CN102251018A - 基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，采用改造的商业化热喷墨式打印机作为抗生素滴加工具，配合软件编辑的梯度渐变灰阶条，取代了目前广泛使用的基于E-Test试剂条测定MIC的方法。与具有15级抗生素梯度的E-Test试剂条相比，本发明中软件编辑的梯度渐变灰阶条具有256个递进灰阶值，即利用该方法可打印出梯度变化更为精细的抗生素量，因此最终产生的抑菌圈的边缘更为平滑，测定出的MIC值理论上更为精确。此外，基于E-Test试剂条的测定方法中，特定种类的抗生素需购买针对该特定种类抗生素的E-Test试剂条，本发明的方法适用于任何种类的水溶性抗生素，节约了成本，应用潜力与价值极大。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素最低抑菌浓度的测定方法，尤其是基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，属于药物检测技术领域。
背景技术
抗生素药敏试验最常用的是纸片扩散法与稀释法，这两种方法也是美国临床实验室标准国家委员会(NCCLS)所采用的权威方法。
纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关。稀释法则用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中间和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC。
纸片扩散法的优点是操作简单，但该法只能定性地反应测试菌对抗生素的敏感程度，无法直接提供具体的MIC值；稀释法的优点是能够得到具体的MIC值，但操作相对繁琐费时；1988年的抗菌药物与化学疗法国际会议(ICAAC)上首次提出、随后由瑞典的AB BIODISK公司商业化投产的E-Test法则很好地结合了上述两种方法各自的优点，操作十分便捷，不仅能够反应测试菌对抗生素的敏感程度，同时又能精确地测定MIC值。
E-Test法与纸片法一样，是基于抗生素的在琼脂中的扩散原理，与其不同之处是，E-Test法中的扩散并非像纸片法一样由一个中心点向四周均匀的扩散，而是呈一种梯度式的扩散方式。E-Test试剂条是一个宽5mm长60mm的塑料薄片，其一面标有抑菌药物浓度值的刻度，另一面则有若干个分隔开的小室，其中填有预先制备好的不同浓度的抑菌药物，该药物浓度呈渐进的对数梯度分布。当E-TEST试剂条填有药物的一面接触到琼脂表面，抗菌药物立刻就会释放到琼脂里并在试条下形成稳定和连续的抗菌药物梯度。培养后，将围绕该试剂条产生一个椭圆形抑菌圈，一端与试剂条某处相交，该处显示的浓度刻度即是该药物的MIC值。
E-Test试剂条具有15级精细的对数浓度梯度，测定的MIC值较为精确，然而其药物的对数浓度梯度仍有很大的提升潜力，理论上能够获得更为精细的测定值。另外，针对不同的抗生素MIC值测定，需要购买相应的E-Test试剂条，价钱昂贵。而该试剂条在储存、运输等环节可能受到一些不利因素的影响，从而影响到MIC值测定的精确性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种简便快速、经济实用、精度高的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法。
本发明的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，包括以下步骤：
1) 喷墨打印机的改造：拆除打印机主体的基座、卷纸装置及废墨清除装置；拆除墨盒的外盖、墨盒内的吸墨海绵以及墨盒底部的过滤网，彻底清洗干净后用紫外灯灭菌。
2) 编辑用于控制抗生素打印的梯度渐变灰阶条带：利用PowerPoint软件编辑一个宽A、长B的矩形梯度渐变灰阶条带，该条带的一端为灰阶值255的纯白，另一端为灰阶值0的纯黑，中间部分呈从白到黑的渐变状态，其灰阶值为从255递减到0的整数，整个矩形梯度渐变灰阶条带共256级灰阶级数。
3) 实验菌悬液的制备：配制Mueller-Hinton肉汤：牛肉浸出粉0.2%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，pH7.4±0.2，121℃灭菌15min；用接种环挑取实验菌菌落3-5个，接种于5ml配制好的Mueller-Hinton肉汤中，35℃孵育8-12h后用生理盐水将其浓度稀释至1~2×108CFU/ml；
4) 含菌琼脂玻璃双碟的准备：配制Mueller-Hinton琼脂培养基：牛肉浸出粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，琼脂1.7%，pH7.3±0.2，121℃灭菌15min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，注入15-20ml灭菌后的Mueller-Hinton琼脂培养基，使其冷却凝固；用无菌棉签蘸取步骤3) 制备的实验菌悬液，在凝固的琼脂培养基表面均匀涂布接种3次，室温下干燥15min，备用；
