MXPA00002609A - Procedimiento de regulacion de la desinfeccion de liquidos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido que comprende la medición del nivel de micro-organismos sobrevivientes y el ajuste en función de ese nivel, de la naturaleza y/o de las dosis del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s) que se utiliza(n) para la desinfección. El procedimiento según la invención presenta sobre todo la ventaja de ser más rápido y fácilmente automatizable.

Description

PROCEDIMIENTO DE REGULACIÓN DE LA DESINFECCIÓN DE LÍQUIDOS DESCRIPCIÓN La presente invención se relaciona de manera general, a medios para regular la desinfección de líquidos. Se relaciona más particularmente con medios de regulación que ponen en obra la medición de actividades enzi áticas. La garantía de calidad y de inocuidad de líquidos destinados para ponerse en contacto con un hombre o un animal, tales como agua destinada al consumo, un líquido alimenticio, una agua para bañarse, una agua destinada a preparaciones farmacéuticas o biotecnológicas , depende directamente de la confiabilidad y de la sensibilidad de las técnicas empleadas para medir el número de microorganismos sobrevivientes en ese líquido. 20 Los métodos que se emplean actualmente para la regulación de la desinfección de un líquido, utilizan las técnicas de cultivo sobre gelosa y/o las técnicas de microscopías.

Zi Las técnicas de cultivo^* sobre gelosa consisten en contar el número de colonias bacterianas que se desarrollan sobre diferentes medios nutritivos gelosados normalizados (ver norma francesa NF T 90-414, Essais des 5 Eaux, Búsqueda y recuento de los coliformes y de los coliformes termotolerantes) . Esas técnicas presentan varios inconvenientes. En primer lugar se puede citar el hecho que dan sus resultados solamente al cabo de 24 horas en promedio, lo que difiere el ajuste eventual del procedimiento de desinfección. Las técnicas de cultivos sobre gelosa limitan además, la realización de baterías de cultivos microbio- lógicos para el análisis de cada muestra de líquido. En efecto, todas las familias microbianas, y bacterianas en particular, no se desarrollan sobre el mismo medio nutritivo; de esa manera, no se puede detectar ningún colifor e después del cultivo sobre el medio nutritivo normalizado para la detección de los coliformes, sino encontrar un buen número de otras bacterias después del cultivo sobre otros medios nutritivos. La selección de los medios nutritivos gelosados determina por lo tanto la calidad del análisis. Esta selección es tanto más delicada que a veces se observa un número más importante de colonias después del cultivo sobre un medio que no sea ¡so —. - —aSifa .*.*«..* * ^.^t*M. iX Ik?H^^y?Áx?a el medio nutritivo normalizado para la detección de esas mismas colonias. Por ejemplo, se ha demostrado que los recuentos de la flora bacteriana aeróbica revivificable, eran más importantes sobre el medio gelosado R2A que sobre el medio nutritivo normalizado correspondiente (ver por ejemplo "A new rapid m dium for enumeration and subcul ture of bacteria from potable water" de Reasoner D. J. y Godreich E. F. , App. Environm. Microbiol . (1985) 49- p. 11-7). Para establecer un diagnóstico negativo confiable, las técnicas de cultivo sobre gelosa llaman por lo tanto a una multiplicación de los análisis. Las técnicas de cultivo sobre gelosa no permiten además, automatizar fácilmente la regulación del procedimiento de desinfección. 15 Además, las bacterias, en particular después de un medio circundante tenso tal como la aplicación de un procedimiento de desinfección, pueden adoptar una forma de resistencia bajo la cual ya no se multiplican, asegurando al mismo tiempo un metabolismo mínimo; tan _n pronto como se restauran condiciones de ambiente circundante más favorables, esas bacterias podrían volver a tomar su multiplicación. Ese tipo de bacterias se denominan "no cultivables pero viables": no son detectables por las técnicas de cultivo sobre gelosa ,?X - 4 -clásicos y pueden representar un riesgo biológico para el consumidor. Un método actualmente d^pSnible para controlar de manera casi cierta la eficacia de la desinfección de un líquido, utiliza técnicas de microscopías asociadas a coloraciones específicas. Este método permite una discrimación entre bacterias cultivables, bacterias no cultivables pero viables y bacterias muertas. Sin embargo, necesita la puesta en obra de varias pruebas de coloraciones para cada muestra y es difícilmente auto atizable técnicamente. La presente invención tiene por objeto disminuir los inconvenientes de las técnicas del arte anterior y propone un procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido, caracterizado en que comprende: A.- En una etapa de la desinfección a continuación designada etapa 2, la medición de la actividad de cuando menos una enzima por puesta en contacto de unos microorganismos eventualmente presentes en el líquido con un substrato seleccionado como pudiendo revelar la actividad de esta o de estas enzima(s), sobre todo mediante transformación del substrato en compuestos coloreados, fluorescentes o luminiscentes o por desaparición del substrato; esta actividad enzimática se denomina a continuación, actividad propia: B.- en una etapa designada a continuación etapa 1, anterior a la etapa 2, la medición de la actividad de la o de las misma(s) enzima(s) que en (A); esta actividad se designa a continuación, actividad inicial; C- la traducción, para cada enzima, de actividad propia y actividad inicial, en tasa de microorganismos en el líquido en la etapa 2 de la desinfección, y esto por medio de un sistema de referencia preestablecido con la ayuda de una muestra del líquido tomado en la etapa 1 y luego se expone a dosis de desinfectante(s) creciente; así como D.