JP2001120299A - 微生物の増殖および活性の測定方法及び感受性試験方法 - Google Patents
微生物の増殖および活性の測定方法及び感受性試験方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】多様な微生物の増殖や活性に関する定量的測定
を微生物を破壊せずかつ迅速簡便に行える方法、及びこ
の測定方法を用いて、種々の細菌に対する各種抗菌剤の
抗菌力を迅速簡便に評価することができる感受性試験方
法を提供すること。 【解決手段】 培養液中で微生物を酸化型キノンととも
にインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量す
る微生物の増殖及び／又は活性の測定方法。培養液中で
微生物を、抗菌剤の存在下、酸化型キノンとともにイン
キュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定
量された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物
の抗菌剤に対する感受性を評価する感受性試験方法。
を微生物を破壊せずかつ迅速簡便に行える方法、及びこ
の測定方法を用いて、種々の細菌に対する各種抗菌剤の
抗菌力を迅速簡便に評価することができる感受性試験方
法を提供すること。 【解決手段】 培養液中で微生物を酸化型キノンととも
にインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量す
る微生物の増殖及び／又は活性の測定方法。培養液中で
微生物を、抗菌剤の存在下、酸化型キノンとともにイン
キュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定
量された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物
の抗菌剤に対する感受性を評価する感受性試験方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物の増殖や活性
を迅速簡便に測定する方法及びこの方法を用いる感受性
試験方法に関する。
を迅速簡便に測定する方法及びこの方法を用いる感受性
試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】生きた
微生物を迅速かつ鋭敏に検出する方法として、細胞内の
アデノシン三リン酸(ATP)の濃度をD−ルシフェリンとル
シフェラーゼを用いた生物化学発光で測定し、微量の微
生物の濃度を知る方法がある。しかし、微生物のATPと
培地中のATPを識別することはできず、誤差の大きい結
果を得る危険性がある。また、培地中のATPを破壊した
り、微生物からATPを抽出しても、これらの処理中に微
生物内のATP濃度が大きく変化し、安定した結果を得る
ことは困難である。
微生物を迅速かつ鋭敏に検出する方法として、細胞内の
アデノシン三リン酸(ATP)の濃度をD−ルシフェリンとル
シフェラーゼを用いた生物化学発光で測定し、微量の微
生物の濃度を知る方法がある。しかし、微生物のATPと
培地中のATPを識別することはできず、誤差の大きい結
果を得る危険性がある。また、培地中のATPを破壊した
り、微生物からATPを抽出しても、これらの処理中に微
生物内のATP濃度が大きく変化し、安定した結果を得る
ことは困難である。
【０００３】別法として、微生物の培養液に酸化型キノ
ンを添加して、還元型キノンを生成させた後、この還元
型キノンが培養液中の溶存酸素と反応し、過酸化水素を
発生させる方法がある（特開平１−１６０４９９号公
報）。過酸化水素の発生量は微生物の量や活性に比例す
るため、微量の過酸化水素を化学発光法で定量し、微生
物の濃度や活性を測定することができる。この方法は生
細胞を破壊することなしに迅速かつ簡便に測定できるの
が大きな特徴である。特に酵母や真核細胞では、良好な
結果が得られている。
ンを添加して、還元型キノンを生成させた後、この還元
型キノンが培養液中の溶存酸素と反応し、過酸化水素を
発生させる方法がある（特開平１−１６０４９９号公
報）。過酸化水素の発生量は微生物の量や活性に比例す
るため、微量の過酸化水素を化学発光法で定量し、微生
物の濃度や活性を測定することができる。この方法は生
細胞を破壊することなしに迅速かつ簡便に測定できるの
が大きな特徴である。特に酵母や真核細胞では、良好な
結果が得られている。
【０００４】ところで、近年、院内感染や耐性菌の出現
が、社会的にも大きな問題となっている。ところが、従
