DE2425999A1

DE2425999A1 - Verfahren zum nachweis von antibiotika und vorrichtung zu seiner durchfuehrung

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Publication number: DE2425999A1
Application number: DE19742425999
Authority: DE
Inventors: Sophia Adriana Lameris; Joannes Gerard Oostendorp; Jan Lambert Van Os
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1973-05-31
Filing date: 1974-05-30
Publication date: 1974-12-19
Also published as: US4946777A; US3941658A; FR2231966B1; AR210724A1; JPS5832879B2; NL7407251A; IE39293B1; FR2231966A1; DK292674A; CA1040517A; NL162138B; IE39293L; JPS5033897A; SE7407176L; DE2425999B2; DK151898C; DK151898B; BR7404400D0; SE418621B; NL162138C

Description

" Verfahren zum Nachweis von Antibiotika und Vorrichtung zu seiner Durchführung "

Priorität: 31. Hai 1973, Großbritannien, Nr. 25 9^7/73

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nächweis von Antibiotika in Flüssigkeiten und eine Vorrichtung zu seiner Durchführung.

Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Restraengen an Antibiotika, wie Penicillin, in Milch und anderen Flüssigkeiten bekannt. Einige dieser Verfahren sind als Standard-Verfahren allgemein anerkannt. Beispiele für derartige Verfahren sind das sogenannte TTC-Verfahren'(Verfahren mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlprid), wie das Verfahren nach Neal et al., J. Dairy-Science, Bd. 38 (1955), Seiten 629 bis 633, und ein Verfahren nach Galesloot et al., Neth. Milk & Dairy J., Bd. 16 (1962), Seiten 89 bis 95, das auf einem von Vincent et al·., Proc. Soc_%. exp.· Biol.Med., Bd. 162 (19/+4), Seite 55, beschriebenen Ve'r- ■ fahren beruht und die Mikroorganismen Bacillus stearothermophi-

lus oder Bacillus calidolactis verwendet, sowie das Verfahren ^L 409851/1027

nach Jacobs et al., Tijdschr. v. Diergeneesk., Bd. 79 (1972), • Seiten 548 bis 550. Das Verfahren nach Galeslopt et al. wird - so durchgeführt, daß man mit der zu untersuchenden Milch getränkte runde Papierstücke in Petrischalen auf Kulturen des Bacillus stearothermophilus oder Bacillus calidolactis legt, die auf einem Agar-Nährmedium gezüchtet wurden, und 2 1/2 Stunden bei 55⁰C inkubiert. Das Entstehen von Heinrazonen ist ein Zeichen für die Anwesenheit von Penicillin oder anderer das Wachstum' dieser Bakterien hemmenden Verbindungen in der untersuchten Milch. Das Verfahren hat eine Empfindlichkeit von etwa 0,0025 IE (Internationale Einheiten) Penicillin pro ml, erfordert Jedoch zur Durchführung besonders geschultes Fachpersonal, . weil frisch gezüchtete Bacilluskultüren verwendet werden müssen. Die Untersuchungsergebnisse sind jedoch verhältnismäßig unzuverlässig, wenn das Verfahren von Laborpersonal ohne spezielle Fachkenntnisse durchgeführt wird.

Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens nach Galesloot et al. zu erhöhen, hat H. MoI₁ in der Zeitschrift Neth. Milk & Dairy J., Bd. 23 (1969), Seiten 153 bis 162, vorgeschlagen, in Petrischalen erhaltene Sporen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis zu verwenden. Dabei wird ein scheibenförmiger Nährboden, der durch Tränken eines Stück Filterpapiers mit einer wäßrigen Lösung von 20 Prozent Pepton sowie 20 Prozent Glucose und anschließendem Trocknen erhalten wurde, mit der zu untersuchenden Milch getränkt und auf ein Agar-Nährmedium gelegt, auf das vorher die Sporen aufgebracht wurden. Nach 6-stündigem Inkubieren der Petrischalen bei 63⁰C kann man an der Bildung von Hemmzonen die

Anwesenheit von Penicillin erkennen. ^u 409851/1027

Das Verfahren nach Mol ist zwar zuverlässiger als das nach Galesloot, hat jedoch noch verschiedene Nachteile. Vor allem ist' für unerfahrenes Laborpersonal die Hemmzone schwierig zu erkennen. Auch ist das Volumen der untersuchten Probe schlecht reproduzierbar. .