- el ajuste en función de la tasa de microorganismos sobrevivientes, de la naturaleza y/o de las dosis del (de los) agentéis ) químico(s) o físico(s) utilizado(s) para la desinfección. Por micro-organismos sobrevivientes, entendemos en la presente solicitud, micro-organismos cultivables y/o micro-organismos no cultivables pero viables. Por tasa de micro-organismos sobrevivientes, entendemos en la presente solicitud, la relación entre concentración en micro-organismos sobrevivientes en el líquido en la etapa 2 de desinfección y la concentración de micro-organismos sobrevivientes en el mismo líquido en la etapa 1. Esa tasa de micro-organismos sobrevivientes, se expresa de preferencia en valores de disminución bajo la forma de potencias negativas de 10 ó en logaritmos de disminución que corresponde a log10 (disminución) . Por ejemplo, la etapa 1 puede corresponder a una etapa "antes de desinfección" del líquido y la etapa 2 a una etapa cualquiera del procedimiento de desinfección, (etapas "después de desinfección" del líquido incluso) . El procedimiento según la invención se dirige a líquidos en los cuales los micro-organismos eventualmente presentes, se someten a condiciones muy particulares, a saber, condiciones de desinfección que induce un stress notable de las células. El procedimiento de la regulación de la desinfección de un líquido según la invención, se dirige particularmente a los líquidos que se destinan a ponerse en contacto con un hombre o un animal, que eso sea un simple contacto, absorción, ingestión, instilación o inyección. Se aplica particularmente a líquidos destinados a ponerse en contacto con un hombre o un animal tal como una agua para bañarse, una agua destinada al consumo, una agua destinada a preparaciones farmacéuticas o biotecnológi-cas, o un líquido alimenticio. La puesta en contacto de los micro-organismos eventualmente presentes en el líquido con el substrato, puede realizarse por puesta en contacto directa del líquido o de una muestra de ese líquido, con el substrato, o entonces por puesta en contacto de un concentrado de los micro-organismos eventualmente presentes, tal como un filtrado o un resto de centrifugación del líquido o muestra del líquido, con el substrato. Previamente a la medición de la actividad de ciertas enzimas tales como la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o la glutatión reductasa, el procedimiento según la invención comprende, de manera ventajosa, la etapa de someter el líquido, la muestra del líquido o el concentrado, a un tratamiento de lisis, sobre todo por sonicación. Previamente a la medición de la actividad de otras enzimas tales como catalasa o superóxido dismutasa, la etapa de lisis previa puede evitarse: la actividad de esas enzimas puede medirse con la ayuda de un substrato que se difusa al interior de los micro-organismos, tal como la lucigenina y el peróxido de hidrógeno. Según un aspecto ventajoso de la invención, la o las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se mide(n), presenta(n) en el líquido, muestra del líquido o concentrado, una relación entre actividad propia y actividad inicial en relación afinada, y con una pendiente significativa diferente de cero, de preferencia inferior a -0.2, con la tasa de micro-organismos sobrevivientes sobre cuando menos una zona de e esas tasas de micro organismos sobrevivientes. Es el caso, por ejemplo, de la glucosa-6-fosfato deshidrogenas» para logaritmos de disminución comprendidos entre 0 y 3 aproximadamente, de f 5 la glutatión reductasa para logaritmos de disminución comprendidos entre 4 y 7 aproximadamente, del superóxido dismutasa para logaritmos de ^disminución comprendidos entre 3 y 6 aproximadamente. Otras enzimas de interés pueden formar parte de la familia de las deshidrogenasas o de la familia de las enzimas implicadas en la respuesta al stress oxidante. Para determinar si una (o varias) enzimas es (son) apropiada(s) a la puesta en obra del método de regulación según la invención sobre un líquido dado, se podrá proceder de la manera siguiente: - toma de cuando menos una muestra del líquido y medición de la concentración en micro-organismos sobrevivientes (micro-organismos' cultivables y/o microorganismos no cultivables pero viables), sobre todo por cultivos sobre gelosa y/o por coloraciones y observaciones con el microscopio; - dosificación de la actividad de cada enzima candidata, sobre esta(s) muestra(s) de líquido; - exposición de la(s) muestra(s) de líquido a 25 diferentes dosis de desinfectante(s) en condiciones por a^^^^^^...,.^^^^^ a^^*^^ i^^^^ otra parte equivalentes (es decir, condiciones de duración de exposición, de temperatura); medición de la actividad de cada enzima candidata después de la exposición a las diferentes dosis de desinfectante(s) ; - realización, para cada enzima candidata, de una curva que presenta los porcentajes de actividad (actividad enzimática medida, después de la exposición a las diferentes dosis de desinfectante(s) comparada con la actividad enzimática correspondiente antes de la exposición) en función de los logaritmos de disminución medidos (tales como se definen más arriba); - determinación para cada enzima candidata de la zona del logaritmo de disminución por la cual la pendiente de la curva es significativamente diferente de cero, de preferencia inferior a -0.2; esta zona constituye la escala de respuesta de la enzima candidata de que se trata, sobre el líquido. - una enzima candidata es apropiada a la puesta en obra del método según la invención sobre el líquido si la escala de respuesta comprende los valores de logaritmo de disminución correspondiente a los objetivos de la desinfección para el líquido de que se trata. Según un aspecto particularmente ventajoso de la