JP2001518308A - 液体を調節および殺菌する方法 - Google Patents

液体を調節および殺菌する方法

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JP2001518308A JP2000513965A JP2000513965A JP2001518308A JP 2001518308 A JP2001518308 A JP 2001518308A JP 2000513965 A JP2000513965 A JP 2000513965A JP 2000513965 A JP2000513965 A JP 2000513965A JP 2001518308 A JP2001518308 A JP 2001518308A
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トゥアティ，ダニエル
デュカーン，サム
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スエズ リヨネーズ デゾー
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Abstract

(57)【要約】 液体の殺菌を調節する方法を提供する。 【解決手段】 Ａ．殺菌の一段階（以後は段階２と呼ぶ）において、液体中に存在するかも知れない微生物をこの酵素またはこれらの酵素類の活性をあらわすことができるように選択された基質と接触させることによって、少なくとも１種類の酵素活性を測定し、この酵素活性を以後は特異的活性と称することにし、Ｂ．以後は段階１と呼ばれる一段階において、前記段階２の前に、Ａの場合と同じ酵素（類）の活性を測定し、この活性を以後は初期活性と称することにし、Ｃ．各酵素につき、前記段階１に集め、それから漸増量の殺菌剤にさらした前記液体サンプルを用いてあらかじめ確立した比較系によって、前記特異的活性および初期活性を、前記殺菌の段階２において前記液体中に生存する微生物のレベルに変換し、Ｄ．前記生存微生物レベルの関数として、前記殺菌に用いた物理的または化学的作用物質（類）の性質および／または用量を調節する諸段階を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は一般的なやり方で液体の殺菌を調節する方法に関する。より詳細に述
べれば、これは酵素活性の測定による調節法に関するものである。
【０００２】 ヒトまたは動物と接触することを目的とする液体、例えば消費を目的とする水
、食事用液体、浴用水、医薬品またはバイオテクノロジー製剤のための水等の品
質および安全性の保証は、前記液体中の生存微生物の数の測定法の確実性および
感度に直接依存する。
【０００３】 液体の殺菌を調節するために現在用いられる方法は、寒天培養法および／また
は顕微鏡法である。
【０００４】 寒天上に培養する方法は、種々の標準的栄養寒天培地上に発生する細菌コロニ
ーの数を数えることからなる［フランス標準ＮＦ Ｔ 90-414、Essais des Eaux 、Recherche et denombrement des coliformes et des coliformes thermotoler
ants（水の分析、大腸菌および耐熱性大腸菌の同定および計数）］。これらの方
法は幾つかの欠点を有する。
【０００５】 第一に、それらの方法では平均２４時間後に漸く結果が得られ、その結果殺菌
法の可能な調節も遅れるという事実が挙げられる。
【０００６】 寒天培養法ではさらに、各液体サンプルの分析のために一連の微生物学的培養
を実施しなければならない。実際、全ての微生物ファミリー、特に細菌ファミリ
ー類は同一栄養培地上で発育しない；例えば、大腸菌群（coliforms）検出用標 準的栄養培地に培養した後、大腸菌群が全然見いだされず、その他の栄養培地上
に培養した後にその他の細菌が多数見いだされることがあり得る。そのため、栄
養寒天培地の選択が分析の質を決める。或るコロニーの検出のための標準的栄養
培地以外の培地に培養した後にその同じコロニーのより多数が観察されることが
多いため、この培地の選択はますます微妙である。例えば、生育可能の好気性菌
のカウント数が、Ｒ２Ａ寒天培地上で、対応する標準的栄養培地上の場合より大
きいことが証明された（例えば《飲用水からの細菌の計数および二次培養のため
の新しい迅速増殖培地》、リーゾナ（Reasoner D.J.）およびゴッドライヒ（God
reich E.F.）、App.Environm.Microbiol.（１９８５）４９巻、１−７ページ） 。そのため信頼性のあるマイナス診断を確立するために、寒天培養法は多数の分
析を必要とする。その上寒天培養法では、殺菌法の調節の自動化は容易ではない
。
【０００７】 細菌はさらに、殺菌法の適用等の環境的ストレスを受けた後は特に、もはや増
殖せず、その間最小の代謝を行うという抵抗型をとり；より好ましい環境条件が
回復するやいなやこれら細菌はそれらの増殖を取り戻す。そのような細菌類は《
培養不可能だが生育可能である》と言われる：それらは一般的寒天培養法では検
出できず、消費者に対する生物学的リスクを示さない。
【０００８】 液体の殺菌効率を実質的に確実に調節するために現在使用できる方法は、顕微
鏡検査を特異的染色と組み合わせて用いる方法である。この方法は培養可能細菌
、培養不可能ではあるが生育可能の細菌、および死んでいる細菌を区別すること
ができる。にもかかわらず、この方法は各サンプルにつき数種の染色テストを必