来の微生物検査には１８時間〜２４時間という長時間が
必要であり、検査結果の臨床への迅速な適用が妨げられ
ていた。このような状況下、迅速かつ簡便な微生物の活
性測定方法の出現が待たれていた。
が、社会的にも大きな問題となっている。ところが、従
来の微生物検査には１８時間〜２４時間という長時間が
必要であり、検査結果の臨床への迅速な適用が妨げられ
ていた。このような状況下、迅速かつ簡便な微生物の活
性測定方法の出現が待たれていた。
【０００５】しかしながら、上記方法は、細菌（微生
物）の活性測定の場合には、必ずしも良好な結果が得ら
れない場合があった。例えば、培養液の組成によって発
光反応が大きく阻害されることがある。特に、上記方法
は、培養液中の塩類の種類と濃度に影響を受けやすいた
め、使用できる培養液が限定される。従って、微生物の
培養条件も限定され応用範囲が狭くなる。また、ミクロ
コッカス、スタヒロコッカス、バシラス、腸内細菌など
は過酸化水素を破壊するカタラーゼをもつものがあり、
発生した過酸化水素がこの酵素によって破壊され、発光
が著しく減少するため微生物の増殖や活性が正確に測定
できない場合がある。更に、微生物の中には、酸素を嫌
う嫌気性微生物もいるため、溶存酸素が存在しない培養
液では、この方法は適用できない。
物）の活性測定の場合には、必ずしも良好な結果が得ら
れない場合があった。例えば、培養液の組成によって発
光反応が大きく阻害されることがある。特に、上記方法
は、培養液中の塩類の種類と濃度に影響を受けやすいた
め、使用できる培養液が限定される。従って、微生物の
培養条件も限定され応用範囲が狭くなる。また、ミクロ
コッカス、スタヒロコッカス、バシラス、腸内細菌など
は過酸化水素を破壊するカタラーゼをもつものがあり、
発生した過酸化水素がこの酵素によって破壊され、発光
が著しく減少するため微生物の増殖や活性が正確に測定
できない場合がある。更に、微生物の中には、酸素を嫌
う嫌気性微生物もいるため、溶存酸素が存在しない培養
液では、この方法は適用できない。
【０００６】以上の実情に鑑み、多様多種の微生物の増
殖や活性を調べるためには、多様な培養液の使用が可能
で、かつ微生物のカタラーゼやその他の酵素で測定が妨
害されず、酸素の有無にも影響されない方法を開発する
必要がある。そこで本発明の目的は、多様な微生物の増
殖や活性に関する定量的測定を、微生物を破壊せず、か
つ迅速簡便に行える方法を提供することにある。さらに
本発明の目的は、上記測定方法を用いて、種々の細菌に
対する各種抗菌剤の抗菌力を迅速簡便に評価することが
できる感受性試験方法を提供することにある。
殖や活性を調べるためには、多様な培養液の使用が可能
で、かつ微生物のカタラーゼやその他の酵素で測定が妨
害されず、酸素の有無にも影響されない方法を開発する
必要がある。そこで本発明の目的は、多様な微生物の増
殖や活性に関する定量的測定を、微生物を破壊せず、か
つ迅速簡便に行える方法を提供することにある。さらに
本発明の目的は、上記測定方法を用いて、種々の細菌に
対する各種抗菌剤の抗菌力を迅速簡便に評価することが
できる感受性試験方法を提供することにある。
【０００７】本発明は、培養液中で微生物を酸化型キノ
ンとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法
で定量することを特徴とする微生物の増殖及び／又は活
性の測定方法に関する。さらに本発明は、培養液中で微
生物を、抗菌剤の存在下、酸化型キノンとともにインキ
ュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定量
された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物の
抗菌剤に対する感受性を評価することを特徴とする感受
性試験方法に関する。
ンとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法
で定量することを特徴とする微生物の増殖及び／又は活
性の測定方法に関する。さらに本発明は、培養液中で微
生物を、抗菌剤の存在下、酸化型キノンとともにインキ
ュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定量
された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物の
抗菌剤に対する感受性を評価することを特徴とする感受
性試験方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の微生物の増殖及び／又は
活性の測定方法及び感受性試験方法では、培養液中で微