Ein Nachweisverfahren muß folgende Bedingungen erfüllen: 1.Es muß in kurzer Zeit durchführbar sein;

2. es soll für einen großen Teil der in der Praxis eingesetzten Antibiotika sehr empfindlich sein;

3. es soll billig sein;

4. es soll auch bei Ausführung durch ungeschultes Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse liefern.

5. Die Gefäße, welche die für das Verfahren nötigen Substanzen enthalten, sollen mehrere Monate oder langer lagerfähig sein.

Da-S Verfahren nach Mol erfüllt bis zu einem gewissen Grad die Bedingungen von Ziff. 1, 2, 3 und 5_f jedoch nicht die Bedingung von Ziff. 4 und benötigt deshalb zu seiner Durchführung "besonders geschultes Fachpersonal. -

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Antibiotika in Flüssigkeiten zu schaffen, das die vorgenannten 5 Bedingungen erfüllt. Diese Aufgabe wird durch dio Erfindung gelöst. ^:

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von Antibiotika, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sporen eines Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibio-

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tikum empfindlich ist, in ein Agar-Nährmedium in einem Gefäß überimpft, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und die Sporen aus Mangel an Nährstoffen nicht keimen, aber noch lebensfähig bleiben, daß man auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums die für das Wachstum des Mikroorganismus nötigen Nährstoffe bringt, hierauf gegebenenfalls nach einer vorausgehenden Inkubationszeit eine vorgegebene Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit zufügt, anschließend den Inhalt des Gefäßes während einer vorgegebenen weiteren Inkubationszeit auf den für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperaturbereich erwärmt und durch das Wachstum oder die Wachstumshemmung des Mikroorganismus die An- oder Abwesenheit eines Antibiotikums in der untersuchten Flüssigkeit entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator nachweist.

Die Genauigkeit der Untersuchungsergebnisse hängt von der Menge der eingesetzten zu untersuchenden Probe ab. Wenn das Verfahren standardisiert wird, liefert es auch bei Ausführung durch ungeschultes Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse. In einigen Fällen kann sogar eine grobe quantitative Abschätzung der Menge des in der untersuchten Probe vorhandenen Antibiotikums erfolgen. Die, Verfestigung des Agar-Nährmediums in senkrechter Lage des Gefäßes in Verbindung mit standardisierten Mengen der zu untersuchenden Probe und des Nährmediums hat den Vorteil, daß die Oberfläche des Agar-Nährmediums definiert ist, sq daß nach dem Eintragen von Nährstoffen zuverlässige Ergebnisse "der Inkubation erhalten werden, die sogar halbquantitativ sein können.

L ' -J

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Dem die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium oder den Nährstoffen kann ein Indikator zugegeben werden. Wird der Indikator dem Agar-Nährmedium zugefügt, kcmn er dann vor Beginn des Verfahrens besser verteilt werden. Auch wird durch den Indikator die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöht und bei manchen zu untersuchenden Flüssigkeiten deren Farbe weniger durch die Eigenfarbe von Verunreinigungen der Probe gestört. Der Indikator kann ein Säure-Base -Indikator, wie Bromkresollpurpur oder Phenolrot, oder ein · Redoxindikator, wie 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, sein. Für den Nachweis von Penicillin ist die Verwendung von Bromkresolpurpur bevorzugt.

Der pH-Wert des Agar-Nährmediuins ist für die optimale Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus als auch für die Wirkung des nachzuweisenden Antibiotikums und damit für die Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber dem Antibiotikum von Bedeutung. Bei Verwendung von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis soll zu Beginn des Verfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert von vorzugsweise etwa 7 haben. Bei Verwendung eines Indikators, wie Bromkresolpurpur, wird eine sehr kurze Zeit zur Durchführung des Verfahrens erreicht. Obwohl diese Zeit etwas langer ist, wenn zu Beginn des Verfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert von etwa 8 aufweist, kann damit die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber gewissen Antibiotika, insbesondere Aminoglucosiden, wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin und Neomycin, erhöht werden. Als Indikator eignet sich in diesem Fall beispielsweise Phenolrot. Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber anderen Antibiotika wird jedoch nicht nachteilig beeinflußt, wenn der pH-Wert während des Verfahrens in der Weise abnimmt, daß

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jedes vorliegende Antibiotikum bei einem ihm entsprechenden pH-Wert das Wachstum des Mikroorganismus hemmt. Der pH-Bereich zwischen Beginn und Ende des Verfahrens kann durch Verwendung von Mischindikatoren gegebenenfalls erweitert werden.

Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber bestimmten Antibiotika kann durch'Verwendung anderer Sporen oder deren Kombination eingestellt werden.

Erfindungsgemäß können Sporen aller Bakterien verwendet werden, die Sporen bilden und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber den zu bestimmenden Antibiotika aufweisen. Ein geeigneter Empfindlichkeitsbereich gegenüber verschiedenen Antibiotika kann durch die Verwendung von Sporen einer einzigen Art oder eines einzigen Stammes oder einer Kombination von Sporen verschiedener Mikroorganismen erhalten werden. Geeignete Sporen erhält man von Sporenbildnern der Gattung Bacillus mit entsprechender Empfindlichkeit gegenüber den zu bestimmenden Antibiotika, beispielsweise Bacillus calidolactis (Hussong et al., J, Bact., Bd. 15 (1928), Seiten 179 bis 188), Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage (1957), Seiten 613 bis 693), die von Galesloot et al. (Neth. Milk & Dairy J., Bd. 13 (1959), Seiten 155 bis 179), beschriebenen thermophilen Bacillen,. Bacillus stearothermophilus var. calidolactis (H. KoI, Neth. Milk & Dairy J., Bd. 23 (1969), Seiten 153 bis 162) und Bacillus calidolactis., Stamm C 953 vom ' Ifiederländisehen Institut für Molkereiforschung in Ede, Niederlande (ßaXeßloot et-al., Neth, Milk & Dairy J., Bd. 16 (1962), Seiten 89 bis 95). Vorzugsweise werden Sporen von Bacillus _j

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stearothennophilus var. calidolactis verwendet, der beim Laboratorium für Mikrobiologie in DeIft, Niederlande, unter der Nummer L.MvD. 74.1 hinterlegt ist. Dieser Mikroorganismus besitzt neben einer hohen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin-G und Penicillin-V und einer sehr hohen Wachstumsgeschwindigkeit den zusätzlichen Vorteil, daß seine optimale Wachstumsgeschwindigkeit bei relativ.hoher Temperatur liegt, bei der sich andere Mikroorganismen normalerweise nicht vermehren, so daß die Gefahr einer Infektion vermindert ist. Sporen dieses Mikroorganismus sind nicht nur gegenüber den vorgenannten und arideren natürlichen Penicillinen empfindlich, sondern auch gegenüber anderen Antibiotika, wie halbsynthetischen Penicillinen, beispielsweise Nafcillin, Cloxacillin, Cephalosporinen, sowie Aminoglucosiden, beispielsweise Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin und Kanamycin, ebenso Tetracycline^wie Chlortetracyclin und Chloramphenicol, Macroliden, wie Oleandomycin und Erythromycin, Polypeptid-Antibiotika und verschiedenen Chemotherapeutika, beispielsweise Trimetroprim, Sulfadoxin und Furazolidon. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zum Nachweis vorstehend genannter Antibiotika und Chemotherapeutika, gegebenenfalls nach Einstellung des entsprechenden pH-Wertes der Probe, verwendbar.

Erfindungsgemäß enthält die Kultur des Mikroorganismus Vorzugsweise 10- bis 10 , insbesondere 10 bis 10' Sporen pro ml des Agar-Nährmediums. Die Sporenkültur des Mikroorganismus wird in einer Oberflächenkultur auf einem Agar-Nährmedium oder in einer flüssigen Submerskultur, beispielsweise in einem Schüttelkolben

oder in einem Fermenter (Yao et al., Appl. Microbiol., Bd. 15 (1967)» Seite 455), hergestellt. Die Sporen werden vorzugsweise

• J

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.β-

derart in das Agar-Nährraedium überimpft, daß sie zwar lebensfähig bleiben, aber nicht keimen. Dem Agar-Nährmedium können eine physiologische Salzlösung und/oder ein Indikator zugegeben werden, Jedoch soll es keine Nährstoffe für den Mikroorganismus enthalten.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es den Einfluß von Hemmstoffen, beispielsweise von Leucocyten gebildeten Verbindungen, die normalerweise in Milch und anderen zu untersuchenden Flüssigkeiten vorliegen und keine Antibiotika darstellen, beträchtlich vermindert, was bei den bekannten Verfahren normalerweise nicht der Fall ist. Die Verminderung der Wirksamkeit dieser Hemmstoffe ist darauf zurückzuführen, daß sie nicht oder nicht in wesentlichem Ausmaß in das Agar-Nährmedium in den Gefäßen,~ beispielsweise den Teströhrchen, eindiffundieren. Dadurch wird die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht und macht es zu einem leicht durchführbaren Verfahren, das zur Inaktivierung jener Hemmstoffe eine Vorbehandlung der Milchprobe normalerweise nicht erfordert, selbst dann, wenn sich die Milchproben in ihrem Aussehen bereits etwas verändert haben.

