JPS5832879B2 - コウセイブツシツノ ソンザイノ ソクテイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体（たとえば牛乳）および肉牛の抗生物質、
たとえばペニシリンの残留物の存在または不存在の迅速
測定法に関する。

牛乳および類似液体中の抗生物質残留物、特にペニシリ
ン残留物の測定法は古くから既知であって、幾つかの国
では幾つかの標準法が公式に認められている。

その例はニール（Ｎｅａｌ ） ラのＪ。Ｄａｉｒｙ
５ｃｉｅｎｃｅ ３８巻、６２９〜６３３頁（１９５５
年）の方法のようないわゆるＴＴＣ法（２、３、５−ト
リフェニルテトラゾリウムクロリドを含む）、ビンセン
ト（Ｖｉｎｃｅｎｔ ）らのＰｒｏｃ、 Ｓｏｃ、 ｅ
ｘｐ。

Ｂｉｏｌ、 Ｍｅｄ、 １６２巻、５５頁（１９４４年
）の方法に基礎を置いたガレスルート（Ｇａ１ｅｓｉｏ
ｏｔ ）らのＮｅｔｈ、 Ｍｉ ｌｋ ＆Ｄａｉｒｙ
Ｊ、 １６巻、８９〜９５頁（１９６２年）のバチルス
・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）またはバチルス・
カリドラクチス（Ｂ、 ｃａｌｉｄｏｌａｃｌ ｉｓ
）を使う方法、およびヤコブズ（Ｊａｃｏｂｓ ）らの
Ｔｉｊｄｓｃｈｒ。

Ｖ、 Ｄｉｅｒｇｅｎｅｅｓｋ ７９巻、９号、５４８
〜５５０頁（１９７２）の方法である。

ガレスルートらの方法は、試験しようとする牛乳に浸漬
した紙ディスクをペトリ皿上のバチルス・ステアロテル
モフィルスまたはバチルス・カリドラクチスの寒天培養
物上に置き、５５℃で２１／２時間恒温培養することに
よって実施される。

抑制帯の生成は牛乳中のペニシリン（またはこれらバチ
ルス類を抑制する他物質）の存在の証拠である。

ガレスルートらの方法は１ｍｌあたりペニシリン約０．
００２５ＩＵ（国際単位）の感度をもつが、バチルス類
の新しい培養物を使う必要があるから、未熟練者が行な
うのに不適当である。

更に、熟練していない人が行なうときは、この試験の信
頼性は比較的低い。

上記ガレスルートの方法の信頼性を増すために、Ｈ０モ
ル（Ｍｏｌ）、Ｎｅｔｈ、 Ｍｉ ｌｋ ＆Ｄａｉｒｙ
Ｊ、 ２３巻、１５３〜１６２頁（１９６９年）はペ
トリ皿中で調製したバチルス・ステアロテルモフィルス
変種カリドラノチスの胞子を使用する。