要とし、自動化は技術的に難しい。
【０００９】 本発明は先行技術の欠点を克服し、液体の殺菌を調節する方法を提供する。こ
の方法は以下を含むことを特徴とする： Ａ．前記殺菌の一段階（以後この段階を段階２と呼ぶ）において、少なくとも
１種類の酵素の活性を次のようにして測定する：すなわち前記液に存在するかも
知れない微生物とこの、またはこれらの酵素の活性をあらわすことができるよう
に選択した基質とを接触させることによって、特に、前記基質を有色蛍光−また
はルミネッセント化合物類に転化することによって、または前記基質の消失によ
って測定する。この酵素活性は以後特異的活性と呼ぶことにする、 Ｂ．前記段階２に先立つ段階（以後段階１と呼ぶことにする）で、Ａにおける
酵素（類）と同じ酵素（類）の活性を測定する。この活性を以後初期活性と呼ぶ
ことにする、 Ｃ．各酵素について、前記段階１において集められ、その後漸増量の殺菌剤に
さらされた前記液体のサンプルを用いてあらかじめ確立した比較系を用い、前記
特異的活性および初期活性を、前記殺菌の段階２の液体中の生存微生物レベルに
変換する、 Ｄ．前記殺菌のために用いた物理的または化学的作用物質（類）の性質および
／または量を、前記生存微生物レベルの関数として調節する。
【００１０】 “生存微生物”という表現は、本明細書では培養可能の微生物および／または
培養不可能だが生育できる微生物を意味すると理解される。
【００１１】 “生存微生物”レベルとは、本明細書では、前記殺菌の段階２において前記液
体中で生きている微生物の濃度と、前記段階１において同じ液体中で生きている
微生物の濃度との比を意味すると理解される。この生存微生物のレベルは好適に
は１０の負の冪の形の減少値として、または−ｌｏｇ10（減少）に相当するｌｏ
ｇ減少としてあらわすのが好ましい。
【００１２】 前記段階１は、例えば、前記液体の《殺菌前の》段階に相当し、前記段階２は
この殺菌法のいかなる段階にも相当する（前記液体の《殺菌後》の段階も含む）
。
【００１３】 本発明による方法は、存在するかも知れない微生物が非常に特異的条件、すな
わち殺菌条件（それは細胞の顕著なストレスを引き起こす）にさらされる液体に
関係する。
【００１４】 本発明による液体の殺菌を調節する方法は特に、単純な接触によろうが、吸収
、摂取、滴下、または注入によろうが、ヒトまたは動物と接触させることを意図
した液体に関するものである。それは特にヒトまたは動物と接触することを目的
とする、浴用水、消費のための水、医薬品またはバイオテクノロジー製剤のため
の水、または食事用水等の液体に適用される。
【００１５】 前記液体中に存在するかも知れない微生物と、前記基質との前記接触は、前記
液体または前記液体のサンプルを前記基質と直接接触させるか、または存在する
かも知れない前記微生物の濃縮液、例えば前記液体または液体サンプルの濾過物
または遠心ペレット等を前記基質と接触させることによって実現する。
【００１６】 グルコース−６−燐酸脱水素酵素またはグルタチオン還元酵素等、若干の酵素
の活性を測定する前に、本発明による方法は好適には、前記液体、液体サンプル
または液体濃縮物を溶解処理、特に超音波による溶解処理にかける段階を含む。
【００１７】 カタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ等、その他の酵素の活性の測
定前には、予備的溶解段階は省いてもよい：これらの酵素の活性は、前記微生物
中に拡散する基質、例えばルシゲニンまたは過酸化水素等を用いて測定すること
ができる。
【００１８】 本発明の好適な面によると、前記液体、液体サンプルまたは液体濃縮物中にお
いて活性を測定すべき酵素（類）は、前記生存微生物レベルの数値の少なくとも
一つのゾーンにわたり生存微生物レベルと密接に関係する“特異的活性と初期活
性との比”を示し、ゼロとは有意に異なる勾配、より好適には−０.２未満の勾 配を有する。これは例えばグルコース−６−燐酸脱水素酵素でｌｏｇ減少値が約
０と３との間、およびグルタチオン還元酵素ではｌｏｇ減少値が約４と７との間
、スーパーオキシドジスムターゼではｌｏｇ減少値が約３と６との間の場合であ
る。
【００１９】 その他の関心とする酵素としては、特別の形で、脱水素酵素ファミリーの一部
または酸化的ストレスに対する反応に関係する酵素ファミリーがある。
【００２０】 本発明による調節法を或る液体で行うために１種類またはそれ以上の酵素が適
しているかどうかを調べるために、次のように上記方法を行う： −前記液体の少なくとも１つのサンプルを集め、生存微生物（培養可能微生物
および／または培養不可能だが生育可能の微生物）の濃度を測定する。より詳細
に述べれば、寒天上に培養しおよび／または染色して顕微鏡検査をする。 −この、またはこれらの液体サンプル中の各候補酵素の活性を分析試験する、 −前記液体サンプル（類）を同等の条件下で（例えば温度および曝露時間等の
条件）種々の用量の殺菌剤（類）にさらす、 −種々の用量の殺菌剤（類）にさらした後の各候補酵素の活性を測定する、 −各候補酵素で、活性パーセント（種々の用量の殺菌剤（類）にさらした後に
測定した酵素活性をさらす前の対応する酵素活性に対してあらわしたもの）を示
す曲線を測定ｌｏｇ減少値（上に定義したもの）の関数としてプロットする、 −各候補酵素で、前記曲線の勾配がゼロとは有意に異なる、より好適には−０
.２未満であるｌｏｇ減少ゾーンを決定する。このゾーンは前記液体中の考慮さ れる候補酵素の反応の範囲を構成する、 −或る候補酵素の反応の範囲が、与えられた液体に関して目的とする殺菌目標