invención, la o cuando menos una de las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se mide(n)f, es una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, una malasa deshidrogenasa, una glicer-aldehido-3-fosfato deshidrogenasa, una catalasa, una superóxido dismutasa o una glutatión reductasa. La o cuando menos una de las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se mide(n) entonces por transformación de un substrato y, si es el caso, en presencia de un co-factor, tal como respectivamente, glucosa-6-fosfato y co-factor NADP, L-malato y co-factor NAD, gliceraldehido-3-fosfato y cofactor NAD, lucigenina, peróxido de hidrógeno, glutatión oxidado y co-factor NADPH. Según un modo ventajoso de realización de la invención, esas mediciones de actividad propia y de actividad inicial, se hacen con la ayuda de un aparato de detección de intensidad luminosa tal como espectrofotó-metro, espectrofluorómetro o lu inómetro, que presentan eventualmente varios canales de análisis. Según otro modo ventajoso de realización, de la invención, la traducción en tasas de micro-organismos sobrevivientes con la ayuda del sistema de referencia pre-establecido, comprende para cada enzima, el cálculo de la relación entre la actividad propia y la actividad inicial, eventualmente expresada en porcentaje. Según todavía otro modo de realización ventajoso de la invención, el sistema de referencia se presenta bajo ¡jjj^^ una forma gráfica tal como una o varias curva(s) que ponen para cada enzima, la relación entre actividad propia y actividad inicial en relación con valores de tasa de micro-organismos sobrevivientes tales como logaritmos de disminución. Esa relación entre actividad propia y actividad inicial, se designa también, por "actividad relativa" en la presente solicitud. Según un aspecto de este otro modo ventajoso de realización de la invención, las mediciones espectrométricas pueden realizarse sobre todo para cada actividad enzimática medida, a una temperatura constante, sobre todo a 25°C y a longitud de onda constante, sobre todo a una longitud de onda comprendida entre 240 y 550 nm, por ejemplo a 340 nm. Esas otras mediciones pueden registrarse de manera continua o discreta sobre un intervalo de tiempo de 30 minutos aproximadamente. En el caso en que se busquen sensibilidades de medición más elevadas, se utiliza de preferencia la luminometría. La etapa de ajuste de desinfección del procedimiento según la invención puede hacerse siguiendo regularmente la evolución de la tasa de los micro-organismos sobrevivientes (es decir, expresada en disminución, logaritmo de disminución o índice D) con la ayuda de indicadores enzimáticos que se presentan más arriba, y esto hasta obtener la objetividad de desinfección fijada.

La etapa de ajuste de desinfección del procedimiento según la invención, puede también hacerse mediante adiciones del equivalente "dosis de desinfectante(s) " que corresponde a la diferencia-centre la tasa de micro-organismos sobrevivientes deseada (valor consigna) y la tasa de micro-organismos efectivamente medido sobre el líquido, muestra de líquido o concentrado, en una etapa de desinfección o después de desinfección. Ventajosamente, ese equivalente de dosis de desinfectante(s) es tal que, leido sobre una curva de referencia, representa la tasa de micro-organismos cultivables en función de la dosis de desinfectante(s) a la cual el líquido está expuesto. La invención da resultados particularmente ventajo-sos para líquidos que comprenden micro-organismos seleccionados entre el grupo constituido sobre todo por el tipo Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacteriu , Methylobacterium , Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Salmonella . El procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido según la invención, puede fácilmente automatizarse de manera particularmente ventajosa, sobre un procedimiento de desinfección de líquido. Contraria-mente a las técnicas del arte anterior, el procedimiento según la invención, permite un control microbiológico seguro, rápido y cómodo para ponerse en obra. De manera preferida, la tasa de micro-organismos sobrevivientes se expresa en valor de disminución (concentración de micro-organismos sobrevivientes relacionada por la concentración inicial de microorganismos sobrevivientes, tal como se mide en la etapa 1, de logaritmo de disminución disminución) o de índice D (= log de disminución). Ese índice D constituye también un índice de la calidad microbiológica del líquido en consideración. Ese procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido según la invención, considera como microorganismos sobrevivientes, aquellos de los micro- organismos presentes que son cultivables y/o aquellos de los micro-organismos presentes que no son cultivables pero que son viables. En el caso en que se desea tener en cuenta a la vez, los micro-organismos cultivables y los micro-organismos no cultivables pero viables, ese sistema de referencia pone entonces ventajosamente, para cada enzima, la relación entre actividad propia y actividad inicial en relación con valores de tasa de microorganismos sobrevivientes que resultan de la adición de los valores de tasa de micro-organismos cultivables y de los valores de tasa de micro-organismos no cultivables, «A?atiig^^a--^^ pero viables, tal con la ayuda de las técnicas clásicas. Entre los agentes químicos" o físicos utilizados ventajosamente para la desinfección, se pueden citar el cloro y sus derivados, los UV, el ozono, H202, las membranas filtrantes, la temperatura, los ultrasonidos, las radiaciones ionizantes. *-* Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a través de los ejemplos de realización a continuación, que se dan a título indicativo y no limitativo. Los ejemplos