Das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium läßt man in senkrecht .aufgestellten Gefäßen fest werden. Um zuverlässige Untersuchungsergebnisse zu erhalten, haben diese Gefäße vorzugsweise eine vorgegebene Größe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sogar bis zu einem gewissen Grad quantitativ, wenn es unter bestimmten Bedingungen durchgeführt wird. Das Antibiotikum diffundiert in das

Agar-Nährmedium_r in dem seine Konzentration mit zunehmender Ein- , ^L 409851/1027

dringtiefe abnimmt. In der Zone des Agar-Nährmediums, in der die Konzentration .des Antibiotikums unter einem bestimmten Wert liegt, kann sich der Mikroorganismus vermehren, so daß ■ der gegebenenfalls im Agar-Nährmediura anwesende Indikator seine Farbe ändert. In der Zone, in der die Konzentration des Antibiotikums über diesem Wert liegt, wird das Wachstum des Mikroorganismus gehemmt und der Indikator ändert seine Farbe nicht. Die Höhe des.Agar-Nährmediumsim Gefäß, beispielsweise dem Te3tröhrchen, in dem der Farbumschlag des Indikators erfolgt, definiert die Empfindlichkeit des Verfahrens. Erfindungsgemäß kann diese Empfindlichkeit durch Standardisieren der Höhe des im Gefäß verfestigten Agar-Nährmediuras festgelegt werden. Diese Maßnahme bietet den Vorteil, daß das Verfahren bei einer bestimmten Höhe des die Sporen enthaltenden Agar-Nährmediums durchgeführt werden kann, bei der der Indikator seine Farbe ändert, wenn die Konzentration des anwesenden Antibiotikums unter einem gewissen Wert liegt, jedoch seine Farbe nicht ändert, wenn die Konzentration des Antibiotikums darüber liegt. Der Durchmesser des Gefäßes ist vorzugsweise 3 bis 20 mm, insbesondere 6 bis 14 mm. Seine Höhe iet so bemessen, daß die Gesamthöhe des eingefüllten Ägar-Nährraediums und der zu untersuchenden Probe vorzugsweise 3 bi3 30 ram betragen kann. Falle das Verfahren quantitativ durchgeführt wird, wobei aus der Höhe der Zone, in der das Wachstum des Mikroorganismus gehemmt wird, quantitative Rückschlüsse gezogen werden, beträgt die Gesamthöhe des Agar-Nährmediums und der zu untersuchenden Probe vorzugsweise 20 bis 30 mm. Falls das Verfahren dazu dient, festzustellen, ob eine bestimmte Konzentration eines Antibiotikums vorliegt oder nicht, beträgt diese Höhe vorzugsweise 5. bis 15 mm.

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Nach dem Beschicken der Gefäf3e mit einer vorgegebenen Menge an flüssigem Agar-Nährmedium werden sie in senkrechter Lage gehalten, damit sich die Oberfläche des sich verfestigenden Agar-Nährmediums senkrecht zur Gefäßinnenv/and ausbildet. Die Gefäße mit dem verfestigten und die Sporen enthaltendem Agar-Nährmedium können verschlossen werden und so wenigstens mehrere Monate, gegebenenfalls gekühlt, gelagert- werden, ohne daß die Sporen ihre Lebensfähigkeit verlieren.