に相当するｌｏｇ減少値を構成するならば、前記候補酵素は本発明による方法を
前記液体で行うのに適している。
【００２１】 本発明の特に好適な面によると、活性（類）が測定される酵素（類）の少なく
とも一つの酵素は、グルコース−６−燐酸脱水素酵素、マレート脱水素酵素、グ
リセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、カタラーゼ、スーパーオキシドジスム
ターゼまたはグルタチオン還元酵素である。前記酵素活性（類）または前記酵素
活性類の少なくとも一つを、基質を転化することによって測定する。その際適切
ならば、補因子の存在下で、例えばそれぞれグルコース−６−燐酸と補因子ＮＡ
ＤＰ、Ｌ−マレートと補因子ＮＡＤ、グリセルアルデヒド−３−燐酸と補因子Ｎ
ＡＤ、ルシゲニン、過酸化水素、酸化型グルタチンと補因子ＮＡＤＰＨ等として
測定する。
【００２２】 本発明の好適実施態様によると、特異的活性の前記測定および初期活性の測定
は分光光度計、スペクトロフルオロメータまたはルミノメータ等の光強度を検出
する機器、任意に分析のための数チャンネルを有するもの等を用いて行われる。
【００２３】 本発明のもう一つの好適実施態様によると、前記のあらかじめ確立された比較
系を利用する前記生存微生物レベルへの変換は、各酵素で特異的活性および初期
活性間の比を計算し、任意にパーセントとしてあらわすことを含んでなる。
【００２４】 本発明のもう一つの好適実施態様によると、前記比較系はグラフの形、例えば
各酵素で特異的活性と初期活性との前記比を生存微生物レベルの数値、例えばｌ
ｏｇ減少値に関係づける１本以上の曲線の形で存在する。特異的活性と初期活性
との間の前記比は、本明細書では《相対的活性》とも呼ばれる。
【００２５】 本発明のこの、その他好適実施態様の一面により、前記分光測定は特に、測定
される各酵素活性につき、一定温度、特に２５℃、そして一定波長、特に２４０
と５５０ｎｍとの間の波長、例えば３４０ｎｍで行われる。前記測定値は連続的
または不連続的に約３０分間記録される。より高い測定感度が求められる場合は
ルミノメトリーの使用が好ましい。
【００２６】 本発明による方法の殺菌調節段階は、上記の酵素インジケータを利用して、生
存微生物レベルの変化（例えば減少、ｌｏｇ減少またはＤインデックスとしてあ
らわされる）を、設定した殺菌目標に達するまで定期的にモニターすることによ
って行われる。
【００２７】 本発明による方法の殺菌調節段階は、目標とする生存微生物レベル（設定値）
と殺菌段階または殺菌後段階における前記液体、液体サンプルまたは液体濃縮物
上で効果的に測定した微生物レベルとの差に相当する《殺菌剤量》等量を添加し
て行うこともできる。
【００２８】 好適には、殺菌剤（類）の前記等量は、培養可能微生物レベルを前記液体に加
える殺菌剤用量の関数としてあらわす比較曲線上に読まれる。
【００２９】 本発明は、エシェリヒア属、アルカリゲネス属、バチルス属、フラボバクテリ
ウム属、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、クレブシエラ属、腸内細菌
属、アグロバクテリウム属、連鎖球菌、小球菌、サルモネラからなる群から選択
される微生物を含む液体で特に好適な結果を与える。
【００３０】 本発明による液体の殺菌調節法は、或る液体殺菌法において特に好都合なやり
方で容易に自動化され得る。先行技術とは異なり、本発明による方法では、確実
、迅速かつ容易に実行できる微生物学的コントロールが可能である。
【００３１】 好適には、前記生存微生物レベルは減少値（前記段階１で測定された、生存微
生物の初期濃度に対してあらわされる生存微生物濃度）、ｌｏｇ減少値（−ｌｏ
ｇ10（減少））、またはＤ指数（＝ｌｏｇ減少）としてもあらわされる。前記Ｄ
指数は考慮している液体の微生物学的質の指数でもある。
【００３２】 本発明による前記液体殺菌調節法は、存在する微生物のなかで培養可能である
もの、および／または存在する微生物のなかで培養不可能だが生育可能であるも
のを生存微生物と考える。培養可能の微生物と、培養不可能だが生育可能である
微生物とを両方考慮する場合、前記比較系は各酵素について、特異的活性と初期
活性との間の前記比を従来の方法によって測定した、培養可能微生物レベルの数
値と培養不可能だが生育可能の微生物のレベルの数値との加算から生成する生存
微生物レベルの数値に好都合に関連づける。
【００３３】 前記殺菌のために好適に用いられる化学的または物理的作用物質のなかでは、
塩素およびその誘導体、ＵＶ照射、オゾン、Ｈ2Ｏ2、濾過膜、温度、超音波また
はイオン化照射が挙げられる。
【００３４】 指針として述べられ、制限するものではない下記の実施態様によって、本発明
のその他の特性および長所も明らかになる。
【００３５】 前記実施例は図１、２および３に関係する：図１は培養可能の大腸菌（Escher
ichia coli）のレベル（初期集団に対する減少値としてあらわされる）を使用遊
離塩素濃度（ｍｇ／ｌ）の関数としてあらわす。 図２は、測定した最大活性の％としてあらわしたグルコース−６−燐酸脱水素
酵素（ＺＷＦ）活性を培養可能細菌レベル（初期細菌集団に対する減少値として
あらわされる）の関数としてあらわす。 図３は、測定（最大）初期活性の％としてあらわしたグルタチオン還元酵素活
性を、培養可能細菌レベル（最大細菌集団に対する減少値としてあらわされる）
の関数としてあらわす。