使用前に、Ｆ紙片をペプトン２０％とグルコース２０％
の水溶液に浸漬しついで乾かして得られる栄養ディスク
を、牛乳試料に浸漬し、寒天上に置く。

ペトリ皿を６３℃で６時間恒温培養し、抑制帯の存在に
よってペニシリンの存在が認められる。

モルの方法で信頼性は増すが、なお、幾つかの欠点があ
る。

まず、特に未熟練者には抑制帯を認めることが困難であ
る。

更に、試料の容量の再現性が不十分である。

適当な迅速試験のためには、次の要件を満す必要がある
。

（１）迅速でなければならない。

（ｉｌ）実際に使われる広範囲の抗生物質に対して高感
度を示す必要がある。

（ｉｉＤ 試験物質を含む容器は妥当な長時間（数カ
月またはそれ以上）貯蔵できる必要がある。

（Ｖ） 試験は安価でなければならない。

（ｖ）未熟練者が実施するときでも、試験は信頼できる
結果を与える必要がある。

たとえば予めきめた濃度の抗生物質の存在を示すように
試験を適合させるとき、十分に信頼性ある正または負の
結果を与える必要がある。

モルの方法はある程度まで（１）〜４■）の要件を満た
すが、Ｍの要件を満たさず、信頼性ある結果を得るには
熟練者が試験を実施する必要がある。

上記幾つかの概念を考慮して、上記の５つのすべての要
件を満たしかくして未熟練者も容易に実施できる液体中
の抗生物質の迅速測定法が本発明者によって開発された
。

本発明によれば、測定しようとする抗生物質に対して高
感度を有する微生物（バチルスステアロテルモフィルス
変種力リドラクチス）の胞子を栄養物がないため発芽し
始めないが生存しているように寒天培地中に伴ないかつ
充分に濃く接種しそして次いで培養することにより調製
した胞子培養物を、寒天培地の最少量が必要であるよう
に小さいが該微生物の生長抑制の適切な測定が可能であ
るように大きい横断面（好ましくは３〜２０ｒｒｒｍ、
さらに好ましくは６〜１４ｍの寸法）を有しかつ充分量
の培地（試験時間と栄養素の拡散速度とによって定めら
れる）と充分量の試験しようとする試料とを含むことが
できるような高さく培地と試料との合計の高さは、好ま
しくは３〜３０ｍｍ、さらに好ましくは５〜１０ｒｒｒ
Ｉｎである）を有する試験用直立管中で、固化せしめる
ことによって得られた固化胞子培養物の表面上に栄養素
を導きそして次いで（前培養（予備培養）が望まれる場
合は前培養後に）予め定めた量の試験しようとする試料
を導き；これを最適温度またはその付近の温度（例えば
５５〜７０℃の温度）で所望の短時間培養し；その後微
生物の生長または生長の抑制を、目視または寒天培地も
しくは栄養素に添加した指示薬による表示によって観察
し、それによって試料中の抗生物質の有無を測定するこ
とを特徴とする試料中の（ミルクのような液体中および
内申の）残留抗生物質（例えばペニシリン）の有無の測
定方法が提供される。

上記方法を規格化するとき、未熟練者でも試験を容易に
行なって信頼ある結果が得られ、またある場合には試料
中に存在する抗生物質量の大体の定量的評価さえ可能で
あり、またはその感度を越えた濃度の存在を検出できる
。

試験容器の垂直位置での寒天培地の固化は、試料および
培地の規格化量と結びついて、寒天培地の表面積の大き
さを十分に規定する利点を有し、そこで栄養化合物を導
入するとき、信頼性ある恒温培養結果が得られ、これは
半定量的であり得る。

指示薬を胞子含有寒天培地または栄養素に添加できる。

指示薬を寒天培地に含めるときは、試験実施前に培地中
で一層良い分布が得られる。

更に、試験の感度が一層高くなり、また牛乳以外の液体
の場合、試料から生じる着色不純物によって色がそれほ
ど汚染されない。

指示薬はブロムクレゾール・パープルまたはフェノール
・レッドのような酸塩基指示薬、または２，３，５−Ｍ
Ｊフェニルテトラゾリウムクロリドのようなレドックス
指示薬であることができる。

ペニシリンの測定には、ブロムクレゾール・パープルの
使用が好ましい。

試験微生物の最適生長速度、および試験しようとする抗
生物質の活性、および抗生物質に対する上記微生物の感
度に対しては、培地のｐＨが重要である。

バチルス・ステアロテルモフィルス変種カリドラクチス
に対しては、たとえば最適生長速度を得るためには、培
地のｐＨは試験時間のはじめに約７であるべきである。

ブロムクレゾール・パープルのような適当な指示薬を使
うことによって、ごく短かい試験時間を達成できる。

試験時間は幾分より長くなるが、約８のｐＨを有する培
地で試験をはじめることによって、ある種の抗生物質、
特にストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン
、カナマイシン、ネオマイシンのようなアミノグルコシ
ド抗生物質に対する試験感度を増すことができる。

この場合の適当な指示薬は、たとえばフェノール・レッ
ドである。

しかし、適当なｐＨで各抗生物質が微生物の生長を抑制
するような方式で試験中培地のｐＨを下げるとき、他の
抗生物質に対する感度は不利には影響を受けない。

試験の開始と終了の間のｐＨ範囲は、望むときは混合指
示薬の使用によって拡張できる。

一層適した胞子または胞子の組合せを使うことによって
、ある種の抗生物質に対する試験感度を適合させること
ができる。

本発明の目的には、胞子を形成でき試験しようとする抗
生物質に対し十分感度をもつすべてのバクテリアからの
胞子を使用できる。

１つの種または菌株の胞子を使うことによって、または
異なる微生物の胞子の混合物を使うことによって、異な
る抗生物質に対する感度の適当なスペクトルを得ること
ができる。