生物を酸化型キノンとともにインキュベーションするこ
とにより生成する生成物を化学発光法で定量することを
特徴とする。本発明の方法で増殖及び／又は活性の測定
をすることができる微生物には特に制限はなく、例え
ば、腸内細菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、ブドウ球
菌、溶血連鎖球菌、腸球菌、バシラス、バクテロイデ
ス、クロストリジウム等を挙げることができる。本発明
の方法において、前記生成物は、具体的には、少なくと
も還元型キノン、スーパオキシドアニオンまたはその両
者である。また、酸化型キノンとしては、例えば、メナ
ジオンを用いることができる。メナジオン以外の酸化型
キノンを用いることもでき、そのような酸化型キノンと
しては、例えば、１，２−ナフトキノン、１，２−ナフ
トキノン−２−スルホン酸、２−メチル−３−フィチル
−１，４−ナフトキノン、２−オキソ−１，４−ナフト
キノン、１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノ
ン、テトラメチル−１，４−ベンゾキノン、２−メチル
−１，４−ベンゾキノン、アントラキノン、アントラキ
ノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム、クロラニル
酸等を挙げることができる。
活性の測定方法及び感受性試験方法では、培養液中で微
生物を酸化型キノンとともにインキュベーションするこ
とにより生成する生成物を化学発光法で定量することを
特徴とする。本発明の方法で増殖及び／又は活性の測定
をすることができる微生物には特に制限はなく、例え
ば、腸内細菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、ブドウ球
菌、溶血連鎖球菌、腸球菌、バシラス、バクテロイデ
ス、クロストリジウム等を挙げることができる。本発明
の方法において、前記生成物は、具体的には、少なくと
も還元型キノン、スーパオキシドアニオンまたはその両
者である。また、酸化型キノンとしては、例えば、メナ
ジオンを用いることができる。メナジオン以外の酸化型
キノンを用いることもでき、そのような酸化型キノンと
しては、例えば、１，２−ナフトキノン、１，２−ナフ
トキノン−２−スルホン酸、２−メチル−３−フィチル
−１，４−ナフトキノン、２−オキソ−１，４−ナフト
キノン、１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノ
ン、テトラメチル−１，４−ベンゾキノン、２−メチル
−１，４−ベンゾキノン、アントラキノン、アントラキ
ノン−２，６−ジスルホン酸ジナトリウム、クロラニル
酸等を挙げることができる。
【０００９】微生物の細胞膜には呼吸鎖が存在し、グル
コースやアルコールを酸化して、生命維持のエネルギー
を確保している。呼吸鎖にはチトクロム成分をはじめ数
多くの電子伝達機能をもつタンパク質が存在している。
また、グラム陰性菌のペリプラズムや細胞質もキノン還
元酵素が存在している。従って、キノンを細胞外から添
加してやると、微生物によって酸化型キノンは還元さ
れ、還元生成物は更に培養液中の溶存酸素と反応して、
不安定なスーパーオキシドアニオンが発生すると推測さ
れる。また、溶存酸素がなければキノンの還元体が培養
液中にそのまま存在しつづける推測される。
コースやアルコールを酸化して、生命維持のエネルギー
を確保している。呼吸鎖にはチトクロム成分をはじめ数
多くの電子伝達機能をもつタンパク質が存在している。
また、グラム陰性菌のペリプラズムや細胞質もキノン還
元酵素が存在している。従って、キノンを細胞外から添
加してやると、微生物によって酸化型キノンは還元さ
れ、還元生成物は更に培養液中の溶存酸素と反応して、
不安定なスーパーオキシドアニオンが発生すると推測さ
れる。また、溶存酸素がなければキノンの還元体が培養
液中にそのまま存在しつづける推測される。
【００１０】本発明の方法では、グラム陰性菌やグラム
陽性菌のような細菌に、メナジオン等の酸化型キノンを
添加し、インキュベーションすると、好気性条件下で
は、スーパオキシドアニオン（Ｏ2 -）が培養液中に発生
する。そして、スーパーオキシドアニオンを化学発光法
により定量することで、細菌の増殖や活性を測定するこ
とができる。具体的には、ルミノール及びルシゲニン等
の発光試薬を用いた化学発光反応の発光強度から細菌の
増殖や活性を定量することができる。
陽性菌のような細菌に、メナジオン等の酸化型キノンを
添加し、インキュベーションすると、好気性条件下で
