TW200821388A - Sterilization indicator - Google Patents

Description

200821388 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明所揭示之技術係關 糸關於一種滅菌指示器及一種製 造滅菌指示器之方法。本發 今七明所揭不之技術係關於一種使 用滅菌指示器來測定滅菌效用之滅菌方法。 【先前技術】 發明背景

主要在衛生保健產業中以及許多其他商業及工業應用 中，通常須監控用於將諸如醫用及非醫用裝置、器具及其 他物件及材料之設備滅菌之方法之效用。此等滅菌方法之 標準操作通常在待滅菌之物件批次中包括滅菌指示器。此 允許以直接方法檢定滅菌方法之致死性。 習知滅菌指示器通常含有生物指示器。該生物指示器 可包：-或多種測試生物體，該等測試生物體經設計比待 由滅囷破壞之生物體耐受滅菌方法。此等 為細菌孢子1知滅菌指示器可以兩種形式來使用 此等形式中之第一種包含使用基板，其中將細菌孢子 直接施加或接種於基板上。基板可被孢子完全覆蓋◊使用 者之任何實體撫作均可導致孢子自基板離失，轉移至使用 者，或潛在污染周圍區域或受周圍區域污染。已建議提供 專用夹子以允許使用者操作基板。然而，此等夹子常阻礙 滅菌方法且可能導致錯誤之測試結果。而且，對此等基板 之最小尺寸限制通常導致需要相對較大之培養基體積（例 如約5至、約1G毫升（ml))及相對較長之培育期（例如 6 200821388 约2至約7天）。 一此等形式中之第二種包括自含。 菌指示器通常含有在單一六哭 工’囷曰不器。此等滅 菌孢子及i立暴其., ^ W ，但處於獨立隔室中之細 夂4養基。使孢子經歷 谷器以使任何存活之跑子 養套》咸困之後，啟動 用。此等減菌指示器可適用^ /養基以測定滅菌之效 於液體減菌方法。、用於氧體滅菌方法’但通常不適

^滅菌指示器之各者之主要 九果之時間延遲。此等 獲仔滅囷1式 養至少兩天且通通电需要將細菌抱子培 孢子。在此^ 天以確保充分谓測任何存活之 使用直至已^ =歷滅菌方法且處於評估中之物件不能 保健力測試之結果。然而，許多衛生 再使用盆^=限#源且必須在24-48小時内且常常即刻 認之/至/u」之/具。在此等背景下，用於無菌確 率的。 呆持時段可能不切實際、耗費成本且無效 此項技術所呈現之一問題在於提供一種最小化 '肖:生物扣不态之操作且在相對較短之時間段内準確偵 侧滅囷方法之效用的滅菌指示器。若此滅菌指示器可適合 ::體=菌方法以及氣體滅菌方法，則為有利的。在至少 具體貝例中’所揭示之技術可提供此問題之解決方法。 【發明内容】 概述 所揭不之技術可係關於一種滅菌指示器，其包含··一 7 200821388 載體，該載體具有第一表面及第二表面；一支撐體，該支 撐體具有第一部分（first section)及第二部分㈨ section)，該載體上覆於該支撐體之第一部分上，該載體之 第二表面附著於該支撐體之第—部分；及_由該㈣支撑 之生物指示器，該支撐體之第二部分具有足夠尺寸以允許 在不接觸該生物指示器之情況下操作該滅菌指示器。 所揭示之技術可係關於一種滅菌指示器套組，其包含： 一含有上文所指示之滅菌指示器之第一隔室，該第一隔室 經改適以允許滅菌指示器與滅菌介質在滅菌期間接觸；及 一含有培養基之第二隔室，該第二隔室經改適以在滅菌期 間保持該培養基與該滅菌指示器分離，且該第二隔室經改 適以允許該培養基在滅菌指示器已暴露於滅菌介質後與爷 滅囷才曰不接觸。 所揭示之技術可係關於一種製造上文所指示之滅菌浐 示器之方法，其包含：將生物指示器施加於載體；及將^ 體附著於支撐體。 所揭示之技術可係關於一種滅菌方法，其包含：將一 待滅菌之物件及上文所指示之滅菌指示器暴露於滅菌介 質。 ’丨 所揭示之技術可係關於一種測定滅菌效用之方法，其 包含：將一待滅菌之物件及上文所指示之滅菌指示器暴露 於滅菌介質，該生物指示器包含至少一種測試生物體·，及 在滅菌後使載體與培養基接觸以判定滅菌是否有效。 所揭示之技術可係關於一種測定滅菌效用之方法， 具 8 200821388 v 包含：將至少一件翁 1千得滅囷之物件及上文所指 器暴露於滅菌介暂— 叮而不之減菌指示 固”貝，该生物指示器包含至少一 使載體與至少一 M祕 種酵素；及 種酵素基質接觸以判定減菌是$ ^ 【實施方式】 闺疋否有效。 詳細說明 :語「減菌」可係指致使物質不能繁 長。雖然其通常咅褶&人 弋身及/或生 中w明疋全不存在活生物體 文中可用於指物皙π人、工丄Α 仁該術語在本 物貝不含活生物體達到預前〜 度。除非另有指干 、、、疋之可接雙程 百扣不，否則術語滅菌在本 滅菌相比嚴袼度較差 亦可用於指與 又平又是之方去及程序，例如消 及其類似方法。本文所述之滅菌指示器及=理 !衛生保健領域、科學領域及其類似領域中使== 菌指示器以及方法乃壯罢 此等滅 及万去及I置可在需要滅菌、 及並Jit) ^ j-, ’ 肩了生處理 及/、颏似方法之商業及工業應用 駿兹制、生廿丄 例如食品加工、 西市衣每及其類似應用。 可使用所揭示之滅菌指示器之滅 方法。舲笪、r¥ 4 + 方去可為任何滅菌 方法此4滅囷方法可包括其中滅菌介質或、Λ — $丨^ * 、士 ^ "貝或滅囷劑可為蒎

Li:二 及一ί多種氣體滅菌劑、-或多種液體 二囷^ 類似物之滅菌方法。輻射可包含電子束或任何 电磁波光譜，包括電離輻射、脈 先或紫外光、微波及 其讀似輻射。輻射可包含γ或β |s 但〆 7 A P ^田射。氣體滅菌劑可包含 ¥氧乙烷、氣體過氧化氫及其類 、s U物。夜體滅菌劑可包含 褐馬林（溶解於水中之甲醛氣體且 U股丑視隱况含有甲醇以抑制 毋性物質之形成）、戊二醛、過氢 虱乙^、液體過氧化氫及 9 200821388 其類似物。 滅菌指示器可用於檢測滅菌劑對抗相比於與滅菌指示 器-起使用之生物指示器對滅菌方法耐受性較小之任何微 生物之致死性。此等微生物可包括細菌，諸如大腸桿菌 (EWdMacoH)、退伍軍人桿菌屬以邮峨-⑹、 曲桿菌屬（c㈣外/▲咖及其他腸道細s，以及葡萄 球菌屬)及鏈球菌屬（&)種， 及其他人類病原性微生物，諸如隱胞子蟲屬 (Cryptosporidium)。 可參考圖1及2來描述滅菌指示器。參看此等圖示， 滅菌指示器ίο可包含載體12，該载體12具有第一表面14 及第二表面16 ·，支撐體20，該支撐體2〇具有第一部分22 及第二部分24，載體12上覆於支撐體20之第一部分22 上，載體12之第二表面16附著於支撐體2〇之第一部分22·， 及由載體12支撐之生物指示器3〇。生物指示器3〇可由載 體12之第一表面14支撐或附著於載體12之第一表面14。 支撐體20之第二部分24可具有足夠尺寸以允許在不接觸 生物指示器30之情況下操作滅菌指示器1〇。亦即，第二 部分24可具有足夠尺寸以充當一把手，藉此允許有利地 無菌操作滅菌指示器1 〇。 載體12可為相對平坦之基板之形式，其在圖式中係圓 形形式描述。然而，應瞭解載體12可具有任何所需之形 狀或形式，例如正方形、長方形、橢圓形及其類似形狀。 載體12可具有稜柱形橫截面。載體12可具有相對較小之 10 200821388 厚度例如約0.001至約3mm，且在__具 至約2 _，且在-具體實例中為約⑽至約154'^·01 力一目碰— 、、J d mm，且 /、體貫例中為約(M至約i _。對生 =之載體12之第-表面…積可相對心 約1至约—範圍内，且在-具體實例 5/m〇mm2之範圍内，且在一具體實例中在約3 至、、”〇一_之範圍内，且在一具體實例中在約5至約5〇 範圍内。此較小面積之一優點在於生物指示器30之 =寸可相對較小’且因此培育生物指示器所需之培養基的 里可相對較小且對培育之時間需要可相對較短。 載體12可包含多孔材料或無孔材料。載體可包含固體 載體载體可包含在滅菌或培育過程期間不溶解或劣化之 f何材料。載體12可包含紙張、金屬、玻璃、陶瓷、塑 膠膜或其兩者或兩者以上之組合。金屬可包含銘或鋼。 塑膠可包含聚烯烴、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸 酯、聚丙烯醯胺、聚醯亞胺、聚酯及其類似物。載體12 可包3薄膜。載體可為短纖或非編織毛氈形式。載體可包 5 C、、宿纖維墊。載體可包含由燒結玻璃、玻璃纖維、陶瓷、 合成？κ合物或其兩者或兩者以上之組合製成之多孔材料。 載體可包含濾紙或吸水紙。載體可包含纖維素襯墊。 支撐體20可包含在滅菌或培育過程期間不溶解或崩解 之任何材料。支撐體可包含金屬、玻璃、陶瓷、塑膠或其 "且a 支撐體可包含铭或不鏽鋼。支撐體可包含聚苯乙烯、 聚稀煙（例如，聚丙烯、聚乙烯）及其類似物。支撐體20 11 200821388