適当な胞子は、含まれる抗生物質に対し適当な感度を有
するバチルス属の胞子形成体の胞子、たとえばバチルス
・カリドラクチス〔フソング（Ｈｕｓｓｏｎｇ ）ら、
Ｊ、 Ｂａｃｔ、 １５巻、１７９〜１８８頁（１９２
８年）〕、バチルス・ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、バチルスＳステアロテルモフィルス（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ７版、６１３−６９
３頁（１９５７年）〕、ガレスルートら、Ｎｅｔｈ、
Ｍｉ ｌｋ ＆ Ｄｉａｒｙ Ｊ、 １３巻、１５５−
１７９頁（１９５９年）に記載の好熱性バチルス類、バ
チルス・ステアロテルモフィルス変種カリドラクチス〔
モル、Ｎｅｔｈ、 Ｍｉｌｋ ＆ Ｄｉａｒｙ Ｊ。

２３巻１５３−１６２頁（１９６９年）〕、ザ・ネーザ
゛−ランズ・インスチチュート・フォー・ディリー・リ
サーチ・アト・ニブ、ザ・ネーザーランズのバチルス・
カリドラクチス菌株Ｃ９５３（ガレスルートら、Ｎｅｔ
ｈ、 Ｍｉ Ｉｋ ＆ Ｄａｉ ｒｙ Ｊ、 １６巻、
８９−９５頁（１９６２年）〕からの胞子である。

好ましくは、バチルス・ステアロテルモフィルス・変種
カリドラクチスからの胞子を使い、この微生物はラボラ
トリ−・フォー・ミクロビオロジー・アトデルフト、ザ
・ネーザーランズ（Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏ
ｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｔ Ｄｅｌｆｔ 、
Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ）に寄託されており
、番号り、Ｍ、Ｄ、Ａ７４．１がつけられている。

またこの微生物は昭和４９年５月２８日付で工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託され、その微生物受託番号
は微工研菌寄第２５９９号である。

この微生物はペニシリン−０１ペニシリン−■に対し高
感度を有し、非常に高い生長速度を有し、また他の微生
物がふつうは生長しないような比較的高い最適生長温度
を有する追加の利点をもつので、感染の機会が減る。

この微生物の胞子はペニシリン−０１ペニシリン−■、
および他の天然ペニシリン類に対し感性であるだけでな
く、幾つかの他の抗生物質たとえば半合成ペニシリンた
とえばナフシリン、クロキサシリン；セファロスポリン
類；アミノグルコシド抗生物質たとえばストレプトマイ
シン、ジヒドロストレプトマイシン、ネオマイシン、カ
ナマイシン；テトラサイクリン類たとえばクロルテトラ
サイクリン；クロラムフェニコール；マクロライド抗生
物質たとえばオレアンドマイシン、エリスロマイシン：
ポリペプチド抗生物質；幾つかの化学療法剤たとえばト
リメトロブリム、スルファトキシン、フラジリドンに対
しても感性であるから、本発明の方法は必要ならｐＨの
調節後これらの抗生物質および化学療法剤の存在を示す
のにも有用である。

本発明で使うためには、培養物は寒天培地１ｍｌ当り微
生物の胞子１０５〜１０８を、特に培地１ｍｌ当り胞子
１０６〜１０７を含むのが好ましい。

胞子培養物の適当な調製法は、ヤオ（Ｙａｏ ）らのＡ
ｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １５巻、４５５頁（１９６７年
）に記載のように、上記微生物を寒天上表面培養で、ま
たは振とうフラスコまたは発酵器で深部液体培養で恒温
培養することである。

胞子が生存しているが発芽をさまたげられるような方式
で寒天培地に胞子を合体するのが好ましい。

生理学的塩溶液および（または）指示薬を寒天に添加で
きるが、微生物の栄養を含むべきではない。

通常試験しようとする牛乳および他の液体中に存在し、
抗生物質ではない抑制剤、たとえばロイコサイトによっ
て生産される生成物の影響をかなりの程度減らせること
は本発明の方法のその上の利点である。

これは従来既知の方法では通常はできなかった。

この抑制剤の影響の減少は、抑制剤が試験容器たとえば
試験管の内側の寒天中に拡散しないかまたはかなりの程
度までは拡散しない事実に起因している。

この事実は本法の信頼性を増すことは明らかであり、牛
乳試料がわずかに変化した外観をもっているときでさえ
も、この抑制剤を不活性化するための牛乳の予備処理は
ふつう不必要であるから、便利な試験法という別の利点
をもつ。