5) 待测抗生素样品的准备与打印：用磷酸盐缓冲液充分溶解待测抗生素样品粉末，控制待测抗生素样品的浓度在103-105μg/ml之间，取出100 μl配置好的待测抗生素样品滴加到黑色墨盒，作为打印用的“墨”；将步骤4）的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”， 打印出按照步骤2）所编辑的梯度渐变灰阶条带；
6) 抗生素MIC值的计算：将打印了待测抗生素样品的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养18-24h，形成一个边缘平滑的椭圆形抑菌圈。由公式 (1) 计算抗生素MIC值：
MIC = (S/N) *(l/L) * C *R*V ------ (1)
式中S 为所编辑矩形梯度渐变灰阶条带的面积，单位为mm2；N为矩形梯度渐变灰阶条带的灰阶级数；l表示灰阶条纯白端到灰阶条与椭圆抑菌圈边缘相交处的直线距离，单位为mm；L为所编辑的灰阶条的长度，单位为mm；C为滴加到墨盒中待测抗生素样品的初始浓度，单位为μg/ml；R为所使用的打印机的分辨率，单位为d.p.mm；V为打印机最小喷墨液滴的体积，单位为ml。
上述的喷墨打印机是市售的商业化喷墨式打印机。所说的矩形梯度渐变灰阶条带的宽A=5mm、长B=60mm。
本发明中，所说的抗生素为水溶性抗生素，包括青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、氨基糖苷类抗生素以及其他临床上应用的水溶性抗生素。
本发明中，所说的实验菌为非厌氧性的致病或非致病菌，包括肠杆菌类，棒杆菌类，嗜血杆菌类，芽孢杆菌类，葡萄球菌类，链球菌类，念球菌类，淋球菌类，双球菌类及弧菌类。
采用本发明的基于喷墨打印原理的抗生素最低抑菌浓度(MIC)的测定方法，无需购买昂贵的E-Test试剂条，大大节约了成本；并且操作简便，稳定可靠，精确性与重复性极佳。
本发明方法采用软件编辑的梯度渐变灰阶条具有256个递进灰阶值，与具有15级抗生素梯度的E-Test试剂条相比，本发明中软件编辑的梯度渐变灰阶条具有256个递进灰阶值，即利用该方法可打印出梯度变化更为精细的抗生素量，因此最终产生的抑菌圈的边缘更为平滑，测定出的MIC值理论上更为精确。
具体实施方式
实施例1
1) 喷墨打印机的改造：选择分辨率为1200×4800d.p.i.的佳能PIXMA ip1880热喷式彩色喷墨打印机作为滴加抗生素的工具，首先对打印机主体进行改造：将打印机主体的外壳揭开，拆除位于墨盒下方的卷纸装置及废墨清除装置，并将其下方的塑料基座锯掉，空出的位置即可放置涂有菌层的琼脂玻璃双碟。之后改装墨盒：将其外盖撬开，用镊子将吸满墨水的海绵夹出来，用清水将墨盒底部的墨汁彻底冲洗干净，直到没有任何残留为止。最后将位于喷头上方的过滤网取出，并用清水反复冲洗干净。装载抗生素前需用70%乙醇清洗3-5次，风干后放置在紫外灯下灭菌1小时左右。
2) 编辑用于控制抗生素打印的梯度渐变灰阶条带：利用PowerPoint软件编辑一个宽5mm、长60mm的矩形梯度渐变灰阶条带，该条带的一端为灰阶值255的纯白，另一端为灰阶值0的纯黑，中间部分呈从白到黑的渐变状态，其灰阶值为从255递减到0的整数，整个矩形梯度渐变灰阶条带共256级灰阶级数。
3) 枯草芽孢杆菌悬液的制备：配制Mueller-Hinton肉汤：牛肉浸出粉0.2%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，pH7.4±0.2，121℃灭菌15min；用接种环挑取形态相似的枯草芽孢杆菌菌落3-5个，接种于5ml配制好的Mueller-Hinton肉汤中，35℃孵育8-12h后用生理盐水将其浓度稀释至1~2×108CFU/ml；
4) 含枯草芽孢杆菌琼脂玻璃双碟的准备：配制Mueller-Hinton琼脂培养基：牛肉浸出粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，琼脂1.7%，pH7.3±0.2，121℃灭菌15min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，注入15-20ml灭菌后的Mueller-Hinton琼脂培养基，使其冷却凝固；用无菌棉签蘸取步骤3) 中准备好的枯草芽孢杆菌悬液，在管内壁液面上方旋转挤压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度以确保接种菌的均匀分布，最后再沿平板边缘涂抹一周，接种了枯草芽孢杆菌的平板放置在室温干燥15min，备用。
5) 阿米卡星样品的准备与打印：用磷酸盐缓冲液充分溶解阿米卡星样品粉末，配制浓度为2000μg/ml的阿米卡星溶液，取出100 μl配置好的阿米卡星溶液滴加到黑色墨盒，作为打印用的“墨”；将步骤4）的含有枯草芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”， 打印出按照步骤2）所编辑的图形。
6) 阿米卡星MIC值的计算：将打印了阿米卡星的含有枯草芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养18-24h，孵育后形成一个边缘平滑的椭圆形抑菌圈。阿米卡星MIC值通过计算最初打印的阿米卡星条带与椭圆形抑菌圈边缘相交处的阿米卡星的量而得到。具体计算公式见式(1)：
