BRPI0716908A2 - Indicadores de esterilização, kit indicador de esterilização, processo para manufaturar o mesmo, processo de esterilização e processos para determinar a eficiência de esterilização. - Google Patents

Indicadores de esterilização, kit indicador de esterilização, processo para manufaturar o mesmo, processo de esterilização e processos para determinar a eficiência de esterilização. Download PDF

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nitrophenyl
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Phillip P Francikovich
Tricia A Cregger
Mark J Duda
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American Sterilizer Co
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Description

INDICADORES DE ESTERILIZAÇÃO, KIT INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, PROCESSO PARA MANUFATURAR O MESMO, PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO E PROCESSOS PARA DETERMINAR A EFICIÊNCIA
DE ESTERILIZAÇÃO
CAMPO TÉCNICO
A tecnologia exposta refere-se a um indicador de esterilização, e a um processo para manufaturar um indicador de esterilização. A tecnologia exposta refere-se a um processo de esterilização que utiliza o in10 dicador de esterilização para determinar a eficiência de esterilização.
ANTECEDENTES
Principalmente na indústria de cuidados da saúde, mas também em muitas outras aplicações comerciais e 15 industriais, freqüentemente é necessário monitorara eficiência dos processos usados para esterilizar equipamento, tais como dispositivos médicos e não médicos, instrumentos e outros artigos e materiais. Muitas vezes é prática padrão nestes processos de esterilização 20 incluir um indicador de esterilização no lote de artigos a serem esterilizados. Isto permite uma abordagem direta para avaliar a condição letal do processo de esterilização.
Os indicadores de esterilização convencionais contêm tipicamente um indicador biológico. 0 indicador biológico pode compreender um ou mais organismos de teste que são projetados para serem mais resistentes ao processo de esterilização do que os organismos que devem ser destruídos pela esterilização. Estes organismos de teste são usualmente esporos bacterianos. Os indicadores de esterilização convencionais podem estar disponíveis em duas formas.
A primeira destas formas envolve o uso de um
substrato em que esporos bacterianos são aplicados ou inoculados diretamente no substrato. 0 substrato pode ser coberto plenamente com os esporos. Qualquer manuseio físico pelo usuário pode resultar na perda de 10 esporos a partir do substrato, transferidos para o usuário, ou potencialmente contaminando ou sendo contaminados pela área circundante. Já se propôs proporcionar clipes especiais para permitirem ao usuário manusear o substrato. Entretanto, estes clipes fre15 qüentemente embaraçam o processo de esterilização e podem resultar em um resultado de teste defeituoso. Da mesma forma, dimensão mínima restringe estes substratos conduzindo tipicamente ao requisito de volumes relativamente grandes de meio de incubação, por exem20 pio, entre cerca de 5 até cerca de 10 mililitros (ml), e períodos de incubação relativamente longos, por exemplo, entre cerca de 2 a cerca de 7 dias.
A segunda destas formas de teste envolve um indicador de esterilização auto-suficiente. Estes indi25 cadores de esterilização contêm tipicamente os esporos bacterianos e o meio de incubação em um único recipiente, mas em compartimentos separados. Os esporos são submetidos ao processo de esterilização. Em seguida à esterilização, o recipiente é ativado de forma que quaisquer esporos sobreviventes podem entrar em contacto com o meio de incubação para determinar a eficiência da esterilização. Estes indicadores de es5 terilização podem ser de utilidade em processos de esterilização gasosos, mas tipicamente não são adequados para processos de esterilização líquidos.
Um inconveniente principal com cada um destes indicadores de esterilização refere-se ao tempo gasto na obtenção dos resultados para o teste de esterilização. Estes indicadores de esterilização normalmente requerem que os esporos bacterianos sejam cultivados durante pelo menos dois e freqüentemente até cerca de sete dias para assegurar a detecção adequada de quaisquer esporos sobreviventes. Durante este período, os artigos que foram submetidos ao processo de esterilização e que se encontram sob avaliação não deverão ser usados até os resultados do teste de viabilidade de esporos terem sido determinados. Entre2 0 tanto, muitos ambientes usados para cuidado da saúde têm recursos limitados e devem reutilizar seus instrumentos "esterilizados" dentro de 24-48 horas e, freqüentemente, imediatamente. Em tais ambientes, o período de espera de dois a sete dias para verificação de esterilidade pode ser impraticável, dispendioso e ineficiente.
Assim, um problema apresentado pela técnica é o de proporcionar um indicador de esterilização que reduza ao mínimo ou que elimine o manuseio do indicador biológico e que seja capaz de detectar com exatidão a eficiência de um processo de esterilização dentro de um período de tempo relativamente curto. Seria 5 vantajoso se este indicador de esterilização pudesse ser adaptável a processos de esterilização de líquidos bem como processos de esterilização gasosos. A tecnologia exposta, pelo menos em uma concretização, pode proporcionar uma solução para este problema.
Smnário
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um indicador de esterilização, que compreende: um carreador, sendo o carreador dotado de uma primeira superfície e uma segunda superfície; um suporte, sendo 15 o suporte dotado de uma primeira seção e uma segunda secção, com o carreador sobrepondo-se à primeira seção do suporte, sendo a segunda superfície do carreador aderente à primeira seção do suporte; e um indicador biológico suportado pelo carreador, sendo a segunda seção 2 0 do suporte de dimensão suficiente para permitir manusear o indicador de esterilização sem contacto com o indicador biológico.
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um kit de indicador de esterilização que compreende: 25 um primeiro compartimento que contém o indicador de esterilização anteriormente indicado, sendo o primeiro compartimento adaptado para permitir que o indicador de esterilização seja levado ao contacto com um meio de esterilização durante a esterilização; e um segundo compartimento que contém um meio de incubação, sendo o segundo compartimento adaptado para manter o meio de incubação separado do indicador de esterilização duran5 te a esterilização, e sendo o segundo compartimento adaptado para permitir que o meio de incubação entre em contacto com o indicador de esterilização depois do indicador de esterilização ser exposto ao meio de esterilização.
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um
processo para manufaturar o indicador de esterilização anteriormente indicado que compreende: aplicar o indicador biológico ao carreador; e fazer aderir o carreador ao suporte.
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um
processo de esterilização que compreende: expor um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização anteriormente indicado a um meio de esterilização.
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um 20 processo para determinar a eficiência de esterilização, que compreende: expor um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização anteriormente indicado a um meio de esterilização, o indicador biológico compreendendo pelo menos um organismo de teste; e contactar o 25 carreador com um meio de incubação depois da esterilização para determinar se a esterilização é efetiva.
A tecnologia exposta pode relacionar-se com um processo para se determinar a eficiência de esterilização, que compreende: expor pelo menos um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização anteriormente indicado a um meio de esterilização, o indicador biológico compreendendo pelo menos uma enzima; e con5 tactar o carreador com pelo menos um substrato enzimático para determinar se a esterilização é efetiva.
Descrição Breve dos Desenhos
Nos desenhos anexos, partes e aspectos assemelhados recebem referências semelhantes.
A Figura 1 é uma vista plana de uma ilustra
ção esquemática de uma concretização do indicador de esterilização exposto.
A Figura 2 é uma ilustração esquemática de uma elevação lateral do indicador de esterilização ilustrado na Figura 1.
A Figura 3 é uma ilustração esquemática explodida de um aparelho para determinar a eficiência de esterilização, com o aparelho contendo dois compartimentos, estando o indicador de esterilização prece20 dente posicionado em um compartimento e havendo um meio de incubação posicionado no outro compartimento.
A Figura 4 é um traçado de esporos recuperáveis para amostras do indicador de esterilização exposto no Exemplo 1, com o traçado não indicando qual25 quer diferença significativa no número de esporos viáveis em seguida à sonicação em comparação com a sonicação anterior.
A Figura 5 é um traçado de pH como uma função do crescimento de esporos de Geobacillus stearothermophilus expostos a meios de incubação e capacidades de tampão de diferentes volumes como expostos no Exemplo 2.
Descrição Detalhada
0 termo "esterilização" pode referir-se a tornar uma substância incapaz de reprodução, metabolismo e/ou crescimento. Embora isto seja muitas vezes considerado como significando ausência total de organismos vivos, o termo pode ser usado neste contexto como se referindo a uma substância isenta de organismos vivos até um grau anteriormente considerado como sendo aceitável. A não ser que de outro modo indicado, o termo esterilização pode ser usado neste contexto como referindo-se também a métodos e procedimentos menos rigorosos do que esterilização, por exemplo, desinfecção, higiene e assemelhadas. 0 indicador de esterilização e os processos e aparelhagem descritos neste contexto podem ser usados nos campos de cuidado da saúde, nos campos científicos e assemelhados. Estes podem ser usados em aplicações comerciais e industriais onde esterilização, desinfecção, higiene, e assemelhados podem ser desejados, por exemplo, processamento de alimentos, manufatura farmacêutica e outros assemelhados.
O processo de esterilização para o qual o indicador de esterilização exposto pode ser usado poderá ser qualquer processo de esterilização. Estes podem incluir processos de esterilização em que o meio de esterilização ou esterilizante pode ser vapor, calor seco, radiação, bem como um ou mais esterilizantes gasosos, um ou mais líquidos esterilizantes, e asseme5 lhados. A radiação pode compreender feixe de elétrons ou quaisquer espectros eletromagnéticos, incluindo radiação de ionização, luz branca ou ultravioleta pulsada, microondas, e outros assemelhados. A radiação pode compreender radiação gama ou beta. Os esteio rilizantes gasosos podem compreender óxido de etileno, peróxido de hidrogênio gasoso, e assemelhados. Os esterilizantes líquidos podem compreender formalina (gás de formaldeído dissolvido em água e opcionalmente contendo metanol para inibir a formação de subs15 tâncias tóxicas), glutaraldeído, ácido peracético, peróxido de hidrogênio líquido, e assemelhados.
O indicador de esterilização pode ser usado para examinar a letalidade dos esterilizantes contra qualquer microorganismo com menos resistência ao pro20 cesso de esterilização do que o indicador biológico usado com o indicador de esterilização. Estes microorganismos podem incluir bactérias tais como Escherichia coli, Legionella sp., Campylobacter sp.r e outras bactérias entéricas, bem como as espécies Staphylo25 coccus e Streptococcus e outros microorganismos patogênicos humanos tais como Cryptosporidium.
0 indicador de esterilização pode ser descrito com referência às Figuras 1 e 2. Com referência a estas figuras, o indicador de esterilização 10 pode compreender o carreador 12, sendo o carreador 12 dotado de uma primeira superfície 14 e uma segunda superfície 16; suporte 20, sendo o suporte 2 0 dotado de 5 uma primeira seção 22 e uma segunda seção 24, o carreador 12 sobrepondo-se à primeira seção 22 do suporte 20, sendo a segunda superfície 16 do carreador 12 levada a aderir à primeira seção 22 do suporte 20; e indicador biológico 3 0 suportado pelo carreador 12. O 10 indicador biológico 3 0 pode ser suportado ou levado a aderir à primeira superfície 14 do carreador 12. A segunda seção 24 do suporte 2 0 pode ser de dimensão suficiente para permitir manusear o indicador de esterilização 10 sem se entrar em contacto com o indi15 cador biológico 30. Isto é, a segunda seção 24 pode ser de dimensão suficiente para funcionar como um manipulo permitindo deste modo manuseio asséptico facilitado do indicador de esterilização 10. O carreador 12 pode estar na forma de um substrato relativamente 20 achatado que é ilustrado nos desenhos como estando na forma de um círculo. Entretanto, deve ser compreendido que o carreador 12 pode ter qualquer configuração ou forma desejada, por exemplo, quadrada, retangular, oval, e assemelhada. 0 carreador 12 pode ter uma se25 ção prismática. 0 carreador 12 pode ter uma espessura que é relativamente pequena, por exemplo, entre cerca de 0,001 até cerca de 3 mm, e em uma concretização entre cerca de 0,01 até cerca de 2 mm, e em uma concretização entre cerca de 0,05 até cerca de 1,5 mm, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de
1 mm. A área da primeira superfície 14 do carreador 12, que proporciona suporte para o indicador biológico 30, pode ser relativamente pequena, por exemplo, a área pode estar na faixa de cerca de 1 até cerca de 80 mm2, e em uma concretização entre cerca de 2 até cerca de 70 mm2, e em uma concretização entre cerca de 3 até cerca de 60 mm2, e em uma concretização entre cerca de 5 até cerca de 50 mm2. Uma vantagem desta área pequena é que o tamanho do indicador biológico 3 0 pode ser relativamente pequena, e conseqüentemente, a quantidade de meio de incubação necessário para incubar o indicador biológico pode ser relativamente pequena e o requisito de tempo para a incubação pode ser relativamente curto.