【００３６】実施例１： ヒトの消費のための殺菌水の微生物学的コントロール この目的は、酵素活性が人の飲用水等、殺菌すべき液体中の生存微生物レベル
の確実なインジケータとなり得るかどうかを決めることである。
【００３７】方法および結果 これに関して、大腸菌（パスツール研究所から入手できる菌株ＭＧ１６５５）
を栄養培地上で（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクト−レブル（Bacto-levure
）エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌを含むＬＢ培地、ｐＨ７に調節される ）２５℃で純粋培養することによって接種菌を調製した。指数的増殖期に細菌を
遠心分離によって採取し、それから燐酸緩衝液（ｐＨ７；０.０５Ｍ）で洗った 。ペレットを種々濃度（０.０から２.０ｍｇ／ｌまで）の遊離塩素を含む燐酸緩
衝液（ｐＨ７；０.０５Ｍ）に再懸濁する（約５×１０7細胞／ｍｌ）。これらの
種々の細菌懸濁液をその後２５℃で撹拌する。２０分後、サンプルを集め、これ
らの細菌懸濁液サンプルの分析を行う（測定すべき酵素活性につき、１００ない
し１０００ｍｌ容量）。
【００３８】 各サンプルで生存微生物レベルおよび種々の酵素活性を次の方法によって平行
して測定する。
【００３９】生存微生物の計数 細菌懸濁液の各サンプルで、生存している微生物の数、すなわち培養可能細菌
および／または培養不可能だが生育可能の細菌の数を数える。
【００４０】 生存微生物の計数は熟練せる当業者には公知の一般的方法によって行うことが
できる：例えば、培養可能細菌の計数のためにはＴＳＡ（トリプシン大豆寒天、
ディフコ（Difco））培地等の寒天培地上に培養することによって、培養不可能 だが生育可能な細菌の計数のためにはＣ．Ｔ．Ｃ．法によって（シャウル（Scha
ule G.）、フレミング（Flemming H.C.）、リッジュウェイ（Ridgway H.F.）、 １９９３、飲料水中のプランクトン性および固着性（sessile）細菌の定量に５ −シアノ−２、３−ジトリル塩化テトラゾリウムの使用、Appl.Environ.Microbi
ol.５９巻：３８５０−３８５７ページ）計数する。
【００４１】 測定した平均数ｎ1から、遊離塩素の各試験用量ｉにおける生存微生物の平均 濃度（Ｃi）を計算する。生存微生物の各平均濃度Ｃiを殺菌前に測定した生存微
生物の平均濃度（最大濃度Ｃmax）に対してあらわす。この説明の場合、Ｃmaxは
遊離塩素が存在しない場合に測定した生存微生物の平均濃度に等しい。各Ｃiを その後下記の式により減少値（または除去値）に変換する： 減少＝Ｃi／Ｃmax 生存微生物のこのレベル Ｃi／Ｃmax は殺菌の質の測定値でもある。
【００４２】 培養可能微生物の計数の結果を図１に示す。ここでは培養可能大腸菌のレベル
が適用した遊離塩素量の関数としてプロットされている。計数によって得られた
培養可能微生物の濃度に対応する減少（または除去）値は図１のｙ軸上にプロッ
トされ、殺菌前に測定した最大濃度に対してあらわされている：１０0は、測定 した最大濃度に等しい培養可能微生物濃度を示す；１０-1は培養可能微生物の濃
度がファクター１０だけ減少したことを示し、１０-2は培養可能微生物の濃度が
ファクター１０2だけ減少したことを示す、以下同様である。対応する細菌懸濁 液中の遊離塩素の初期濃度は図１のｘ軸上にプロットされる。この方法を、培養
不可能だが生育可能な細菌の計数結果で、同様にして行う。もし所望ならばこれ
を培養可能微生物の計数結果に加えてもよい。
【００４３】酵素活性 上記の生存微生物の計数と平行して種々の酵素活性を測定する。
【００４４】 ２種類の酵素―グルコース−６−燐酸脱水素酵素（以後はＺＷＦと呼ぶ）およ
びグルタチオン還元酵素―に関する実験をここに、より詳細に示す。これらの酵
素は一般に多くの微生物に存在する；そのためこれらは上記懸濁液に存在する全
微生物集団をあらわすことができ、そのため殺菌の結果あらわれる像を与えるこ
とができる。
【００４５】 ここに記載の実験において、懸濁液中の細菌の濃度は非常に低く、そのためあ
らかじめ濃縮せずに集めた液体サンプルでそれらの酵素活性を直接正しく測定す
ることはできない。そこで懸濁液のサンプルをここで濾過し（０.２２μｍ膜） 、微生物を回収する。微生物は４℃で３０００ｇで１０分間遠心分離することに
よって採取してもよい。
【００４６】 比較研究の結果、ＺＷＦまたはグルタチオン還元酵素活性を測定する前に微生
物を溶解することが好ましいことが判明した。そのためここではフィルター（ま
たはペレット）をシステム中に置き、回収された微生物を溶解する：ＺＷＦまた
はグルタチオン還元酵素活性の測定前に、微生物を超音波プローブによって溶解
することが好ましい（超音波下で３０秒、２サイクル、そして３０秒放置）。Ｚ
ＷＦまたはグルタチオン還元酵素以外の酵素、例えばカタラーゼまたはスーパー
オキシドジスムターゼ等の活性を測定するためには、ルシゲニンおよび過酸化水
素等、拡散する基質を用いることによって、これら微生物の予備的溶解は省くこ
とができる。
【００４７】 種々の酵素活性は熟練せる当業者に公知の方法によって測定することができる
。つまり、測定すべき各酵素活性ごとに、各サンプルの微生物を選択した基質と
接触させる。上記基質は、標的酵素がその基質の転化を触媒することができ、こ
の酵素的転化がスペクトロカロリメトリー、スペクトロフルオロメトリまたはル