MIC = (S/256) *(l/60) * C *R*V ------ (1)
式中S 为所编辑矩形梯度渐变灰阶条的面积(S=300mm2)，N为矩形梯度渐变灰阶条的灰阶级数(N=256)，l表示灰阶条纯白端到灰阶条与椭圆抑菌圈边缘相交处的直线距离(mm)，L为所编辑的灰阶条的长度(L=60mm)，C为滴加到墨盒中待测抗生素样品的初始浓度(μg/ml)，R为所使用的打印机的分辨率(R=1200×4800d.p.i =1200×4800/25.4 d.p.mm)，V为打印机最小喷墨液滴的体积(V=2×10-9ml)。
本例中加入到黑色墨盒中的阿米卡星溶液的浓度为2000μg /ml，测得的l值为3.5mm，按照式(1)可计算出阿米卡星对枯草芽孢杆菌的MIC值为0.062μg/ml。
实施例2
1) 步骤1同实施例1中的步骤1；
2) 步骤2同实施例1中的步骤2；
3) 藤黄八叠球菌悬液的制备：除使用的实验菌改为藤黄八叠球菌外，其余步骤同实施例1中的步骤3；
4) 含藤黄八叠球菌琼脂玻璃双碟的准备：配制Mueller-Hinton琼脂培养基：牛肉浸出粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，琼脂1.7%，pH7.3±0.2，121℃灭菌15min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，注入15-20ml灭菌后的Mueller-Hinton琼脂培养基，使其冷却凝固；用无菌棉签蘸取步骤3) 中准备好的藤黄八叠球菌悬液，在管内壁液面上方旋转挤压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度以确保接种菌的均匀分布，最后再沿平板边缘涂抹一周，接种了藤黄八叠球菌的平板放置在室温干燥15min，备用；
5) 四环素样品的准备与打印：用磷酸盐缓冲液充分溶解四环素样品粉末，配制浓度为104μg/ ml的四环素溶液，取出100 μl配置好的四环素溶液滴加到黑色墨盒，作为打印用的“墨”；将步骤4）的含有藤黄八叠球菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”， 打印出按照步骤2）所编辑的图形；
6) 四环素MIC值的计算：将打印了四环素的含有藤黄八叠球菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养18-24h，孵育后形成一个边缘平滑的椭圆形抑菌圈。四环素MIC值通过计算最初打印的四环素条带与椭圆形抑菌圈边缘相交处的四环素的量而得到。具体计算公式见式(1)：
MIC = (S/256) *(l/60) * C *R*V ------ (1)
式中S 为所编辑矩形梯度渐变灰阶条的面积(S=300mm2)，N为矩形梯度渐变灰阶条的灰阶级数(N=256)，l表示灰阶条纯白端到灰阶条与椭圆抑菌圈边缘相交处的直线距离(mm)，L为所编辑的灰阶条的长度(L=60mm)，C为滴加到墨盒中待测抗生素样品的初始浓度(μg/ml)，R为所使用的打印机的分辨率(R=1200×4800d.p.i =1200×4800/25.4 d.p.mm)，V为打印机最小喷墨液滴的体积(V=2×10-9ml)。
本例中加入到黑色墨盒中的四环素溶液的浓度为104μg/ ml，测得的l值为12.5mm，按照式(1)可计算出四环素对藤黄八叠球菌的MIC值为1.107μg/ml。
实施例3
1) 步骤1同实施例1中的步骤1；
2) 步骤2同实施例1中的步骤2；
3) 金黄色葡萄球菌悬液的制备：除使用的实验菌改为金黄色葡萄球菌外，其余步骤同实施例1中的步骤3；
4) 含金黄色葡萄球菌琼脂玻璃双碟的准备：配制Mueller-Hinton琼脂培养基：牛肉浸出粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，琼脂1.7%，pH7.3±0.2，121℃灭菌15min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，注入15-20ml灭菌后的Mueller-Hinton琼脂培养基，使其冷却凝固；用无菌棉签蘸取步骤3) 中准备好的金黄色葡萄球菌悬液，在管内壁液面上方旋转挤压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度以确保接种菌的均匀分布，最后再沿平板边缘涂抹一周，接种了金黄色葡萄球菌的平板放置在室温干燥15min，备用；
5) 新霉素样品的准备与打印：用磷酸盐缓冲液充分溶解新霉素样品粉末，配制浓度为5000μg/ml的新霉素溶液，取出100 μl配置好的新霉素溶液滴加到黑色墨盒，作为打印用的“墨”；将步骤4）的含有金黄色葡萄球菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”， 打印出按照步骤2）所编辑的图形；
6) 新霉素MIC值的计算：将打印了新霉素的含有金黄色葡萄球菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养18-24h，孵育后形成一个边缘平滑的椭圆形抑菌圈。新霉素MIC值通过计算最初打印的新霉素条带与椭圆形抑菌圈边缘相交处的新霉素的量而得到。具体计算公式见式(1)：