0 carreador 12 pode compreender um material poroso ou um material não-poroso. 0 carreador pode compreender um carreador sólido. O carreador pode 20 compreender qualquer material que não se dissolva nem deteriore durante os processos de esterilização ou incubação. 0 carreador 12 pode compreender papel, metal, vidro, cerâmica, plástico, membranas, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. 0 plástico po25 de compreender uma poliolefina, polistireno, policarbonato, polimetacrilato, poliacrilamida, poliimida, poliéster, e assemelhados. 0 carreador 12 pode compreender uma película. 0 carreador pode estar na forma de um feltro tecido ou não tecido. 0 carreador pode compreender uma esteira de fibras comprimidas. 0 carreador pode compreender um material poroso produzido a partir de vidro sinterizado fibras de vidro, cerâmica, polímero sintético, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. O carreador pode compreender papel de filtro ou papel absorvente. O carreador pode compreender um chumaço de celulose. O suporte 2 0 pode compreender qualquer material que não se dissolva ou desintegre durante os processos de esterilização ou incubação. O suporte pode compreender metal, vidro, cerâmica, plástico, ou uma combinação dos mesmos. O suporte pode compreender alumínio ou aço inoxidável. O suporte pode compreender polistireno, poliolefina (por exemplo, polipropileno, polietileno), e outros assemelhados. 0 suporte 20 pode ser flexível ou rígido. 0 suporte 2 0 pode ser dobrável. 0 suporte 2 0 ilustrado nos desenhos é de forma retangular; entretanto, fica entendido que o suporte pode ter qualquer configuração ou forma desejada, por exemplo, quadrado, círculo, oval, e outras assemelhadas. 0 comprimento do suporte 2 0 pode estar na faixa entre cerca de 0,2 até cerca de 12 cm, e em uma concretização entre cerca de 0,2 até cerca de 10 cm, e em uma concretização entre cerca de 0,5 até cerca de 7 cm, e em uma concretização entre cerca de 1 até cerca de 5 cm, e em uma concretização entre cerca de 1,5 até cerca de 3,5 cm. A largura do suporte 2 0 pode estar na faixa entre cerca de 0,25 até cerca de 2 cm, e em uma concretização entre cerca de 0,2 até cerca de 1,5 cm, e em uma concretização entre cerca de 0,25 até cerca de 1 cm. A espessura do suporte 2 0 pode estar na faixa 5 entre cerca de 0,02 até cerca de 3 mm, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 2 mm. 0 comprimento da segunda seção 24 pode estar na faixa entre cerca de 0,2 até cerca de 12 cm, e em uma concretização entre cerca de 0,3 até cerca de 11 cm, e 10 em uma concretização entre cerca de 0,5 até cerca de 10 cm, e em uma concretização entre cerca de 1 até cerca de 7 cm, e em uma concretização entre cerca de 1,5 até cerca de 4,5 cm.
O suporte 2 0 pode estar na forma de uma folha 15 ou tira retangular, a primeira seção 22 do suporte 2 0 compreendendo uma parte menor do comprimento do carreador 20, a segunda seção 24 do suporte 2 0 compreendendo uma parte maior do comprimento do suporte 20. A relação do comprimento de uma segunda seção 24 para o 20 comprimento da primeira seção 22 pode estar na faixa entre cerca de 2:1 até cerca de 12:1, e em uma concretização entre cerca de 4:1 até cerca de 8:1, e em uma concretização entre cerca de 5.5:1 até cerca de 6.5:1.
0 carreador 12 pode ser fixado ao suporte 2 0
utilizando-se soldagem sônica, selagem a quente, um adesivo, ou laminação. O carreador 12 pode ser fixado ao suporte 2 0 antes ou subseqüentemente à aplicação do indicador biológico 3 0 ao carreador 12. O carreador 12 pode ser fixado ao suporte 2 0 subseqüentemente à aplicação do indicador biológico 3 0 ao suporte 12 utilizando-se soldagem sônica ou um adesivo. A solda5 gem sônica pode envolver ligação por fricção do suporte ao carreador. O adesivo pode ser qualquer adesivo que seja compatível com o carreador 12 e o suporte 20, e não se dissolva ou deteriore durante os processos de esterilização ou incubação. 0 adesivo não 10 deverá ser letal ou inibidor para os organismos de interesse. 0 adesivo pode ser a adesivo sensível à pressão.
O indicador de esterilização 10 pode ser usado em qualquer processo em que o indicador biológico 15 3 0 fique exposto a um meio de esterilização durante um processo de esterilização e então a um meio de incubação para determinar se o processo de esterilização foi efetivo. 0 indicador de esterilização 10 pode ser usado com qualquer processo de esterilização, por 20 exemplo, processos de esterilização que empregam esterilizantes gasosos ou líquidos. O indicador de esterilização 10 junto com os artigos a serem esterilizados pode ser exposto a um meio de esterilização durante um processo de esterilização. Quando da conclu25 são do processo de esterilização, o indicador de esterilização 10 pode ser colocado em um frasco que contém um meio de incubação. O indicador biológico 3 0 pode ser então incubado durante um período de tempo desejado e então examinado para se determinar se o processo de esterilização foi efetivo.
0 indicador de esterilização 10 pode ser usado em um kit indicador de esterilização auto5 suficiente compreendendo um recipiente com dois compartimentos separados. Um dos compartimentos pode conter o indicador de esterilização 10. O outro compartimento pode conter um meio de incubação. Em uso, o kit e os artigos a serem esterilizados podem ser 10 expostos ao meio de esterilização. Então, em seguida à esterilização, o kit pode ser ativado de forma que o indicador biológico 3 0 entre em contacto com o meio de incubação suficientemente para determinar se o processo de esterilização foi efetivo. Estes kits po15 dem ser usados com qualquer processo de esterilização em que o indicador biológico pode ser exposto ao meio de esterilização, por exemplo, processos de esterilização que empregam esterilizantes gasosos.
0 kit indicador de esterilização auto20 suficiente pode estar na forma ilustrada na Figura 3. Com referência à Figura 3, o kit 4 0 compreende o tubo afilado 42, compartimento interno 44, e tampa de fechamento 46. A tampa de fechamento 46 inclui projeções 48. Um espaço anular 43 é formado entre a super25 fície interna do tubo afilado 42 e a superfície externa do compartimento interno 44, com o espaço anular 43 formando outro compartimento interno. 0 indicador de esterilização 10 é posicionado no espaço anular 43. O meio de incubação fica contido no compartimento interno 44. 0 tubo afilado 42 e a tampa de fechamento 46 podem ser feitos a partir de qualquer material que seja compatível com as condições e químicas usadas no 5 processo de esterilização. Estes materiais podem incluir policarbonato, poliolefinas, poliamida, polimetacrilatos, polimetilpentenos, poliésteres, e outros assemelhados. 0 compartimento interno 44 pode estar na forma de um vidro ou de ampola de vidro quebradi10 ço.
Outros detalhes sobre a construção do tubo afilado 42, compartimento interno 44 e tampa de fechamento 4 6 podem ser encontrados na patente U.S. 4.304.869, que fica incorporada neste contexto por 15 referência. Durante a esterilização, o kit 40, juntamente com os artigos a serem esterilizados, é exposto ao meio de esterilização. Depois de completada a esterilização, a tampa de fechamento 46 é pressionada descendentemente dentro do tubo afilado 42. As proje20 ções 48 exercem pressão contra o compartimento interno 44 e fazem com que ele seja quebrado. Isto permite que o meio de incubação entre em contacto com o indicador biológico 30. Depois de incubação durante um espaço de tempo predeterminado, o indicador de este25 rilização 10 pode ser removido e a extensão da esterilização pode ser determinada por detecção da alteração no indicador biológico 30.
O indicador biológico 3 0 pode compreender um ou mais organismos de teste. Alternativamente, o indicador biológico 30 pode compreender uma ou mais enzimas. A uma ou mais enzimas podem ser derivadas de e/ou isoladas a partir de um ou mais organismos de 5 teste. 0 indicador biológico 3 0 pode compreender um ou mais organismos de teste em combinação com uma ou mais enzimas.
O organismo de teste pode compreender qualquer organismo cuja resistência ao processo de este10 rilização pretendido exceda aquela dos outros organismos que se destinam a ser destruídos pelo processo de esterilização. 0 tipo de organismo usado como o indicador biológico 3 0 pode ser dependente de uma variedade de fatores exemplificados por, sendo que não 15 se fica limitado aos mesmos, o tipo de processo de esterilização que está sendo usado. 0 organismo de teste pode ser um microorganismo. As variedades que podem ser usadas poderão ser aquelas que são mais resistentes ao processo usado para a esterilização. 0 20 microorganismo de teste pode compreender bactérias. Os microorganismos bacterianos podem ser aqueles que formam endósporos, isto é, esporos bacterianos. 0 organismo de teste pode compreender bactérias dos gêneros Bacillus ou Clostridia. Estes podem incluir Geo25 bacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, e outros assemelhados. As bactérias podem compreender fungos, microbactérias, protozoários, bactérias vegetativas, e outros assemelhados. Exemplos de fungos que podem ser usados podem incluir Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, e outros assemelhados. Exemplos de microbactérias que podem ser usadas podem incluir Mycobacterium chelonae, Myeobaeterium gordonae, Myeobaeterium smegmantis, Myeobaeterium terrae, e outros assemelhados. Exemplos de protozoários que podem ser usados podem incluir Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, e outros assemelhados. Exemplos de bactérias vegetativas que podem ser usadas podem incluir Aeromonas hydrophila, Enteroeoeeus faeealis, Streptoeoeeus faeealis, Enteroeoeeus faeeium, Streptoeoeeus pyrogenes, Escheriehia eoli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Metilobaeterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella eholeraesuis, Helieobaeter pylori, Staphyloeoceus aureus, Staphyloeoecus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, e outros assemelhados. Organismos tais como Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, e outros assemelhados, podem ser usados para determinação da eficácia de esterilização a quente, úmida, (esterilização em autoclave), com Geobacillus stearothermophilus sendo especialmente útil.