ミノメトリ、等の自動化可能の一般的分析法によって容易にモニターできるよう
に選択される。
【００４８】 グルコース−６−燐酸脱水素酵素活性を測定するために、上記サンプルの微生
物と、０.６ｍＭグルコース−６−燐酸および酸化型ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド燐酸（０.２ｍＭ ＮＡＤＰ）からなる基質とをｐＨ安定化溶液（
トリス緩衝液添加、ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）の存在下で接触させる。 この基質はグルコース−６−燐酸脱水素酵素の存在下で、ニコチナミドアデニン
ジヌクレオチド燐酸の還元型（ＮＡＤＰＨ）を生成させる。その外観をスペクト
ロカロリメトリーで、波長３４０ｎｍでモニターできる（フレンケル（Fraenkel
D.G.）およびレビソーン（Levisohn S.R.）、１９６７、ホスホグルコースイソ
メラーゼが欠如している大腸菌突然変異体のグルコースおよびグルコネート代謝
、J.Bact. ９３巻：１５７１−１５７８ページ）。
【００４９】 グルタチオン還元酵素活性を測定するためには、サンプル中の微生物をｐＨ安
定化溶液（１００ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７）の存在下で還元型ニコチナミドアデ
ニンジヌクレオチド燐酸（０.２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）および酸化グルタチオン（２
.５ｍＭグルタチオンジスルフィド ＧＳ−ＳＧ）からなる基質と接触させる。グ
ルタチオン還元酵素の触媒作用のもとで、この基質は酸化型ニコチナミドアデニ
ンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰ）および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）に転化
する。ＮＡＤＰＨの消失をスペクトロカロリメトリーで波長３４０ｎｍでモニタ
ーする（ロペツ−バリ（Lopez-Barea J.）およびリー（Lee C.Y.） １９７９、 マウス肝グルタチオン還元酵素：精製、速度論および調節、Eur.J.Biochem.９８
巻：４８７−４９９ページ）。
【００５０】 酵素活性の測定はここでは同じ一定温度（２５℃）で、パーキンエルマー ラ ムダ１型分光光度計によって行われる。
【００５１】 考慮する酵素反応の開始前に測定した光学密度値を“測定のためのブランク”
とする。各反応媒質の特異的光学密度値を或る時間にわたって記録する。
【００５２】 サンプルの特異的酵素活性を、上記基質を標的酵素と接触させた後に観察され
る特異的光学密度をあらわす曲線の直線部分（例えば５分と３５分との間）で計
算する。《サンプルの特異的光学密度を時間の関数としてあらわした》曲線の５
−３５分の時間間隔における勾配の計算は、特異的光学密度の変動の数値を与え
る。
【００５３】 各酵素について、殺菌剤の種々用量で測定される特異的酵素活性（時間単位で
消費されまたは生産される基質量）を各々同じ酵素で記録された初期活性値の％
、すなわち同じ酵素で最低量の殺菌剤で測定された活性値の％としてあらわす：
この説明では、サンプルの特異的グルコース−６−燐酸脱水素酵素（ＺＷＦ）活
性および特異的グルタチオン還元酵素活性が遊離塩素を含まない（すなわち殺菌
前）細菌懸濁液で測定されたそれぞれ特異的グルコース−６−燐酸脱水素酵素（
ＺＷＦ）およびグルタチオン還元酵素活性の％としてあらわされる。殺菌法の或
る段階（すなわち殺菌中または殺菌後）における液体の特異的酵素活性と、この
同じ液体の殺菌前の特異的酵素活性との間のこの比を、ここでは殺菌の前記段階
におけるこの液体の相対的酵素活性と呼ぶ。
【００５４】 得られた相対的酵素活性をその後微生物学的計数の測定値と比較する。培養可
能微生物の計数結果は図２および３に示す。
【００５５】 図２は、ｙ軸に、測定グルコース−６−燐酸脱水素酵素活性（ＺＷＦ）を、記
録された最大活性（初期活性）の％としてあらわし、ｘ軸に計数によって得た培
養可能の大腸菌の対応する数をあらわす。 図３は、ｙ軸に、測定されたグルタチオン還元酵素活性を記録された最大活性
（初期活性）の％としてあらわし、ｘ軸に計数によって得られる培養可能大腸菌
の対応する数をあらわす。 図２並びに図３において、生存微生物の数は下記の式によってｌｏｇ減少の関
数としてあらわされる。 ｌｏｇ減少＝−ｌｏｇ10（Ｃi／Ｃmax） 上記式中、ＣiおよびＣmaxは上記のように定義される。
【００５６】 必要ならば、培養不可能だが生育可能の微生物の計数を考慮して同じタイプの
図を得ることができる。
【００５７】 図２並びに図３において、ｌｏｇ減少値は次のようにしてｘ軸上にプロットす
る： １Ｅ００は、記録された最大数に一致する培養可能微生物数をあらわす（
遊離塩素を含まない懸濁液）；１Ｅ−０１は、最大記録数からｌｏｇ減少値１に
対応する微生物数だけ減少した培養可能微生物数をあらわす；１Ｅ−２は、最大
記録数からｌｏｇ減少値２に対応する微生物数だけ減少した培養可能微生物数を
あらわす、等々。最後に１Ｅ−０７は、最大記録数からｌｏｇ減少値７に対応す
る微生物数だけ減少した培養可能微生物数をあらわす。
【００５８】 このｌｏｇ減少値は考慮液体の微生物学的質の指数ともなる。この指数はＤと
呼ばれる。
【００５９】 得られた結果は、グルコース−６−燐酸脱水素酵素活性（相対的活性）のモニ