上記胞子を含む寒天培地を垂直試験容器中で固化させる
。

試験結果が十分信頼性があるためには、この容器は予め
決めた寸法を持つことが好ましい。

本発明による試験をある決めた環境で行なうときは、抗
生物質は寒天中に拡散し、寒天中で減少する濃度勾配を
形成するから、本試験はある程度まで定量的にさえなる
。

抗生物質濃度がある水準以下の領域では、生長の抑制は
起きないから、培地は微生物の生長によって影響を受け
、存在する指示薬はその色を変える。

抗生物質濃度が上記水準以上の領域では、生長の抑制が
起り、指示薬はその色を変えない。

指示薬の色が変化する試験容器たとえば試験管中の寒天
培地の高さが試験の感度を規定する。

本発明による容器中の固化寒天の高さを規格化すること
によって、本発明の容器において感度を確立できる。

抗生物質がある値以下の濃度で存在するときは指示薬が
その色を変えるが、抗生物質濃度がこの値以上のときは
その色を変えないような方式で、胞子含有寒天の高さを
選ぶ試験法を開発するのに上記の特徴を有利に使える。

試験容器の断面寸法は好ましくは３〜２０ｒｒａｎ、更
に好ましくは６〜１４ｍ＋＋＋であり、また容器が好ま
しくは３〜３０ｍの高さに相当する培地と試料の量を含
むことができるような容器の高さである。

試験を定量試験のために準備する場合は、すなわち抑制
帯の高さから幾分定量的結果を読むことのできる試験の
ために準備する場合は、この高さは好ましくは２０〜３
０ＷｒｒＬである。

ある濃度の抗生物質が存在するかどうかを読む試験のた
めに準備する場合は、その高さは好ましくは５〜１５間
である。

液状寒天培地の予め決めた量を充たしたら、水平寒天表
面が得られるように試験容器を垂直位置にして、内容物
を固化させる。

胞子を含む固化した寒天培地を含む試験容器を密閉でき
る。

この条件で胞子がその生存能力を失なうことなく、必要
なら冷凍器で少なくとも数カ月貯蔵できる。

抗生物質の存在の試験を行なう場合は、指示薬を含有で
きる必要な栄養化合物をまず試験容器中の胞子含有寒天
培地の表面に置く。

液状の栄養化合物の予め決めた量を寒天培地表面に置く
ことができるが、栄養素が一層良い貯蔵安定性をもつよ
うに、乾燥状態の必要な栄養化合物を含んでいる乾燥形
の、好ましくはＦ紙ディスクまたは錠剤形の栄養素を使
うのが好ましい。

上記ディスクまたは錠剤を培地上に置くとき空気の捕獲
を防ぐように、ディスクまたは錠剤は容器の断面積より
も小さいことが必要である。

空気の捕獲は寒天中の拡散パタンに影響を与える。

使う栄養素は、適用する菌株に依存して、好ましくはグ
ルコースおよびペプトン形で少なくとも同化性の炭素源
および窒素源を含むべきである。

この栄養ディスクまたは錠剤は指示薬および（または）
緩衝剤を含むことができる。

寒天培地表面に栄養化合物を置いた後、試験しようとす
る液体、一般には牛乳または肉の予め決めた量を試験容
器内容物に加える。

寒天培地表面に栄養素をおいた後直接これを行なうこと
ができ、また前恒温培養時間後に行なうことができる。

栄養素が乾燥形であるときは、前恒温培養法においでは
、幾分かの水または生理学的塩溶液も添加する。

たとえば、牛乳のバッチが工場について、ある種の目的
に、ペニシリン（または他の抗生物質）の不在が確定し
た後にだけ行なえるのだが、たとえば人間の消費用に牛
乳として配給するため、バターおよびチーズ製造のため
、またはヨーグルト発酵のため使う場合に、試験結果が
わかるまで上記バッチの使用前に待つ時間を一層短縮で
きる利点を上記後者の操作は有している。