Bei der Durchführung des Verfahrens zum Nachweis eines Antibiotikums werden zuerst die erforderlichen Nährstoffe, gegebenenfalls mit einem Indikator, auf die Oberfläche des die Sporen enthaltenden Agar-Nährniediums gegeben. Obwohl auch eine vorgegebene Menge an Nährstoffen in flüssiger Form zugefügt werden kann, ist die Zugabe von Nährstoffen in trockener Form bevorzugt, insbesondere auf runden Filterpapieren als Trägermaterial oder in ' Form von Tabletten, welche die getrockneten Nährstoffe enthalten, die so eine bessere Lagerstabilität aufweisen. Die runden Filterpapiere oder Tabletten sollen kleiner als die Querschnittsfläche des Gefäßes sein, damit sie beim Aufliegen auf dem Agar-Nährmedium den Luftzutritt nicht wesentlich behindern, was das Diffusionsbild in der Agarschicht beeinflussen würde. Die verwendeten Nährstoffe sollen wenigstens eine dem verwendeten Stamm angepaßte assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthalten, vorzugsweise in Form von Glucose und Pepton. Der mittels den Filterpapieren oder den Tabletten zugegebene Nährstoff enthält gegebenenfalls den Indikator und/oder eine Puffersub-? stanz.

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• - 11 -

Nach dem Aufbringen der Nährstoffe auf die Oberfläche der Agarschieht wird eine,vorgegebene Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit, im allgemeinen Milch, oder des zu untersuchenden Fleisches zum Inhalt des Gefäßes gegeben. Dies kann unmittelbar nach dem Einbringen der Nährstoffe auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums oder nach einer vorausgehenden Inkubationszeit geschehen. Falls die Nährstoffe in trockener Form zugegeben wurden, kann für die vorausgehende Inkubationszeit etwas Wasser oder physiologische Kochsalzlösung zugegeben werden. Dies hat den Vorteil, daß zwischen dem Zugeben der Probe im Verfahren und dessen Beendigung weniger Zeit verstreicht als beim Arbeiten ohne vorausgehende Inkubationszeit. Beispielsweise kann in einer Mol- ' kerei die Milch, die zur Verteilung an die Verbraucher oder zur Herstellung von Butter, Käse oder Joghurt vorgesehen ist, erst nach Feststellung der Abwesenheit von Penicillin oder anderen Antibiotika weiter verarbeitet werden. Die nach Anlieferung der Milch vor ihrer Veiterverarbeitung erforderliche Wartezeit bis zürn Vorliegen des Untersuchungsergebnisses kann durch Arbeiten mit einer vorausgehenden Inkubationszeit im Verfahren verkürzt werden. Die vorausgehende Inkubationszeit beträgt in Abhängigkeit der gegebenen Bedingungen bis zu etwa 1 Stunde. Das Verfahren wird noch wirtschaftlicher, wenn während der Zeit, in der die zu untersuchende Milch sich noch auf dem Transport zur Molkerei befindet, bereits das Verfahren begonnen wird. Auch können weitere Kombinationen vorstehend genannter Maßnahmen angewandt werden.

Die Inkubationszeit, einschließlich der vorausgehenden Inkubationszeit, die vor dem Zusatz der zu untersuchenden Probe ab-

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läuft, hängt von den Bedingungen, wie der Art der eingesetzten Sporen, den Nährstoffen und der Temperatur, ab. Bei Verwendung von Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolactis liegen die Temperaturen für die Inkubation bei vorzugsweise etwa 55 bis 7O°C, insbesondere 60 bis 65°C Die Inkubationszeiten, die zuverlässige Ergebnisse des Verfahrens bringen, betragen vorzugsweise etwa 1 1/2 bis A Stunden, insbesondere 2 bis 3 Stunden.

Obwohl das Verfahren vorzugsweise zur Anwendung bei Milch entwickelt wurde, dient es auch zur Untersuchung anderer Produkte, wie Fleisch, beispielsweise in Form von kleinen Fleischstückchen, der aus einer Fleischprobe gepreßten Flüssigkeit oder der .;, von tiefgefrorenem und anschließend aufgetautem Fleisch abtropfenden Flüssigkeit. In diesem Fall müssen die Nährstoffe auf störende Bestandteile der Probe abgestimmt werden, was beispielsweise durch Zugabe entsprechender Verbindungen, wie Puffersubstanzen, erreicht wird. Störende Bestandteile, wie Lactoferin und Seroferin, können durch Zugabe von Eisen(II)-sulfat unwirksam gemacht werden. Als Vorprüfung auf die Anwesenheit von Antibiotika in Schlachttieren kann das Verfahren auf deren Urin angewandt werden, da sich Antibiotika darin ansammeln. Zur. Untersuchung von unverdünntem Urin soll der pH-Wert unter Verwendung einer entsprechenden Puffersubstanz in der Tablette der Nährstoffe eingestellt werden. Urinproben können auch ohne Zusatz von Puffersubstanzen untersucht werden, jedoch ist dann' ein Verdünnen der Probe mit Wasser auf etwa das 10-fache nötig.