ターが、微生物除去のための何の処理も受けなかった液体サンプルから約３以下
のｌｏｇ減少（または除去）を有する液体サンプルまでの範囲のサンプルでは、
生存微生物の数をあらわすインジケータとなることを示す（図２参照）。
【００６０】 上記結果はまた、グルタチオン還元酵素活性（相対的活性）は、大体４から７
までのｌｏｇ減少（または除去）を有する液体サンプル範囲で、生存微生物数の
典型的インジケータであることを示す（図３参照）。実際、グルタチオン還元酵
素活性はｌｏｇ減少４に達する前には顕著な影響を受けない。この酵素では約４
から７までの間のｌｏｇ減少ゾーンにおいてのみ、相対的活性とｌｏｇ減少との
間に明らかな比例関係が認められる。
【００６１】 同様にして、我々はスーパーオキシドジスムターゼ（相対的）活性（ルミノメ
トリーでルシゲニンにより測定）が約３と６との間のｌｏｇ減少（または除去）
を有する液体サンプルで、生存微生物数をあらわすインジケータであることを証
明できた。スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼはさらに、溶解処理
を必要としないという利点を有する：それらの活性の測定は、ルミノメトリーに
よって、それぞれルシゲニンおよび過酸化水素等の拡散基質で行うことができる
。
【００６２】 このように、試験した種々の酵素は同じ感度領域をカバーしない：グルコース
−６−燐酸脱水素酵素（ＺＷＦ）の相対的活性は、微生物集団の相対的減少が小
さい液体サンプルにおける生存微生物数（ｌｏｇ減少）をあらわすインジケータ
であり、スーパーオキシドジスムターゼおよびグルタチオン還元酵素の相対的活
性は、微生物集団の中程度の、ないし高い相対的減少を蒙る液体サンプル中の生
存微生物数（ｌｏｇ減少）をあらわすインジケータである。
【００６３】 同じタイプの感度範囲（ｌｏｇ減少値の若干のゾーンでは相対的活性とｌｏｇ
減少との間に比例関係がある）が、マレート脱水素酵素、グリセルアルデヒド−
３−燐酸脱水素酵素、カタラーゼの相対的活性の測定によって認められた（ｐＨ
７の緩衝溶液中で過酸化水素の消費を２４０ｎｍで測定するか、または化学ルミ
ネッセンスによって）。熟練せる当業者は酵素活性を測定するための酵素および
プロトコルのその他の例を種々の参考書に見いだすことができる。例えば：酸化
的ストレスおよび抗酸化性防御の分子生物学、１９９７、Cold Spring Harbor L
aboratory Press 0-87969-502-1/97；Lehninger １９７７、Biochemie、Flammar
ion ISBN 2-257-25009-5；酵素学的方法、Academic Press Inc. 等、I-XLI-XLII
-89-105 および 234。
【００６４】 例えば上記のプロトコルにしたがって相対的活性およびｌｏｇ減少の間に有意
な比較関係（例えば−０.２未満の有意な勾配）を証明できる酵素は全て、本発 明による信頼できるインジケータとなる。
【００６５】 大腸菌懸濁液に漸増量の塩素ではなく漸増量のオゾンまたは漸増量のＵＶを適
用することによって、同じタイプの酵素感度範囲が得られる。
【００６６】検討 このように、酵素活性の測定によって、殺菌液体中の微生物集団の変化をモニ
ターできることは明らかである。細菌モニターに代わるこれら種々の酵素的イン
ジケータは、全ての微生物集団―培養可能微生物および培養不可能だが生育可能
の微生物―を明らかにする。
【００６７】 例えば、３未満のｌｏｇ減少値の代わりにＺＷＦ相対的活性をモニターし、４
より大きいｌｏｇ減少値の代わりにグルタチオン還元酵素相対的活性をモニター
することができる。３から４までのｌｏｇ減少値の正確な測定が必要な場合は、
例えばスーパーオキシドジスムターゼの相対的活性を測定することができる。
【００６８】 行われた殺菌が６より大きいｌｏｇ減少値を誘導しない場合、３より大きいｌ
ｏｇ減少値から反応を開始するスーパーオキシドジスムターゼの相対的活性を単
にモニターするか、またはｌｏｇ減少値３まではＺＷＦ相対的活性をモニターし
、その先はスーパーオキシドジスムターゼの相対的活性をモニターする。
【００６９】 上記の細菌モニターに代わる種々のタイプの酵素的インジケータにより、試験
液体のｌｏｇ減少値を知ることができ、それによって微生物学的質のＤ指数、そ
の減少値およびそこに生き残っている微生物数を知ることができる。こうしてそ
れらインジケータは最後には使用した殺菌法の速度および効率の測定値を与える
。
【００７０】 試験液体中の生存微生物数（例えばｌｏｇ減少または殺菌の質の指数の形であ
らわされる）が感染目標値（例えばｌｏｇ減少または殺菌の質の設定値）に一致
しない場合は、前記液体に加えた殺菌剤の量（例えば遊離塩素、オゾンの濃度、
ＵＶ線量、温度、超音波、イオン化照射の量）を相応に調節できる。
【００７１】 殺菌剤（類）の用量のこの増加または減少を、生存微生物の数の変化（ｌｏｇ
減少）を上記の酵素的インジケータによって規則的にモニターすることによって
、設定殺菌目標に達するまで行うことができる。
【００７２】 殺菌剤（類）の用量の調節は、例えばｌｏｇ減少値、殺菌剤（類）の適用量（
例えば遊離塩素、オゾン、ＵＶ、温度、超音波またはイオン化照射の漸増量）の
関数としてあらわされる生存微生物のレベルをあらわす前記液体サンプルのあら
かじめ確立された比較曲線を用いても行うことができる。
【００７３】 このような比較曲線は、上に述べた酵素的インジケータによって得られる生存