前恒温培養時間を使うことによって、試験試料の存在に
おける恒温培養を、前恒温培養時間を用いないときより
も短縮できる。

この前恒温培養時間は、環境に依存して約１時間までで
あることができる。

温度を一定に保つため熱ブロックを使い輸送中試験を開
始することによって、試験する液体、一般には牛乳を工
場に輸送する時間を一層経済的に利用もできる。

また、上記方法の組合せも使用できる。

恒温培養時間（前恒温培養時間も含め）は環境、たとえ
ば使う胞子、使う栄養素および温度に関係スル。

バチルス・ステアロテルモフィルス変種カリドラクチス
の胞子を使うときは、適当な恒温培養温度は約５５〜７
０℃、好ましくは６０〜６５℃であり、信頼性ある結果
が得られる恒温培養時間は比較的短かくて、約１７〜４
時間、好ましくは２〜３時間である。

上記試験は特に牛乳用に開発されてきたが、他の物質た
とえば寒天上に置かれた肉の小片、肉試料からしぼった
肉汁、または低温凍結したおよび冷凍をもどした肉から
のしたたり落ちた液にもこの試験を使用できる。

この目的には、防害因子を無効にするよう、栄養素を適
合させる必要がある。

適当な薬品、たとえばｐＨ緩衝剤を試験に添加すること
によって上記を行なえる。

硫酸鉄（ＩＩ）を添加することによって、ラクトフェリ
ン、セロフェリンのような防害因子を無効にできる。

層殺動物中の抗生物質の残留物の予備ふるいとしては、
抗生物質は尿中に蓄積するので、試験を尿に適用できる
。

未希釈尿試験には、錠剤中に適当なｐＨ緩衝剤を使うこ
とによって、尿のｐＨを試験に適合させる必要がある。

添加剤を使わずに尿試料を試験できるが、この場合には
試料を水で約１０倍うすめる必要がある。

試料中に存在する抗生物質がペニシリンかまたは他の抗
生物質かを決めるために、試験を２つの試験容器で行な
うことができる。

１つの容器には、ペニシリナーゼを含む栄養錠剤または
別の錠剤またはディスクを加え、一方他の容器にはペニ
シリナーゼを添加せずに栄養錠剤を加える。

ペニシリナーゼが存在すると、試験中ペニシリナーゼに
耐性のないペニシリンは分解する。

ペニシリナーゼの代りに、システィンのような他の特異
的ペニシリン不活性化剤を使うこともできる。

本発明の方法では、液体（たとえば牛乳）または肉牛の
残留抗生物質（たとえばペニシリン）の迅速測定用試験
容器が用いられ、これは試験しようとする抗生物質に対
して高感度を有する微生物の胞子からなっており、また
栄養素を添加し最適温度またはその付近で短時間恒温培
養後は十分な生長が進んでその生長が目でみえるかまた
は培地に加えた指示薬によって示されるほど十分に濃く
接種されており、上記胞子培養物は垂直位置の試験容器
内で固化している。

この試験容器は特に上で述べた巾と高さの寸法をもつこ
とができる。

本発明の方法では、一定数の試験容器の組合せ、たとえ
ば試験容器を形成する多数の孔を備えた半透明物質のブ
ロックも用いられうる。

別の具体化では、胞子懸濁物を含む試験管またはアンプ
ル形であることができる容器を、適当な格子だなまたは
かごによってセットに集めることができる。

上記のように、寒天培地を含む試験容器を、適当な貯蔵
条件特に温度を維持することによって長時間貯蔵できる
。

大気によって、多分大気中の二酸化炭素の存在によって
、試験容器中の寒天培地のｐＨは貯蔵中影響を受ける。

そこで、アンプルのように試験容器を貯蔵中好ましくは
空気と触れぬよう閉じて置く。

寒天は容器壁からはがれる傾向がある。

胞子の栄養素または抑制剤として働かない粘着剤を寒天
に添加することによって、上記の傾向を減らすことがで
きる。

適当な粘着剤の例はナトリウムカルボキシメチルセルロ
ースおよびツイン（商品名）として知られるソルビタン
エステルである。

本発明の方法では、液体（たとえば牛乳）または肉牛の
残留抗生物質（たとえばペニシリン）の迅速測定用のセ
ットも用いられ、これは上記のような１つまたはそれ以
上の試験容器から成っているが、更に上記のような乾燥
形の必要な栄養素を含んでいる和尚する量のディスクま
たは錠剤と、ディスクまたは錠剤を寒天培地表面に置い
て試料液の予め決めた量を寒天表面上にもたらすための
随時の装置とを含んでいる。

上記セットを、スチロポア（発泡ポリスチレン）プラス
チック物質のような適当な包装材でつつむことができる
。

上記試験容器は、栄養ディスクまたは錠剤を含むことも
できる。

このディスクまたは錠剤は寒天培地から水分を吸収する
から、ふつうのまたは貯蔵温度で水分が培地から錠剤ま
たはディスクに移動するのを防ぐが試験条件では栄養素
の移動を許す層で被覆される。