se refieren a las figuras 1, 2 y 3: La figura 1 representa la tasa de bacterias Escherichia coli cultivables (expresada en valor de disminución en relación con la población inicial) en función de la concentración de cloro libre aplicada (mg/l). La figura 2 representa la actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Z F), expresada en % de la actividad máxima medida, en función de la tasa de bacterias cultivables (expresada en valores de disminución en relación con la población microbiana inicial) . La figura 3 representa la actividad glutatión reductasa, expresada en % de la actividad inicial (máxima) medida, en funcHon de la tasa de bacterias cultivables (expresada en valores de disminución en relación con la población microbiana máxima) . EJEMPLO 1 : Control microbiolósico de una acma en desinfección destinada al consumo humano. Se busca determinar si las actividades enzimáticas pueden constituir un indicador confiable de la tasa de micro-organismos sobrevivientes en un líquido en desinfección tal como una agua destinada al consumo humano . Métodos v resultados A este título, se realiza un inoculum por cultivo puro de Ericherchia coli (cepa MG1655 disponible en el Instituto Pasteur) sobre un medio nutritivo a 20°C (medio L B que comprende 10 g/1 de triptona Bacto 5 g/1 de extracto de levadura Bacto, 10 g/1 de NaCl, pH ajustado a 7). Las bacterias se recolectan en fase exponencial de crecimiento por centrifugación y luego se lavan con la ayuda de un amortiguador fosfato (pH 7; 0.05 M) . Los restos se vuelven a poner en suspensión (aproximadamente 5.10"*7 células/ml) en soluciones de amortiguador fosfato (pH 7; 0.05 M) que comprenden cloro libre en diferentes concentraciones (de 0.0 a 2.0 mg/l). Las diferentes suspensiones bacterianas se colocan después bajo agitación a 20°C. Al cabo de 20 minutos, se toma entonces para análisis de las muestras de esas suspensiones bacterianas (volumen de 100 a 1000 ml por actividad enzimática a medir) . Para cada muestra, se mide en paralelo, la tasa de micro-organismos sobrevivientes y las diferentes actividades enzimáticas según los métodos siguientes: Numeración de los micro-organismos sobrevivientes: Para cada muestra de suspensión bacteriana, se cuenta el número de micro-organismos que sobrevivieron, es decir el número de bacterias cultivables y/o el número de bacterias no cultivables pero viables. La numeración de los micro-organismos sobrevivientes puede hacerse según las técnicas conocidas por el hombre del oficio: por ejemplo, por extensión sobre un medio geloso tal como un medio de TSA ( Tryptic Soy Agar, Di feo) para la numeración de las bacterias cultivables, y por la técnica del C. T. C. para la numeración de las bacterias no cultivables pero viables ( Schaule G. , Flemming H. C. y Ridgway H. F. 1993, Use of 5-cyano-2 , 3-dicotyl tetrazo- liu chloride for qualifyíng planktonic and sessile bacteria in drinking water, Appl . Environ . Microbiol . 59: 3850-3857) . A partir del número promedio n^ medido, se calcula entonces la concentración promedio (C¿) en microorganismos sobrevivientes a cada una de las dosis i de cloro libre probada. Cada concentración promedio C¿ en micro-organismos sobrevivientes, se expresa entonces en relación con la concentración máxima de micro-organismos sobrevivientes tal como se mide antes de la desinfección (concentración máxima Cma?) . En el caso de la presente ilustración, Cma? corresponde a la concentración promedio en micro-organismos sobrevivientes tal como se mide en la ausencia de cloro libre. Cada C^ se traduce de esa manera en valor de disminución (o de eliminación) con la ayuda de la fórmula: disminución = C^ / Cjna? Esa tasa de micro-organismos sobrevivientes Cj/Cma? representa también una medición de la calidad de desinfección. Los resultados de las numeraciones de microorganismos cultivables se ilustran en la figura 1 en donde se indica la tasa de bacterias E. coli cultivables en función de la dosis de cloro libre. En ordenada de la figura 1, se indican los valores de disminución (o de eliminación) correspondiente a las concentraciones de micro-organismos cultivables tal como se obtienen por numeración y se comparan a la concentración máxima medida antes de la desinfección: 10° indica una concentración de micro-organismos cultivables igual a la concentración máxima medida; 10"1 indica que la concentración de micro-organismos cultivables disminuyó de un factor de 10; 10"^ indica que la concentración de micro-organismos disminuyó de un factor 101 etc. En abscisa de la figura 1, se indica la concentración inicial de cloro libre de la suspensión bacteriana correspondiente. Se procede de manera idéntica con los resultados de las numeraciones de micro-organismos no cultivables pero viables que pueden adicionarse, si se desea, a los resultados de numeración de los micro-organismos cultivables. Actividades enzimáticas: Paralelamente a la numeración de los microorganismos sobrevivientes que se describen en lo que precede, se miden diferentes actividades enzimáticas. Se indican aquí más particularmente los experimentos relativos a dos enzimas: la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (a continuación designada por ZWF) y la glutatión reductasa. Esas enzimas se encuentran presente comúnmente en muchos micro-organismos; por lo tanto pueden representar el conjunto de las poblaciones microbianas presentes en las suspensiones y de esa manera dar la imagen resultante de la desinfección realizada. En los experimentos que se describen en la presente memoria descriptiva, las bacterias en suspensión se encuentran en concentraciones demasiado pequeñas para que sus actividades enzimáticas puedan medirse correctamente %L - 19 -sobre la muestra de líquido tomada sin concentración previa. Las