微生物の測定レベルおよび所望レベルにそれぞれ対応する殺菌剤量の数値を読み
取ることを可能にする。そこで試験液体に投与する殺菌剤の量を、殺菌剤（類）
のこれらの対応する量の間の差によって単に増やしたり、減らしたりすればよい
。
【００７４】 このような比較曲線は例えば、漸増量の殺菌剤（例えば遊離塩素、オゾンの漸
増濃度、ＵＶ、イオン化照射、超音波の漸増量、又は高める温度）にさらした前
記液体のサンプル中の生存微生物を数えることによって得ることができる。
【００７５】 本発明による液体の殺菌調節法は、酵素活性の測定によって、液体の殺菌を、
そこに生存する微生物の生理的状態または同一性（identity）には無関係に、完
全に、簡単にそして迅速に（１時間未満）モニターすることができる。本発明に
よる液体の殺菌を調節する方法は、その他に、顕微鏡試験または微生物学的培養
技術を用いる方法とは異なり、自動化が容易であるという特別の利点も有する。
【００７６】 本発明は上に説明し、記載した典型的実施態様に制限されるものではなく、全
ての変形体を含むことは当然である。よって、特に酵素活性の測定は、上記以外
の分析法によって行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、培養可能の大腸菌のレベルを使用浮遊塩素濃度の関数としてあらわし
たグラフである。
【図２】 図２は、測定した最大活性の％としてあらわしたグルコース−６−燐酸脱水素
酵素活性を培養可能細菌レベルの関数としてあらわしたグラフである。
【図３】 図３は、測定初期活性の％としてあらわしたグルタチオン還元酵素活性を、か
培養可能細菌レベルの関数としてあらわしたグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デュカーン，サム フランス国、13013 マルセーイユ、ブー ルヴァール ポロ 19

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 液体の殺菌を調節する方法であって、 Ａ．前記殺菌の一段階（以後は段階２と呼ぶ）において、前記液体中に存在す
    るかも知れない微生物をこの酵素またはこれらの酵素類の活性をあらわすことが
    できるように選択された基質と接触させることによって、少なくとも１種類の酵
    素活性を測定し、この酵素活性を以後は特異的活性と称することにし、 Ｂ．以後は段階１と呼ばれる一段階において、前記段階２の前に、Ａの場合と
    同じ酵素（類）の活性を測定し、この活性を以後は初期活性と称することにし、 Ｃ．各酵素につき、前記段階１に集め、それから漸増量の殺菌剤にさらした前
    記液体サンプルを用いてあらかじめ確立した比較系によって、前記特異的活性お
    よび初期活性を、前記殺菌の段階２において前記液体中に生存する微生物のレベ
    ルに変換し、 Ｄ．前記生存微生物レベルの関数として、前記殺菌に用いた物理的または化学
    的作用物質（類）の性質および／または用量を調節する 諸段階を含む方法。
  2. 【請求項２】 前記段階１が前記液体の殺菌前の段階に相当し、前記段階２
    が前記殺菌のいずれかの段階に相当する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記液体がヒトまたは動物と接触することを目的とする液体
    、例えば浴用水、消費用の水、医薬品またはバイオテクノロジー製剤のための水
    、または食事用液体であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 前記液体中に存在するかも知れない微生物と前記基質との接
    触が、前記液体または前記液体のサンプルを前記基質と直接接触させることによ
    って行われることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかの項に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 前記液体または前記液体のサンプル中に存在するかも知れな
    い微生物と前記基質との前記接触が、前記液体または前記液体のサンプルの濾過
    物または遠心分離ペレットを前記基質と接触させることによって行われる請求項
    １ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記液体、液体サンプルまたは濃縮物が、前記少なくとも１
    種類の酵素の活性の測定前に、溶解処理、特に超音波による溶解処理にかけられ
    ることを特徴とする請求項１ないし請求項５記載のいずれかの項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 活性（類）を測定すべき酵素（類）が前記液体、液体サンプ
    ルまたは濃縮物中で、前記生存微生物レベルの数値の少なくとも一つのゾーンで
    は生存微生物レベルと密接に関係する特異的活性と初期活性との比を示し、その
    勾配はゼロとは有意に異なり、好適には−０.２未満であることを特徴とする請 求項１ないし請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 活性（類）を測定すべき酵素がグルコース−６−燐酸脱水素
    酵素、マレート脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、カタラ
    ーゼ、スーパーオキシドジスムターゼまたはグルタチオン還元酵素であることを