は、スーパオキシドアニオン（Ｏ2 -）が培養液中に発生
する。そして、スーパーオキシドアニオンを化学発光法
により定量することで、細菌の増殖や活性を測定するこ
とができる。具体的には、ルミノール及びルシゲニン等
の発光試薬を用いた化学発光反応の発光強度から細菌の
増殖や活性を定量することができる。
【００１１】前記特開平１−１６０４９９号公報に記載
された方法では、生細胞によりキノンの酸化還元を介し
て生成された過酸化水素を、過酸化水素の定量に適した
試薬を用いた化学発光法により定量している。測定対象
である生細胞が主に酵母や真核細胞の場合、キノンの酸
化還元を介して過酸化水素が定量的に生成されるため、
この過酸化水素量を定量することで、生細胞の増殖や活
性を定量することができた。それに対して、測定対象が
細菌（微生物）の場合、キノンの酸化還元を介した過酸
化水素の生成が、必ずしも生細胞の増殖や活性と比例し
ないことが、本発明者らの検討の結果、明らかになっ
た。その理由は、キノン還元酵素の存在位置が、酵母や
真核細胞と細菌とで異なるためと考えられている。本発
明と前記特開平１−１６０４９９号公報に記載された方
法とでは、化学発光法において定量する対象がスーパー
オキシドアニオンであるか、過酸化水素であるか及びこ
れらの対象により発光させる試薬が異なる。
された方法では、生細胞によりキノンの酸化還元を介し
て生成された過酸化水素を、過酸化水素の定量に適した
試薬を用いた化学発光法により定量している。測定対象
である生細胞が主に酵母や真核細胞の場合、キノンの酸
化還元を介して過酸化水素が定量的に生成されるため、
この過酸化水素量を定量することで、生細胞の増殖や活
性を定量することができた。それに対して、測定対象が
細菌（微生物）の場合、キノンの酸化還元を介した過酸
化水素の生成が、必ずしも生細胞の増殖や活性と比例し
ないことが、本発明者らの検討の結果、明らかになっ
た。その理由は、キノン還元酵素の存在位置が、酵母や
真核細胞と細菌とで異なるためと考えられている。本発
明と前記特開平１−１６０４９９号公報に記載された方
法とでは、化学発光法において定量する対象がスーパー
オキシドアニオンであるか、過酸化水素であるか及びこ
れらの対象により発光させる試薬が異なる。
【００１２】本発明の微生物の増殖及び／又は活性の測
定方法においては、培養液中の微生物濃度は、例えば、
数個〜１０8個程度とし、培養液中の酸化型キノンの濃
度は０．０１〜１μｇ／ｍｌ程度とすることができる。
また、培養液に含まれる栄養成分等やインキュベーショ
ンの温度は、微生物の種類により適宜選択することがで
きる。化学発光の測定は以下のように行うことができ
る。微生物を含む培養液に酸化型キノンを添加してイン
キュベーションを開始し、適当な間隔で培養液から適量
をサンプリングする。サンプリング液にルミノール等の
発光性還元物を添加し、化学発光の強度を測定する。酸
化型キノンとしてメナジオンを用いる場合、サンプリン
グ間隔が秒単位でもメナジオン添加直後から発光強度の
上昇を観察することができる。これにより、微生物の増
殖や活性が秒刻みで測定できる。従来の病原菌の薬物感
受性試験は、細菌の増殖の変化を目視で判定しているた
め、試験結果が得られるまでに最低でも10時間以上必要
であった。しかし、本発明の測定方法では、１５分から
数時間程度の時間で、微生物の増殖や活性を測定するこ
とができる。
定方法においては、培養液中の微生物濃度は、例えば、
数個〜１０8個程度とし、培養液中の酸化型キノンの濃
度は０．０１〜１μｇ／ｍｌ程度とすることができる。
また、培養液に含まれる栄養成分等やインキュベーショ
ンの温度は、微生物の種類により適宜選択することがで
きる。化学発光の測定は以下のように行うことができ
る。微生物を含む培養液に酸化型キノンを添加してイン
キュベーションを開始し、適当な間隔で培養液から適量
をサンプリングする。サンプリング液にルミノール等の
発光性還元物を添加し、化学発光の強度を測定する。酸
化型キノンとしてメナジオンを用いる場合、サンプリン
グ間隔が秒単位でもメナジオン添加直後から発光強度の
上昇を観察することができる。これにより、微生物の増
殖や活性が秒刻みで測定できる。従来の病原菌の薬物感
受性試験は、細菌の増殖の変化を目視で判定しているた
め、試験結果が得られるまでに最低でも10時間以上必要
であった。しかし、本発明の測定方法では、１５分から
数時間程度の時間で、微生物の増殖や活性を測定するこ
とができる。
【００１３】本発明の感受性試験方法は、上記培養液中
での微生物のインキュベーションを抗菌剤の存在下で行
うこおて実施される。使用される抗菌剤の種類には特に
