type de l'infection où le prélèvement est effectué et qui présente des contaminants qui peuvent être connus Le substrat est fonction de la bactérie contaminante et peut notamment être du glucose, de l'urée, etc.
Le pH du milieu est maintenu acide dans le cas où l'urée est le substrat, et basique dans le cas où il s'aglt du glucose.
A titre indicatif, le témoin limite d'incubation contenant la bactérie uréase + : staphylococcus intermedius, comporte également de l'urée, un indicateur de virage dans un milieu à pH acide (5,5).
Afin de permettre une meilleure conservation de la bactérie contaminante, cette derniere est présente, au depart, dans le temoin limite d'incubation sous forme déshydratée, de façon a être, une fois régénérée, à un taux de 103 UFC/ml maximum.
Selon une première forme de mise en oeuvre de l'invention, le milieu de réhydratation de la bactérie contaminante déshydratée est un milieu de culture conventionnel à un pH détermine (acide dans le cas d'une bactérie urease + et basique dans le cas d'une bacterie glucose +) et contenant alors :
- le substrat - et/ou l'indicateur de virage de pH.
De façon avantageuse, on peut ajouter dans ce milieu de réhydratation, divers réactifs améliorant la pousse des coccies gram + (comme des staphylocoques) qui présentent une croissance moins rapide que les bacilles gram - en milieu conventionnel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre de l'invention, le substrat, l'indicateur de pH et les réactifs sont contenus dans le milieu de déshydratation correspondant à un milieu de culture conventionnel à pH déterminé (acide dans le cas d'une bactérie uréase + et basique dans le cas d'une bactérie glucose +) contenant des élements essentiels connus en soi pour la stabilité de la bactérie déshydratée, par exemple : gélatine à 1 % final, sérum de poulain à 68 %
final, polyol à 1,2 % final. D'autre part, dans ce déshydratat, divers réactifs qui améliorent la croissance des coccies gram + comme les statphylocoques, sont ajoutes.
Ces réactifs peuvent être également ajoutés dans le milieu de réhydratation : Arg a 0,05 % final, Cyst à 0,05 % final, Thiamine 0,1 % final, acide nicotinique 0,1 % final. Ces réactifs supplementaires ont pour but d'ameliorer la pousse des coccies gram + qui présentent une croissance moins rapide que les bacilles gram - en milieu conventionnel.
Le milieu défini pour notre test comporte donc les elements essentiels pour une croissance des bacilles gram -et des coccies gram +, et ne favorise aucun micro-organisme des deux groupes plus qu'un autre.
Ce milieu est également adapté à la croissance des contaminants que l'on rencontre dans les infections externes : otites, pyodermites.
En effet, le substrat, l'indicateur de virage de pH et les reactifs susmentionnés peuvent être présents de façon interchangeable dans le milieu de déshydratation ou dans le milieu de réhydratation, comme indique ci-dessus.
Le principe mis en oeuvre dans le témoin limite d'incubation consiste à révéler la croissance des bactéries contaminantes par le changement de pH du milieu qui en résulte.
En effet, la croissance par exemple d'une bactérie uréase + nécessite la dégradation de l'urée qui provoque une alcalinisation du milieu. L'alcalinisation du milieu est due lors de la dégradation de l'urée au dégagement d'ammoniac selon la réaction suivante :
~ NH2 H20 + 0 = C \ ~ C~2 + 2NH3 Alors que la croissance d'une bacterie glucose +, grace à la dégradation du glucose, provoque l'acidification du milieu.
De façon préférentielle, l'indicateur du pH est le rouge de phénol, de couleur rouge à pH alcalin et jaune à pH
acide.
Selon une caractéristique importante de l'invention, le virage du témoin limite d'incubation se fait avec une cinétique :
- proportionnelle à la concentration de bactérie contaminante du départ ; et - proportionnelle à la temperature environnante de 24 heures a 40 degrés Celsius à 4 jours à 20 degres Celsius.
Selon l'invention, la concentration de bactérie contaminante est constante, 103 UFC/ml, de sorte que le virage dépend uniquement de la température environnante. En effet, la chaleur apportee au temoin limite d'incubation favorise alors les réactions biochimiques de dégradation du substrat par la bacterie contaminante. Le changement de pH
et sa révélation avec l'indicateur colore se fait, par conséquent, de façon plus ou moins rapide, selon la température apportée au témoin limite d'incubation.
Les travaux et expérimentations ayant abouti à la présente invention ont essentiellement porté sur l'utilisation de ce témoin de révélation des contaminants pour la réalisation d'un antibiogramme effectué directement sur le prélèvement.
Il ne s'agit cependant pas d'une application limitative.
En effet, ce tèmoin limite d'incubation, de par sa composition et sa destination, permet de révéler tous contaminants et peut être utilisé de façon plus générale dans le cadre d'expériences et de tests pratiqués directement sur tout prélèvement de tissus ou de milieux infectieux, en vue de déterminer et de visualiser la croissance des contaminants pouvant etre présents dans le - 16 - 2 1 a7406 prélèvement.