V 可為可撓性的或硬性的。支撐體2〇可摺疊。圖式中所描 ^之支撐體20之形狀為長方形，然而，應瞭解支撐體可 /、有4何所而之形狀或形式，例如正方形、圓形、橢圓形 ^一員似形狀。支揮體20之長度可在約0.2至約12 cm之 辜巳圍内，且在-具體實例中在㉟〇·2至約！ 〇議之範圍内， 在具體只例中在約0.5至約7 cm之範圍内，且在一具 體實例中在約1 $ & < 八 I T隹、〇 1至約5咖之範圍内，且在一具體實例中在 •5至力3.5 em之範圍内。支撐體2〇之寬度可在約ο』 至：2⑽之範圍内，且在-具體實例中在約0.2至約h5⑽ 2乾圍内’且在一具體實例中在約0·25至約i⑽之 内。支撐體20之厚声可力的Λ 固 予度了在約〇·02至約3 mm之範圍内， ^在一具體實例中在約Μ至約2随之範圍内。第二部 :24之長度可在約〇·2至約12⑽之範圍内，且在 馬例中在約0·3至約！ ！⑽之銘鬥向 各 ，、體 太队 靶圍内，且在一具體實例中 在約〇·5至約10⑽之範圍内，且在一具體垂 二 至約7 cm之範圍内，且在一呈體每 〆、貝1 約1 ^ 具體貝例中在約1.5 5j < 之範圍内。 ）至約4.5 cm 支撐體20可為長方形薄片或條帶之 之第-部㈣包含支撐體2〇之長声 1切體2〇 ⑼之第二部分24包含支撐體2〇之長度，支撐體 部分24之長度與第一部分22之長度之比率可二分。第二 約12:1之範圍内，且在一具體實例中在約〜2:1至 範圍内，且在一具體實例中在約5 5:1至約6 $至約8:1之 可使用音波溶接（sonic welding)、熱·5、：1之範圍内。 ' ' 龜著劑或層 12 200821388 壓將載體12附著於支撐體2〇。載體12可在將生物指示器 3〇施加於載體12之前或之後附著於支撐體20。可在將生 物指示^ 30施加於載體12之後使用音波溶接或黏著劑將 載體12附者於支撐體2Q。音波溶接可涉及支撐體與载體 之摩：性黏合。黏著劑可為與載體12及支撐體2"目容且 在殺菌或培育過程期間不溶解或劣化之任何黏著劑。黏著 劑不應對所關注之生物體具有致命性或抑制性。黏著劑可 為壓敏性黏著劑。 :囷指不器10可在任何方法中使用，其中在滅菌方法 二：生：指示器30 I露於滅菌介質，且接著暴露於培 :广' :判疋該滅菌方法是否有效。滅菌指示器10可與任 " 例如使用氣體或液體滅菌劑之滅菌方法一起 可在滅菌方法期間將滅菌指示器' 1Q連同待滅菌之 起暴露於滅菌介質。在完成滅菌方法後，即可將滅 指示 ‘養基之小瓶中。接著可將生物 法是否有效H所糾間段錢著㈣㈣定滅菌方 人i忒:曰:°° 10可在包含具有兩個獨立隔室之容器的自 :二囷指：器Λ組中使用。該等隔室之-可含有滅菌指 H从另隔至可含有培養基。在使用時，可將套組及 囷之物件暴露於滅菌介質。接， 組以使生物指示器30盥以 方 ，i 養基_ /、 困 是否有效之培 將生物指㈣異/且可與任何滅菌方法一起使用（其中可 *路於滅菌介質），例如使用氣體滅菌劑之 13 200821388

V 滅囷方法。 自含式滅菌指示器套組可為 圖3，套組40包含模形管42所^之形式。參看 帽46包括突出物48。環隙43^隔室44及封帽-。封 内部隔…外表面之間形成=換形管42之内表面與 隔室。滅菌指示器10係安置於”;％隙43形成另-内部 ^ ρ ^ ΑΛ Λ,, 、隙43中。培養基含於内 口P P閉至44中。楔形管42及封 # ^ ^ ^ u 畅46可由與滅菌方法中所 使用之條件及化學品相容之任 Λ甘 』材枓製成。此等材料可句 括斌碳酸酯、聚烯烴、聚醯胺、 ΛΚ甲基丙烯酸酯、聚甲篡 戊烯、聚酯及其類似物。内部隔 # —44可為玻璃或易碎玻 耦女瓿之形式。關於楔形管42、 鬥砕隔至44及封帽46之 構k之進一步細節可見於美國直 吴國專利4,3〇4,869巾，該專利 =用的方式併入本文中。滅菌期間，將套組4〇連同待 滅囷之物件一起暴露於滅菌介質。當滅菌完成時，將封帽 二下[至楔形官42中。突出物48與内部隔室44相抵擠 塵且使其破裂。此允許培養基接觸生物指示II 3G。在培育 預疋％間後，可將滅菌指示器1〇移除且藉由偵侧生物指 示為3 0之變化來測定滅菌程度。 生物指示器30可包含一或多種測試生物體。或者，生 物指示器30可包含一或多種酵素。一或多種酵素可衍生 及/或分離自一或多種測試生物體。生物指示器3〇可包含 戍夕種測试生物體與一或多種酵素之組合。 測試生物體可包含對目標滅菌方法之耐受性超過待藉 由該滅菌方法破壞之其他生物體之耐受性的任何生物體。 200821388 用作生物私示益30之測試生物體之類型可視多種因素而 定，其例如（但不限於）所用滅菌方法之類型。測試生物 體可為微生物。可使用之菌株可為對用於滅菌之方法最具 耐受性之菌株。測試微生物可包含細菌。細菌微生物可為 形成内生孢子（亦即，細菌孢子）之細菌微生物。測試生 物體可包含芽孢桿菌似）或梭菌（ c/wa油七）屬 之細菌。此等細菌可包括嗜熱脂肪芽孢桿菌（ stear〇thermophilus)、萎綠芽孢桿菌（BaciUus atr〇phaeus)、 括草芽抱桿菌（wh/仏）、短小芽孢桿菌（仏ci//w P謂z/似）、凝結芽孢桿菌紹·c⑽別z㈣S)、生孢梭 亀(Clostridium sporogenes )、球形變異枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis globigii )、蠟狀芽孢桿菌（仏以//似 arew)、環狀芽孢桿菌（5(^ζ•"似cz>⑶μ則）及其類似細 菌。細菌可包含真菌、分枝桿菌、原生動物、營養細菌及 其類似物。可使用之真菌之實例可包括黑麯黴 niSer )、白色念珠菌（C⑽)、鬚瘡髮癖菌 (Trichophyton mentagrophytes)、反炎玉氏数 QWangiella

Arma"及其類似真菌。可使用之分枝桿菌之實例可包 括龜分枝桿菌（Mj/cohcier/ww )、戈氏分枝桿菌 (Mycobacterium gordonae ) 、包皮垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegamatis ) 、蘿 _ 分枝桿菌 krrae)及其類似分枝桿菌。可使用之原 生動物之實例可包括梨形鞭毛蟲（Gkrdk )、微 小隱孢子蟲（〇乂piosporz·山parvwm )及其類似原生動物。 15 200821388 可使用之營養細菌之實例可包括嗜水產氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila )、糞腸球菌（ /aeea/b)、糞鏈球菌（/beca/b)、屎腸球 菌(Enterococcus faecium )、腹鍵球菌(Streptococcus pyrogenes )、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌（ pneumoniae )、嗜肺性退伍軍人桿菌 （Legz·⑽ 网㈣mop/z/M)、甲基桿菌屬、綠膿 桿菌 (Pseudomonas aeruginosa )、褚霍_匕沙、門氏菌 (仏/m⑽e//a )、幽門螺旋桿菌（丑e"c〇imcier )、金黃色葡萄球菌（&叩 aureusj 、表 皮葡萄球菌（ep/ArmzWs )、嗜麥寡養食 單胞菌（户；2〇mo⑽^ )及其類似營養細 菌。諸如嗜熱脂肪芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿 ii、凝結芽孢桿菌、生孢梭菌及其類似物之生物體可用於 測定濕熱滅菌（高壓釜滅菌）之功效，其中嗜熱脂肪芽孢 桿菌尤其適用。 可將諸如營養細菌（vegetative bacteria)、營養細胞 (vegetative cell)及/或其組成部分之可用作測試生物體之微 生物沈和於載體12上且當在一或多種賦形劑存在下沈積 時其歷經乾燥及儲存而存活。賦形劑可定義為可用於使不 %疋貫體穩定之廣泛種類之一般惰性化合物。可使用之賦 形d之子頒包括碳水化合物，例如寡聚醣及多聚醣。此 化口物之-貫例可為海藻糖，其為雙醣。某些生物體組織 中之海藻糖高濃度可允許生物體在缺水狀態下存活。海藻 16 200821388 糖可用於使功能性細胞 在極端# # f 、、1脫水後復活。海藻糖可提供 π U％ i兄條件（例如， 膜及其他大分子結：二T細胞存活所必需之 可包括單…如，二：其他穩定化賦形劑化合物 例如’葡聚糖，、填脂糖、纖維素及 二:二非碳水化合物為主之賦形劑可包括蛋 二：^衝劑、蠟、脂質、油以及其他烴基物質。

± ^ μ r ^ 〖之生物體而接受選擇之模擬 體^二"耆熱脂肪芽孢桿菌）之外，生物指示器π 物。卜二Ί非1我複製因子及/或亞細胞組份或細胞產 在：物質可因其臨床意義或因其作為生物性恐怖攻擊 ::用途而加以使用。此等生物體可包含目前可因天然 或人為修飾而對常規抗生素治療或化學消毒方式具有耐受 ，之困株。前者類型之實例可㈣VRE(耐萬古黴素腸球 囷 ’ vancomycin Resistant 邮㈣⑽⑷、msra (耐二甲 氧苯青黴素金黃色葡萄球菌，Methiciuin ㈣知/_咖纖）、龜分枝桿菌（柳以⑺謂 咖w)及其類似物。由於VRE及mrsa已對治療對策 顯現耐受性（例如’抗生素耐受性）且龜分枝桿菌（説 咖/⑽·）已對一些消毒模式顯現耐受性（例如，戊二經耐 受性），因此可使用此等生物體。 生物指不器30可包含一或多種新出現之生物體，對於 該等新出現之生物體可能尚不存在模擬替代物。此等生物 體可對治療性作用過程或消毒表現出特殊風險或挑戰。此 17 200821388 等生物體之實例可包括朊病毒(prion)。朊病毒本身並非活 生物體，但其作為致病因子之功能可與其結構相關且此結 構/功能關係可用於測定其相對傳純。其他非自主性因子 (例如’病毒）以及亞細胞元件及蛋白質類朊病毒亦可用 作生物指示器30。 可藉由製備包含測試生物體之水性懸浮液或分散液， 用測試生物體接種載體12。水性懸浮液或分散液可包含（例 如）=(例如）約105至約ι〇10菌落形成單位（他）/毫 升=範圍内’且在-具體實例中在約1()7至約1()9也㈤ :二圍内之濃度的細菌孢子。可將懸浮液或分散液之一等 :忒板置放於載體12 ±。舉例而言，可製備枯草芽孢桿 ^ ^抱子於水中《懸浮液或分散液以得到每份 等分試樣所需數目之抱子用於接種載冑12。可使孢子在載 V可使用空氣流乾燥支撐體上之孢子，諸如藉由 將載體置放於層流罩中來加速乾燥過程。乾燥載體上孢子 之^法可包括藉由靜置孢子來使其風乾，將孢子置放於含 有諸士氯化鈣之乾燥劑之乾燥器中、將孢子置放於層流罩 中及^類似方法。由載M 12承載之菌落形成單位之數目 可在母平方毫米支撐體約1〇4至約1〇7菌落形成單位 (CfU/mm2)之範圍内，且在一具體實例中在約1〇5至約1〇6 cfu/mm2之範圍内。 可藉由使滅菌指示器、10、經歷與追求無菌條件之物件相 ^的，菌質及處理來使用滅菌指示器。可施加熱量及/或 可使氣體、液體、蒸汽或化學及/或物理試劑進入生物指示 18 200821388 器」〇所安置之區域’藉此使生物指示器3〇暴露 〜