制限はない。また、培養液中の抗菌剤濃度を変化させて
試験することや２種以上の抗菌剤を併用することで、種
々の角度から薬剤感受性試験を行うこともできる。本発
明の方法は上記のように短時間で薬剤の微生物に対する
影響が観察されるので、この時間内に薬物感受性試験が
完了する。
での微生物のインキュベーションを抗菌剤の存在下で行
うこおて実施される。使用される抗菌剤の種類には特に
制限はない。また、培養液中の抗菌剤濃度を変化させて
試験することや２種以上の抗菌剤を併用することで、種
々の角度から薬剤感受性試験を行うこともできる。本発
明の方法は上記のように短時間で薬剤の微生物に対する
影響が観察されるので、この時間内に薬物感受性試験が
完了する。
【００１４】
【発明の効果】上記のように本発明の方法では、従来の
薬物感受性試験の所要時間に比べて、極めて短い時間で
試験が完了する。そのため、緊急の化学療法を必要とす
る治療に特に有用である。また、医薬品や食品の製造現
場で菌の汚染が発見された場合も緊急の消毒が必要であ
り、適切な消毒薬を選択するときには、本方法を用いる
ことでで消毒薬の効果を知ることができる。
薬物感受性試験の所要時間に比べて、極めて短い時間で
試験が完了する。そのため、緊急の化学療法を必要とす
る治療に特に有用である。また、医薬品や食品の製造現
場で菌の汚染が発見された場合も緊急の消毒が必要であ
り、適切な消毒薬を選択するときには、本方法を用いる
ことでで消毒薬の効果を知ることができる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例１ （スーパーオキシドアニオンの発生と化学発
光の関係） 次の3種の細菌を用いてスーパーオキシドアニオンの発
生と化学発光の関係を調べた。 大腸菌(Escherichia coli) ATCC25922 シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginos
a) ATCC27853 エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecal
is) ATCC29212 試験は次のように行った。酵母エキスとアミノ酸を基本
とした組成にメナジオンを添加した合成培地に、試験苗
を106CFU／mLに接種し37℃4時間培養後、カタラーゼあ
るいはSOD(superoxide dismutase)を最終濃度50units/m
Lの濃度に添加し、添加前（O)と15,30,60,120分後に発
光値を測定した。結果を図１〜３に示す。図１〜３に示
すように、発光値はカタラーゼ添加では大きく変化せ
ず、SOD添加により劇的に減少することから、発光に関
与している物質は過酸化水素ではなくスーパーオキシド
アニオンであることがわかる。
明する。 実施例１ （スーパーオキシドアニオンの発生と化学発
光の関係） 次の3種の細菌を用いてスーパーオキシドアニオンの発
生と化学発光の関係を調べた。 大腸菌(Escherichia coli) ATCC25922 シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginos
a) ATCC27853 エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecal
is) ATCC29212 試験は次のように行った。酵母エキスとアミノ酸を基本
とした組成にメナジオンを添加した合成培地に、試験苗
を106CFU／mLに接種し37℃4時間培養後、カタラーゼあ
るいはSOD(superoxide dismutase)を最終濃度50units/m
Lの濃度に添加し、添加前（O)と15,30,60,120分後に発
光値を測定した。結果を図１〜３に示す。図１〜３に示
すように、発光値はカタラーゼ添加では大きく変化せ
ず、SOD添加により劇的に減少することから、発光に関
与している物質は過酸化水素ではなくスーパーオキシド
アニオンであることがわかる。
【００１６】 実施例２ （細菌の増殖と化学発光の関係） 大腸菌をミュラーヒントン培地で培養し培地の600nmの
吸光度がO．4になった時に、96穴のマイクロプレートの
各穴に25μｌ加え、更に25μｌのメナジオン溶液（10mg
/L)を加えて、化学発光測定器に入れた。そして10秒間
隔で各穴に50μｌの緩衝液と5.Oμｌの発光試薬を添加
し、5秒間の発光強度を測定した。また、これとは別に
分光光度計で600nmの吸光度を測定した。測定温度は全
て37℃であった。この時に使用したルシゲニン発光用緩
衝液は、1Lの蒸留水中に67gの炭酸水素ナトリウム、49.