Microorganismos tais como bactérias vegetativas, células vegetativas e/ou suas partes constitutivas, que podem ser usadas como o organismo de teste, podem ser depositados no carreador 12 e sobreviver a secagem e armazenamento quando depositados na presen5 ça de um ou mais excipientes. Os excipientes podem ser definidos como uma ampla classe de compostos geralmente inertes que podem ser usados para estabilizar entidades instáveis. Uma subclasse de excipientes que pode ser usada inclui os carboidratos, por exem10 pio, sacarídeos oligoméricos e poliméricos. Um exemplo de tal composto pode ser a trealose que é um dissacarídeo. Altas concentrações de trealose nos tecidos de determinados organismos podem permitir que os organismos sobrevivam em um estado de deficiência de água. 15 A trealose pode ser usada para reavivar os componentes celulares funcionais depois de desidratação. A trealose pode proporcionar estabilidade para membranas e outras estruturas macromoleculares essenciais para a viabilidade de uma célula sob condições ambi20 entais extremas (por exemplo, secagem por congelamento) . Outros compostos de excipiente de estabilização podem incluir açúcares simples (por exemplo, sacarina, glicose, maltose, e outros assemelhados) e polímeros de cadeia longa (por exemplo, dextranas, amido, 25 agarose, celulose, e outros assemelhados). Outros excipientes baseados em não-carboidratos podem incluir proteínas, fosfonatos, agentes tampão, ceras, lipídeos, óleos, bem como outros materiais baseados em hidrocarbonetos.
Adicionalmente aos organismos simuladores selecionados com base na sua aceitação como representando o organismo mais resistente (por exemplo, Geobacillus stearothermophilus), o indicador biológico 30 pode compreender, outrossim, agentes não autoreplicadores e/ou componentes subcelulares ou produtos de células. Estes podem ser usados por causa de seu significado clínico ou por causa de seu uso como agentes de bioterrorismo. Estes organismos podem compreender variedades que podem ter agora resistência a meios normais de tratamento antibiótico ou desinfecção química devido a modificações naturais ou feitas pelo homem. Exemplos do primeiro tipo incluem VREs (Vancomycin Resistant enterococci), MSRAs (MethicilIin Resistant Staphylococcus aureus), Mycobacterium cheloni, e outros assemelhados. Estes podem ser usados porque os VREs e MRSAs desenvolveram resistência a contramedidas terapêuticas (por exemplo, resistência a antibióticos) e M. cheloni desenvolveu resistência a algumas modalidades de desinfecção (por exemplo, resistência a glutaraldeído).
O indicador biológico 3 0 pode compreender um ou mais organismos emergentes para os quais pode não ser ainda uma alternativa simulatória. Estes podem representar um risco ou desafio especial ao curso de ação terapêutica ou desinfecção. Exemplos destes organismos podem incluir prions. Os prions não são organismos vivos por si, mas a sua função, como agentes causadores de enfermidades, pode estar relacionada com sua estrutura e esta relação de estrutura/função pode ser empregada para determinar sua condição de in5 fecção relativa. Outros agentes não-autônomos (por exemplo, vírus) bem como elementos sub-celulares e prions proteínicos podem ser usados como o indicador biológico 30.
0 carreador 12 pode ser inoculado com o organismo de teste pelo preparo de uma suspensão ou dispersão aquosa que compreende o organismo de teste. A suspensão ou dispersão aquosa pode compreender, por exemplo, esporos bacterianos sob uma concentração variando, por exemplo, entre cerca de IO5 até cerca de IO10 unidades de formação de colônia (cfu) por mililitro, e em uma concretização entre cerca de IO7 até cerca de IO9 cfu por mililitro. Uma alíquota da suspensão ou dispersão pode ser colocada no carreador 12. Por exemplo, a suspensão ou dispersão de esporos B. subtilis em água pode ser preparada para proporcionar um número desejado de esporos por alíquota para inoculação do carreador 12. Os esporos podem ser deixados secar no carreador. Um fluxo de ar pode ser usado para secar os esporos no suporte, tal como, por exemplo, pela colocação do carreador em uma capa de fluxo laminar para apressar o processo de secagem. 0 método de secagem dos esporos no carreador pode incluir deixar os esporos secar ao ar deixando-os parados, colocando os esporos em um dessecador que contém um dessecante tal como cloreto de cálcio, colocando os esporos em capuz de fluxo laminar, e outros assemelhados . 0 número de unidades de formação de colônias 5 suportado pelo carreador 12 pode ser da ordem de cerca de IO4 até cerca de IO7 cfu por milímetro quadrado de suporte (cfu/mm2) , e em uma concretização na faixa de cerca de IO5 até cerca de IO6 cfu/mm2.
0 indicador de esterilização 10 pode ser usado pela sua sujeição ao mesmo meio de esterilização e tratamento como os artigos para os quais possam ser procuradas condições estéreis. Calor pode ser aplicado e/ou um gás, líquido, vapor, ou agente químico e/ou físico pode passar dentro da área onde o indicador biológico 30 está localizado, expondo assim o indicador biológico 30 ao mesmo processo de esterilização ou agente que os artigos que estão sendo esterilizados. Em seguida à esterilização, um meio de incubação pode ser levado ao contacto com o indicador biológico 30. 0 meio de incubação pode ser referido como um meio de crescimento. 0 meio de incubação pode estar na forma de um sólido ou de um líquido. O meio de incubação pode compreender uma solução aquosa tamponada, muito embora uma vantagem da tecnologia exposta seja a de que a capacidade tampão do meio de incubação pode ser reduzida de maneira que o indicador biológico pode ser mais sensível a alterações de pH, potenciais redox, atividade enzimática, e outros assemelhados. Qualquer procedimento por meio do qual o indicador biológico seja levado ao contacto com o meio de incubação sob condições que permitam o crescimento do organismo de teste, se ele ainda existir, 5 pode ser usado. 0 meio de incubação pode estar presente na câmara de esterilização na forma de pó ou de comprimido e, depois da esterilização, água estéril pode ser adicionada de forma que o indicador biológico entra em contacto com o meio de incubação aquoso.
O meio de incubação pode compreender uma ou
mais fontes de nutrientes. A fonte de nutriente pode ser usada para proporcionar energia para o crescimento de qualquer um dos organismos de teste que possa sobreviver ao processo de esterilização. Exemplos de 15 fontes de nutrientes podem incluir digerido pancreático de caseína, digerido enzimático de farinha de soja, sacarina, dextrose, extrato de lêvedo, Lcistina, e misturas de dois ou mais dos mesmos. Um indicador de crescimento microbiano, que muda de cor 20 ou estado nativo, na presença de organismos de teste viáveis, pode ser usado com o meio de incubação. 0 indicador de crescimento pode ser disperso ou solubilizado no meio de incubação e transmitir uma cor inicial ao meio de incubação. 0 indicador de crescimento 25 também pode transmitir uma mudança de cor ao meio de incubação quando do crescimento de microorganismo. Os indicadores de crescimento que podem ser empregados incluem indicadores de corante sensível a pH (tais como azul de bromotimol, púrpura de bromocresol, vermelho de fenol, e outros, ou combinações dos mesmos), indicadores de corante de oxidação-redução (tais como azul de metileno, e outros), substratos enzimáticos, 5 ou misturas de dois ou mais dos mesmos. O substrato enzimático pode compreender qualquer substrato enzimático cuja atividade se relacione com uma ou mais enzimas que podem estar presentes no organismo de teste. Os substratos enzimáticos que podem ser usados podem 10 incluir aqueles discutidos adiante. O uso destes indicadores de crescimento microbianos pode resultar em uma mudança na cor em resposta a um fenômeno de crescimento de microorganismo, tal como alterações no pH, potenciais de oxidação-redução, atividade enzimática, 15 bem como outras indicações de crescimento. O meio de incubação pode compreender um ou mais tampões de pH, um ou mais neutralizadores, um ou mais agentes para manutenção de equilíbrio osmótico, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos. Os tampões de pH podem inclu20 ir K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, 2,2-Bis (hidroxilmetil) 2 , 2',2"-nitrilotietanol (Bis Tris), 1, 3-Bis[tris(hidroximetil)metilamino] propano (Bis-Tris Propano), ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-etanossulfônico (HEPES), 2-Amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol (Triz25 ma, Tris base), N-[Tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricina) , Diglicina (Gly-Gly) , N,N-Bis(2-hidroxietil) glicina (Bicina), ácido N-(2-Acetamido)iminodiacético (ADA), ácido N-(2-Acetamido) -2-aminoetanossulfônico (aces), ácido I,4-Piperazinodietanossulfônico (PIPES), ácido R-Hidroxi-4-morfolinopropanossulfônico (MOPSO), N,N-Bis(2-hidroxietil) -2-aminoetanossulfônico (BES) , ácido 3 -(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS) , ácido 5 2 -[(2-Hidroxi-1,1-bis(hidroxilmetil)etil)amino]etanossulfônico (TES) , ácido 3-(N,N-Bis[2-hidroxietil]amino) -2-hidroxipropanossulfônico (DIPSO), ácido 4- (Nmorfolino)butanossulfônico (MOBS), ácido 2-Hidroxi-3- [tris(hidroximetil)metilamino]-1-propanossulfônico 10 (TAPSO), hidrato de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina1-(2-hidroxipropanossulfônico (HEPPSO), diidrato de ácido piperazina-1,4-bis(2-hidroxipropanossulfônico) (POPSO), ácido 4-(2-Hidroxietil) -1-piperazina propanossulfônico (EPPS), ácido N-(2-Hidroxietil)pipera15 zina-N' - (4-butanossulfônico) (HEPBS) , ácido [ (2- Hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]-1-propanossulfônico (TAPS), 2-Amino-2-metil-l,3-propanodiol (AMPD), ácido N-tris(Hidroximetil)metil-4-aminobutanossulfônico (TABS), ácido N-(1,1- Dimetil-2- 20 hidroxietil) -3-amino-2-hidroxipropanossulfônico (AMPSO) , ácido 2-(Cicloexilamino)etanossulfônico (CHES) , ácido 3- (Cicloexilamino) -2-hidroxil-l-propanossulfônico (CAPSO), 2-Amino-2-metil-l-propanol (AMP), ácido 3-(Cicloexilamino) -1-propanossulfônico (CAPS), 25 ácido 4- (Cicloexilamino) -1-butanossulfônico (CABS) , hidrato de ácido 2- (N-Morfolino)etanossulfônico (MES), ácido N- (2-Acetamido) -2-aminoetanossulfônico (ACES) , e misturas de dois ou mais dos mesmos. Os neutralizadores podem incluir, sendo que não se fica limitado aos mesmos, tioglicolato de sódio, tiossulfato de sódio, catalase, bissulfato de sódio, lecitina de bissulfito de sódio, polissorbato 20, polissor5 bato 80, bicarbonato de cálcio, e misturas de dois ou mais dos mesmos. Os agentes para manterem o equilíbrio osmótico podem incluir sal de sódio, sais de potássio, sais de magnésio, sais de manganês, sais de cálcio, sais metálicos, cloreto de sódio, cloreto de 10 potássio, sulfato de magnésio, cloreto de ferro, e misturas de dois ou mais dos mesmos. O meio de incubação pode compreender uma composição aquosa constituída de: água; entre cerca de 0,01 até cerca de 100 gramas, por litro de água (g/l) , e em uma concretizais ção entre cerca de 0,1 até cerca de 50 g/l, de uma ou mais fontes de nutrientes; entre cerca de IlOxlO5 até cerca de 10 g/l, e em uma concretização entre cerca de I,OxlO4 até cerca de 1,0 g/l de um ou mais indicadores de crescimento microbianos; até cerca de 5000 20 g/l, e em uma concretização entre cerca de 0,001 até cerca de 5000 g/l, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 1000 g/l, de um ou mais tampões de pH; até cerca de 100 g/l, e em uma concretização entre cerca de 0,01 até cerca de 100 g/l, e em uma 25 concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 50 g/l, de um ou mais neutralizadores; até cerca de 50 g/l, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 50 g/l, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 2 5 g/l, de um ou mais agentes para manterem equilíbrio osmótico.