滅囷之物件相同之滅菌方法或試劑。滅菌之後，可仃 基與生物指示器30接觸。培養基可稱為生長培養基。= 養基可為固體或液體之形式。培養基可包含緩衝水容液、 但所揭示之技術之一優點在於培養基之緩衝能力可降低至 使生物指示器可對ρΗ值偏移、氧化還原電位、酶活性及 其類似因素更為敏感。可使用藉以使生物指示器與培養其 在允許測試生物體（若其仍存在）生長之條件下接觸的^ 何程序。培養基可以粉末或錠劑形式存在於滅菌冑中，且 在滅菌之後，可添加無菌水以使生物指示器與水性择 接觸。 〇 1 一培養基可包含-或多種營養源。營養源可用以向經歷 滅囷過程之後可能存活之任何測試生物體提供生長能量。 營養源之實例可包括酪蛋白之胰腺消化物、大豆粉之=消 化物、蔗糖、右旋糖、酵母抽出物、L_胱胺酸及其兩者或 兩者以上之混合物。可將在存活測試生物體之存在下改變 顏色或自然狀態之微生物生長指示劑與培養基一起使用。 可將生長指示劑分散或溶解於培養基中且其賦予培養基最 初顏色。生長指示劑亦可在微生物生長時使培養基發2變 色。可使用之生長指示劑包括對pH值敏感性染料指示劑 (諸如，溴百里酚藍、溴甲酚紫、酚紅等或其組合）、氧 化還原染料指示劑（諸如，亞甲基藍等）、酵素基質或其 兩種或更多種之混合物。酵素基質可包含活性與一或多種 可存在於測試生物體中之酵素相關的任何酵素基質。可使 19 200821388 =之酵素基質可包括下文所討論之彼等。此等微生物生長 之使用可回應於微生物生長現象（諸如pH值改變、 氧化還原電位、酶活性以及其他生長指示）產生顏色改變。 培養基可進-步包含一或多冑pH值緩衝劑、一或多種中 和劑、-或多種用於維持滲透平衡之試劑或其兩者或兩者 以上之混合物。pH值緩衝劑可包括K2HP〇4、KH2p〇4、 (NH4)2HP〇4、2,2·雙（羥甲基）_2,2，，2"_ 氮基硫乙醇（2,2_

Bis(hydroxymethyl)-2,2，’，2’’-nitrilothiethanol) ( Bis-Tris)、 1，3-雙[參（經甲基）甲基胺基]丙烷（Bis_Tris丙烷）、4_(2_ 羥乙基）派畊-乙烷磺酸（HEPES)、L胺基_2_(羥曱基^ 丙二醇（Trizma，Tris鹼）、ΛΓ-[參（經甲基）甲基]甘胺酸 (Tricine)、二甘胺酸（Gly-Gly ) 、雙羥乙基）甘 胺酸（Bicine) 、iV-(2·乙醯胺基）亞胺基二乙酸（ADA )、 #-(2-乙醯胺基）_2_胺基乙烧磺酸（aces ) 、1，4-旅啡二乙烧 石黃酸（PIPES)、β-經基-4-嗎淋丙烧磺酸（MOPSO)、#，#-雙（2-羥乙基）-2-胺基乙烷磺酸（BES) 、3-(Ν-嗎啉基)丙烷 磺酸（MOPS) 、2-[(2-羥基-1，1-雙（羥曱基）乙基）胺基）乙 烷磺酸（TES) 、3-(W-雙[2-羥乙基]胺基）-2-羥基丙烷磺 酸（DIPSO) 、4-(N-嗎啉基）丁烷磺酸（MOBS) 、2-羥基-3-[參（羥甲基）甲基胺基]-1-丙烷磺酸（TAPSO) 、4-(2-羥 乙基）哌明羥基丙烷磺酸）水合物（HEPPS0 )、哌啡-1，4-雙（2-羥基丙烧磺酸）二水合物（P〇ps〇 )、4-(2_羥乙基）-1_ 哌畊丙烷磺酸（EPPS ) 、#-〇羥乙基）旅啡-N’-(4_丁烷磺 酸）（HEPBS) 、[(2-羥基-1，1-雙（羥甲基）乙基）胺基]_1·丙 20 200821388 V 烷磺酸（TAPS) 、2-胺基-2-曱基-1，3-丙二醇（AMPD)、 參（羥甲基）甲基-4-胺基丁烷磺酸（TABS) 、N-(l，卜二 甲基-2 -經乙基）-3 -胺基-2 -控基丙烧石黃酸（AMP S Ο )、2 - ($衣 己胺基）乙烷磺酸（CHES) 、3-(環己胺基）-2-羥基-1-丙烷 磺酸（CAPSO) 、2·胺基-2-甲基-1-丙醇（AMP) 、3-(環 ^ 己胺基）-1-丙烷磺酸（CAPS) 、4-(環己胺基）-1-丁烷磺酸 (CABS) 、2-(N-嗎啉基）乙烷磺酸水合物（MES) 、#-(2-乙醯胺基）-2-胺基乙烷磺酸（ACES)及其兩種或更多種之 φ 混合物。中和劑可包括（但不限於）巯乙酸鈉、硫代硫酸 鈉、過氧化氫酶、硫酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、印磷酯、聚山 梨醇酯20、聚山梨醇酯80、碳酸氫鈣及其兩種或更多種 _ 之混合物。用於維持渗透平衡之試劑可包括納鹽、舒鹽、 鎂鹽、錳鹽、鈣鹽、金屬鹽、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、 氯化鐵及其兩種或更多種之混合物。培養基可包含一水性 組成物，該水性組成物包含以下各物：水；每公升水約0·01 至約100公克（g/1)，且在一具體實例中為約〇1至約50 g/1 Φ 之一或多種營養源；約1·0Χίο-5至約10 g/ι，且在一具體 實例中為1.0X10·4至約1.0 g/ι之一或多種微生物生長指示 劑；至多約5000 g/Ι，且在一具體實例中為約〇.〇〇1至約50⑽ g/1，且在一具體實例中為約〇·1至約1〇〇〇 g/1之一或多種 pH值缓衝劑；至多約1〇〇 g/i，且在一具體實例中為約〇 〇1 至約100 g/Ι，且在一具體實例中為約03至約5〇 g/丨之一 或多種中和劑；至多約50 g/Ι，且在一具體實例中為約〇· i 至約50 g/1，且在一具體實例中為約〇·!至約25 g/1之一或 21 200821388 多種用於維持滲透平衡之試劑。 培養基可具有相對較低之缓衝能力，i在約 約-0.070 m〇i H+之範圍内 ^-0.070 m〇l 在八體只例中在約铺至 之乾圍内，且在一呈驊每 約-〇·(Η4㈣Η+之筋心u 〃體貝例中在約铺至 … 圍内。此緩衝能力可藉由調配具有所 才曰不之低緩衝能力夕^立美I ^ 古e一^ 之°養基或猎由用水或其他液體稀釋且 輕力之預調配培養基來提供。在先前技術中， 一般已調配培養基來增強生物體之生長。此可引起生物體 在生長及分Ιέ上消耗較多能量而在排出累積酸性廢物及皇 他代謝所產生之副產物h肖耗較少能^培養基内之缓衝 劑可用以保持培養基呈；^夠中性或驗性以促進酸性副產物 (質子）之跨細胞膜轉運。與所揭示之滅菌指示器一起使 用之培養基可關係到可偵測到生長之迅速程度。藉由使用 在約-0.001 1約_0.010 mol H+之範圍内，且在一具體實例 中在約-G.005 m〇()7 mGl H+之範圍内之降低緩衝能 力心養基可對較小之pH值偏移、氧化還原電位及/或酵 素活性更為敏感。 培養基可包含營養肉湯、D/E中和肉湯、Davis基本培 養基、無菌測試肉湯以及任何以大豆酪蛋白消化物或牛肉 抽出物為主之培養基。此等培養基可包括大豆酪蛋白消化 肉湯之水溶液、流體酼乙酸鹽及右旋糖胰化蛋白（Difc〇 Laboratories，Inc·)。可使用經修飾之無葡萄糖之胰蛋白 酶大豆肉湯基礎。若量測酵素活性，則培養基可包含水、 酵素基質及可選擇之pH值緩衝劑。 22 200821388 可使用之培養基之一實例為Bact〇TM胰蛋白酶大豆肉 湯，其含有駱蛋白之胰腺消化物（17 0 g/1)、大豆粉之酵 素消化物（3.0 g/l )、氯化鈉（5 〇 ^ )、鱗酸氫二鉀（2.5 g/Ι)及右旋糖（2.5 g/Ι)。此等成份可分散或溶解於水中。 以g/Ι表不之濃度係指每公升水中成份之公克數。酪蛋白 之胰腺消化物、大豆粉之酵素消化物及右旋糖向微生物之 生長提供能量來源。此等成份可稱為營養源。氯化鈉可用 以、准持液體培養基中之滲透平衡。磷酸氫二鉀可充當pH 值緩衝劑。舉例而言，可將pH值敏感性染料酚紅（i8mg/i) 添力^至BaCt0™胰蛋白酶大豆肉湯調配物中。染料可用作 由微生物生長所引起之培養基PH值偏移之指示劑。 、,可使用之培養基之另一實例為BBLtm流體酼乙酸鹽培 養基此培養基含有酪蛋白之胰腺消化物（i5G州、酵 母抽出物（5.〇g/1)、右旋糖（5.5g/l)、氯化納（2.5g/l)、 ，Κ 〇·5 g/i )'疏乙g楚鈉（Q 5⑽）及刀天青(u _ )。 :成份可分散或溶解於水。酪蛋白之胰腺消化物 營養2心糖及L•胱胺酸為可向微生物生長提供能量之 :可用、作可用以維持培養基中之滲透平衡。1乙酸 以孰習… 月可用作氧化/還原染料指示劑。可 二此項技術者已知之其他營養源、渗透 伤代替所列舉之成份。 奴成 所揭示之技術之-優點為生物指 較小且因此培育载體12 ^ v七 之尺寸可相對 ^ ^ 上任何存活之測試生物體所恭+ 、 對較小。此可導致可相對較短之择古 23 200821388 因此，在-具體實例中’生物指示器3〇 τ由相對較小之 載體12支撐’載體12具有在約！至約8〇_2之範圍内， 且在-具體實例中在約5至約50 _2之範圍内之表面積。 在滅菌之前，由載體12承載之抱子之數目可在約Μ至約 i w之範圍内，且在一具體實例中在約1〇5至約- 一之範圍内。滅菌之後’培育生物指示器3〇所需之 培養基體積可在約（U至約5 ml之範圍内，且在―具體實