De façon particulière, ce témoin limite d'incubation peut également etre utilise dans le cadre de l'identification des bactéries à taux suprapathologique (supérieur à 10 UFC/ml) effectue directement à partir d'un prelèvement. Ces dernières sont détectées par leur croissance formant un trouble dans le milieu avant que le témoin limite d'incubation ne vire.
Selon l'invention, la realisation d'un antibiogramme consiste en premier lieu, à prélever du milieu infecte contenant les bactéries pathogènes à tester, sous forme d'écouvillon du tissu infecté ou sous forme de liquides biologiques (liquide d'épanchement infecté...), à l'inoculer dans des milieux de culture contenant différents antibiotiques à leur CMI. De façon preférentielle, on dilue le milieu prélevé à 102 UFC/ml, dans un milieu de transport qui garde viable toutes les espèces bactériennes aux memes concentrations que celles du prélèvement, puis on ensemence dans un milieu de culture et on inocule ensuite ce milieu de culture ensemencé à différents antibiotiques présents, à
leur CMI.
A titre indicatif, et dans notre cas d'etude 200 ~l de ce milieu ont été distribués dans divers puits ou autres réceptacles contenant différents antibiotiques, à leur CMI
dans un m;lieu de culture conventionnel.
Gr3ce au milieu de transport utilise qui garde stable 10 heures à la température ambiante et 24 heures à 4 - 8 degrés Celsius le milieu de transport ensemence, le technicien de laboratoire ou de façon plus générale le manipulateur n'est pas contraint d'inoculer rapidement après l'ensemencement.
Il est nécessaire pour que les résultats de l'antibiogramme soit correct que le témoin limite d'incubation soit réhydraté ou préparé lorsque que le prélèvement est inoculé aux différentes concentrations d'antibiotiques. Ce moment determine le point de départ (T = 0) des différentes réactions s'effectuant entre bacteries, antibiotiques, contaminants et substrats du prélèvement présents dans les diffèrents puits ou réceptables contenant les différents antibiotiques ainsi que la réaction de dégradation du substrat par la bactérie contaminante dans le témoin limite d'incubation.
La lecture de cet antibiogramme est simple en ce sens qu'il suffit de voir avant le changement de couleur du témoin limite d'incubation dans quel puits ou réceptable aucune bactérie s'est développée (aucun trouble) pour savoir quel est ou quels sont les antibiotiques requis pour le traitement de l'infection où s'est effectué le prélèvement.
Cette lecture est conditionnée au changement de couleur du témoin limite d'incubation.
Par exemple, la lecture de l'antibiogramme est stoppée des que le temoin d'incubation limite initialement jaune (pH
5,5) vire au rouge lorsque le témoin limite d'incubation contient la bactérie uréase + ; staphylococcus intermedius, de l'uree et du rouge de phénol.
Selon une caracteristique avantageuse de l'invention, le virage du temoin d'incubation limite est uniquement proportionnel à la température environnante de 18 à 24 heures à 40 degrés Celsius, de 36 à 44 Heures à 25 degrés Celsius et 4 jours à 20 degrés Celsius.
La réalisation d'un antibiogramme directement sur le prélèvement à des températures variables d'un test à l'autre ou variables dans le temps pour une température constante est ainsi possible. En effet, tant que le témoin d'incubation limite ne vire pas, la lecture de l'antibiogramme est possible sans risque d'interférence des contaminants. L'effet de la température sur la croissance des bactéries aura lieu aussi bien sur le témoin d'incubation limite que sur le système d'antibiogramme dans lequel se retrouvent les germes responsables de l'infection.
Quelle que soit la temperature, les bactéries pathogènes présentes sur le site de l'infection poussent avant que le témoin limite d'incubation ne vire. Seul le temps que met le temoin limite dlincubation à virer dépend de la température ambiante, généralement :
- 40 degrés Celsius - 18 à 24 heures - 25 degrés Celsius - 36 à 44 heures - 20 degrés Celsius - 4 jours (96 heures) Cette sécurité permet de réaliser des antibiogrammes non seulement directement à partir du prélèvement mais de ne pas se soucier des conditions de température, donc de réaliser ces tests en ambulatoire, soit par les vétérinaires, soit par des médecins eloignés d'une unité de laboratoire. On peut en effet pratiquer l'antibiogramme sans étuve et sans régulation de température.
Dans des conditions opératoires simplifiées (à partir du prélèvement, sans souci de température) cet antibiogramme peut etre non seulement pratique par un personnel non spécialisé, mais de plus par le malade lui-meme (dans le cadre d'infections urinaires de la femme enceinte éloignée d'un centre médical, plaie de blessure de guerre, ...), donc dans le cadre de la médecine humanitaire ou de la médecine de guerre.
Le vétérinaire ou autre utilisateur de cet antibiogramme a ainsi la certitude que l'antibiotique révélé efficace "in vitro" par cet antibiogramme aboutira plus certainement à un rèsultat thérapeutique. Compte tenu de l'exposé qui precède, les moyens permettant de réaliser les antibiogrammes, selon l'invention, peuvent etre avantageusement executes sous forme de kits.