0 meio de incubação pode ter uma capacidade tampão relativamente baixa, na faixa entre cerca de 5 0,001 até cerca de -0,070 mol H+, e em uma concretização na faixa entre cerca de -0,01 até cerca de 0,070 mol H+, e em uma concretização na faixa situada entre cerca de -0,01 até cerca de -0,014 mol H+. Esta capacidade de tampão pode ser proporcionada pela for10 mulação do meio de incubação com a capacidade de tampão baixa indicada ou por diluição de um meio de incubação pré-formulado que tem uma capacidade de tampão mais elevada com água ou outro líquido. Na técnica anterior, os meios de incubação foram formulados 15 tipicamente para aumentar o crescimento dos organismos. Isto pode fazer com que os organismos consumam mais energia no crescimento e divisão e menos energia no esgotamento de acúmulo de refugo ácido e outros subprodutos produzidos pelo metabolismo. Os tampões 2 0 dentro de um meio de incubação podem ser usados para manter o meio suficientemente neutro ou alcalino para facilitar o transporte de subprodutos ácidos (prótons) através da membrana de célula. O meio de incubação usado com o indicador de esterilização exposto
2 5 pode focar o quão rapidamente o crescimento pode ser detectado. Pelo emprego de uma capacidade de tampão reduzida na faixa entre cerca de -0,001 até cerca de -0,010 mol H+, e em uma concretização na faixa entre cerca de -0,005 até cerca de -0,007 mol H+, o meio de incubação pode ser mais sensível a pequenas mudanças no pH, potenciais redox e/ou atividade enzimática.
O meio de incubação pode compreender um caldo nutriente, caldo de neutralização D/E, meio mínimo de Davis, caldo de teste de esterilidade, bem como qualquer digesto de soja-caseína ou meios baseados em extrato de carne. Estes podem incluir uma solução aquosa de caldo digesto de soja-caseína, tioglicolato fluido e Dextrose Tryptone (Difco Laboratories, Inc.). Uma base de caldo de soja tríptica modificada, sem glicose, pode ser usada. Se estiver sendo medida atividade enzimática, o meio de incubação poderá compreender água, um substrato enzimático, e opcionalmente tampões de pH.
Um exemplo de um meio de incubação que pode ser usado é o Bacto™ Tryptic Soy Broth, que contém digesto pancreático de caseína (17,0 g/l), digesto enzimático de farinha de soja (3,0 g/l), cloreto de só20 dio (5,0 g/l), fosfato de dipotássio (2,5 g/l), e dextrose (2,5 g/l). Estes ingredientes podem ser dispersos ou dissolvidos em água. As concentrações expressas em termos de g/l referem-se aos gramas de ingrediente por litro de água. O digesto pancreático de ca25 seína, o digesto enzimático de farinha de soja, e dextrose proporcionam fontes de energia para crescimento do microorganismo. Estes podem ser referidos como fontes nutrientes. 0 cloreto de sódio pode ser usado para manter um equilíbrio osmótico no meio líquido. O fosfato de dipotássio pode funcionar como um tampão de pH. 0 vermelho de fenol, por exemplo, que é um corante sensível a pH, pode ser adicionado (18 mg/l) à 5 formulação do Bacto™ Tryptic Soy Broth. O corante pode ser de utilidade como um indicador de mudança de pH no meio de incubação resultante do crescimento de microorganismos.
Outro exemplo de um meio de incubação que pode ser usado é o BBL™ Fluid Thioglycollate Medium. Este meio de incubação contém digesto pancreático de caseína (15,0 g/l), extrato de lêvedo (5,0 g/l), dextrose (5.5 g/l), cloreto de sódio (2,5 g/l), L-cistina (0,5 g/l), tioglicolato de sódio (0,5 g/l), e resazurin (1,0 mg/l). Estes ingredientes podem ser dispersos ou dissolvidos em água. 0 digesto pancreático de caseína, extrato de lêvedo, dextrose, e L-cistina são fontes de nutrientes que podem proporcionar energia para crescimento de microorganismos. 0 cloreto de sódio pode ser usado para manter equilíbrio osmótico no meio de incubação. 0 tioglicolato de sódio pode ser usado como um neutralizador. 0 resazurin pode ser usado como um indicador de corante de oxidação/redução. Outras fontes de nutrientes, mediadores osmóticos e ingredientes gerais conhecidos daqueles experimentados na técnica poderão substituir os ingredientes que foram listados.
Uma vantagem da tecnologia exposta é que a dimensão do indicador biológico 3 0 pode ser relativamente pequena e, deste modo, o volume de meio de incubação necessário para incubar quaisquer organismos de teste sobreviventes no carreador 12 pode ser rela5 tivamente pequeno. Isto pode resultar em um período de incubação que pode ser relativamente curto. Desta maneira, de acordo com uma concretização, o indicador biológico 30 pode ser suportado por um a carreador 12 que é relativamente pequeno, o carreador 12 tendo uma 10 área de superfície na faixa entre cerca de 1 até cerca de 80 mm2, e em uma concretização entre cerca de 5 até cerca de 50 mm2. O número de esporos suportados pelo carreador 12, antes da esterilização, pode estar na faixa entre cerca de IO4 até cerca de IO7 cfu/mm2, 15 e em uma concretização na faixa entre cerca de IO5 até cerca de IO6 cfu/mm2. O volume do meio de incubação necessário para incubar o indicador biológico 3 0 depois da esterilização pode estar na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 5 ml, e em uma concretiza2 0 ção entre cerca de 0,1 até cerca de 4 ml, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 3 ml, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 2 ml, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 1,5 ml, e em uma concretização entre cerca 25 de 0,3 até cerca de 1 ml. 0 tempo requerido para incubar o indicador biológico 30 depois da esterilização pode estar situado na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 48 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 36 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 24 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 18 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 5 até cerca de 15 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 12 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 10 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 8 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 10 até cerca de 6 horas, e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 5 horas e em uma concretização entre cerca de 0,1 até cerca de 4 horas. A enzima que pode ser usada como o indicador biológico 3 0 pode compreender qualquer enzima, incluindo enzimas extra15 celulares ou intracelulares, cuja atividade pode relacionar-se com a viabilidade de pelo menos um organismo de teste. Por "relacionar-se" entende-se que a atividade da enzima, em relação a antecedentes, pode ser usado para prognosticar o crescimento futuro de 20 um organismo de teste. A enzima pode ser uma que em seguida a um ciclo de esterilização, que é sub-letal para o organismo de teste, permanece suficientemente ativa para reagir com um substrato enzimático dentro de um período de tempo desejado, por exemplo, entre 25 cerca de 4 até cerca de 164 horas, e em uma concretização entre cerca de 4 até cerca de 84 horas, sendo ainda desativado ou apreciavelmente reduzido na sua atividade em seguida a uma esterilização que seria letal para o organismo de teste.
0 teste seguinte pode ser de utilidade na identificação dessas enzimas que são dotadas das características requeridas para serem de utilidade como 5 indicador biológico 30. A enzima, quando submetida a condições de esterilização que são apenas suficientes para diminuir a população de cerca de 1 x IO6 organismos de teste em cerca de 6 Iogs (isto é, para uma população de cerca de zero quando medida pela ausência 10 de desenvolvimento dos organismos de teste), pode ter atividade enzimática residual que é igual ao "antecedente" quando medida por reação com um substrato enzimáticos; entretanto, a enzima ao ser submetida a condições de esterilização suficientes apenas para dimi15 nuírem a população de cerca de 1 x IO6 organismos de teste em pelo menos cerca de I Iog, mas menos do que cerca de 6 Iogs, pode ter atividade enzimática maior do que o "antecedente" quando medida por reação com o substrato enzimáticos. O substrato enzimáticos pode 20 ser uma substância, ou uma mistura de substâncias, que quando submetida à ação de enzimas proporciona um produto capaz de ser detectado, por exemplo, fluorescente ou colorido, modificado por enzima. A atividade enzimática pode ser medida pela quantidade de produto 25 modificado por enzima capaz de ser detectado que foi produzido. A enzima pode ser uma que tenha atividade suficiente, em seguida a condições de esterilização insuficientes para diminuir a população do organismo de teste em cerca de 6 Iogs, para reagir com o substrato enzimáticos e produzir uma quantidade detectável de produto modificado por enzima dentro de um período de tempo na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 48 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 12 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 4 horas.
A atividade do indicador biológico 3 0 depois das condições de esterilização que são insuficientes para diminuírem a população de microorganismos em cerca de 6 Iogs pode ser de pelo menos cerca de 2 por cento maior do que o antecedente, e de acordo com uma concretização pelo menos cerca de 5 por cento maior do que o antecedente, e em uma concretização pelo menos cerca de 10 por cento maior do que o antecedente. 0 nível de atividade enzimática residual que é definido como "antecedente" pode ser mais alto do que aquele que é alcançado pela conversão espontânea do substrato enzimático para produto depois que a enzima foi desativada.
As enzimas que podem ser usadas no indicador biológico 30 podem incluir, sendo que não se fica limitado às mesmas, enzimas hidrolíticas provenientes de microorganismos formadores de esporos. Estas enzimas podem incluir beta-D-glicosidase, alfa-Dglucosidase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, esterase de butirato, esterase lípase de caprilato, miristato lípase, leucina aminopeptidase, valina aminopeptidase, quimotripsina, fosfoidrolase, alfa-Dgalactosidase, beta-D-galactosidase, alfa-L-arabinofuranosidase, N-acetil -beta-glicosaminidase, beta-D5 celobiosidase, alanina aminopeptidase, prolina aminopeptidase, tirosina aminopeptidase, fenilalanina aminopeptidase, beta-D-glicuronidase, e uma esterase de ácido graxo, derivada de microorganismos formadores de esporos, tais como as espécies de microorganismos 10 Candida, Bacillus ou Clostridium.
As enzimas provenientes de Geobacillus stearothermophilus que podem ser usadas podem incluir alfaD-glicosidase, beta-D-glicosidase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, butirato esterase, lípase de caprilato esterase, leucina aminopeptidase, quimotripsina, fosfoidrolase, alfa-D-galactosidase, beta-Dgalactosidase, alanina aminopeptidase, tirosina aminopeptidase, e fenilalanina aminopeptidase e uma esterase de ácido graxo. As enzimas provenientes de Bacillus subtilis que podem ser usadas incluem alfa-Larabinofuranosidase, beta-D-glicosidase, N-acetil beta-glicosaminidase, beta-D-celobiosidase, alanina aminopeptidase, prolina aminopeptidase, tirosina aminopeptidase, leucina aminopeptidase e fenilalanina aminopeptidase.
Beta-D-glicosidase e alfa-L-arabinofuranosidase a partir de Bacillus subtilis podem ser usadas na monitoração de esterilização de óxido de etileno. A alfa-D-glicosidase proveniente de Geobacillus stearothermophilus pode ser usada para monitor condições de esterilização por vapor.
Um substrato enzimático pode ser uma substância ou mistura de substâncias que quando submetida à ação de uma enzima é convertida em um produto modificado por enzima. De uma maneira geral, o produto modificado por enzima pode ser um material luminescente, fluorescente, colorido ou radioativo. Entretanto, o substrato enzimático pode compreender um ou mais compostos que quando submetidos à ação da enzima, podem proporcionar um produto que reage com um composto ou composição adicional para proporcionar um material luminescente, fluorescente, colorido ou radioativo. Quando o substrato enzimático se destina a ser incluído no indicador biológico 30 durante a esterilização, o substrato enzimático não deverá decompor-se ou converter-se espontaneamente em um produto detectável durante a esterilização ou incubação. Por exemplo, em indicadores de esterilização usados para monitorar esterilização a quente a seco ou por vapor, o substrato enzimático deverá ser estável sob temperaturas entre cerca de 20°C e cerca de 180°C. Onde o substrato enzimático é para ser incluído com um meio de incubação convencional, ele deverá ser estável no meio de incubação, por exemplo, não autofluorescente no meio de incubação.