例中在約至約41111之範圍内，且在—具體實例中在約 °，1至約3 ml之範圍内，且在-具體實例中在約(M至約2ml 之範圍内，且在一具體實例中在約〇1至約i 5mi之範圍 内，且在一具體實例中在約〇_3至約Η之範圍内。滅菌 之後，培育生物指示器3〇所需之時間可在約Η至約Μ 之範圍内，且在—具體實例中在約〇1至約％小時之 =内’且在-具體實例中在約W至約2μ、時之範圍内， 且在—具體實例中在約0」至約18 =實例中在…約—圍 ==至約12小時之範圍内，且在-具體實例中：

至約·8 /小時之範圍内，且在-具體實例中在約(U 小日之^^範圍内’且在—具體實例中在約^至約6 t之犯圍内，且在一具體實例中在約 乾圍内，且在—且俨每抝由+从 主、、0 5小日守之 可用至約4小時之範圍内。 外b 3G之酵素可包含任㈣素，包括胞 卜酵素或胞内酵素，其活性 枯先 活力相關。「愈_ ▲ 種剩試生物體之存 …·.相關」思謂高於背景值之酵素活性可用 24 200821388 以預測測試生物# 體具有亞致純料可為在料測試生物 在所需時fm ㈣後仍具有足夠活性與酵素基質 二：广間段内（例如約4至'約164小時 例中為約4至約μ , 士、 — /、體貝 七u 、 小％)反應，而在對於測試生物體且 有致死性之滅菌後失活或活性略微降低之酵素。

^下測試可用於鏗別具有適用作生物指示器3G所必須 之彼等酵素。當酵素經歷恰足以將約“I則生 :體之群體減少約6、（亦即，減少至如由缺乏測試^ =生㈣所量測之_ Q之群體）之滅菌條件時，酶可具有 寺於如藉由與酵素基質反應所量測之「背景值」之殘餘酵 素活性，然而，在酵素經歷僅足以將約1χΐ〇6測試生物體 之群體減小至少約"。g但小於約“。g之滅菌條件時，酵 素可具有大於如藉由與酵素基質反應所量測之「背景值」 酵素活〖生。酵素基質可為一種物質或物質之混合物，其 在又到酵素作用時產生可偵測（例如，螢光或有色）之酵 素伶飾產物。酵素活性可由可偵測之所產生酵素修飾產物 之置來量測。酵素可為在不足以將測試生物體之群體減小 約6 log之滅菌條件後具有足夠活性在約〇. i至約48小時 之範圍内’且在一具體實例中在約0 · 1至約12小時之範圍 内’且在一具體實例中在約〇 · 1至約4小時之範圍内之時 間段中與酵素基質反應且產生可偵測量之酵素修飾產物的 酵素。 在不足以將微生物群體減小約6 log之滅菌條件後， 生物指示器30之活性可比背景值大至少約2%，且在一具 25 200821388 體只例令比背景值大至少約5% 景值大至少約聰義為「背^在-具體實例中比背 平可高於在酵素已失活後由酵：二：殘餘酵素活性水 成之酵素活性水平。 ’、土貝t轉化成產物所達 可用於生物指示器3〇中 自报忐Λ工—π 素可包括（但不限於）來 V成I子之微生物之水解酵素。 擗忐灼工> ，、此荨酵素可包括衍生自 形成孢子之微生物（諸如念珠 M a ,,. 蜀牙孢桿囷屬或梭菌屬 種破生物）之β-D-葡糖苷酶、a_D , 葡糖普酶、驗性磷酸酶、 酉欠性％酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯 轉月日肪酶、十四烷酸脂肪 _、白胺酸胺基肽酶、纖胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白酶、 %酸水解酶、a_D•半乳㈣酶、㈣半乳糖㈣、‘阿 拉伯咬喃糖㈣、Ν·乙醯基_β_胺基葡㈣酶、P_D_纖維二 糖㈣、丙胺酸胺基肽酶、脯胺酸胺基肽酶、㈣酸胺基 肽酶、苯丙胺酸胺基肽酶H葡糖㈣㈣及脂肪酸醋 酶0 可使用之來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌之酵素可包括a_D· 葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁 酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、白胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白 酶、磷酸水解酶、a-D-半乳糖苷酶、卜D_半乳糖苷酶、丙 胺酸胺基肽酶、酪胺酸胺基肽酶及苯丙胺酸胺基肽酶及脂 肪酸I旨酶。可使用之來自枯草芽孢桿菌之酵素包括心^阿 拉伯呋喃糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、N_乙醯基-β_胺基葡糖苷 酶、β-D-纖維二糖苷酶、丙胺酸胺基肽酶、脯胺酸胺基肽 酶、酪胺酸胺基肽酶、白胺酸胺基肽酶及苯丙胺酸胺基肽 26 200821388

▲ 1 草芽孢桿菌之β-D-葡糖苷酶及α-L-阿拉伯呋喃 ，苦酶可=於“環氧^之滅菌。纟自嗜熱脂肪芽抱桿 囷之α-D’糖苷酶可用以監測蒸汽滅菌狀態。

酵素基貝可為一種物質或物質之混合物，其在受到酵 ，作^ %轉^成酵素修飾產物。_般而言，酵素修飾產物 :為：光、螢光、冑色或放射性物質。然而，酵素基質亦 可包3或多種當受到酵素作用時可產生與額外化合物或 口物反應以產生發光、螢光、有色或放射性物質之產物 的化口物。*在滅菌期間生物指示器30中包括酵素基質 日守，酵素基質不應在滅g或培育期間自發分解或轉變成可 :貞測之產物。舉例而言’在用以監測蒸汽及乾熱滅菌之滅 菌才曰不⑽中’酵素基質在約2Q〇c與約.⑽。C之間的溫度下 應係穩定的。在—起包括酵素基質與習知培養基之情況 下，酵素基質在培養基中應係穩定的，例如在培養基中不 自發螢光。 存在兩種基本類型之可用於偵侧特定酵素之酵素基 質。第一種類型之酵素基質可為螢光或發色的，且可以諸 如AB之化學式給出。當受到酵素作用時，ab可分解成 A+B。舉例而言，B可為螢光或有色的。此類型之螢光基 質之一特定實例可為4-甲基傘形酮磷酸酯。在酶磷酸酶存 在下，此基質可分解成4-甲基傘形酮及磷酸酯。此類型之 其他螢光基質可包括4-曱基傘形酮基、試^靈及螢光素之 知生物。此類型之發色基質之一實例可為5_溴_4_氯_3_0引 27 200821388 哚磷酸酯。在磷酸酶存在下，此基質可分解成靛藍及磷酸 酯。此類型之其他發色基質可包括吲羥、硝基酚及酚酞之 衍生物，其中發色吲羥基質可分解且藉由AB之以下化學 反應產生比色反應。當隨後受到適當酵素作用時，Ab可 分解成A+B。接著當出現BB時，可獲得顏色。

第二種類型之酵素基質可以化學式CD給出，舉例而 言，其可由特異性酵素轉化成C+D。然而，c或D皆非螢 光或有色的，但D能夠進一步與化合物z反應而產生螢光 或有色化合物，由此指示酵素活性。此類型之一特定螢光 實例可為胺基酸離胺酸。在酶離胺酸脫羧酶存在下，離胺 酸可失去c〇2分子。離胺酸之剩餘部分可則被稱作屍胺， 其具有強驗性。可併入諸如4·甲基傘形嗣之驗性指示劑且 其可在強鹼存在下發出螢光。此類型之發色基質可為萘 基磷酸酷。酶磷酸酶可與此酵素基質反應以產生卜萘酚T ，釋，之β-萘齡可與含冑i•重氮基_4_节酿胺基_2,5_二乙 氧基苯之發色試劑反應而產生紫色。 么酵素基質可為螢光化合物，螢光化合物在本文中定義 ^匕夠（例如）藉由水解經酵素修飾而產生具有明顯改良 或增加之螢光之衍生螢光體的化合物。 螢光化σ物本身可為非螢光性的或變性螢光性的 庫Π:—)(亦即，例如在顏色或強度方面與相 飾產物相比以截然不同之方式發出榮光）且可使 虚可妒Ο, e 酵素修飾所產生之螢光信號 了此存在之任何其他螢光分離。 28 200821388 可使用針對天然存在或合成來源之多樣化來源之酵素 的許多種酵素基質。此等酵素基質可包括螢光性4_甲美傘 形酮基衍生物（可水解成4_甲基傘形酮）；7_醯胺基 基-香立素之衍生物；二乙醯基螢光素衍生物；及螢胺。 可用作酵素基質之4-曱基傘形酮基之衍生物可包括： 4-甲基傘形酮基-2-乙醯胺基-4,6-0-亞节基_2_去氧哌 喃葡糖苷、4-甲基傘形酮乙酸酯、4_甲基傘形酮基乙醯 基-β-D-胺基半乳糖苷、4_曱基傘形酮基_N_乙醯基 基葡糖苷、4-甲基傘形酮基乙醯基胺基葡糖苷、 2 -(4-曱基傘形酮基）_a-D-N_乙醯基神經胺糖酸、甲基傘 形酮基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷、扣甲基傘形酮基_a_L_阿拉伯 糖苷、4-甲基傘形酮丁酸酯、4_甲基傘形酮基纖維二 糖苷、曱基傘形酮基-β-D-N’N、二乙醯基幾丁二糖苷、‘甲 基芈形酮反油酸酯、4-曱基傘形酮基_p_D_岩藻糖苷、仁曱 基傘形酮基-a_L·岩藻糖苷、4-甲基傘形酮基岩藻糖 苷、‘曱基傘形酮基_a_D_半乳糖苷、扣曱基傘形§同基_p_D_ 半礼糖苷、4-甲基傘形酮基-a_D_葡糖苷、4_甲基傘形酮基_ β - Εκ葡糖苷、4_甲基傘形酮基葡糠苷酸、4·甲基傘形 酉同對胍基苯甲酸酯、4-曱基傘形酮庚酸酯、4_甲基傘形酮 基哌喃甘露糖苷、4_曱基傘形酮基-p_D_哌喃甘露糠 苷‘甲基傘形酮油酸酯、4-曱基傘形酮棕櫊酸酯、4_甲 基傘形酮磷酸酯、4·甲基傘形酮丙酸酯、扣曱基傘形酮硬 月曰酸酯、‘甲基傘形酮硫酸酯、4-甲基傘形酮基-β-D-n，n’，n'三乙醯基幾丁三糖、4、甲基傘形酮基_2,3,5-三_爲_ 29 200821388 苄醯基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基傘形酮基三甲基肉 桂酸氯化銨及4-曱基傘形酮基-β—D-木糖：g：。 可用作酵素基質之7-醯胺基-4-甲基香豆素之衍生物可 包括·· L-丙胺酸醯胺基-4_甲基香豆素、L_脯胺酸_7_醯 胺基-4-甲基香豆素、L_酪胺酸-7_醯胺基·4_甲基香豆素、L_ 白胺酸-7-醯胺基-4_甲基香豆素、^苯丙胺酸_7_醯胺基_4_ 甲基香豆素及7-戊二醯基-苯丙胺酸_7_醯胺基甲基香豆 素。 " 可用作酵素基質之7-醯胺基-4-甲基香豆素之肽衍生物 可包括：N-t-BOC_Ile-Glu-Gly-Arg 7-醯胺基-4-曱基香豆 素、N+BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7_醯胺基 _4_曱基香豆素、 N CBZ-Phe-Arg 7-醯胺基-4-甲基香豆素、Pr〇_phe-Arg 7_酿 胺基4曱基香豆素、N_t-B〇c_Val_Pr〇_Arg 7_醯胺基-4_甲 基曰五素及N-戊二醯基_Gly_Arg 醯胺基_4_曱基香豆素。 可用作酵素基質之二乙醯基榮光素之衍生物可包括二 -欠螢光素、螢光素二（β-Ε)-哌喃半乳糖苷）及二月桂酸螢 光素。 活眭待偵側之酵素為葡糖苷酶、胰凝乳蛋 ^ Θ肪1夂S曰酶（例如來自嗜熱月旨肪芽抱桿菌）之情況 可使用之榮光酵素基質可分別為4_甲基傘形酮基_a_D_ ^戊二醯基苯丙胺酸·7·醯胺基·4_甲基香豆素或4- 牟形酮庚酸|旨。在活松 ^ ^ , 隹舌14待偵側之酵素為a-L-阿拉伯呋 音_ (例如衍生自枯草芽 光酵素基質可為4ΨΑ1)之情況下，可使用 .、、、甲基半形酮基-an可拉伯呋喃糖苷 30 200821388 活性待彳貞侧之酵 桿菌）之情況下 酮基-β-D-葡糖:y： 素為β-D-葡糖苷酶（例如衍生自枯草芽孢 了使用之螢光酵素基質可為4 -甲基傘形