muestras de las suspensiones en la presente memoria descriptiva, son filtros (membrana de 0.22 µm) de manera a recolectar los micro-organismos de las mismas. Los micro-organismos pueden también recolectarse por centrifugación a 3000 g durante 10 minutos a 4°C. Los estudios comparativos llevados a cabo ponen de manifiesto que es preferible lisar los micro-organismos previamente a la medida de actividades ZWF o glutatión reductasa. Los filtros (o restos) se colocan en un sistema que permite la lisis de los micro-organismos recolectados: previamente a una medición de actividad ZWF o glutatión reductasa, la lisis de los microorganismos se hace de manera preferida por una sonda de ultrasonidos (2 ciclos de 30 segundos bajo ultrasonidos y 30 segundos en reposo) . Se puede notar que, para medir la actividad de enzimas que no sean SWF o glutatión reductasa, tales como por ejemplo catalasa o superóxido di utasa, la lisis previa de los micro-organismos puede evitarse utilizando un substrato que difuse, tal como la lucigenina y el peróxido de hidrógeno. Las diferentes actividades enzimáticas pueden medirse según las técnicas conocidas por el hombre del oficio. Brevemente, para cada actividad enzimática que se debe medir, los micro-organismos de cada muestra se colocan con un substrato se cc ona o de manera a que la enzima que se busca, pueda catalizar su transformación y de manera a que esta transformación enzimática pueda fácilmente seguirse con las técnicas analíticas clásicas tales como espectrocolorimetría, espectrofluoro etría o luminometría para las cuales* se puede realizar una automatización. Para medir una actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, se colocan los micro-organismos de la muestra, en contacto con un substrato compuesto de glucoso-6-fosfato 0.6 mM y de nicotinamida adenina denucleótida fosfato bajo forma oxidada (NADP 0.2 mM) en presencia de una solución que estabilice el pH (añadiendo amortiguador Tris pH 7.6 MgCl2 10 mM) . Este substrato conduce, en presencia de glucoso-6-fosfato deshidrogenasa, a la formación de nicotinamida adenina denucleótida fosfato bajo forma reducida (NADPH) de la cual se puede seguir la aparición por espectrocolorometría a la longitud de onda de 340 nm ( Frankel D. G. y Levisohn S. R. 1967, Glucose and gluconate metabolism in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase, J. Bact. 93 : 1571-1578) . Para medir una actividad glutatión reductasa, se colocan los micro-organismos de la muestra en contacto con un substrato compuesto de nicotinamida adenina denucleótida fosfato bajo forma reducida (NADPH 0.2 mM) y de glutatión oxidado (disulfuro de glutatión GS-SG 2.5 nM) en presencia de una solución que estabilice el pH (amortiguador 100 pH 7). Bajo la acción catalítica de la 5 glutatión reductasa, ese substrato se transforma en nicotinamida adenina denucleótida fosfato bajo forma oxidada (NADP) y en glutatión bajo la forma reducida (GSH). La desaparición de NADPH se sigue entonces con el espectrocolorímetro a la longitud de onda de 340 nm (López Barea J. y Lee C. Y. , 1979, Mouse liver glutha tione reductase : purification, kinetics and regulation, Euro. J. Biochem . 98: 487-499). Las mediciones de actividades enzimáticas se realizan en la presente memoria descriptiva a una temperatura constante idéntica (25°C) con la ayuda de un espectrofotómetro PERKIN-ELMER modelo lambda 1. El valor de densidad óptica medido antes del arranque de la reacción enzimática bajo consideración, sirve de "blanco de medición". Los valores y densidades ópticas propios de cada medio reaccional se registran entonces en el transcurso del tiempo. La actividad enzimática propia de la muestra, se calcula después en la parte lineal de la curva que representa la densidad óptica propia que se observa después de la puesta en contacto del substrato con la A fa^; ^^^¿i ^ ^^^^¿^^ enzima objeto de la presente^medición (por ejemplo, entre 5 minutos y 35 minutos). El cálculo de la pendiente de la curva "densidad óptica propia a la muestra en función del tiempo" en el intervalo de tiempo 5-35 minutos bajo consideración, da un valor de esta variación de densidad óptica propia. Para cada enzima, las actividades enzimáticas propias medidas en las diferentes dosis de desinfectantes (cantidad de substrato consumido o producido por unidad de tiempo) , se expresan cada una en % del valor inicial de actividad registrada para la misma enzima, es decir en % del valor de actividad medida, para la misma enzima, a la dosis más pequeña de desinfectante: en la presente ilustración, la actividad propia glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (ZWF) y la actividad propia glutatión reductasa de lae muestras, se expresan en % de la actividad propia glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (ZWF) y, respectivamente, glutatión reductasa tal como se mide para las suspensiones bacterianas, no contenga cloro libre (es decir antes de la desinfección). Esa relación entre actividad enzimática propia del líquido en una etapa del procedimiento de desinfección (es decir en el transcurso o después de la desinfección) , y la actividad enzimática propia de ese mismo líquido antes de la desinfección, se designa en la presente ilustración: actividad enzimática relativa del líquido en la etapa mencionada de desinfección. Las actividades enzimáticas que se obtienen, se comparan entonces a las mediciones de las numeraciones microbiológicas. Los resultados de las numeraciones de micro-organismos cultivables, se ilustran en las figuras 2 y 3. La figura 2 representa, en ordenada, la actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (ZWF) medida, expresada en % del máximo (actividad inicial) de actividad registrada y, en abscisa, el número correspondiente de E.