Existem dois tipos básicos de substratos de enzima que podem ser usados para a detecção de enzimas específicas. 0 primeiro tipo de substrato enzimático pode ser seja fluorogênico ou cromogênico, e pode ser-lhe dada uma formula química tal com, AB.
5 Quando submetido à ação da enzima, AB, pode decomporse em A+B. 0 B, por exemplo, pode ser seja fluorescente ou colorido. Um exemplo específico de um substrato fluorogênico deste tipo pode ser fosfato de 4- metilumbeliferil. Na presença da fosfatase de enzima, 10 o substrato pode ser decomposto em 4- metilumbeliferona e fosfato. Outros substratos fluorogênicos deste tipo podem incluir os derivados 4- metilumbeliferil, resorufina, e fluoresceína. Um exemplo de um substrato cromogênico deste tipo pode 15 ser fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil. Na presença de fosfatase, o substrato pode ser decomposto em indigotina e fosfato. Outros substratos cromogênicos deste tipo podem incluir derivados de indoxil, nitrofenol e fenolftaleína, onde substratos de indoxil cro20 mogênico podem ser decompostos e uma resposta colorimétrica produzida pela seguinte reação química, AB. Quando subsequentemente submetido à ação da enzima apropriada, AB, pode decompor-se para A+B. A cor pode ser então obtida quando ocorre BB.
0 segundo tipo de substrato enzimático pode
ser dado pela formula química CD, por exemplo, que pode ser convertida por uma enzima específica para C+D. Entretanto, nem C nem D pode ser fluorescente ou colorido, mas D pode ser capaz de ser ainda levado a reagir com o composto Z para proporcionar um composto fluorescente ou colorido, indicando assim atividade enzimática. Um exemplo fluorogênico específico deste 5 tipo pode ser a lisina de aminoácido. Na presença da decarboxilase de lisina enzimática, a lisina pode perder uma molécula de CO2. A parte restante da lisina pode ser então chamada de cadaverina, a qual é fortemente básica. Um indicador básico tal como 4- 10 metilumbeliferona pode ser incorporado e pode florescer na presença de uma base forte. Um substrato cromogênico deste tipo pode ser fosfato de 2-naftil. A fosfatase de enzima pode reagir com o substrato enzimático para proporcionar beta-naftol. 0 beta-naftol 15 liberado pode reagir com um reagente cromogênico que contém l-diazo-4-benzoilamino-2, 5-dietoxibenzeno para produzir uma cor violeta.
O substrato enzimático pode ser um composto fluorogênico, definido neste contexto como um compos20 to capaz de ser modificado enzimaticamente, por exemplo, por hidrólise, para proporcionar um derivado fluoro que tem uma fluorescência apreciavelmente modificada ou aumentada.
Os compostos fluorogênicos podem por si mesmos ser ou não-fluorescentes ou meta-fluorescentes (isto é, fluorescentes de uma maneira distintamente diferente, por exemplo, seja pela cor ou intensidade, em relação aos correspondentes produtos modificados por enzima) e comprimentos de onda de excitação e detecção apropriados, podem ser usados para separar o sinal de fluorescência desenvolvido pela modificação de enzima a partir de qualquer outra fluorescência 5 que possa estar presente.
Pode ser usado um número de substratos de enzima para enzimas de diversas origens, seja que se apresentam naturalmente ou de origem sintética. Estes podem incluir derivados de 4-metilumbeliferil fluoro10 gênicos (hidrolisáveis para 4-metilumbeliferona); derivados de 7-amido-4-metil-cumarina; derivados de diacetilfluoresceina; e fluorescamina.
Derivados de 4-metilumbeliferil que podem ser usados como o substrato enzimático podem incluir: 4- 15 metilumbeliferil-2-acetamido-4, 6-O-benzilideno-2-deoxi -beta-D-lucopiranosida; acetato de 4-metilumbeliferil; 4-metilumbeliferil-N-acetil -beta-D-galactosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil-alfa-D-glicosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil -beta-D
glucosami-nida; ácido de 2'-(4-metilumbeliferil)
alfa-D-N-acetil neuramínico; 4-metilumbeliferil-alfaL-arabi-nofuranosida; 4-metilumbeliferil-alfa-L
arabinosida; butirato de 4-metilumbeliferil; 4- metilumbeliferil -beta-D-celobiosida; metilumbeliferil -beta-D-N, N'-diacetil quitobiosida; 4- metilumbeliferil elaidato; 4-metilumbeliferil -beta-Dfucosida; 4-metilumbeliferil-alfa-L-fucosida; 4-
metilumbeliferil -beta-L-fucosida; 4-metilumbeliferilalfa-D-galactosida; 4-metilumbeli-feril -beta-Dgalactosida; 4-metilumbeliferil-alfa-D-glicosida; 4- metilumbeliferil -beta-D-glucosida; 4-metilumbeliferil -beta-D-glicuronida; 4-metilumbeli-feril p
5 guanidinobenzoato; 4-metilumbeliferil heptanoato; 4- metilumbeliferil-alfa-D-manopiranosida; 4-
metilumbeliferil -beta-D-manopiranosida; 4-metilumbeliferil oleato; 4-metilumbeliferil palmitato; 4- metilumbeliferil fosfato; 4-metilumbeliferil propionato; 4-metilumbeliferil estearato; sulfate de 4- metilumbeliferil; 4-metilumbeliferil -beta-D-N,
N', N"-triacetilquitotriose; 4'
metilumbeliferil 2,3,5-tri -beta-benzoil-alfa-Larabinofuranosida; cloreto de cinamato de 4- metilumbeliferil -beta-trimetilamônio; e 4-
metilumbeliferil -beta-D-xilosida. Derivados de 7- amido-4-metilcumarina que podem ser usados como o substrato enzimático podem incluir: L-alanina-7-amido4-metilcumarina; L-prolina-7-amido-4-metilcumarina; L20 tirosina-7-amido-4-metilcumarina; L-leucina-7-amido-4- metilcumarina; L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina; e 7-glutaril-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina. Os derivados peptídicos de 7-amido-4-metil cumarina que podem ser usados como o substrato enzimático podem in25 cluir: N-t-BOC-IIe-GIu-GIy-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-1-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-CBZPhe-Arg 7-amido-4-metilcumarina; Pro-Phe-Arg 7- amido-4-metilcumarina; N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-amido-4- metilcumarina; e N-glutaril-Gly-Arg 7-amido-4- metilcumarina.
Derivados de diacetilfluorescexna que podem ser usados como o substrato enzimático podem incluir 5 diacetato de fluoresceína, fluoresceína di-(beta-Dgalacto-piranosida), e dilaurato de fluoresceína. Onde a enzima cuja atividade vai ser detectada é alfa-Dglicosidase, quimotripsina, ou esterase de ácido graxo, por exemplo, proveniente de Geobacillus stearo10 thermophilus, pode utilizar-se um substrato enzimático fluorogênico que pode ser 4-metilumbeliferil-alfaD-glicosida, 7-glutarilfenilalanina-7-amido-4-metil
cumarina, ou heptanoato de 4-metilumbeliferil, respectivamente. Onde a enzima cuja atividade deve ser de15 tectada é alfa-L-arabinofuranosidase, por exemplo, derivada de Bacillus subtilis, um substrato enzimático fluorogônico que pode ser usado pode ser 4- metilumbeliferil-alfa-L-arabinofuranosida. Onde a enzima cuja atividade vai ser detectada é beta-D20 glucosidase, por exemplo, derivada de Bacillus subtilis, um substrato enzimático fluorogênico que pode ser usado pode ser 4-metilumbelliferil -beta-Dglicosida. Um substrato enzimático que pode ser usado pode ser um composto cromogênico capaz de ser modifi25 cado enzimaticamente para proporcionar um derivado de cromofor, ou um produto que reage com outro composto de uma espécie semelhante ou diferente para proporcionar um derivado de cromofor, cromofor esse que tem uma cor diferente ou mais intensa. Os compostos cromogênicos podem ser não-coloridos ou coloridos de uma maneira distintamente diferente, por exemplo, seja pela cor ou pela intensidade, em relação aos corres5 pondentes produtos modificados por enzima. Estas alterações podem ser discerniveis a olho nu ou requer o uso de instrumentação detetora de cor. Comprimentos de onda de excitação e detecção apropriados, de maneiras amplamente conhecidas dos usuários de instru10 mentação colorimétrica, podem ser usados para separar os sinais coloridos desenvolvidos pela modificação de enzima em relação a qualquer outra cor que possa estar presente.
Os compostos cromogênicos que podem ser usados como substratos enzimáticos podem incluir derivados de 5-bromo-4-cloro-3-indolil; derivados de nitrofenil; derivados de indoxil; e derivados de fenolftaleína. Derivados de 5-bromo-4-cloro-3-indolil que podem ser usados podem incluir acetato de 5-bromo-6- cloro-3-indolil, acetato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil -beta-D-galactopiranosida, diacetato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-l,3-, 5- bromo4-cloro-3-indolil -beta-D-fucopiranosida, 5- bromo-4-cloro-3-indolil -beta-D-glicopiranosida, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil -beta-D-glicurônico, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil, e sulfato de 5- bromo-4-cloro-3-indolil.
Os derivados de nitrofenil que podem ser usados podem incluir derivados p-nitrofenol e onitrofenol. Estes incluem fosfato de dietil-pnitrofenil; fosfato de di-p-nitrofenil; p-nitrofenil2-acetamido-2-deoxi-3-0 -beta-galactopiranosil -beta5 glicopiranosida; p-nitrofenil-2-acetamido-2-deoxi
beta-glicopiranosida; acetato de p-nitrofenil; pnitrofenil-N-acetil -beta-D-glucosaminida; p-nitrofenil -beta-D-N, N'-diacetilquitobiosida; p-nitrofenilalfa-glicopiranosida; p-nitrofenil-alfa-maltosida; pnitrofenil -beta-maltosida; p-nitrofenil-alfa
manopira-nosida; p-nitrofenil -beta-manopiranosida; miristato de p-nitrofenil; palmitato de p-nitrofenil; fosfato de p-nitrofenil; bis(p-nitrofenil)fosfato; tris(p-nitrofe-nil) fosfato; p-nitrofenil -beta15 glucopiranosida; p-nitrofenil -beta-glicuronida; alfap-nitrofenilglice-rina; p-nitrofenil -alfa
ramnopiranosida; estearato de p-nitrofenil; sulfato de p-nitrofenil; p-nitrofenil-2,3,4,6-tetra-O-acetil beta-glicosaminida; p-nitrofe-nil timidina mono20 fosfato; éster metílico de ácido p-nitrofenil-2,3,4- tri-O-acetil -beta-glicurônico; e valerate de pnitrofenila.
Os o-nitrofenóis de utilidade podem incluir acetate de o-nitrof enil, o-nitrofenil -beta-glicosida 25 e o-nitrofenil -beta-D-glicopiranosida. Outros derivados de nitrofenil de utilidade podem incluir nitrofenil -beta-fucopiranosida; nitrofenil -alfagalactopiranosida; nitrofenil -beta-galactopiranosida; butireto de nitrofenil; caprato de nitrofenil; caproato de nitrofenil; caprilato de nitrofenil; laurato de nitrofenil; e propionate de nitrofenil.