可使用之酵素基質 色團或產生與另 可為能 一類似或不同 夠經酵素修飾而產生衍生 種類之化合物反應以產生 生毛色團之產物的發色化合物，該發色團具有不同或更 ▲色^色化合物可為無色的或（例如）在顏色或強 方面與相應酵素修飾產物相比以截然不同之方式帶色。 等變化可由眼睛辨別或需要使㈣測顏色之儀器。可以 發衍強 度 此 比 色儀器使用者所孰知之古斗、# m ώ丄 叮“、、夭之方式使用適當之激勵及偵侧波長將 由酵素修飾所產生之右$ & 之有色化唬與可能存在之任何其他顏色分離。 〃可使用之可用作酵素基質之發色化合物可包括5-溴-4- 氯-3-㈣基衍生物、硝基苯基衍生物、犧衍生物及齡敝 衍生物。 可使用之5-溴-4_氯-3+朵基之衍生物可包括5_溴_6_ 氯i叫丨哚乙酸酯、5_溴_4|3、丨哚乙酸酯、5•溴_4_氯_3_ =羥+D-哌喃半乳糖苷、5_演_4_氯_3_〇引哚基-υ-二乙酸 酯、5-溴-4-氯-3-叫丨哚基_卩_0_哌喃岩藻糖苷、5_溴_4_氯_3_ 引木基-β-D-l喃葡糖苦、5_溴+氯-3一。引哚基_卜d_葡糖醛 酸、5-溴-4-氯-3-叫|哚磷酸酯及5_溴·4_氯_3•叫丨哚硫酸酯。 可使用之硝基苯基之衍生物可包括對硝基酚及鄰硝基 酚衍生物。此等硝基苯基衍生物包括磷酸二乙基_對硝基苯 酯、磷酸二-對硝基苯酯、對硝基苯基_2_乙醯胺基_2_去氧_ 31 200821388 3-Ο-β-哌喃半乳糖基_β_哌喃葡糖苷、對硝基苯基_2_乙醯胺 基-2-去氧-β-哌喃葡糖苷、乙酸對硝基苯酯、對硝基苯基_ Ν-乙醯基-β-D-胺基葡糖苷、對硝基苯基二乙醯 _ 基幾丁二糖苷、對硝基苯基-α-哌喃葡糖苷、對硝基苯基_α_ . 麥芽糖苷、對硝基苯基-β-麥芽糖苷、對硝基苯基_α_哌喃 甘露糖苷、對硝基苯基_β_哌喃甘露糖苷、十四烷酸對硝基 笨酯、棕櫚酸對硝基苯酯、鱗酸對硝基苯酯、雙（對硝基苯 基）磷酸酯、參（對硝基苯基)磷酸酯、對硝基苯基_β_哌喃葡 _ 糖苷、對硝基苯基葡糖苷酸、α-對硝基苯基甘油、對硝 基苯基-(X-哌喃鼠李糖苷、硬脂酸對硝基苯酯、硫酸對硝基 苯S旨、對硝基苯基_2,3,4,6-四-0-乙醯基邛_胺基葡糖普、對 ^ 墙基苯基胸苷單磷酸酯、對硝基苯基-2,3,4-三-Ο-乙醯基-β-葡糖醛酸曱酯及戊酸對硝基苯酯。 適用之鄰硝基酚可包括乙酸鄰硝基苯酯、鄰硝基苯基_ β-葡糖苷及鄰硝基苯基-β-D-哌喃葡糖苷。其他適用之硝基 苯基衍生物可包括硝基苯基-β-哌喃岩藻糖苷、硝基苯基 _ 旅喃半乳糖苷、硝基苯基-β-哌喃半乳糖苷、丁酸硝基苯酯、 癸酸硝基苯酯、己酸硝基苯酯、辛酸硝基苯酯、月桂酸硝 基笨及丙酸確基苯醋。 可使用之吲羥衍生物可包括吲經-乙酸酯、吲經β-D-葡糖苷、3 -吲經硫酸酯及3 -吲經碟酸酯。 可使用之酚酞衍生物可包括··酚酞二丁酸酯、酚酞二 磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡糖醛酸、酚酞單-β_葡糠苷 酸、酚酞單-β_葡糖醛酸及酚酞單磷酸酯。 32 200821388 色團 上述叙色酵素基質可與適當之酵素直接反應而產生發 〇 右使何生酵素修飾產物進一步與諸如重氮化染料之發 色忒d反應以產生發色團，則可使用含有1_萘基、萘基 及不基AS ^BI个丁生物之其他酵素基質，該等重氣化染料例 如為1-重氮基-4-苄醯胺基_2,5·二乙氧基苯、i重氮基冰 ㈣胺基_2,5·二乙氧基苯、對重氮基·2,5.二乙氧基善节 δ皿基丙胺酉夂、4_虱甲基苯氯化重氮及鄰胺基偶氮甲苯重 氮鹽。 =用^ r萘基之衍生物可包括卜萘基_n•乙酸基令 D-胺基匍糖普。 可使用之2-奈基之衍生物 J匕括奈基·磷酸酯、2-萘 基-丁酸酯、2-萘基_辛酸酯、 ^ Α ί ^ ^ /下、土-十四燒酸酯、L·白胺 fe基-2-奈基胺、L_纈胺醯基·2_芡 笑苴於^ x /下基月女、L-胱胺醯基-2- 奈仏胺、…基_DL•精胺酸_2-蔡 -苯丙胺酸-2-萘基-胺、2_萘基_磷酸醋 *戊一 &基 哌喃半乳糖苷、2-萃基-β D r 土 · 卜2-奈基-a-D· -*㈣口辰喃半乳糖芽、2 。南葡糖普、6-漠-2•萘紛H底读葡糖 =_美二 ^南甘露料及2_萘基W南岩藻糖苦/奈基^ 可使用之萘基-AS-ΒΙ之衍生物可包括 酸酯及萘基-AS-BI-P-D_葡糖苷酸。 矛、土 -AS-ΒΙ-磷 在活性待偵侧之酵素為二 脂肪芽孢桿菌）之情況下，酵 。啤（例如來自嗜熱 喃葡糖苷。在活性待偵側二土貝可為對硝基苯基+哌 …為α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 33 200821388 (例如衍生自枯草芽孢桿菌）之情況下，可使用之酵素基 質可為對墙基苯基-ex-L -阿拉伯咬喃糖苷。在活性待彳貞側之 酵素為β-D-葡糖苷酶（例如衍生自枯草芽孢桿菌）之情況 下，可使用之酵素基質可為對硝基苯基-β-D-哌喃葡糖苷。 在活性待偵側之酵素為β-半乳糖苷酶之情況下，酵素基質 可為5-溴-4-氯-3_吲哚基-β_ϋ-哌喃半乳糖苷。在活性待偵 侧之酵素為β-半乳糖苷酶之情況下，酵素基質可為4-甲基 傘形_ 喃半乳糖苷。 可使用之酵素基質可視活性接受研究之酵素之身份而 定。以下為多種酵素基質及可與該基質反應以產生具有明 顯改良或增加之螢光或顏色之產物的相應酵素之清單。

酵素基質 酵素 4-甲基傘形酮乙酸酯 酯酶 4-曱基傘形酮丁酸酯 酯酶 4-曱基傘形酮反油酸酯 脂肪酶 4-甲基傘形酮基-β-D-哌喃半乳糖苷 β-D-半乳糖苷酶 4-甲基傘形酮基-α-D-旅喃半乳糖苷 a-D-半乳糖苷酶 4-甲基傘形酮基-a-D-派喃葡糖苷 a-D-葡糖苷酶 4-甲基傘形酮基-β-D-哌喃葡糖苷 β-D-葡糖苷酶 4-曱基傘形酮庚酸酯 酯酶 4-甲基傘形酮油酸酯 脂肪酶 4-甲基傘形酮磷酸酯 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 4-甲基傘形酮丙酸酯 酷酶 34