Coli cultivables que se obtiene por numeración. La figura 3 representa, en ordenada, la actividad glutatión reductasa medida, expresada en % del máximo de actividad registrada (actividad inicial) y, en abscisa, el número correspondiente de E. Coli cultivables que se obtiene por numeración. En la figura 2, igualmente como en la figura 3, el número de micro-organismos sobrevivientes, se expresa en función del logaritmo de disminución, por la fórmula siguiente: logaritmo de disminución = - log10 (C^ / Cma?) en donde C^ y ma? son tales como se definen en lo que precede.

^ H-A? Si es necesario, los mismos tipos de figuras pueden realizarse teniendo en cuenta los resultados de las numeraciones de micro-organismos no cultivables, pero viables. En la figura 2, igualmente como en la figura 3, los valores del logaritmo de disminución se indican sobre el eje de las abscisas de la manera siguiente: 1E+00 representa un número de micro-organismos cultivables igual al número máximo registrado (suspensión que no presenta cloro libre); 1E-01 representa un número de micro-organismos cultivables igual al número máximo registrado disminuido de un número de micro-organismos a un valor de logaritmo de disminución de 1; 1E-02 representa un número de micro-organismos cultivables igual al número máximo registrado disminuido de un número de micro-organismos que corresponde a un valor del logaritmo de disminución de 2, y de esa manera siguiendo hasta 1E-07 que representa un número de micro-organismos cultivables igual al número máximo registrado disminuido de un número de micro-organismos que corresponde a un valor del logaritmo de disminución de 7. También se puede notar que este valor del logaritmo de disminución constituye también un índice de la calidad microbiológica del líquido bajo consideración, índice que denominamos D.

Los resultados que se obtienen, ponen de manifiesto que el seguimiento de la actividad glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (actividad relativa), es un indicador representativo del número de micro-organismos sobre- vivientes para una escala de muestras que van de las muestras del líquido que no se sometió a ningún tratamiento de eliminación de los micro-organismos, hasta las muestras de líquido que presentan un logaritmo de disminución (o de eliminación) inferior o igual a 3 aproximadamente (ver figura 2). Los resultados que se obtienen ponen de manifiesto también que la actividad glutatión reductasa (actividad relativa) es un indicador representativo del número de micro-organismos sobrevivientes para una escala de muestras que van de las muestras del líquido que presenta un logaritmo de disminución (o de eliminación) comprendido entre 4 y 7 aproximadamente (ver figura 3). En efecto, la actividad de la glutatión reductasa no es significativamente afectada antes de que se haya llegado a 4 logaritmos de disminución. Una proporcionalidad significativa entre actividad relativa y el logaritmo de disminución, se observa, para esta enzima, solamente sobre la zona de los logaritmos de disminución comprendidos entre 4 y 7 aproximadamente.

JAÉS^^^^^gjü^^j^^^^^^ De manera similar, hemos podido demostrar que la actividad (relativa) superóxido dismutasa (medidas en luminometría con la ayuda de lu#igenina) es un indicador representativo del número f*de' micro-organismos sobre- 5 vivientes para una escala de muestras de líquido que presenta un logaritmo de disminución (o de eliminación) comprendido entre 3 y 6 aproximadamente. Las superóxidos dis utasas y las catalasas, presentan además la ventaja de no necesitar tratamiento de lisis; la medición de su actividad puede realizarse sobre un substrato difusante, tal como la lucigenina, o respectivamente el peróxido de hidrógeno, por luminometría. Por lo tanto, las diferentes enzimas probadas, no cubren los mismos campos de sensibilidad; la actividad relativa de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (ZWF) es un indicador representativo del número de microorganismos sobrevivientes (logaritmo de disminución) en muestras de líquido que solamente se sometieron a disminuciones pequeñas relativas de poblaciones microbia- 20 ñas, la actividad relativa de la superóxido dismutasa y de la glutatión reductasa, son indicadores representativos del número de micro-organismos sobrevivientes (logaritmo de disminución) en muestras de líquido que se sometieron a disminuciones relativas de poblaciones microbianas promedio a importantes. c*- o .* mM.fr IÍT'I ^-«^-^<-«-^*. ***&*,, * ***..