5gの水酸化カリウムを溶解したものである。ルシゲニン
発光試薬は、1Lの蒸留水に150mgのルシゲニンを溶解し
たものである。
吸光度がO．4になった時に、96穴のマイクロプレートの
各穴に25μｌ加え、更に25μｌのメナジオン溶液（10mg
/L)を加えて、化学発光測定器に入れた。そして10秒間
隔で各穴に50μｌの緩衝液と5.Oμｌの発光試薬を添加
し、5秒間の発光強度を測定した。また、これとは別に
分光光度計で600nmの吸光度を測定した。測定温度は全
て37℃であった。この時に使用したルシゲニン発光用緩
衝液は、1Lの蒸留水中に67gの炭酸水素ナトリウム、49.
5gの水酸化カリウムを溶解したものである。ルシゲニン
発光試薬は、1Lの蒸留水に150mgのルシゲニンを溶解し
たものである。
【００１７】もう一方のルミノール発光の条件は下記の
通りである。大腸菌をミュラーヒントン培地で培養し、
600nmの吸光度がO.4に達した時に、96穴のマイクロプレ
ートの各穴に50μ1を添加し、更に50μｌのメナジオン
溶液(10mg/L)を添加した。その後、マイクロプレートを
発光測定器に入れ、10秒間隔で100μlの発光試薬を添加
し、5秒間発光強度を測定した。測定温度は37℃であ
る。発光試薬は、1Lの0.5Mホウ酸緩衝液(pH9.5)に、200
mgのルミノール、1gの牛アルブミン、100mgのワサビペ
ルオキシダーゼを溶解したものである。
通りである。大腸菌をミュラーヒントン培地で培養し、
600nmの吸光度がO.4に達した時に、96穴のマイクロプレ
ートの各穴に50μ1を添加し、更に50μｌのメナジオン
溶液(10mg/L)を添加した。その後、マイクロプレートを
発光測定器に入れ、10秒間隔で100μlの発光試薬を添加
し、5秒間発光強度を測定した。測定温度は37℃であ
る。発光試薬は、1Lの0.5Mホウ酸緩衝液(pH9.5)に、200
mgのルミノール、1gの牛アルブミン、100mgのワサビペ
ルオキシダーゼを溶解したものである。
【００１８】測定結果を図4に示す。図中の各記号は、
それぞれルミノール発光(□)、ルシゲニン発光(◇)、吸
光度(○)を示している。培養時間の経過とともに、各細
菌の増殖が進行し、その結果として培地の濁度(600nmの
吸光度)が上昇した。ルシゲニンやルミノールによる化
学発光は、大腸菌が最も盛んに細胞分裂を繰り返してい
る対数増殖期に最も強くなり、その後定常状態に達する
と発光強度は初期に比べて増加しているものの一定にな
った。これらのことは、濁度は生菌・死菌の総数を反映
しているのに対して、化学発光は細菌の各増殖段階での
生菌の活性を反映していると考えらる。
それぞれルミノール発光(□)、ルシゲニン発光(◇)、吸
光度(○)を示している。培養時間の経過とともに、各細
菌の増殖が進行し、その結果として培地の濁度(600nmの
吸光度)が上昇した。ルシゲニンやルミノールによる化
学発光は、大腸菌が最も盛んに細胞分裂を繰り返してい
る対数増殖期に最も強くなり、その後定常状態に達する
と発光強度は初期に比べて増加しているものの一定にな
った。これらのことは、濁度は生菌・死菌の総数を反映
しているのに対して、化学発光は細菌の各増殖段階での
生菌の活性を反映していると考えらる。
【００１９】実施例３ （ポリミキシンB、塩化ベンザ
ルコニウム、カルボニルシアナイドｍ−クロロフェニル
ヒドラゾンの殺菌効果の測定） 実施例２と同じ条件で、培地にポリミキシンB(5μg/m
l)、塩化ベンザルコニウム(0.005%)、カルボニルシアナ
イドm一クロロフェニルヒドラゾン(50μM)を添加した。
そして、実施例２の化学発光法で経時的に発光強度の変
化を調べた。結果を図5に示す。図5中の記号は、それぞ
れコントロール(□)ポリミキシンB(◇)、塩化ベンザル
コニウム(○)、カルボニルシアナイドm一クロロフェニ
ルヒドラゾン(△)を示す。僅か10分以内で膜を破壊する
ポリミキシンBや塩化ベンザルコニウム、膜内外の水素
イオン濃度勾配を破壊するカルボニルシアナイドm-クロ
ロフェニルヒドラゾンの殺菌効果が観察された。このよ
うな抗生物質や殺菌剤の効果を測定する方法として、一
夜以上の培養が必要であるディスク法による薬剤感受性
試験があるが、これに比べて本方法は極めて短い時間で
測定が完了することが分かった。
ルコニウム、カルボニルシアナイドｍ−クロロフェニル
ヒドラゾンの殺菌効果の測定） 実施例２と同じ条件で、培地にポリミキシンB(5μg/m
l)、塩化ベンザルコニウム(0.005%)、カルボニルシアナ
イドm一クロロフェニルヒドラゾン(50μM)を添加した。
そして、実施例２の化学発光法で経時的に発光強度の変
化を調べた。結果を図5に示す。図5中の記号は、それぞ
れコントロール(□)ポリミキシンB(◇)、塩化ベンザル
コニウム(○)、カルボニルシアナイドm一クロロフェニ
ルヒドラゾン(△)を示す。僅か10分以内で膜を破壊する
ポリミキシンBや塩化ベンザルコニウム、膜内外の水素
イオン濃度勾配を破壊するカルボニルシアナイドm-クロ
ロフェニルヒドラゾンの殺菌効果が観察された。このよ
うな抗生物質や殺菌剤の効果を測定する方法として、一
夜以上の培養が必要であるディスク法による薬剤感受性
試験があるが、これに比べて本方法は極めて短い時間で
測定が完了することが分かった。
【００２０】 実施例４ （細菌膜・タンパク合成阻害剤の殺菌効果） 10種類の抗菌薬を用い4菌株に対する最小発育阻止濃度