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Zur Untersuchung, ob in einer Probe ein Penicillin oder ein anderes Antibiotikum vorliegt, kann das Verfahren mit zwei Gefäßen durchgeführt werden. In das erste Gefäß wird eine-Penicillinase-haltige Tablette mit Nährstoffen oder ein mit Nährstoffen getränktes Filterpapier, in das zweite Gefäß werden die gleichen Nährstoffe, jedoch ohne Penicillinase, gegeben. Bei Anwesenheit von Penicillinase. werden während des Verfahrens die gegen Penicillinase nicht resistenten Penicilline abgebaut. Anstelle von Penicillinase können auch andere spezielle Inaktivatoren des Penicillins, wie Cystein, eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einem Gefäß besteht, das Sporen eines Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum sehr empfindlich ist, in einem Agar-Nährmedium enthält, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und die Sporen in das Agar-Nährmedium so überimpft sind, daß sie nach der Zugabe von Nährstoffen und, einer Inkubationszeit bei etwa der für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperatur in kurzer Zeit so weit wachsen, daß ihr Wachstum entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator nachgewiesen wird, und das Gefäß einen Innendurchmesser, der so klein ist, daß für das Verfahren möglichst wenig Agar-Nährmedium benötigt wird, aber so groß ist, daß eine Wachstumshemmung des Mikroorganismus nachgewiesen werden kann, und: eine Höhe aufweist, die gestattet, eine ausreichende Menge des Agar-Nährmediums und der zu untersuchenden Flüssigkeit aufzunehmen. jl

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Das Gefäß der Erfindung hat einen Innendurchmesser von vorzugsweise 3 bis 20 mm, insbesondere 6 bis 14 mm. Die erforderliche Menge des Agar-Nährmediunis ist von der vorgesehenen Zeitdauer . des-Verfahrens sowie der Diffusionsgeschwindigkeit der Nährstoffe abhängig. Die Gesamthöhe von Agar-Nährmedium und zu unter suchender Probe im Gefäß ist vorzugsweise 3 bis 30 mm, insbesondere 5 bis 10 mm.

-Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht aus einem Block eines durchscheinenden Materials, 'das derart mit einer Anzahl von Öffnungen versehen ist, daß mehrere Gefäße in diesem Block gebildet werden.. In einer anderen Ausführungsform können die Untersuchungsgefäße in Form von Röhrchen oder Ampullen vorliegen, die die Sporen in einer Suspension enthalten, und unter Verwendung einer entsprechenden Haltevorrichtung zusammengestellt sein.

Die das Ägar-Nährmedium enthaltenden Gefäße können über einen längeren Zeitraum gelagert werden, der von den Lagerbedingungen, insbesondere der Temperatur, abhängt.

Bei Luftzutritt kann sich der pH-Wert des Agar-Nährmediums im Gefäß während der Lagerzeit ändern, was vermutlich auf die Einwirkung von Kohlendioxid aus der Luft zurückzuführen ist. Deshalb werden die Gefäße varzugsweise während der Lagerung luftdicht verschlossen, wie es bei Ampullen der Fall ist.

Manchmal neigt das Agar-Nährmedium.dazu, sich von der Gefäßwand zu .lösen... Dem kann durch Zugabe eines klebrigen Zusatzes, der.

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nicht als Nähr- oder Hemmstoff gegenüber den Sporen wirken soll, begegnet werden. Beispiele für klebrige Zusätze sind Natriuracarboxymethylcellulose und Sorbitanester (Tweens).

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt die erforderlichen Geräte und Substanzen zur schnellen Bestimmung von Antibiotika in vorstehend genannten Produkten,-worunter ein oder mehrere Gefäße, eine entsprechende Menge von Filterpapieren oder Tabletten, die jeweils die erforderlichen Nährstoffe in trockener Form enthalten, gegebenenfalls weitere Instrumente zum Auflegen der Filterpapiere oder Tabletten·auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums und zum Einbringen einer vorgegebenen Menge der flüssigen Probe auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums zu verstehen sind.