Los mismos tipos de escalas de sensibilidad (proporcionalidad entre actividad relativa y el logaritmo de disminución para ciertas zonas de valores del logaritmo de disminución) , pudieron observarse midiendo la actividad relativa de la alata deshidrogenasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, las catalasas (ya sea por medición del consumo de peróxido de hidrógeno a 240 nm en una solución amortiguada a un pH de 7, ya sea por quimioluminescencia) . El hombre del oficio podrá encontrar otros ejemplos de enzimas y de protocolos de medición de actividades enzimáticas en diferentes obras de referencia, tales como: Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press 0-87969-502-1/97; Lehninger 1977, Biochimie, Flammarion ISBN 2-257-25009-5; Methods in Enzymology, Academis Press Inc. e . g. volúmenes I-XLI-XLII-89-105 y 234. Cualquier enzima para la cual una proporcionalidad significativa (pendiente significativa, por ejemplo inferior a -0.2) entre actividad relativa y logaritmo de disminución, puede ponerse de manifiesto, por ejemplo, siguiendo el protocolo que se describe en lo que precede, constituye un indicador confiable según la invención. Los mismos tipos de escalas de sensibilidad enzimática pueden obtenerse aplicando a las suspensiones '^^M?s^^^^^m^^^=, de E. col i que no sean dosis crecientes de cloro, sino dosis crecientes de ozono o dosis crecientes en UV. Discusión: Por lo tanto, se pone que la medición de actividades enzimáticas, permite seguir la evolución de las poblaciones microbianas en un líquido en desinfección. Esos diferentes indicadores enzimáticos de sobrevida microbiana, permiten darse cuenta de la totalidad de las poblaciones microbianas: micro- organismos cultivables y micro-organismos no cultivables pero viables. Por ejemplo, se puede seguir la actividad relativa ZWF para logaritmos de disminución inferiores a 3, y la actividad relativa glutatión reductasa para logaritmos de disminución superiores a 4. En el caso en que una medición precisa de un logaritmo de disminución comprendido entre 3 y 4 se requiere, por ejemplo se puede entonces medir una actividad relativa superóxido dismutasa. En el caso en que la desinfección que se ha efectuado, no conduce a logaritmos de disminución superiores a 6, se puede entonces, ya sea simplemente seguir la actividad relativa superóxido dismutasa, que comenzará a responder solamente a partir de logaritmos superiores a 3 , ya sea seguir la actividad relativa ZWF hasta los logaritmos de disminución de 3, y luego la actividad relativa superóxido dismutasa más allá. Los diferentes tipos de indicadores enzi áticos de sobrevida microbiana presentados en lo que precede, permiten por lo tanto conocer el valor de logaritmo de disminución del líquido controlado, y por eso mismo, su índice D de calidad microbiológica, su valor de disminución, y el número de micro-organismos que sobreviven en ese líquido. Por lo tanto dan in fine una medición de la velocidad y de la eficacia del procedimiento de desinfección aplicado. Si el número de micro-organismos sobrevivientes en el líquido controlado (es decir expresado bajo la forma de un logaritmo de disminución o índice de calidad de desinfección), no corresponde al objetivo de desinfección fijado (es decir valor consigna del logaritmo de disminución o de calidad de desinfección) , la dosis de desinfectante(s) aplicada al líquido (es decir la concentración de cloro libre, de ozono, la dosis de U.V. , de temperatura, de ultrasonidos, de radiaciones ionizantes), puede ajustarse en consecuencia. Este aumento o disminución de la dosis de desinfec-tante(s) puede hacerse siguiendo de manera regular, la evolución del número de micro-organismos sobrevivientes (logaritmo de disminución) con la ayuda de los indicadores enzimáticos presentan en lo que precede, y esto hasta obtener el objetivo de desinfección fijado. El ajuste de la dosis de desinfectante(s) puede también hacerse con la ayuda de curvas de referencia preestablecidas sobre una muestra del líquido que representa la tasa de micro-organismos sobrevivientes, es decir expresada en valores de logaritmos de disminución, en función de las dosis de desinfectante(s) crecientes de cloro libre, de ozono, de U.V. , de temperatura, de ultrasonidos, de radiaciones ionizantes) . Ese tipo de curvas de referencia, permiten leer los valores de las dosis de desinfectante(s) equivalente(s) respectivamente, a la tasa medida y a la tasa deseada de micro-organismos sobrevivientes tal como se obtienen con la ayuda de los indicadores enzimáticos presentados en lo que precede. Basta entonces aumentar o disminuir la dosis de desinfectante(s) aplicada al líquido controlado de la diferencia leida entre esos equivalentes de dosis de desinfectantes. Por ejemplo, esas curvas de referencia pueden obtenerse numerando los micro-organismos sobrevivientes en una muestra del líquido expuesta a dosis crecientes de desinfección (es decir, concentraciones crecientes de cloro libre, de ozono, de U.V., de temperatura, de ultrasonidos, de radiaciones ionizantes). El procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido según la invención, permite por lo tanto, con la ayuda de mediciones de actividades enzimáticas, controlar de manera completa, sencilla y rápida (menos de una hora) la desinfección de un líquido, y esto cualquiera que sea el estado fisiológico o la identidad de los micro-organismos que sobreviven en ese líquido. El procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido según la invención, presenta además la ventaja particular de ser fácilmente automatizable, contrariamente a los procedimientos que ponen en obra las técnicas de microscopías o de cultivos microbiológicos . Por supuesto que la presente invención no está limitada a los ejemplos de realización que se describen y que se representan, sino que abarca todas las variantes. Es de esa manera que las mediciones de actividades enzimáticas pueden realizarse por medio de técnicas analíticas que no son aquellas mencionadas más arriba.