200821388 4-甲基伞形嗣基-β-D-半乳糖普 4-甲基伞形嗣基-β-D-匍糖苦 4-甲基傘形酮基-α-D-葡糖苷 4-甲基傘形酮基-a-L-阿拉伯吱味糖苷 L-白胺酸_7_醯胺基-4-甲基香豆素 7-戊二醯基-苯丙胺酸-7-醯胺基-4-曱基香豆素 D-蜜二糖 磷酸對硝基苯酯 乙酸對硝基苯酯 鄰石肖基苯基-β-D-旅喃半乳糖苦 對石肖基苯基-a-D-。底喃半乳糖苦 鄰硝基苯基-β-D-哌喃葡糖苷 對硝基苯基-a-D-哌喃葡糖苷 對墙基苯基-β-D-匍糖苦酸 對硝基苯基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷 月桂酸對硝> 基苯酯 十四烧酸對确基苯酯 棕櫚酸對硝基苯酯 磷酸對硝基苯酯二鈉鹽 酚酞二丁酸酯 酚酞二磷酸酯 酚酞二磷酸酯五鈉鹽 酚酞-β-D-葡糖苷酸鈉鹽 酚酞-β-D-葡糖苷酸 β-D-半乳糖苷酶 β-D-葡糖苷酶 葡糖苷酶 a-L-阿拉伯咬喃糖苷酶 白胺酸胺基肽酶 胰凝乳蛋白酶 a-D-半乳糖苷酶 鹼性磷酸酶或酸性磷酸酶 脂肪酶 β-D-半乳糖苷酶 a-D-半乳糖苷酶 β-D-葡糖苷酶 a-D-葡糖苷酶 β-D-葡糖酸酸苷酶 a_L-阿拉伯吱喃糖苷酶 酯酶 酉旨酶 酯酶 驗性磷酸酶 酯酶 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 β-D-葡糖酸酸苦酶 β-D-葡糖盤酸皆酶 35 200821388 L -苯丙胺酸乙酯鹽酸鹽 胰凝乳蛋白酶 苯基-β-D-哌喃半乳糖苷 β-D-半乳糖苷酶 苯基-β-D-葡糖苦酸 β-D-葡糖酸酸苷酶 苯基-β-D-派喃葡糖苷 β-D-葡糖苷酶 苯基-β-D-葡糖苷酸 β-D-葡糖盤酸苷酶 苯基-α-D-葡糖苷 a-D-葡糖苷酶 β-甘油鱗酸納 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 1-奈基石粦酸納 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 2-萘基磷酸鈉 酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶 2-萘基-丁酸酯 酯酶 β-萘基乙酸酯 脂肪酶 6-Br-2-萘基-β-D-葡糖苷 β-D-葡糖苷酶 L-白胺醯基-2-萘基醯胺胺基肽酶 白胺酸 L-顯胺酿基-2-奈基酿胺胺基狀酶 纈胺酸 N-戍二酿基-苯丙胺酸-2-奈基胺 胰凝乳蛋白酶 萘基-AS-ΒΙ-磷酸酯 磷酸水解酶 吲羥乙酸酯 脂肪酶 N-曱基吲羥乙酸酯 脂肪酶 N-甲基吲羥十四烷酸酯 脂肪酶 5-溴吲羥乙酸酯 脂肪酶 3-吲羥磷酸酯 酸性填酸酶或驗性填酸酶 吲羥-β-D-葡糖苷 ' β-D-葡糖苷酶 5-Br-4-Cl-3-吲哚乙酸酯 脂肪酶 5-Br-4-Cl-3-吲哚磷酸酯 鹼性磷酸酶或酸性磷酸酶 36 200821388 β-D-葡糖駿酸苦酶 脂肪酶/S旨酶 5-ΒΓ-Φα-3,哚基-β-D-葡糖醛酸 二乙醯基螢光素 已完成滅菌方法後，可使其上具有可在經歷滅菌方法 後存活之任何酵素的載體12與含有合適之酵素基質之水 性培養基或水溶液或半固體或固體接觸或置放於其中或其 上。水性培養基或水溶液可經緩衝。所揭示之技術之一優 點在於安置於载Μ 12上之酵素的量可相對較小，且因此 偵測經歷滅菌之後可能存活之任何酵素所需的酵素基質之 量可相對較小。此可導致可相對較短之偵測時期◊載體 可具有在約1至約80 mm2之範圍内，且在一具體實例中 在約5至約50 mm2之範圍内之表面積。在滅菌之前，由 載體12承載之酵素單位可在肖1〇.7至❾ι〇6單位/平方毫 米之範圍内，且在一具體實例中在約1〇·4至約〖Μ單位/平 方毫米之範圍内。酵素與其合適之酵素基f可在水性培養 基或水溶液中彼此接觸。可使用等張緩衝液，諸如磷酸鹽 級衝生理食鹽水溶液、參（經甲基）胺基甲烧-鹽酸溶液或乙 酸鹽緩衝液。此等等張緩衝液可與大多數螢光及發色酵素 基貝相#、擇緩衝液時之另__考慮因素為緩衝液對酵素 活!·生之衫響。舉例而言’磷酸鹽緩衝生理食鹽水含有高濃 度之，’’、機知I鹽’其為驗性碟酸酶之強競爭性抑制劑。對 於此酵素而言，可使用⑴^识^緩衝液。 經緩衝水溶液中之酵素基質之濃度可視酵素基質及酵 素之身份、須產生以便可目視或藉由儀器摘侧之酵素修飾 37 200821388 產^之！及判定反應混合物中是否存在活性酵素所需之時 門里而疋可為充足之酵素基質之量可為與可在已完成滅 菌後存在之任何活性酵素反應以致可在至多約4小時或更 v之日守間長内產生至少約1χΐ()_8莫耳之莫耳濃度之酵素修 飾產物所需之量。在酵素基質為4_甲基傘形嗣基衍生物之 情況下1在經緩衝水溶液中之濃度可在肖ΐχΐ〇.5至約 1Χ10·3莫耳之範圍内。

可將含有酵素基質之經緩衝水溶液之PH值調整至在 約5至約9.5之範圍内，且在一具體實例中為約7 5之pH 值，以防止某些鹼性螢光基質自發螢光。 在已使酵素經歷滅菌循環後，可將經緩衝水溶液中之 =質與：性編之酵素一起培育。培育可持續足以 s可偵侧罝之酵素修飾產物之時間段且在足以釋放可偵 側量之酵素修飾產物之條件下進行，纟中假定任—種辛 均保持活性。—般而言，可仙之產物之量可低達約卜心 莫耳。培育條件應足以產生至少約1χ1()_8莫耳之酵素 產物，且在一具體實例中產生約1X10-6至約lx10-5莫耳 酵素修飾產物。產生引貞側量之酵素修飾產物所需之2 時間及溫度可視酵素及酵素基質之身份及其各者二 緩衝水溶液中之：詹洚而A &二 ；、邊 夜中之/辰度而疋。-般而言，戶斤需培育時 至多約48小時，且在一具體實例中為至多約％小萨·、、、 培育溫度可在約2(rc至約7屹之範圍内。培育時間；在, 〇·1至約48小時之範圍内’且在一具體實例中在約"約 約36小時之範圍内，且在一具體實例中在約〇 .至 主約24 38 200821388 小時之範圍内’且在-具體實例中在約o.i至約12小時之 範圍内，且在一具體實例中在約〇ι至約“、時之， 且在Γ具體實例中在約至約4小時之範_，且在-u中在、、’勺(u至約3小時之範圍内。在枯草芽孢 菌或嗜熱脂肪芽孢桿g為酵素來源之情況下，培育時間可 在約°.1。至約3小時之範圍内，且培育溫度可分別在約30〇c 至約40°C之範圍岐在約抓至約价之範圍内。

可使用之用於偵側酵素修飾產物之一般適用方法可包 括光度敎、電位測定、重量測[熱量敎、電導測定 或電流敎技術。在—具體實例中，可使用螢光法或分光 光度法。舉例而言，特定酵素基質可包含4-甲基傘形酮基 衍生物，其與酵素相互作用後產生可以螢光法監控之傘形 酮；或基質可包含硝基酚或類似類型之衍生物，其與酵素 相互作用後產生可以比色法監測之產物。 儘管生物指示器3〇在本文中主要根據單一酵素及/或 測試生物體來描述，但該生物指示器3G彳包含複數種酵 素及/或測試生物體或其組合。舉例而言，生物指示器Μ 可含有4種類型之酵素（其可衍生自三種類型之微生物）， 一種酵素具有耐熱性，第二種對氣體滅菌介質具有耐受 性，第三種對輻射（例如γ或β照射）具有耐受性，及第 四種對基於流體之介質（例如過氧乙酸、穩定過氧化氫、 氯胺、四級胺、酚、臭氧水或戊二醛等）具有耐受性。類 似地’生物指示器3〇可含有三種測試生物體種，一種物 種具有耐熱性，第二種物種對氣體滅菌介質具有耐受性， 39 200821388 及第三種物種對輻射具有耐受性，及第四種對基於流體之 介負具有耐受性。 實例 將一張Ahlstrom 238紙（由Ahlstr〇m供給之紙製品） 剪成六個圓形支撐圓盤，各自具有6mm之直徑（ 28 3Im2 之表面積）。將三個圓盤在一側上用7微升之具有大於1Μ cfu/ml之密數的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子懸浮液接種。'三個

圓盤不進行接種。將各圓盤音波熔接至具有乃瓜㈤“ 5 mm之尺寸的永笨乙烯支撐條帶。對於各圓盤而 吕，使熔接角與載體條帶之一侧接觸，同時將圓盤置放成 與載體條帶之另一側接觸。對於進行接種之圓盤而言，將 不含孢子之圓盤之側置放成與支撐條帶接觸。音波處理 後以如上所述之相同方式將三個未經接種之圓盤接種。 圖4展不此等測試之結果。此等測試證明由於音波熔接而 無頒者微生物離失。 實例2 將實例1中所述類型之滅菌指示器樣品用106 cfu/ml 之嗜熱脂肪芽孢桿菌接種，且暴露於不同體積及緩衝能力 養基樣πσ。監測隨微生物生長變化之樣品pH值改變。 培養基樣品如下： 樣ασ A ·具有全緩衝能力之1 · 〇 mi含龄紅之胰蛋白酶 大豆肉湯（TSB)。 樣B •具有50%全緩衝能力之0.5 ml含酚紅之TSB 及0.5 ml無菌去離子（m)水。 40 200821388 樣品C :具有80%全緩衝能力之0.4 ml含酚紅之TSB 及0.1 ml無菌DI水。 樣品D :具有60%全缓衝能力之〇·3 ml含酚紅之TSB 及0.2 ml無菌DI水。 樣品E :具有40%全緩衝能力之〇·2 ml含紛紅之TSB 及0.3 ml無菌DI水。 結果展示於圖5中。此等結果表明較小培養基體積及 降低之缓衝能力展示出快於較大培養基體積之微生物生 雖然已結合特定具體實例說明所揭示之技術，但應瞭 解熟習此項技術者在閱讀本說明書後將清楚瞭解其各種修 改。因此，應瞭解本文中所揭示之本發明意欲涵蓋在所附 申請專利範圍之範疇内的此等修改。 【圖式簡單說明】 在附圖中，相同部件及特徵具有相同參考符號。 圖1為所揭示之滅菌指示器之一具體實例之圖解說明 之平面圖。 _圖2為圖1所描述之滅菌指示器之側面正視圖之圖解 效用之裝置之分解圖說明，該裝 菌指示器係安置於一隔室中且培 圖3為用於測定滅菌 置含有兩個隔室，前述滅 養基係安置於另一隔室中 圖4為實例1 _ 、 斤揭示之滅菌指示器之樣品的可回故 孢子之緣圖，★玄έ备同主 w、、、曰圖表明與音波處理之前相比在音波處理 41 200821388 之後存活孢子數無顯著差異。 圖5為如實例2所揭示pH值隨暴露於不同體積及缓 衝能力之培養基的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子 _ stearothermophi丨us)之主長變化之繪圖。 【主要元袢符號說明】 10 :滅菌指示器 12 :載體 14 :第一表面 ⑩ 16 :第二表面 20 :支撐體 · " 22 :第一部分 - 24 :第二部分 30 :生物指示器 40 :套組 42 :楔形管 43 :環隙 ® 44 :内部隔室 ’ 46 :封帽 48 :突出物 42

