JP2008092938A - 真核微生物の活性測定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、好ましくは触媒の存在下で化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定する。この発明においては、キノン類の溶媒として微生物にダメージを与えにくいジメチルスルホキシドを用いているため、微生物の有機物質代謝活性を害することなく、微生物活性および有機物質量に応じた微生物の活性を測定することを可能とするといったすぐれた効果を奏する。
【選択図】 なし
Description
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径ラ180mmの試験管に入れたYPD液体培地2mlに接種し、シリコーン栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。なお、YPD液体培地としては、酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解し、全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが、YPD寒天培地としては、酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解し、全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したものが用いられた。
実施例1において、メナジオンの溶媒としてDMSOの代わりにエタノールを用い、BOD値440mg O2/lを示すGGA標準溶液を用いて5回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は4.39×10-6であり、変動係数(CV値)は、15.1%であった。
比較例1において、GGA標準溶液の代わりに純水を用いて5回測定を行ったところ、応答値(発光強度)は8.05×10-6であり、変動係数(CV値)は、13.8%であった。
実施例1において、酵母液としてOD600=21.4のものが同量用いられ、また10倍PBS緩衝液量が50μlに、純水量が70μlにそれぞれ変更され、さらに測定試料液として5.5 O2/l、11mg O2/l、22mg O2/l、55mg O2/l、110mg O2/l、165mg O2/l、220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液または純水を同量用いて、反応溶液の攪拌を振とう機(NISSIN Co., NA-201 series 2)に変更し、振とう速度を180rpmとして正確に5分間振とう後に化学光検出器にセルをセットし、発光試薬溶液を同量添加して化学発光測定が行われた。
図1に示すFIAシステムを用い、流路1に発光試薬溶液としての0.7mMルミノール試薬を、流路2に20mMフェリシアン化カリウム試薬を、流路3にキャリヤー溶液であるPBS緩衝液を、それぞれ室温下、流速約0.7ml/分でポンプにより送液した。発光試薬溶液はキャリヤー溶液(流路3)と混合する前に、ルミノール試薬(流路1)とフェリシアン化カリウム試薬(流路2)とを予め混合した後、遅延コイルを通過させた。試料液としては、10倍PBS緩衝液46.5μl、純水48.5μl、0.9%生理食塩水25μl、DMSOで調製した20mMメナジオン溶液5μl、110mg O2/l、220mg O2/l、330mg O2/l、440mg O2/lのBOD値を示すGGA標準溶液または純水350μlと酵母液(OD600=15)25μlの混合液500μlを遮光性のマイクロチューブ内で振とうしながら正確に5分間反応させたものが用いられ、これをサンプルインジェクター(REODYNE社製7125型、100μlサンプルループ)により流路3のキャリヤー溶液中に注入した。注入された試料液は、発光試薬液との混合部に移送してT字管で混合し、渦巻状のフローセルまで送液した。
実施例3において、図2に示すFIAシステムを用い、試薬液としては酵母液が全量純水に置き換えられたもの用いて、応答値(発光強度)の測定を3回行ったところ、各々1mVの出力が認められた。ここで、酵母固定化カラムとしては、直径0.745cm、長さ5.0cm、容積2.19mlのステンレス製容器内に、S. cerevisiaeをアルギン酸カルシウム担体に固定化した酵素固定化ゲルビーズを充填したものが用いられた。ここで酵素固定化ゲルビーズは、(OD600=45)の酵母懸濁液3gを0.9%塩化ナトリウム水溶液9mlに入れて20分間攪拌後、2%アルギン酸ナトリウム溶液15mlを入れてさらに20分間攪拌後、1mLのシリンジを用いて1%塩化カルシウム溶液300ml中に添加して30分間攪拌することにより調製された。
実施例4において、試薬液中のGGA標準溶液の代わりに同量の純水が用いられたところ、3回の測定のいずれも0mVであった。
実施例2において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=22.3のものが同量用いられ、また攪拌時間が20秒に変更されて化学発光の測定が行われた。
実施例2において、測定試料液として220mg O2/l GGAのBOD値を示す標準溶液(コントロール)または一種類の重金属イオン(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+)1mg/lと220mg O2/l GGAを含む混合液350μlが、また酵母液としてはOD600=23.2のものが同量用いられて化学発光の測定が行われた。
Claims (15)
- ジメチルスルホキシドに溶解した酸化型のキノン類の存在下で、真核微生物が有機物質を代謝する際に生成する過酸化水素または酸素ラジカルを、化学発光により検出または定量することにより、真核微生物の呼吸量を測定することを特徴とする真核微生物の活性測定法。
- 化学発光が、触媒の存在下で行われる請求項1記載の真核微生物の活性測定法。
- 酸化型のキノン類に加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させて過酸化水素を生成させる請求項1または2記載の真核微生物の活性測定法。
- 酸化型のキノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノン、1,2-ナフトキノンまたはコエンザイムQ1である請求項1または2記載の真核微生物の活性測定法。
- 真核微生物が酵母である請求項1または2記載の真核微生物の活性測定法。
- 化学発光の試薬として、ルミノールが用いられる請求項1または2記載の真核微生物の活性測定法。
- 触媒が、ヘキサシアノ鉄(III)カリウムまたはペルオキシダーゼである請求項6記載の真核微生物の活性測定法。
- 酸化型のキノン類の存在下で、微生物に有機物質を代謝させて過酸化水素を生成させた後、化学発光により過酸化水素の検出が行われる請求項1または2記載の真核微生物の活性測定法。
- 発光強度がバッチ式の発光測定装置により測定される請求項1乃至8のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 移相液を連続的に通した流路に、真核微生物、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液を混合した試料液を導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるといったフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項1乃至8のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 真核微生物をカラム内に固定化し、そこに移相液を連続的に通した上で、酸化キノンおよび有機物質を含有する溶液とを混合した溶液を移相液へ導入することにより生成する過酸化水素を、別の流路から供給される化学発光試薬と混合させ、化学発光させるフローインジェクション式により有機物質の検出または定量が行われる請求項1乃至8のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 真核微生物により有機物質を代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりBODの測定が行われる請求項1乃至11のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 真核微生物によりグルコースを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりグルコースの検出・定量が行われる請求項1乃至11のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 真核微生物によりエタノールを代謝させた際の微生物の呼吸量を測定することによりエタノールの検出・定量が行われる請求項1乃至11のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
- 土壌中に生息する微生物または酒醸製造工程で用いられる微生物の活性測定に用いられる請求項1乃至11のいずれかに記載の真核微生物の活性測定法。
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