Claims (20)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido, caracterizado en que comprende: A.- en una etapa de la desinfección a continuación designada etapa 2, la medición de la actividad de cuando menos una enzima por puesta en contacto de unos microorganismos eventualmente presentes en el líquido con un substrato seleccionado como pudiendo revelar la actividad de esta o de estas enzima(s), sobre todo mediante transformación del substrato en compuestos coloreados, fluorescentes o luminiscentes o por desaparición del substrato; esta actividad enzimática se denomina a continuación, actividad propia; B.- en una etapa designada a continuación etapa 1 anterior a la etapa 2, la medición de la actividad de la o de las misma(s) enzima(s) que en (A); esta actividad se designa a continuación, actividad inicial; C- la traducción, para cada enzima, de actividad propia y actividad inicial, en tasa de micro-organismos en el líquido en la etapa 2 de la desinfección, y esto por medio de un sistema de referencia preestablecido con la ayuda de una muestra del líquido tomado en la etapa 1 y luego se expone a dosis de desinfectante(s) creciente, así como;
2. D.- el ajuste en función de la tasa de microorganismos sobrevivientes, de la naturaleza y/o de las dosis del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s) utilizado(s) para la desinfección. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado en que la etapa 1 corresponde a una etapa antes de la desinfección del líquido y en que la etapa 2 corresponde a una etapa cualquiera de la desinfección,
3. 3.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado en que el líquido de que se trata es un líquido que se destina a ponerse en contacto con un hombre o un animal tal como una agua para bañarse, una agua destinada al consumo, una agua destinada a preparaciones farmacéuticas o biotecnológicas, o un líquido alimenticio.
4. 4.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que la puesta en contacto de los micro-organismos eventualmente presentes en el líquido con el substrato, se realiza por puesta en contacto directa del líquido o de una muestra de ese líquido, con el substrato.
5. 5.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la puesta en contacto de los micro-organismos eventualmente presentes en el líquido o en una muestra del líquido, con el substrato, se realiza por puesta en contacto de un filtrado o de un resto de centrifugación del líquido o muestra del líquido, con el substrato.
6. 6.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que el líquido, la muestra del líquido o el concentrado, se someten previamente a las mediciones de la actividad de cuando menos una enzima, a un tratamiento de lisis, sobre todo por sonicación.
7. 7.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado en que la o las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se mide(n), presenta(n) en el líquido, muestra del líquido o concentrado, una relación entre actividad propia y actividad inicial en relación afinada, y con una pendiente significativa diferente de cero, de preferencia inferior a -0.2, con la tasa de micro-organismos sobrevivientes sobre cuando menos una zona de valores de esas tasas de microorganismos sobrevivientes.
8. 8.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que la o las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se mide(n), es una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa una malata deshidrogenasa, una gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, una catalasa, un superóxido de dismutasa, o una glutatión reductasa.
9. 9.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado en que las 5 mediciones de actividad propia y de actividad inicial, se hacen con la ayuda de un espectrofotómetro, espectro- fluorómetro o luminómetro, que presentan eventualmente varios canales de análisis.
10. 10.- Procedimiento según cualquiera de las 10 reivindicaciones 1 a 9, caracterizado en que la traducción en tasas de micro-organismos sobrevivientes con la ayuda del sistema de referencia pre-establecido, comprende para cada enzima, el cálculo de la relación entre la actividad propia y la actividad inicial, 15 eventualmente expresada en porcentaje.
11. 11.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado en que el sistema de referencia se presenta bajo una forma gráfica tal como una o varias curva(s) que ponen para cada enzima, la 20 proporción entre actividad propia y actividad inicial en relación con valores de tasa de micro-organismos sobrevivientes .
12. 12.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado en que las 25 mediciones espectrométricas se realizan para cada ?^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ actividad enzimática medida, a una temperatura constante, sobre todo a 25°C y a longitud de onda constante, sobre todo a una longitud de onda comprendida entre 240 y 550 nm, por ejemplo a 340 nm.
13. 13.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado en que las mediciones espectrométricas se realizan de manera continua o discreta sobre un intervalo de tiempo de 30 minutos aproximadamente .
14. 14.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado en que el ajuste de las dosis del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s), se hace mediante adición del equivalente "dosis de desinfectante(s) " correspondiente a la diferencia entre la tasa de micro-organismos sobrevivientes que se desea obtener y la tasa de microorganismos medida en el líquido, en la muestra de líquido o en el concentrado.
15. 15.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado en que el equivalente de dosis de desinfectante(s) , es tal como se lee sobre la curva de referencia que representa la tasa de micro-organismos sobrevivientes en función de la dosis de desinfectante(s) a la cual se expone el líquido.
16. 16.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado en que el líquido comprende micro-organismos seleccionados entre el grupo constituido por el género Escherichia, Alcaligenes, 5 Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Salmonella .
17. 17.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado en que se 10 automatiza sobre un procedimiento de desinfección de líquido.
18. 18.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado en que la tasa de micro-organismos se expresa en valor de disminución 15 (concentración en micro-organismos sobrevivientes en relación con la concentración inicial de micro-organismos sobrevivientes, tal como se mide en la etapa 1, de logaritmo de disminución (-log10 disminución) o de índice D (= log de disminución). 20
19. 19.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado en que los microorganismos sobrevivientes son micro-organismos cultivables y/o micro-organismos no cultivables pero viables.
20. 20.- Procedimiento según cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 19, caracterizado en que los agentes químicos o físicos que se utilizan para la desinfección se seleccionan entre el grupo constituido por el cloro y sus derivados, el ozono, los U.V., H2?2, las membranas filtrantes, la temperatura, los ultra-sonidos, las radiaciones ionizantes. 10 15 20 25