Claims (1)

1. 200821388 十、申請專利範圍： 1 · 種滅囷指不|§，其包含： 一載體’該載體具有第一表面及第二表面； 一支撐體，該支撐體具有第一部分及第二部分，該載 體上覆於該支撐體之第一部分上，該載體之第二表面附著 於該支撐體之第一部分；及 一由該載體支撐之生物指示器，該支撐體之第二部分

   具有足夠尺寸以允許在不接觸該生物指示器之情況下操作 該滅菌指示器。 2·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 之第一表面具有在約1至約8〇 mm2之範圍内的表面積。 3 ·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 包含多孔材料或無孔材料。 4·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 包含紙張、金屬、玻璃、陶瓷、塑膠、膜或其兩種或更多 種之組合。 如甲睛專利範圍第 包含壓縮纖維。 6·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 包含由燒結玻璃、玻璃纖維、陶瓷、合成聚合物或其兩種 或更多種之組合製成之多孔材料。 7·如申請專利範圍第丨項之滅菌指示器，其中該 包含紙張。 人 一 8·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 43 200821388 包含一纖維素襯墊。 1項之滅菌指示器，其中該載體 長方形、橢圓形或稜柱形橫截面 1項之滅菌指示器，其中該支撐 陶資*、塑膠或其兩種或更多種之 9·如申請專利範圍第 為一具有圓形、正方形、 之形狀之基板之形式。 10.如申請專利範圍第 體係由包含金屬、玻璃、 組合之材料製成。

   11·如申請專利範圍第 體係由塑膠製成。 1項之滅菌指示器，其中該支撐 12·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該支撐 體係由聚苯乙烯製成。 13 ·如中4專利圍第i項之滅菌指示器，其中該支撐 體為一具有一長度之長方形條帶之形式，該支撐體之第一 邛勿包含该支撐體之長度之次要部分，該支撐體之第二部 分包含該支撐體之長度之主要部分。 14·如申請專利範圍第丨項之滅菌指示器，其中該載體 係使用音波熔接（sonic welding)、黏著劑、熱封或層壓被 附著於該支撐體。 1 5 ·如申请專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含一或多種測試生物體、一或多種酵素或其混合 物0 16.如申請專利範圍第}項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含細菌。 17·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 44 200821388 指示器包含細菌抱子。 18·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示1§包含芽孢桿菌（召ae///似）或梭菌（)屬 之細菌。 19·如申請專利範圍第！項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含嗜熱脂肪芽孢桿菌（ stearothermophilus、、萎綠等扼得儀 Q Bacillus atrophaeus)、 枯草芽孢桿菌（)、短小芽孢桿菌（心cz7/w 5 )、凝結芽孢桿菌（⑽）、生孢梭 菌 (Clostridium sporogwa )、球形變異枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtilis globigii)、蠟狀芽孢桿菌（ cerew )、環狀芽孢桿菌（⑽$ )或其兩種或 更多種之混合物。 20.如申請專利範圍第i項之滅菌指示器，其中該生物 指示裔包含真菌、分枝桿菌、原生動物、營養細菌（vegetative bacteria)及其兩種或更多種之混合物。 21·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示裔包含黑麵徽（n/ger )、白色念珠菌 (Candida albicans ) 、Μ 瘡髮 0 議 C Trichophyton mentagrophytes)、皮久玉氏/黴（Wangiella dermatitis)、 龜分枝桿菌（c/ze/o似e )、戈氏分枝桿菌 (Mycobacterium gordonae ) 、包皮垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegamatis ) 、蘿蔔分枝桿菌 (ierrae )、梨形鞭毛蟲（G/ardz.a /amZ?/z4 )、 45 200821388 微4、隱抱子螽（Cryptosporidium parvum)、嗜水產氣單胞 菌(Aeromonas hydrophila )、糞腸球菌（

   /aeca/b)、糞鏈球菌/aeea/b)、屎腸球 菌(Enterococcus faecium )、膿鏈球菌（Sirepiococcws pyrogenes)、大腸桿菌（i^c/^rie/π’α eoh·)、肺炎克雷伯 氏桿菌（pneumoniae )、嗜肺性退伍軍人桿菌 (Legionella pneumophila ) 、甲基 桿菌屬 (Methylob acterium )、綠腹桿菌（P seudomonas aewgMwa )、豬霍亂沙門氏菌（5Wmond/a c/z〇/eraew^ )、 幽門螺旋桿菌（py/orz·)、金黃色葡萄球菌 (57叩¥/wcw）、表皮葡萄球菌（&叩办/〇⑶CCi^ epidermidis )、嗜參暮秦食隼版蛰{ Sten〇tr〇ph〇m〇nas ^β"ορ/Η·/ζ·α )或其兩種或更多種之混合物。 22.如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含嗜熱脂肪芽孢桿菌。 23 .如申請專利範圍第丨項之滅菌指示器，其中該生物 指示裔包含營養細菌、營養細胞（vegetative ceiis)及/或其 組成部分。 24·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含一或多種微生物且進一步包含一或多種賦形 劑0 25.如申請專利範圍第24項之滅菌指示器，其中該賦 形劑包含一或多種碳水化合物。 26·如申請專利範圍第24項之滅菌指示器，其中該賦 46 200821388 形劑包含海藻糖。 27·如申請專利範圍第24項之滅菌指示器，其中該賦 形劑包含蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、澱粉、瓊脂糠、 纖維素、蛋白質、膦酸酯、緩衝劑、蠟、脂質、油或其兩 種或更多種之混合物。 28·如申請專利範圍第丨項之滅菌指示器，其中該生物 才曰示為包§耐萬古挺素腸球菌（Vanc〇myCin Resistant enterococci )、耐二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌 (Methicillin Resistant Stephyloooccus aureus)、龜分枝 桿菌c/?e/〇m·)或其兩種或更多種之混合 物0 29·如申請專利範圍帛1項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含一或多種朊病毒（prion)。 30·如申請專利範圍帛17項之滅菌指示器，其中由該 載體承載之孢子之浪度為每平方毫米該載體約⑺4至約 cfu。

   其中該生 3 L如申請專利範圍帛1項之滅菌指示器 指示器包含一或多種酵素。 32.如申請專利範圍第i項之滅g指示器，其中該生 指不器包纟β-D-葡糖普酶、a_D·葡糖㈣、驗性麟酸酶 酸性石粦酸酶、丁酴两匕給 夂知St、辛酸酯酶脂肪酶、十四烷酸酯 肪酶、白胺酸胺基肽酶、 叫胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白酶 辱丰酸水解酶、a_D•半聋 牛礼糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、a_L_ 拉伯呋喃糖苷酶、N 7。 乙基胺基葡糖苷酶、β-D-纖維. 47 200821388 糖芽酶、丙胺酸胺基肽酶、脯胺酸胺基肽酶、絡胺酸胺基 肽酶、苯丙胺酸胺基肽酶、β—D-葡糖醛酸苷酶、脂肪酸醋 酶或其兩種或更多種之混合物。 33·如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該生物 指示器包含α-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、a_D-葡糖苷 酶、β-D-葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸醋酶、 辛酸酷酶脂肪酶、白胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白酶、填酸 水解酶、a-D-半乳糖苷酶、β_ι>半乳糖苷酶、丙胺酸胺基 肽酶、酪胺酸胺基肽酶、苯丙胺酸胺基肽酶、脂肪酸酯酶、 a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、p_D-葡糖苷酶、义乙醯基呼-胺基 葡糖普酶、β-D-纖維二糖苷酶、丙胺酸胺基肽酶、脯胺酸 胺基肽酶、酪胺酸胺基肽酶、白胺酸胺基肽酶、笨丙胺酸 胺基肽酶或其兩種或更多種之混合物。 34.如申請專利範圍第1項之滅菌指示器，其中該載體 包含紙張’該生物指示器包含嗜熱脂肪芽孢桿菌之孢子， 且該支撐體包含聚苯乙烯，該載體係使用音波熔接（s〇nic welding)被附著於該支撐體。 35·—種滅菌指示器，其包含： 一载體，該載體具有第一表面及第二表面，該第一表 面具有在約1至約80mm2之範圍内的面積； 一支撐體，該支撐體具有第一部分及第二部分，該載 體上覆於該支撐體之第—部分上，該載體之第二表面附著 於該支撐體之第一部分；及 由遠載體之第一表面支撐之生物指示器，該生物指 48 200821388 不器包含細菌孢子，該支撐體之第二部分具有足夠尺寸以 允許在不接觸該生物指示器之情況下操作該滅菌指示器。 3 6·—種滅菌指示器套組，其包含·· .一 一=有如申請專利範圍第1項之滅菌指示器之第一隔 室，該第一隔室經改適以允許該滅菌指示器與滅菌介質在 滅菌期間接觸；及 、 一含有培養基之第二隔室，該第二隔室經改適以在滅 ®期間保持該培養基與該滅菌指示器分離，且該第二隔室 _、、、工改適以允許該培養基在該滅菌指示器已暴露於該滅菌介 質後與該滅菌指示器接觸。 37. —種製造如申請專利範圍第丨項之滅菌指示器之方 ， 法，其包含： 將該生物指示器施加於該載體上；及 將違载體附著於該支撐體。 38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該載體係使 用音波溶接（S〇nic welding)或黏著劑被附著於該支撐體。 響 39· 一種滅菌方法，其包含： 將一待滅菌之物件及如申請專利範圍第1項之滅菌指 示器暴露於滅菌介質。 40. 如申睛專利範圍第39項之方法，其中該滅菌介質 包含至少一種液體滅菌劑。 41. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該滅菌介質 包含至少一種氣體滅菌劑。 42·—種測定滅菌效用之方法，其包含·· 49 200821388 將至少一件待滅菌之物件 、以共+ 如甲叫專利範圍第1項之 滅囷扣不為暴路於滅菌介質， 、 貝4生物指示器包含黾小一鍤 測試生物體；及 匕3至少一種 在滅菌後使該載體與培養基 效。 A刊疋该滅菌是否有 43·如申請專利範圍第42項之 含一啖多籀越盖、后η 、 去，其中該培養基包 s Α夕裡呂養源及一或吝链例^ a, 次夕種斂生物生長指示劑。 44.如申請專利範圍第43項之方 一步包含一 4 „ 、 / ，、中該培養基進 /匕3 A多種pH值镑輪添，丨 . 平衡之ϋ丨 ' 月 或多種用於維持滲透 物。 種中和劑或其兩種或更多種之混合 45·如申請專利範圍第42 含具有在約-0.001至約0 07〇方去’其中該培養基包 王、、-υ·〇7〇 m〇l 金斤 的缓衝溶液。 H之减内之緩衝能力 46·一種測定滅菌效用之方法，其包含： 將至少一件待滅菌之物 …盈☆ 件及如申凊專利範圍第1項之 滅囷#日不為暴鉻於滅菌介一 酵素·及 、該生物扣不器包含至少一種 使該載體與至少一插缺主# 七外 種酵素基質接觸以判定該滅菌是否 有效。 47·如申請專利範圍裳 1入· n 46項之方法，其中該酵素基質 包含· 一或多種螢并 , 土 丰形酮基（4-methylumbelliferyl) 何生物；一或多種7_醯胺 夕佐一长 土 甲基-香丑素衍生物；一或 多種一乙基螢井去你斗立 ’、’生物；螢胺；或其兩種或更多種之 50 200821388 混合物。