（MIC)を測定した。試験菌株は、米国NCCLS(National C
ommittee for Clinical Laboratory Standards)の「微
量液体希釈法によるMIC測定法」記載の次の参考菌株と
した。なお、NCCLSの試験法は世界的な標準法になって
いる。 大腸菌(Escherichia coli) ATCC25922 スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aure
us) ATCC29213 シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginos
a) ATCC27853 エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecal
is) ATCC29212
（MIC)を測定した。試験菌株は、米国NCCLS(National C
ommittee for Clinical Laboratory Standards)の「微
量液体希釈法によるMIC測定法」記載の次の参考菌株と
した。なお、NCCLSの試験法は世界的な標準法になって
いる。 大腸菌(Escherichia coli) ATCC25922 スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aure
us) ATCC29213 シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginos
a) ATCC27853 エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecal
is) ATCC29212
【００２１】試験は日本化学療法学会標準法に準じて行
った。酵母エキスとアミノ酸を基本とした組成にメナジ
オンを添加した合成培地で、各抗菌薬江度が16,8,4，2,
1,O,5,O.25,O.13μg/mLの希釈系列をつくり、おのおの9
6ウエルのマイクロプレートに50μL/ウエルずつ分注し
た培地を作製しました。各ウエルに試験菌を106CFU/mL
になるように接種し37℃、4時間培養後、発光値を測定
し、その値から最小発育阻止濃度を求めた結果である
(表１)。対照とする値は、NCCLS記載の参考菌株の管理
範囲を用いた。
った。酵母エキスとアミノ酸を基本とした組成にメナジ
オンを添加した合成培地で、各抗菌薬江度が16,8,4，2,
1,O,5,O.25,O.13μg/mLの希釈系列をつくり、おのおの9
6ウエルのマイクロプレートに50μL/ウエルずつ分注し
た培地を作製しました。各ウエルに試験菌を106CFU/mL
になるように接種し37℃、4時間培養後、発光値を測定
し、その値から最小発育阻止濃度を求めた結果である
(表１)。対照とする値は、NCCLS記載の参考菌株の管理
範囲を用いた。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１に示す結果から、従来試験されている
18〜24時間の培養時間と比較して、本発明の方法は、非
常に短時間の4時間で標準法と同様の成績が得られ、医
療現場では迅速な治籏の方針がたてられる利点がある。
18〜24時間の培養時間と比較して、本発明の方法は、非
常に短時間の4時間で標準法と同様の成績が得られ、医
療現場では迅速な治籏の方針がたてられる利点がある。
【図１】実施例1で得られた化学発光に対するカタラー
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（大腸
菌(Escherichia coli) ATCC25922）。
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（大腸
菌(Escherichia coli) ATCC25922）。
【図２】実施例1で得られた化学発光に対するカタラー
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（シュ
ードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginosa) A
TCC27853）。
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（シュ
ードモナス・アエルギノサ(Pseudomoans aeruginosa) A
TCC27853）。
【図３】実施例1で得られた化学発光に対するカタラー
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（エン
テロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)
ATCC29212）。
ゼ及びSOD(superoxide dismutase)の添加の影響（エン
テロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)
ATCC29212）。
【図４】実施例2で得られた細菌の増殖と化学発光の関
係を示すグラフ。
係を示すグラフ。
【図５】実施例3で得られた殺菌剤の存在下における細
菌の増殖と化学発光の関係を示すグラフ。