Os derivados de indoxil que podem ser usados 5 podem incluir indoxil-acetato; indoxil beta-Dglicosida; sulfato de 3-indoxil; e fosfato de 3- indoxil.
Os derivados de fenolftaleína que podem ser usados poderão incluir: dibutirato de fenolftaleína; 10 difosfato de fenolftaleína; dissulfato de fenolftaleína; ácido glicurônico de fenolftaleína; ácido fenolftaleína mono -beta-glicosidurônico; ácido fenolftalína mono-beta-glicurônico; e mono-fosfato de fenolftaleína.
Os substratos de enzima cromogênicos descritos
anteriormente podem reagir diretamente com uma enzima apropriada para produzir um cromofor.
Poderão ser empregados substratos enzimáticos adicionais que contêm derivados de 1-naftil, 2-naftil 20 e Naftil-AS-BI se o produto modificado por enzima de derivado for ainda levado a reagir com um reagente cromogênico, tal como corantes diazotizados, por exemplo, l-diazo-4-benzoilamino-2, 5-dietoxibenzeno, 1- diazo-4-benzoilamino-2, 5-dietoxibenzeno, p-diazo-2,5- 25 dietoxi-N-benzoialanina, cloreto de 4-cloro -2- metilbenzeno diazônio, e sal de o-aminoazotolueno diazônio, para produzir um cromofor.
Os derivados de 1-naftil que podem ser usados podem incluir 1-naftil-N-acetil -beta-D-glicosaminida.
Os derivados de 2-naftil que podem ser usados podem incluir 2-naftil-fosfato; 2-naftil-butirato; 2- naftil-caprilato; 2-naftil-miristato; L-leucil-2- naftilamida; L-valil-2-naftilamida; L-cistil-2-
naftilamida; N-benzoil-DL-arginina-2-naftilamida; Nglutaril -fenilalanina 2-naftil-5amina; 2-naftilfosfato; 6-Br-2-naftil-alfa -D-galacto-piranosida; 2- naftil -beta-D-galacto -piranosida; 2-naftil-2-Dglicopiranosida; 6-bromo -2-naftol -beta-D
glicopiranosida; 6-bromo-2-naftil -2-D-manopiranosida; e 2-naftil -alfa-L-fucopiranosida.
Derivados de naftil-AS-Bl que podem ser usados podem incluir naftil-AS-BI-fosfato; e naftil-AS-BI beta-D-glicuronida.
Onde a enzima cuja atividade se destina a ser detectada é alfa-D-glicosidase, por exemplo, a partir de Geobacillus stearothermophilus, o substrato enzimático pode ser p-nitrofenil-alfa-glicopiranosida. Onde 2 0 a enzima cuja atividade se destina a ser detectada é alfa-L-arabinofuranosidase, por exemplo, derivada de Bacillus subtilis, o substrato enzimático que pode ser usado pode ser p-nitrofenil -alfa-Larabinofuranosida. Onde a enzima cuja atividade se 25 destina a ser detectada é beta-D-glicosidase, por exemplo, derivada de Baeillus subtilis, o substrato enzimático que pode ser usado pode ser p-nitrofenil beta-D-glicopiranosida. Onde a enzima cuja atividade se destina a ser detectada é R-galactosidase, o substrato enzimático pode ser 5-bromo-4-cloro-3-indolil-RD-galactopiranosida. Onde a enzima cuja atividade se destina a ser detectada é R-galactosidase, o substrato 5 enzimático pode ser 4-metilumbelliferona-R-D-galactopiranosida.
0 substrato enzimático que pode ser usado pode depender da identidade da enzima cuja atividade se encontra em estudo. Em seguida encontra-se uma lista de 10 um número de substratos enzimáticos e das correspondentes enzimas que podem reagir com o substrato para produzir um produto que tem fluorescência ou cor apreciavelmente aumentada ou modificada.
Substrato Enzimático Enzima 4-Metilumbeliferil acetato Esterase 4-Metilumbeliferil butirato Esterase 4-Metilumbeliferil elaidato Lipase 4-Metilumbeliferil-p-D-galactopiranosida β-D-Galactosidase 4-Metilumbeliferil-a-D- galactopiranosida a-D-Galactosidase 4-Metilumbeliferil-a-D-glicopiranosida a-D-Glicosidase 4-Metilumbeliferil-P-D-glicopiranosida β-D-Glicosidase 4-Metilumbeliferil heptanoato Esterase 4-Metilumbeliferil oleato Lipase 4-Metilumbeliferil fosfato Fosfatase ácida ou alcalina 4-Metilumbeliferil propionato Esterase 4-Metilumbeliferil-p-D-galactosida β-D-Galactosidase 4-Metilumbeliferil-P-D-glicosida β-D-Glicosidase 4-Metilumbeliferil-a-D-glicosida a-D-Glicosidase 4-Metilumbeliferil-a-L- arabinofuranosida L-Leucina-7-amido-4-metilcumarina 7-glutaril-fenilalanina-7- amido-4- metilcumarina D-Melibiose
Fosfato de p-Nitrofenil Acetato de p-Nitrofenil o-Nitrofenil-P-D-galactopiranosida p-Nitrofenil-a-D-galactopiranosida IO o-Nitrofenil-3-D-glicopiranosida p-Nitrofenil-a-D-glicopiranosida p-Nitrofenil^-D-glicuronida p-Nitrofenil-a-L-arabinofuranosida p-Nitrofenil Iaurato p-Nitrofenil miristato p-Nitrofenil palmitato Sal de diNa de p-Nitrofenil fosfato Fenolftaleína dibutirato Fenolftaleina difosfato 2 O Sal de pentaNa fenolftaleína difosfato Sal de Na fenolftaleína^-D- glicuronida Fenolftaleína-P-D-glicuronida L-Fenilalanina etiléster HCI Fenil-p-D-galactopiranosida 2 5 Fenil-P-D-glicuronida
Fenil-p-D-glicopiranosida
Fenil-p-D-glicuronida
Fenil-a-D-glicosida
α-L- Arabinofuranosidase Leucina aminopeptidase
Quimotripsina a-D-Galactosidase Fosfatase ácida ou alcalina Lipase
β-D-Galactosidase
a-D-Galactosidase
β-D-Glicosidase
a-D-Glicosidase
β-D-Glucuronidase
a-L-Arabinofuranosidase
Esterase
Esterase
Esterase
Fosfatase Alacila
Esterase
Fosfatase ácida ou alcalina
Fosfatase ácida ou alcalina
β-D-Glucuronidase
β-D-Glicuronidase
Quimotripsina
β-D-Galactosidase
β-D-Glicuronidase
β-D-Glicosidase
β-D-Glicuronidase
a-D-Glicosidase β-glicerofosfato de sódio Fosfatase ácida ou alcalina 1-naftil fosfato de sódio Fosfatase ácida ou alcalina 2-naftil fosfato de sódio Fosfatase ácida ou alcalina 2-Naftil-butirato Esterase Acetato de β-Naftil Lipase 6-Br-2-naftil^-D-glicosida β-D-Glicosidase L-Leucil-2-naftilamida aminopeptidase Leucina L-Valil-2-naftilamida aminopeptidase Valina N-glutaril-fenilalanina-2- naftilamina Quimotripsina Fosfato de NaftiI-AS-BI- Fosfoidralase Acetato de Indoxil Lipase Acetato de N-Metilindoxil Lipase Miristato de N-Metilindoxil Lipase Acetato de 5-Bromoindoxil Lipase Fosfato de 3-lndoxil Fosfatase ácida ou alcalina Indoxil^-D-glicosida β-D-Glicosidase Acetato de 5-Br-4-CI-3-lndolil Lipase Fosfato de 5-Br-4-CI-3-lndolil Fosfatase ácida ou alcalina 5-Br-4-CI-3-lndolil^-D- glicurônico β-D-Glicuronidase Diacetilfluoresceina Lipase/esterase Depois de o processo de esterilização ser completado, o carreador 12 com qualquer enzima que possa ter sobrevivido ao processo de esterilização no mesmo 25 pode ser contactado com ou colocado em um meio aquoso ou solução aquosa ou um semi-sóiido ou sólido que contenha um substrato enzimático apropriado. O meio aquoso ou solução aquosa pode ser tamponado. Uma vantagem da tecnologia exposta é que a quantidade de enzima posicionada no carreador 12 pode ser relativamente pequena e, assim, o volume do substrato enzimático necessário para detectar quaisquer enzimas que possam ter sobrevi5 vido à esterilização pode ser relativamente pequeno. Isto pode resultar em um período de detecção que pode ser relativamente curto. 0 carreador 12 pode ter uma área de superfície na faixa entre cerca de 1 até cerca de 80 mm2, e de acordo com uma concretização, na faixa 10 entre cerca de 5 até cerca de 50 mm2. As unidades de enzima suportadas pelo carreador 12, antes da esterilização, podem estar na faixa entre cerca de IO'7 até cerca de IO6 unidades/mm2, e em uma concretização, na faixa entre cerca de IO"4 até cerca de IO3 unidades/mm2. A 15 enzima e seu substrato enzimático apropriado podem entrar em contacto um com o outro no meio aquoso ou solução aquosa. Poderá ser usado um tampão isotônico, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de tris(hidroximetil) aminometano-HCI, ou tampão 20 de acetato. Estes tampões isotônicos podem ser compatíveis com a maior parte dos substratos enzimáticos fluorogênicos e cromogênicos. Outra consideração na seleção do tampão é a sua influência na atividade da enzima. Por exemplo, solução salina tamponada com 25 fosfato contém uma alta concentração de fosfato inorgânico que é um forte inibidor competitivo de fosfatase alcalina. Para esta enzima, pode utilizar-se um tampão de tris-HCI. A concentração de substrato enzimático na solução aquosa tamponada pode ser dependente da identidade do substrato enzimático e da enzima, da quantidade de produto modificado por enzima que deve ser 5 gerada para ser detectável, seja visualmente ou por meio de instrumento, e o espaço de tempo requerido para determinar se enzima ativa está presente na mistura de reação. A quantidade de substrato enzimático que pode ser suficiente pode ser a quantidade necessá10 ria para fazer reagir qualquer enzima ativa que pode estar presente depois da esterilização ter sido completada, de forma tal que pode ser produzido um produto modificado por enzima sob uma concentração molar de pelo menos cerca de 1 x IO'8 molar dentro de um pe15 ríodo de até cerca de 4 horas ou menos. Onde o substrato enzimático é um derivado de 4- metilumbeliferila, sua concentração na solução aquosa tamponada pode estar na faixa entre cerca de 1 x IO"5 até cerca de 1 x IO"3 molar.
2 0 O pH da solução aquosa tamponada que contém o
substrato enzimático pode ser ajustado para um pH na faixa entre cerca de 5 até cerca de 9,5, e em uma concretização cerca de 7,5, a fim de prevenir autofluorescência para alguns substratos fluorogênicos básicos.