   勺入復如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素基質 匕3 . 甲基傘形酮基·2-乙醯胺基-4,6-〇_亞苄基_2_去氧_ β-D-哌喃葡糖苦、4_甲基傘形酮乙酸酯、4·甲基傘形酮基_ 乙酿基仰·胺基半乳㈣、4·甲基傘形酮基·Ν·乙醯基_ 4胺基葡糖芽、4·甲基傘形酮基_Ν·乙醢基仙_胺基葡 糖皆、2，-(4·甲基傘形_基）_a_D_N_乙酿基神經胺糖酸、4_ 甲基傘形酮基·αΐ阿拉伯㈣料、4_f基傘形酮基 阿拉伯糖苷、4-曱基傘形酮丁酸酯、4_甲基傘形酮基仙_ 纖維二糖苦、甲基傘形酮基_p_d_n，n,_二乙醯基幾丁二糖 苷、4-甲基傘形酮反油酸酯、4_甲基傘形酮基·β_〇_岩藻糖 ^ 4_甲基傘形酮基·4_岩藻料、4•甲基傘形_基_p_L· 岩藻糖苷、4_曱基傘形酮基_a_D_半乳糖苷、4_曱基傘形酮 基-β-D-半乳糖苷、4-曱基傘形酮基葡糖音、4_甲基傘 形酮基-β-D-葡糖苷' 4-曱基傘形酮基葡糖苷酸、4_曱 基傘形酮對胍基苯曱酸酯、4-甲基傘形酮庚酸酯、4_甲基 傘形酮基-a-D-哌喃甘露糖苷、4-曱基傘形酮基j_D_哌喃甘 露糖苷、4-甲基傘形酮油酸酯、4-甲基傘形酮棕櫊酸酯、扣 曱基傘形酮填酸酯、4-曱基傘形顧1丙酸酉旨、曱基傘形酸j 硬脂酸酯、4-曱基傘形W硫酸酯、扣甲基傘形酮基_p_D_ N，N’，N’’-三乙醯基幾丁三糖、4、甲基傘形酮基·2,3,5_三_β_ 苄醯基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基傘形g同基三曱基肉 桂酸氯化銨、4-曱基傘形酮基木糖苷或其兩種或更多 種之混合物。 51 200821388 49·如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素基質 包含：L-丙胺酸_7-醯胺基甲基香豆素、脯胺酸-7-醯 胺基·4-甲基香豆素、L-酪胺酸-7_醯胺基-4-甲基香豆素、L-白酸-7-酿胺基_4_甲基香豆素、L-苯丙胺酸-7-醯胺基-4-曱基香豆素、7-戊二醯基-苯丙胺酸_7_醯胺基_4_甲基香豆 素或其兩種或更多種之混合物。 50·如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素基質

   包含· N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg 7-醯胺基-4-甲基香豆素、 N-t-BOC-Leu_Ser-Thr-Arg 7-醯胺基 | 甲基香豆素、N-CBZ-Phe-Arg 7-酸胺基-4-曱基香豆素、Pr〇_phe-Arg 7屬胺 基-4-甲基香丑素、N-t-BOC-Val-Pro_Arg 7-醯胺基-4-甲基 香豆素、N-戊一酿基_Gly-Arg 7-醯胺基_4-甲基香豆素或其 兩種或更多種之混合物。 51.如申請專利範圍第46項 六τ咏醉i签 包含二乙酸螢光素、螢光素二（β_Ι)_哌喃半乳糖苷）一 桂酸螢光素或其兩種或更多種之混合物。 52.如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包 α-D-葡糖苷酶、胰凝乳蛋白酶或脂肪酸酯酶，且該酵素 質包含4-甲基傘形酮基_a_D_葡糖普、7_戊二酸基苯丙胺 -7-醢胺基-4-甲基香豆素或4_甲基傘形酿1庚酸酯。 53·如申請專利範圍第46項之方法，复0 /、丫琢酵素包 a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，且該酵素基質 ” 、 6 甲基傘形 基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷。 Μ·如申請專利範圍第46項之方直 八甲·该酵素 52 200821388 ’ 含P_D葡糖苦酶，且該酵素基質包含4-甲基傘形酮基仙· 葡糖苷。 55_如申請專利範圍第46項之方法，其中：該酵素基 質包含一或多種5_溴-4-氯-3-十朵基衍生物；-或多種石肖 基苯基衍生物；一或多種❹衍生物；-或多種紛醜街生 物；或其兩種或更多種之混合物。 56. 如申請專利範㈣46項之方法，其中該酵素基質 包含5-溴-6-氯_3“弓卜朵乙酸醋、5_演_4_氯_3_〇引哚乙酸醋、^ • 溴_4-氯―3-吲羥-P-D-哌喃半乳糖苷、5_溴_4_氯_3_吲哚基_ 1，3-二乙酸酉旨、5_溴_’4_氯_3·吲絲仙_哌喃岩藻糖苦二 "溴_4_氯_3_°引哚基ID·派喃葡糖苷、5-演-4-氯-3-弓丨哚基·β_ _ D_葡糖醛酸、5_溴-4-氣-3-η引哚磷酸酯、5_溴_4-氯叫丨哚 硫酸酯或其兩種或更多種之混合物。 57. 如申請專利範圍帛46項之方法，其中該酵素基質 包含：-或多種對石肖基盼衍生物；一或多種鄰破基盼衍生 物，或其混合物。 # 58·如申請專利範圍帛46項之方法，其中該酵素基質 包含：磷酸二乙基-對硝基苯醋、磷酸二_對硝基苯醋、對 硕基苯基·2-乙ϋ胺基·2·去氧·3_〇_βκ半乳糖基_β-派喃 葡糖苷、對硝基苯基-2-乙醯胺基去氧_β_哌喃葡糖苷、 乙酸對硝基苯醋、對硝基苯基_Ν_乙醯基_β_〇_胺基葡糖普、 對硝基苯基-β-〇-Ν，Ν·-二乙醯基幾丁二糖苷、對硝基苯基_α_ 哌喃葡糖苷、對硝基苯基-α-麥芽糖苷、對硝基苯基_β_麥 芽糖普、對硝基苯基-α-哌喃甘露糖苦、對硝基苯基_β哌 53 200821388 喃甘露糖苷、十四烷酸對硝基苯酯、棕櫚酸對硝基苯酯、 磷酸對硝基苯酯、雙（對硝基苯基）磷酸酯、參（對硝基苯基） 磷酸酯、對硝基苯基-β_哌喃葡糖苷、對硝基苯基葡糖 苷酸、心對硝基苯基甘油、對硝基苯基-α-哌喃鼠李糖苷、 硬脂酸對硝基苯酯、硫酸對硝基苯酯、對硝基苯基_2,3,4,6_ 四-0-乙醯基-β-胺基葡糖苷、對硝基苯基胸苷單磷酸酯、 對硝基苯基-2,3,4-三乙醯基葡糖醛酸甲酯、戊酸對 硝基苯酯或其兩種或更多種之混合物。 _ 59·如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素基質 包含··乙酸鄰硝基苯酯、鄰硝基苯基_β_葡糖苷、鄰硝基苯 • 基-β-D-哌喃葡糖苷、硝基苯基-α-哌喃半乳糖苷、硝基苯 - 基哌喃半乳糖苷、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯、己酸 硝基苯_、辛酸硝基苯酯、月桂酸硝基苯酯、丙酸硝基苯 酉曰、°引經-乙酸酉曰、,罗莖β-D-葡糠苷、3-σ引經硫酸醋、3_〇引 羥磷酸酯、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸醋、 酚酞葡糖醛酸、酚酞單_β_葡糖苷酸、酚酞單_β_葡糖醛酸 _ 及酚酞單磷酸酯、1-重氮基-4-苄醯胺基-2,5-二乙氧基笨、 1-重氮基-4-苄醯胺基-2,5-二乙氧基苯、對重氮基_2,5_二乙 氧基-Ν-节醯基丙胺酸、4-氯-2-曱基苯氯化重氮、鄰胺基 偶氮甲苯重氮鹽、1-萘基-Ν-乙醯基-β-D-胺基葡糖普、2-英 基-鱗酸i旨、2-秦基-丁酸酯、2-萘基-辛酸酯、2-萘基_十四 烷酸酯、L-白胺醯基_2-萘基醯胺、L-纈胺醯基-2-萘基驢胺、 L-胱胺酸基-2-奈基酸胺、N-苄醯基-DL-精胺酸_2_蔡基酵 胺、N-戊一 S&基-本丙胺酸-2-萘基-胺、2-萘基_碌酸g旨、& 54 200821388 萘基喃半乳糖苷、2_萘基仙％喃半 2奈基喃葡糖芽、6备2-萘紛仙“辰喃葡糖苦、卜 漠-2 -奈基-2-D_a辰喃甘露牆接 9| 两I路糖*、2_奈基，L_哌喃岩 萘基-AS-ΒΙ-磷酸酯、关美AS R …甘 或更多種之混合物。 其兩種 60.如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包含 4葡糖㈣’且該酵素基質包含對確基苯基㈣味葡糖 苷。 61·如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包含 4阿拉何喃料酶4該酵素基質包含對硝基苯基_α_ L-阿拉伯呋喃糖苷。 =·如中請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包含 葡糖皆酶，且該酵素基質包含對確基苯基H派喃葡 糖苷。 63.如申請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包含 =糖*酶，且該酵素基質包含5_ I喃半乳糖苷。 卜半^?請專利範圍第46項之方法，其中該酵素包含 半乳=且輯素Π包含4·甲基傘㈣仰-旅。南 十一、圆式： 如次頁 55