菌の増殖と化学発光の関係を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山庄司 志朗 兵庫県神戸市垂水区海岸通９−50−514 (72)発明者 池戸 正成 栃木県下都賀郡野木町野木143 栄研化学 株式会社野木事業所内 (72)発明者 馬目 功 栃木県下都賀郡野木町野木143 栄研化学 株式会社野木事業所内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA06 QQ05 QQ15 QQ89 QR41 QS07 QX02 QX07 4B065 AA01X BB05 CA46
Claims (6)
- 【請求項１】 培養液中で微生物を酸化型キノンととも
にインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量す
ることを特徴とする微生物の増殖及び／又は活性の測定
方法。 - 【請求項２】 培養液中で微生物を、抗菌剤の存在下、
酸化型キノンとともにインキュベーションし、生成物を
化学発光法で定量して、定量された微生物の増殖力及び
／又は活性から前記微生物の抗菌剤に対する感受性を評
価することを特徴とする感受性試験方法。 - 【請求項３】 前記生成物が還元型キノン及び／又はス
ーパオキシドアニオンである請求項１または２に記載の
方法。 - 【請求項４】 前記化学発光法において発光試薬を用い
る請求項1〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記発光試薬がルミノールまたはルシゲ
ニンである請求項1〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記酸化型キノンがメナジオンである請
求項1〜５のいずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31061699A JP2001120299A (ja) | 1999-11-01 | 1999-11-01 | 微生物の増殖および活性の測定方法及び感受性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31061699A JP2001120299A (ja) | 1999-11-01 | 1999-11-01 | 微生物の増殖および活性の測定方法及び感受性試験方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001120299A true JP2001120299A (ja) | 2001-05-08 |
Family
ID=18007414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31061699A Pending JP2001120299A (ja) | 1999-11-01 | 1999-11-01 | 微生物の増殖および活性の測定方法及び感受性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001120299A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005090592A1 (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Nikken Bio Medical Laboratory Inc. | 微生物の高感度検出法、微生物検出のための発光測定用試薬キット及びシステム |
| JP2008092938A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-04-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 真核微生物の活性測定法 |
| CN116999420A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-07 | 华南农业大学 | 甲萘醌作为多粘菌素类药物增敏剂在抗革兰阴性菌中的应用 |
-
1999
- 1999-11-01 JP JP31061699A patent/JP2001120299A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005090592A1 (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Nikken Bio Medical Laboratory Inc. | 微生物の高感度検出法、微生物検出のための発光測定用試薬キット及びシステム |
| JP2008092938A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-04-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 真核微生物の活性測定法 |
| CN116999420A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-07 | 华南农业大学 | 甲萘醌作为多粘菌素类药物增敏剂在抗革兰阴性菌中的应用 |
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|
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