0 substrato enzimático na solução tamponada aquosa pode ser incubado com a enzima cuja atividade é para ser detectada depois de a enzima ter sido submetida ao ciclo de esterilização. A incubação pode continuar durante um período de tempo e sob condições suficientes para liberar uma quantidade detectável do produto modificado por enzima, supondo-se que qual5 quer enzima permanece ativa. Em geral, a quantidade de produto que pode ser detectado pode ser tão baixa quanto cerca de 1 x IO"8 molar. As condições de incubação deverão ser suficientes para gerarem pelo menos cerca de 1 x IO"8 molar de produto modificado por en10 zima, e em uma concretização entre cerca de 1 x IO"6 até cerca de 1 x IO"5 molar de produto modificado por enzima. O tempo de incubação e temperatura necessários para produzir uma quantidade detectável de produto modificado por enzima pode depender da identida15 de da enzima e do substrato enzimático, e das concentrações de cada um presentes na solução aquosa tamponada. De uma maneira geral, o tempo de incubação requerido pode ser de até cerca de 4 8 horas, e em uma concretização até cerca de 36 horas, e a temperatura 2 0 de incubação pode estar na faixa entre cerca de 2 0 0C até cerca de 70°C. 0 tempo de incubação pode estar na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 4 8 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 3 6 horas, e em uma concretização na faixa 25 entre cerca de 0,1 até cerca de 24 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 12 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 6 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 4 horas, e em uma concretização na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 3 horas. Onde o Bacillus subtilis ou Geobacillus stearothermophilus é a fonte da enzima, o 5 tempo de incubação pode estar na faixa entre cerca de 0,1 até cerca de 3 horas, e a temperatura de incubação pode estar na faixa entre cerca de 300C até cerca de 40°C, e na faixa entre cerca de 50°C até cerca de 65°C, respectivamente.
Os métodos geralmente aplicáveis que podem
ser usados para detectar o produto modificado por enzima podem incluir técnicas fotométrica, potenciométrica, gravimétrica, calorimétrica, condutométrica, ou amperométrica. Em uma concretização, podem utili15 zar-se métodos fluorométricos ou espectrofotométricos. Por exemplo, o substrato enzimático específico pode compreender um derivado de 4-metilumbeliferila que na interação com a enzima dá origem a umbeliferona que pode ser monitorada fluorometricamente, ou o
2 0 substrato pode compreender um derivado de nitrofenol, ou tipo de derivado assemelhado, que na interação com a enzima dá origem a um produto que pode ser monitorado colorimetricamente.
0 indicador biológico 30, muito embora neste contexto esteja descrito principalmente em termos de uma única enzima e/ou organismo de teste, pode compreender uma pluralidade de enzimas e/ou organismos de teste ou as suas combinações. Por exemplo, o indicador biológico 30 pode conter quatro tipos de enzimas (que podem ser derivadas de três tipos de microorganismos) , sendo uma enzima resistente ao calor, sendo uma segunda resistente ao meio de esterilização 5 gasoso, sendo uma terceira resistente a radiação, por exemplo, irradiação gama ou beta, e com uma quarta sendo resistente a meios baseados em fluidos, por exemplo, ácido peracético, peróxido de hidrogênio estabilizado, cloraminas, aminas quaternárias, fenóis, 10 água ozonizada, ou glutaraldeído e outros. De forma assemelhada, o indicador biológico 3 0 pode conter três espécies de organismos de teste, sendo uma espécie resistente ao calor, uma segunda espécie sendo resistente a meios de esterilização gasosos, e sendo 15 a terceira espécie resistente a radiação e uma quarta espécie resistente a meios baseados em fluidos. Exemplo 1
Corta-se uma folha de papel Ahlstrom 238 (um produto de papel fornecido pela Ahlstrom) em seis 20 discos de suporte circulares, cada um deles com um diâmetro de 6 mm (área de superfície de 28,3 mm2) . Três dos discos são inoculados em um lado com 7 microlitros de suspensão de esporos Geobacillus stearothermophilus tendo uma população maior do que IO8 cfu 25 por mililitro. Três dos discos não são inoculados. Cada disco é soldado de forma sônica a uma tira de suporte de polistireno que tem as dimensões de 25 mm x 6 mm x 0,25 mm. Para cada disco, uma trompa de solda é colocada em contacto com um lado da tira carreadora enquanto o disco é colocado em contacto com o outro lado da tira carreadora. Para os discos que são inoculados, o lado dos discos que não contém esporos é co5 locado em contacto com a tira de suporte. Em seguida à soldagem sônica, os três discos não inoculados da mesma maneira que se descreveu anteriormente. A Figura 4 mostra os resultados destes testes. Estes testes demonstram uma ausência de perda de microorganismos 10 significativa como um resultado da soldagem sônica. Exemplo 2
Amostras indicadoras de esterilização do tipo descrito no Exemplo 1 são inoculadas com IO6 cfu/ml de Geobacillus stearothermophilus e expostas a amostras 15 de meios de incubação de diferentes volumes e capacidades de tamponamento. As amostras são monitoradas quanto a mudança de pH como uma função do crescimento de microorganismos. As amostras de meios de incubação são as seguintes:
Amostra A: 1,0 ml de Tryptic Soy Broth (TSB)
com vermelho fenol com capacidade de tamponamento plena.
Amostra B: 0,5 ml de TSB com vermelho fenol e 0,5 ml de água deionizada esterilizada (Dl) com 50% de capacidade de tamponamento plena.
Amostra C: 0,4 ml de TSB com vermelho fenol e 0,1 ml de água esterilizada Dl com 80% de capacidade de tamponamento plena. Amostra D: 0,3 ml de TSB com vermelho fenol e 0,2 ml de água esterilizada Dl com 60% de capacidade de tamponamento plena.
Amostra E: 0,2 ml de TSB com vermelho fenol e 5 0,3 ml de água esterilizada Dl com 4 0% de capacidade de tamponamento plena.
Os resultados encontram-se expostos na Figura 5. Estes resultados indicam que os volumes de meios de incubação menores e capacidade de tamponamento re
duzida mostram crescimento microbiano mais rapidamente do que volumes de meios de incubação maiores.
Embora a tecnologia exposta fosse explicada em relação a concretizações específicas, deve ser compreendido que várias modificações das mesmas serão evi15 dentes para aqueles versados na técnica quando da leitura do relatório. Portanto, deve ficar entendido que a invenção exposta neste contexto destina-se a abranger todas as modificações que incidirem no escopo das reivindicações em anexo.

Claims (64)

1. Indicador de esterilização, caracterizado por compreender: - um carreador, sendo o carreador dotado de uma primeira superfície e uma segunda superfície; - um suporte, sendo o suporte dotado de uma primeira seção e uma segunda secção, o carreador sobrepondo-se à primeira seção do suporte, sendo a segunda superfície do carreador aderente à primeira seção do suporte; e - um indicador biológico suportado pelo carreador, sendo a segunda seção do suporte de dimensão suficiente para permitir manusear o indicador de esterilização sem contacto com o indicador biológico.
2. Indicador de esterilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira superfície do carreador ter uma área de superfície na faixa de cerca de 1 até cerca de 80 mm2.
3. Indicador de esterilização, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o carreador compreende um a material poroso ou um material não poroso .
4. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender papel, metal, vidro, cerâmica, plástico, membranas, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
5. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender fibras comprimidas.
6. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender um material poroso feito de vidro sinterizado, fibras de vidro, cerâmica, polímero sintético, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
7.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender papel.
8.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender um chumaço de celulose.
9. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador estar na forma de um substrato dotado da forma de um círculo, quadrado, retângulo, oval ou seção prismática.
10. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o suporte ser feito de um material que compreende metal, vidro, cerâmica, plástico, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
11. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o suporte ser feito de plástico.
12.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o suporte ser feito de polistireno.
13. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o suporte estar na forma de uma tira retangular com um comprimento, a primeira seção do suporte que compreendendo uma parte menor do comprimento do suporte, a segunda seção do suporte que compreendendo uma parte maior do comprimento do suporte.
14. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador ser vinculado ao suporte utilizando-se soldagem sônica, um adesivo, selagem a quente ou laminação.
15. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender um ou mais organismos de teste, uma ou mais enzimas, ou uma mistura dos mesmos.
16. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender bactérias.
17. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender esporos bacterianos.
18.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender bactérias do gênero Bacillus ou Clostridia.
19.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender Geobacillus stearothermophilus, Baeillus atrophaeus, Baeillus subtilis, Baeillus pumilus, Baeillus eoagulans, Clostridium sporogenes, Baeillus subtilis globigii, Baeillus eereus, Baeillus eireulans, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
20.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender fungos, microbactérias, protozoários, bactérias vegetativas, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
21. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender Aspergillus niger, Candida albieans, Triehophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Myeobaeterium ehelonae, Myeobacterium gordonae, Myeobaeterium smegmantis, Myeobaeterium terrae, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enteroeoeeus faecalis, Streptococeus faecalis, Enteroeoeeus faeeium, Streptoeoecus pyrogenes, Eseheriehia eoli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Methylobaeterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella eholeraesuis, Helieobaeter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, ou uma mistura de duas ou mais dos mesmos.
22. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender Geobacillus stearothermophilus.
23. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender bactérias vegetativas, células vegetativas e/ou suas partes constituintes .
24. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender um ou mais microorganismos e compreender ainda um ou mais excipientes.
25. Indicador de esterilização, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o excipiente compreender um ou mais carboidratos.
26. Indicador de esterilização, de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterizado por o excipiente compreender trealose.
27. Indicador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-26, caracterizado por o excipiente compreender sacarina, glicose, maltose, dextrano, amido, agarose, celulose, proteína, fosfonato, agente de tamponamento, cera, lipídeo, óleo, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
28. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender enterococci resistente a vancomicina, Staphyloccus aureus resistente a meticilina, Myeohaeterium eheloni, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
29.Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender um ou mais prions.
30. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a concentração de esporos suportada pelo carreador varia entre cerca de IO4 até cerca de IO7 cfu por milímetro quadrado do carreador.
31. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender uma ou mais enzimas.
32. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender beta-Dglicosidase, alfa-D-glicosidase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, esterase de butirato, lipase esterase de caprilato, lipase de miristato, aminopeptidase de leucina, aminopeptidase de valina, quimotripsina, fosfoidrolase, alfa-D-galactosidase, beta-D-galactosidase, alfa-L-arabinofuranosidase, N-acetil-beta glicosaminidase, beta-D-celobiosidase, aminopeptidase de alanina, aminopeptidase de prolina, aminopeptidase de tirosina, aminopeptidase de fenilalanina, beta-Dglicuronidase, esterase de ácido graxo, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
33. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o indicador biológico compreender alfa-Dglicosidase, beta-D-galactosidase, alfa-D-glicosidase, beta-D-glicosidase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, esterase de butirato, lipase de esterase de capriIato, aminopeptidase de leucina, quimotripsina, fosfofidrolase, alfa-D-galactosidase, beta-D-galactosidase, aminopeptidase de alanina, aminopeptidase de tirosina, aminopeptidase de fenilalanina, esterase de ácidos graxos, alfa -L-arabinofuranosidase, beta-D-glicosidase, N-acetil -beta-glicosaminidase, beta-D-celobiosidase, aminopeptidase de alanina, aminopeptidase de prolina, aminopeptidase de tirosina, aminopeptidase de leucina, aminopeptidase fenilalanina, ou uma mistura dois ou mais dos mesmos.
34. Indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o carreador compreender papel, o indicador biológico compreender esporos de Geobacillus stearothermophilus, e o suporte compreender polistireno, sendo o carreador levado a aderir ao suporte utilizando-se soldagem sônica.
35. Indicador de esterilização, caracterizado por compreender: - um carreador, sendo o carreador dotado de uma primeira superfície e uma segunda superfície, sendo a primeira superfície dotada de uma área na faixa de cerca de 1 até cerca de 80 ram2; - um suporte, sendo o suporte dotado de uma primeira seção e uma segunda seção, o carreador sobrepondo-se à primeira seção do suporte, sendo a segunda superfície do carreador levada a aderir à primeira seção do suporte; e - um indicador biológico suportado pela primeira superfície do carreador, sendo que o indicador biológico compreende esporos bacterianos, sendo a segunda seção do suporte de dimensão suficiente para permitir o manuseio do indicador de esterilização sem contacto com o indicador biológico.