Outre la connaissance du type ou des types d'antibiotiques requis pour le traitement, l'antibiogramme exécuté selon l'invention, permet également de connaître si le taux de bactérie prélevé et testé est ou non suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un pouvoir pathologique probable) quelle que soit la température dans laquelle l'antibiogramme est porté.
En effet, si une croissance bactérienne se produit dans les tubes contenant un antibiotique précis à sa concentration CMI et du prélévement (se visualisant sous la forme de trouble) avant que le témoin d'incubation limite ne vire du jaune au rouge, l'on est sûr que la bactérie présente sur le site de l'infection est présente à un taux supérieur à 10 UFC/ml donc qu'elle correspond à un taux dit suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un pouvoir pathologique probable).
Inversement, si aucune croissance bactérienne ne se produit avant que le témoin d'incubation limite ne vire, cela signifie qu'aucune bactérie n'est présente sur le site d'infection à des concentrations inférieures à 103 UFC/ml.
Si après que le témoin d'incubation limite ait viré au rouge une croissance bactérienne apparaît, il peut s'agir :
- d'un contaminant si le prélèvement est un prélèvement externe (muqueuse, pus, urines...) ;
- d'un germe d'une humeur profonde à un taux supérieur à
103 UFC/ml (ex : Hémoculture ou LCR : milieu ne présentant jamais de contaminant).
Claims (13)
1. - Témoin de limite d'incubation destiné à révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes sous forme déshydratée, et qui une fois régénérée sera présente à
un taux de 10 3 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé pour la déshydrations de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) incluant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance de la ou desdites bactéries, par exemple constitué par un indicateur coloré de changement de pH.
un taux de 10 3 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé pour la déshydrations de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) incluant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance de la ou desdites bactéries, par exemple constitué par un indicateur coloré de changement de pH.
2. - Témoin de limite d'incubation destiné à révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes sous forme déshydratée, et qui une fois régénérée sera présente à
un taux de 10 3 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu de réhydratation ou régénération de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) incluant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance de la ou desdites bactéries, par exemple constitue par un indicateur coloré de changement de pH.
un taux de 10 3 UFC/ml maximum, ledit témoin de limite d'incubation comprenant également un milieu de réhydratation ou régénération de la ou desdites bactérie(s) contaminante(s) incluant un substrat déterminé en fonction de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance de la ou desdites bactéries, par exemple constitue par un indicateur coloré de changement de pH.
3. - Procédé de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture ou antibiogramme, caractérisé en ce qu'il s'effectue directement à partir du prélèvement du milieu infecté, en présence du témoin, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ce témoin permettant de révéler la croissance de contaminants présents dans ce prélèvement, ledit témoin étant utilisé comme signal limitant le temps de lecture de l'antibiogramme.
4. - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en que l'antibiogramme s'effectue à des températures variables comprises entre 20 à 40 degrés Celsius et dans des temps variables de 18 heures à 4 jours.
5. - Témoin de limite d'incubation destiné a révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en que la bactérie classiquement contaminante est une bactérie uréase + et/ou glucose +.
6. - Témoin de limite d'incubation destiné à révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'indicateur coloré de changement de pH est du rouge de phénol.
7. - Témoin de limite d'incubation destine a révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6, caractérisé en ce qu'il comporte dans un milieu classique à
pH = 5,5 des bactéries staphylococcus intermedius, de l'urée et du rouge de phénol.
pH = 5,5 des bactéries staphylococcus intermedius, de l'urée et du rouge de phénol.
8. - Témoin de limite d'incubation destiné à révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6, caractérisé en ce qu'il comporte dans un milieu classique à
pH = 10 des bactéries glucose +, du glucose et du rouge de phénol.
pH = 10 des bactéries glucose +, du glucose et du rouge de phénol.
9. - Témoin de limite d'incubation destine a révéler la croissance de contaminants présents dans un prélèvement, selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de déshydratation ou de réhydratation contient des réactifs améliorant la pousse de coccies gram+.
10. - Procédé de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture (ou antibiogramme) selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le témoin est réhydraté ou préparé au moment de l'inoculation du prélèvement dans des milieux contenant différents antibiotiques en CMI.
11. - Procédè de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture ou antibiogramme selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le prélèvement est dilué préalablement à l'inoculation des milieux contenant des antibiotiques à leur CMI, dans un milieu de transport gardant viables les bactéries pathogènes présentes dans le prélèvement.
12. - Procédé de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture ou antibiogramme selon la revendication 11, caractérisé en ce que le prélèvement est dilué à 10 2 UFC/ml puis 200 µl du prélèvement dilué sont inoculés dans les milieux contenant les antibiotiques.
13. - Procédé de détection "in vitro" de la sensibilité des bactéries pathogènes à différents antibiotiques présents en CMI dans des milieux de culture ou antibiogramme selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que la détection de la présence en quantité suprapathologique de bactéries pathogènes dans le prélèvement est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 3, 4, 10, 11 et 12.
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