適当な被覆物の例は、約３５〜５５℃の、好ましくは４
０〜４５℃の融点をもつワックスの被覆物である。

上記セットは、他の有用な付属品、たとえばペニシリン
（または他の抗生物質）含量のおよその評価を抑制帯の
高さから読むことができる検査ピクチャ（ｐｉｃｔｕｒ
ｅ ）を含むこともできる。

また、予め決めた量の試料を試験容器に導入するための
装置を含むことができる。

好ましくは、ペニシリンまたは他の抗生物質を有さない
１つのブランク試料、たとえば無添加水（ｐｌａｉｎ
ｗａｔｅｒ ）を含めてセットの良好な働らきを制御で
きる。

上記のように、本法は牛乳中の抗生物質残留物、たとえ
ばペニシリン残留物の測定に使用できる。

しかし、他の液中の抗生物質の残留物も本法によって測
定できる。

たとえば、肉、器官、腎臓、食料品、飼料をしぼって得
られる液体、たれ液（ｄｒｉｐｌｉｑｕｉｄ ）および
血清、尿のような他の液体中の抗生物質残留物の測定に
使える。

必要なら、ｐＨ制御のため緩衝剤を添加できる。

この緩衝剤は動物によって異なることができる。

実際に使う場合、他の抗生物質の検出のため他の微生物
を使用できる。

勿論、これは培地、栄養素、恒温培養条件の適合を含む
ことができる。

本発明を次の実施例で例示する。

実施例 １ 試験管の準備 バチルス・ステアロテルモフィルス変種カリドラクチス
（Ｌ、Ｍ、Ｄ、嵐７４．１；微工研菌寄第２５９９号）
の培養物を、 バクト培養寒天、ジフコ記号０００１ １５Ｓ’（
ジフコは商品名） バクト寒天、ジフコ記号０１４０ ５ｆブドウ
糖 ０．５Ｌ？Ｍｒ
ｌＳＯ４・Ｈ２０３０ｍ９ 蒸留水 １ｏｏｏｍｌ からなり、１２０℃で２０分殺菌した培地に接種する。

接種後、培地を６０℃で少なくとも４８時間、良好な胞
子形成が認められるまで恒温培養する。

胞子を集め、蒸留水で洗い、４℃で貯蔵する。生存胞子
の量は バクト寒天、ジフコ記号０１４０ ２０ｆバクト
・トリプトン、ジフコ記号０１２３ ８．５？フイト
ン・ペプトン、ＢＢＬ記号１１９０５ １．５ｆ？ブ
ドウ糖 ５１蒸留
水 １０１００Ｏ からなり、１２０℃で２０分殺菌した培地で試験するこ
とによって検出する。

接種後、培地を６０℃で４８時間恒温培養し、その後コ
ロニーを数える。

胞子懸濁物が１ｍｌ当り生存胞子約１０８個を含むまで
、蒸留水を胞子懸濁物に加えるかまたは水を除去する。

１ｒｒＬｌ当り１０８の微生物を含む上記胞子懸濁物１
％を次の溶液に添加する。

バクト寒天、ジフコ記号０１４０ １２Ｓ’塩
化ナトリウム ９１蒸留水
１０１００Ｏまで、１２０ ℃で２０分殺菌。

培地を加熱して液化し、６０℃に冷す。

約９ｒｒｒＩｎの断面寸法を有する殺菌試験管に各々、
上記で得た培地０．５１ｒＬｌをみたす。

試験管内容物を、管を垂直位置に保持して固化させる。

この管を４℃で貯蔵する。

栄養ディスクの準備 次の培地をつくる。

（ａ） ０．０２ＮＮａＯＨ９，２ＴＬｌに溶かした
ブロムクレゾール・パープル（０，１Ｓ’）を蒸留水で
薄め２５７７１１にする。

（ｂ） ブドウ糖 ５
０Ｌ？蒸留水 ５０ＴＬｌ
（Ｃ） バクトドリプトン、ジフコ記号０１２３ ３
４グフイトン・ペプトン、ＢＢＬ記号１１９０５ ６Ｓ
’蒸留水 １００ｍ１ 溶液（ａ）と（ｂ）はザイツ（５ｅｉｔｚ ）濾過器を
通して殺菌し、培地（ｃ）は１１０℃で３０分殺菌する
。