    特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれかの項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 特異的活性および初期活性の前記測定が分光光度計、スペク
    トロフルオロメータまたはルミノメータによって行われ、これらは任意に分析の
    ために数チャンネルを有することを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれ
    かの項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記のあらかじめ確立された比較系による、生存微生物レ
    ベルへの前記変換が、各酵素で、特異的活性と初期活性との比（任意にパーセン
    トとしてあらわされる）の計算を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項９
    のいずれかの項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記比較系が、各酵素で、前記特異的活性と初期活性との
    比を生存微生物レベルの数値に関係づける１本以上の曲線等のグラフの形で存在
    することを特徴とする請求項１ないし請求項１０記載のいずれかの項に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記分光法測定が測定する各酵素活性ごとに、一定温度、
    特に２５℃、一定波長、特に２４０ないし５５０ｎｍの波長、特に３４０ｎｍの
    波長で行われることを特徴とする請求項９ないし請求項１１のいずれかの項に記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記分光測定が時間間隔約３０分にわたって連続的または
    不連続的に行われることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のいずれかの項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 化学的または物理的作用物質（類）の用量の前記調節が、
    目的とする生存微生物レベルと、前記液体、液体サンプルまたは濃縮物で測定し
    た微生物レベルとの間の差に応じた等価の“殺菌用量”の添加によって行われる
    ことを特徴とする請求項１ないし請求項１３のいずれかの項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 殺菌剤（類）の前記等価量が、生存微生物レベルを前記液
    体に加えられる殺菌剤（類）の用量の関数としてあらわした比較曲線上に読まれ
    ることを特徴とする請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記液体が、エシェリヒア属（Escherichia）、アルカリ ゲネス属（Alcaligenes）、バチルス属（Bacillus）、フラボバクテリウム属（F
    lavobacterium）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、シュードモナ ス属（Pseudomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）、腸内細菌属（Enterobac
    terium）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、連鎖球菌（Streptococcus
    ）、小球菌（Micrococcus）、サルモネラ（Salmonella）からなる群から選択さ れる微生物を含む請求項１ないし請求項１５のいずれかの項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 液体殺菌法として自動化されることを特徴とする請求項１
    ないし請求項１６のいずれかの項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記生存微生物レベルが減少値（前記段階１で測定される
    、生存微生物の初期濃度に対してあらわされる生存微生物濃度）、ｌｏｇ減少値
    （−ｌｏｇ10（減少））またはＤ指数（＝ｌｏｇ減少）としてあらわされること
    を特徴とする請求項１ないし請求項１７のいずれかの項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記生存微生物が培養可能微生物および／または培養不可
    能であるが生育可能な微生物であることを特徴とする請求項１ないし請求項１８
    のいずれかの項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 殺菌に用いられる前記化学的または物理的作用物質が、塩
    素およびその誘導体、ＵＶ照射、オゾン、Ｈ2Ｏ2、濾過膜、温度、超音波または
    イオン化照射からなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし請求項
    １９のいずれかの項に記載の方法。
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