36.Kit de indicador de esterilização, caracterizado por compreender: - um primeiro compartimento que contém o indicador de esterilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, sendo o primeiro compartimento adaptado para permitir que o indicador de esterilização seja levado ao contacto com um meio de esterilização durante a esterilização; e - um segundo compartimento que contém um meio de incubação, sendo o segundo compartimento adaptado para manter o meio de incubação separado do indicador de esterilização durante a esterilização, e sendo o segundo compartimento adaptado para permitir que o meio de incubação entre em contacto com o indicador de esterilização depois do indicador de esterilização ser exposto ao meio de esterilização.
37. Processo para manufaturar o indicador de esterilização conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado por compreender: - aplicar o indicador biológico ao carreador; e fazer aderir o carreador ao suporte.
38.Processo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o carreador ser levado a aderir ao suporte utilizando-se soldagem sônica ou um adesivo.
39. Processo de esterilização, caracterizado por compreender: - expor um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização de qualquer uma das reivindicações 1-35 a um meio de esterilização.
40. Processo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o meio de esterilização compreender pelo menos um esterilizante líquido.
41. Processo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o meio de esterilização compreender pelo menos um esterilizante gasoso.
42. Processo para determinar a eficiência de esterilização, caracterizado por compreender: - expor pelo menos um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-35 a um meio de esterilização, sendo que o indicador biológico compreende pelo menos um organismo de teste; e - contactar o carreador com um meio de incubação depois da esterilização para determinar se a esterilização é efetiva.
43. Processo, de acordo com a reivindicação42, caracterizado por o meio de incubação compreender uma ou mais fontes de nutrientes e um ou mais indicadores de crescimento microbianos.
44.Processo, de acordo com a reivindicação43, caracterizado por o meio de incubação compreender ainda um ou mais tampões de pH, um ou mais agentes para manterem equilíbrio osmótico, um ou mais neutralizadores, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
45 . Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42-44, caracterizado por o meio de incubação compreender uma solução tamponada dotada de uma capacidade de tamponamento na faixa de cerca de -0,001 até cerca de -0,070 mol H+.
46. Processo para determinar a eficiência de esterilização, caracterizado por compreender: - expor pelo menos um artigo a ser esterilizado e o indicador de esterilização conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-35 a um meio de esterilização, o indicador biológico compreende pelo menos uma enzima; e - contactar o carreador com pelo menos um substrato enzimãtico para determinar se a esterilização é efetiva.
47. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o substrato enzimático compreender: um ou mais derivados de 4-metilumbeliferila fluorogênico; um ou mais derivados de 7-amido-4-metilcumarina; um ou mais derivados de diacetilfluoresceína; fluorescamina; ou uma mistura de dois ou mais deles.
48 . Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o substrato enzimático compreender: 4-metilumbeliferil-2-acetamido-4, 6-0-benzilidene- 2-deoxi-beta-D-lucopiranosida; acetato de 4-metilumbeliferil; 4-metilumbeliferil-N-acetil -beta-D-galactosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil -alfa-D-glicosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil -beta-Dglicosaminide; ácido 21 -(4-metilumbeliferil) -alfa-D-Nacetil neuramínico; 4-metilumbeliferil -alfa-Larabinofuranosida; 4-metilumbeliferil alfa-Larabinosida; 4-metilumbeliferil butirato; 4- metilumbeliferil -beta-D-celobiosida; metilumbeliferil -beta-D-N, N'-diacetil quitobiosida; 4-metilumbeliferil elaidato; 4-metilumbeliferil -beta-D-fucosida; 4- metilumbeliferil -alfa-L-fucosida; 4-metil-umbeliferil -beta-L-fucosida; 4-metilumbeliferil -alfa-Dgalactosida; 4-metilumbeliferil -beta-D-galactosida; 4- metilumbeliferil -alfa-D-gliosida; 4-metilumbeliferil beta-D-glicosida 4-metilumbeliferil -beta-Dglicuronida; 4-metilumbeliferil p-guanidinobenzoato; 4- metilumbeli-feril heptanoato; 4-metilumbeliferil -alfaD-mannopira-nosida; 4-metilumbeliferil -beta-Dmannopiranosida; 4-metilumbeliferil oleato; 4- metilumbeliferil palmitato; 4-metilumbeliferil fosfato; 4-metilumbeliferil propionato; 4-metilumbeliferil estearato; 4-metilumbeliferil sulfato; 4-metilumbeliferil beta-D-N, N1, N"-triacetil-quitotriose; 4'metilumbeliferil 2,3,5-tri-beta-benzoil -alfa-Larabinofuranosida; cloreto de cinamato 4- metilumbeliferil -beta-trimetilamônio; 4-metilumbeliferil -beta-D-xilosida; ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
49. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o substrato enzimático compreender: L-alanina-7-amido -4-metilcumarina; L-prolina-7- amido -4-metilcumarina; L-tirosina-7-amido -4- metilcumarina; L-leucina-7-amido -4-metilcumarina; Lfenilala-nina-7-amido -4-metilcumarina; 7-glutarilfenilalanina-7-amido -4-metilcumarina; ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
50. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o substrato enzimático compreender: N-t-BOC-IIe-Glu-Gly-Arg 7-amido -4-metilcumarina; N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-amido -4-metilcumarina; NCBZ-Phe-Arg 7-amido -4-metilcumarina; Pro-Phe-Arg 7- amido -4-metilcumarina; N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-amido-4- metilcumarina; N-glutaril-Gly-Arg 7-amido-4- metilcumarina; ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos .
51. Processo, de acordo com a reivindicação46, caracterizado por o substrato enzimático compreender diacetato de fluoresceína, di-(beta-D-galactopiranosida) de fluoresceína, dilaurato de fluoresceína, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
52. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender alfa-Dglicosidase, quimiotripsina, ou esterase de ácidos graxos; e o substrato enzimático compreender 4-metilumbeliferil -alfa-D-glicosida, 7-glutarilfenilalanina-7- amido-4-metil cumarina, ou heptanoato de 4-metilumbeliferil.
53. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enxima compreender alfa-Larabinofuranosidase; e o substrato enzimático compreender 4-metilumbeliferil -alfa-L-arabinofuranosida.
54. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender beta-Dglicosidase; e o substrato enzimático compreender 4- metilumbeliferil -beta-D-glicosida.
55. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por um substrato enzimático compreender um ou mais derivados de 5-bromo-4-cloro-3-indolil; um ou mais derivados de nitrofenila; um ou mais derivados de indoxila; um ou mais derivados de fenolftaleína ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
56.Processo, de acordo com a reivindicação46, caracterizado por o substrato enzimático compreender acetato de 5-bromo-6-cloro -3-indolil, acetato de5-bromo-4-cloro -3-indolil, 5-bromo-4-cloro -3-indoxil -beta-D-galactopiranosida, 5-bromo-4-cloro -3-indolil1,3-diacetato, 5-bromo-4-cloro -3-indolil -beta-Dfucopiranosida, 5-bromo-4-cloro -3-indolil -beta-Dglicopiranosida, ácido 5-bromo-4-cloro -3-indolil beta-D-glicurònico, fosfato de 5-bromo-4-cloro -3- indolil, sulfato de 5-bromo-4-cloro -3-indolil, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
57. Processo, de acordo com a reivindicação46, caracterizado por o substrato enzimático compreender: um ou mais derivados de p-nitrofenol; um ou mais derivados de o-nitrofenol; ou uma mistura dos mesmos.
58. Processo, de acordo com a reivindicação46, caracterizado por um substrato enzimático compreender: fosfato de dietil-p-nitrofenil; fosfato de di-pnitrofenil; p-nitrofenil -2-acetamido-2-deoxi -3-0- beta-galactopiranosil -beta-glicopiranosida; pnitrofenil -2-acetamido -2-deoxi-beta-glicopiranosida; acetato de p-nitrofenil; p-nitrofenil -N-acetil -betaD-glicosaminida; p-nitrofenil -beta-D-N, N'diacetilquitobiosida; p-nitrofenil -alfaglicopiranosida; p-nitrofenil -alfa-maltosida; pnitrofenil -beta-maltosida; p-nitrofenil -alfamanopiranosida; p-nitrofenil -beta-manopiranosida; pnitrofenil miristato; p-nitrofenil palmitato; fosfato de p-nitrofenil; fosfato de bis(p-nitrofenil) ; fosfato de tris(p-nitrofenil); p-nitrofenil -beta -glicopiranosida; p-nitrofenil -beta-glicuronida; alfa-pnitrofenil-glicerina; p-nitrofenil -alfaramopiranosida; estearato de p-nitrofenil; sulfato de p-nitrofenil; p-nitrofenil-2,3,4,6-tetra-0-acetil beta-glicosaminida; mono-fosfato de timidina de pnitrofenil; éster metílico de ácido p-nitrofenil-2,3,4- tri-O-acetil -beta-glicurônico; valerato de pnitrofenil; ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
59. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por um substrato enzimático compreender: acetato de o-nitrofenil; o-nitrofenil -betaglicosida; o-nitrofenil -beta-D-glicopiranosida; nitrofenil -alfa-galactopiranosida; nitrofenil -beta-galactpiranosida; butirato de nitrofenil; caprato de nitrofenil; caproato de nitrofenil; caprilato de nitrofenil; laurato de nitrofenil; propionato de nitrofenil; acetato de indoxil; beta-D-glicosido de indoxil; sulfato de 3-indoxil; fosfato de 3-indoxil; dibutirato de fenolftaleína; difosfato de fenolftaleína; dissulfato de fenolf taleína; ácido glicurônico de fenolftaleína; ácido mono-beta-glicosidurônico de fenolftaleína; ácido monobeta-glicurônico de fenolftaleína; e mono-fosfato de fenolftaleína; l-diazo-4-benzoilamino-2; 5-dietoxibenzeno; l-diazo-4-benzoilamino-2; 5-dietoxibenzeno; pdiazo-2,5-dietoxi-N-benzoialanina; cloreto de 4-cloro2-metilbenzeno diazônio; sal de diazônio de oaminoazotolueno; 1-naftil-N-acetil -beta-D-glicosaminida; fosfato de 2-naftil; butirato de 2-naftil; 2- naftil-caprilato; 2-naftil-miristato; L-leucil-2- nafilamida; L-valil -2-naftilamida; L-cistil-2-naftilamida; N-benzoil-DL-arginina -2-naftilamida; Nglutaril-fenilalanina 2-naftil-amina; fosfato de 2- naftil; 6-Br-2-naftil -alfa-D-galacto-piranosida; 2- naftil -beta -D-galacto-piranosida; 2-naftil -2-Dglicopiranosida; 6-bromo-2-naftol -beta -Dglicopiranosida; 6-bromo-2-naftil -2-D-manopiranosida; 2-naftil -alfa -L-fucopirano-sida; fosfato de naftilAS-BI; glicuronida de naftil-AS-BI-beta-D-; ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
60. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender alfa-Dglicosidase, e o substrato enzimático compreender pnitrofenil -alfa-glicopiranosida.
61. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender alfa-Larabinofuranosidase, e o substrato enzimático compreender p-nitrofenil -alfa-L-arabinofuranosida.
62. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender beta-Dglicosidase, e o substrato enzimático compreender pnitrofenil -beta-D-glicopiranosida.
63. Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a enzima compreender Sgalactosidase, e o substrato enzimático compreender 5- bromo -4-cloro -3-indolil -β-D-galactopiranosida.
64. Processo, de acordo com a reivindicação46, caracterizado por a enzima compreender βgalactosidase, e o substrato enzimático compreender 4- metilumbeli-ferona -β-D-galactopiranosida.
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