培地（ｃ）は懸濁物で残る。

溶液（ａ）５部、溶液（ｂ）２部、懸濁物（ｃ）３部を
混合し、得られる溶液０．０４ｍ１を約８７＃ｌの断面
寸法をもつＥ紙ディスクと接触させ、ディスクを乾かす
。

実施例 ２ 試験の実施 ペニシリン−〇を新鮮な牛乳に添加して、ＩＴＬｌ当り
０．１．０．０３．０．０１．０．００３．０．００１
１Ｕの濃度にする。

一方ペニジリン−〇を含まない牛乳の１試料をブランク
試験にかける。

実施例１の方法でつくった６個の試験管に各々栄養ディ
スクを入れ、試料者０．２ｍを試験管に入れる。

直ちに、試験管を６５℃の水浴に入れる。

３時間および４時間後、観察する。

結果は次の通りである。ブランク試料：寒天の色は黄色
、 ０、０１ ＩＵ／ｒｒＬｌより小さい試料：寒天は黄色
に着色、 ０、 ＯＩ ＩＵ／ｍｌおよびそれ以上の試料：培地は
紫色に着色。

実施例 ３ 既知試験の感度と比較した本試験の感度 次の表−１に、実施例１の方法で造った試験管および栄
養ディスクを用いて行う試験の感度を抗生物質残留物測
定の既知の試験すなわちショットホルスト（５ｃｈｏｔ
ｈｏｒｓｔ ）、ペーレンークノル（Ｐｅｅｌｅｎ −
Ｋｎｏｌ ）、Ｔｉ ｊｄｓｃｈｒ、 Ｖ、 Ｄｉｅｒ
ｇｅｎｅｅｓｋｇ５巻、４３８−４４５頁（１９７０）
に記載のオランダで規定された腎臓試験、およびＧｅｒ
ｍａｎＢｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓ −Ａｍｔ
、 ｃｆ 、 Ｌｅｖｓｔｚｏｗ。

Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓ ｂｌａｔｔ ｉ
４巻、３０−４２頁（１９７１年）、バルテルズ（Ｂ
ａｒｔｅｌｓ ）ら、Ｄｉｅｆｌｅｆｓｃｈｗｉｒｔｓ
ｃｈａｆｔ ５２巻、４７９−４８２頁（１９７２年）
により開発されたドイツ法の感度と比較して示す。

本発明の試験は２つの方式で実施される。

まず、食塩水に溶かした表に示した抗生物質で試験を行
ない、第２に表に示した抗生物質で汚染された牛乳で行
なう。

第１の方式は試験を肉試験として行なうとき、期待でき
る効果を与える。

感度をμｆ？／ｍｌで示した表かられかるように、本発
明の試験法は表に示した抗生物質の大部分に対して腎臓
試験よりも感度がよい。

これはドイツ試験法と比較しても同様である。

本発明の試験はペニシリンに対しはるかに感度が高い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 測定しようとする抗生物質に対して高感度を有する
   微生物を寒天培地中に導入しそして培養物を固化せしめ
   ることによって得られた固化培養物に試験しようとする
   試料を導き、予め定めた時間の間最適温度またはその付
   近の温度で培養し、その後微生物の生長または生長の抑
   制による抗生物質の有無を観測することからなる、ミル
   クのような液体中または肉牛の残留抗生物質の有無を迅
   速に測定する方法において、 微生物バチルス ステアロテルモフィルス変種力リドラ
   クチスの胞子を栄養物がないため発芽し始めないが生存
   しているように寒天培地中に伴ないかつ充分に濃く接種
   しそして次いで培養することにより調製した胞子培養物
   を、寒天培地の最少量が必要であるように小さいが該微
   生物の生長抑制の適切な測定が可能であるように大きい
   横断面を有しかつ充分量の培地と充分量の試験しようと
   する試料とを含むことができるような高さを有する試験
   用直立管中で、固化せしめることによって得られた固化
   胞子培養物の表面上に栄養素、そして次いで予め定めた
   量の試験しようとする試料を導き；これを５５〜７０℃
   の温度で短時間培養し；その後微生物の生長または生長
   の抑制を、目視または寒天培地もしくは栄養素に添加し
   た指示薬による表示によって観察し、それによって試験
   中の抗生物質の有無を測定することを特徴とする該測定
   方法。