MIC = (S/256) *(l/60) * C *R*V ------ (1)
式中S 为所编辑矩形梯度渐变灰阶条的面积(S=300mm2)，N为矩形梯度渐变灰阶条的灰阶级数(N=256)，l表示灰阶条纯白端到灰阶条与椭圆抑菌圈边缘相交处的直线距离(mm)，L为所编辑的灰阶条的长度(L=60mm)，C为滴加到墨盒中待测抗生素样品的初始浓度(μg/ml)，R为所使用的打印机的分辨率(R=1200×4800d.p.i =1200×4800/25.4 d.p.mm)，V为打印机最小喷墨液滴的体积(V=2×10-9ml)。
本例中加入到黑色墨盒中的新霉素溶液的浓度为5000μg/ml，测得的l值为7mm，按照式(1)可计算出阿米卡星对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.310μg/ml。
实施例1至3的数据显示：与传统MIC测定方法相比，基于喷墨打印原理的MIC测定方法不仅操作更便捷，MIC测定结果极其精细。
Claims (5)
1.基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：
1) 喷墨打印机的改造：拆除打印机主体的基座、卷纸装置及废墨清除装置；拆除墨盒的外盖、墨盒内的吸墨海绵以及墨盒底部的过滤网，彻底清洗干净后用紫外灯灭菌；
2) 编辑用于控制抗生素打印的梯度渐变灰阶条带：利用PowerPoint软件编辑一个宽A、长B的矩形梯度渐变灰阶条带，该条带的一端为灰阶值255的纯白，另一端为灰阶值0的纯黑，中间部分呈从白到黑的渐变状态，其灰阶值为从255递减到0的整数，整个矩形梯度渐变灰阶条带共256级灰阶级数；
3) 实验菌悬液的制备：配制Mueller-Hinton肉汤：牛肉浸出粉0.2%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，pH7.4±0.2，121℃灭菌15min；用接种环挑取实验菌菌落3-5个，接种于5ml配制好的Mueller-Hinton肉汤中，35℃孵育8-12h后用生理盐水将其浓度稀释至1~2×108CFU/ml；
4) 含菌琼脂玻璃双碟的准备：配制Mueller-Hinton琼脂培养基：牛肉浸出粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，琼脂1.7%，pH7.3±0.2，121℃灭菌15min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，注入15-20ml灭菌后的Mueller-Hinton琼脂培养基，使其冷却凝固；用无菌棉签蘸取步骤3) 制备的实验菌悬液，在凝固的琼脂培养基表面均匀涂布接种3次，室温下干燥15min，备用；
5) 待测抗生素样品的准备与打印：用磷酸盐缓冲液充分溶解待测抗生素样品粉末，控制待测抗生素样品的浓度在103-105μg/ml之间，取出100 μl配置好的待测抗生素样品滴加到黑色墨盒，作为打印用的“墨”；将步骤4）的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”， 打印出按照步骤2）所编辑的梯度渐变灰阶条带；
6) 抗生素MIC值的计算：将打印了待测抗生素样品的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养18-24h，形成一个边缘平滑的椭圆形抑菌圈；
由公式 (1) 计算抗生素MIC值：
MIC = (S/N) *(l/L) * C *R*V ------ (1)
式中S 为所编辑矩形梯度渐变灰阶条带的面积，单位为mm2；N为矩形梯度渐变灰阶条带的灰阶级数；l表示灰阶条纯白端到灰阶条与椭圆抑菌圈边缘相交处的直线距离，单位为mm；L为所编辑的灰阶条的长度，单位为mm；C为滴加到墨盒中待测抗生素样品的初始浓度，单位为μg/ml；R为所使用的打印机的分辨率，单位为d.p.mm；V为打印机最小喷墨液滴的体积，单位为ml。
2.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，其特征是所说的喷墨打印机为商业化喷墨式打印机。
3.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，其特征是矩形梯度渐变灰阶条带的宽A=5mm、长B=60mm。
4.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，其特征是所说的抗生素为水溶性抗生素，包括青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、氨基糖苷类抗生素以及其他临床上应用的水溶性抗生素。
5.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理测定抗生素最低抑菌浓度的方法，其特征是所说的实验菌为非厌氧性的致病或非致病菌，包括肠杆菌类，棒杆菌类，嗜血杆菌类，芽孢杆菌类，葡萄球菌类，链球菌类，念球菌类，淋球菌类，双球菌类及弧菌类。
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