Die erfindungsgemäßen Gefäße enthalten gegebenenfalls .bereits während ihrer Lagerung die Nährstoffe auf Filterpapier oder in Tablettenform. Da die Filterpapiere oder Tabletten dem Agar-Nährmedium Feuchtigkeit entziehen wurden, werden sie mit einer Schicht überzogen, die den Übergang von Feuchtigkeit aus dem Agar-Nährmedium in die Tabletten oder Filterpapiere bei der Lagertemperatur verhindert, jedoch unter den Bedingungen des Verfahrens den Übergang von Nährstoffen in das Agar-Nährmedium erlauben. Eine derartige Schicht besteht beispielsweise aus Wachs mit einem Schmelzpunkt von vorzugsweise etwa 35 bis 55°C, insbesondere 40 bis 45°C

Die für das Verfahren nötigen Geräte können auch ein Vergleichsbild umfassen, das auf Grund der im Gefäß ermittelten Höhe der

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Zone, in der das Wachstum des Mikroorganismus gehemmt wurde, eine Abschätzung des Gehalts an Penicillin oder einem anderen Antibiotikum ermöglicht. Außerdem kann den Geräten eine Vorrichtung zum Einbringen einer vorgegebenen Menge der zu untersuchenden Probe in das Gefäß beigegeben sein. Vorzugsweise wird zur Kontrolle der Funktionsfähigkeit der Vorrichtung eine Blindprobe, wie !fässer, ohne Gehalt an Penicillin oder eines anderen Antibiotikums dazugegeben.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können/Antibiotika in Flüssigkeiten, die durch Auspressen von Fleisch, Organen, wie Nieren, oder Nahrungs- und Futtermittel erhalten wurden, und in anderen Flüssigkeiten, wie Blutserum und Urin, nachgewiesen werden. Dabei v/erden gegebenenfalls zur Einstellung eines bestimmten pH-Wertes Puffersubstanzen zugegeben.

Falls andere Mikroorganismen zum Nachweis anderer Antibiotika verwendet werden, können das Nährmedium, die Nährstoffe und die Inkubationsbedingungen entsprechend angepaßt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Teströhrchen

Eine Kultur von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis L.M.D. 74.1 wird in ein Medium folgender Zusammensetzung über-' impft: . ■ ■

L .;■ ·■'" -I

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	2425999
	g
15	g
5	5 g
O,	mg
30	ml
1000

' - 17 -

Agar-Nährmedium Difco 0001 Agar-Nährmedium Difeo 0140 Glucose
MnSO^.H₂O

destilliertes Wasser auf

20 Minuten bei 120⁰C sterilisieren.

Nach dem Überimpfen wird das Medium 48 Stunden bei 60⁰C iukubiertj bis eine gute Sporenbildung beobachtet wird. Die Sporen werden gesammelt, mit destilliertem Wasser -gewaschen und bei 4⁰C gelagert.

Die Menge an lebensfähigen Sporen wird durch Untersuchen auf

einem Medium folgender Zusammensetzung bestimmt: Agar-Nährmedium Difco 0140 20 g

Trypton,. Difco 0123 · 8,5 g ·

Plryton Pep ton BBL 11905 1,5 g

Glucose 5g

destilliertes Wasser auf 1000 ml

20 Minuten bei 120°C sterilisieren,

Nach dem Überimpfen wird das Medium 48 Stunden bei 60°C inkubiert. Anschließend v/erden die Kolonien gezählt.

Mit destilliertem Wasser wird eine Suspension der Sporen hergostellt und auf einen Gehalt von etwa 10 Keimen/ml eingestellt, 1 Prozent der erhaltenen Suspension wird ein.er Lösung folgender Zusammensetzung zugefügt: - -

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Agar-Nährmedium Difco 0140 Natriumchlorid destilliertes Wasser auf

20 Minuten bei 120°C sterilisieren.

12 g 9 g 1000 ml

Das Agar-Nährmedium wird durch Erhitzen verflüssigt und anschließend auf 6O⁰C abgekühlt; Sterile Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von etwa 9 mnj werden mit Jeweils 0,5 ml des erhaltenen Nährmediums gefüllt. In senkrechter Stellung der Teströhrchen läßt man ihren Inhalt erstarren. Anschließend werden die Teströhrchen bei 4⁰C gelagert.

Herstellung der Nährstoff-getränkten Filterpapiere Eine Nährstaffkombination folgender Zusammensetzung' wird hergestellt:

(a) 0,1 g Bromkresolpurpur werden in 9,2 ml 0,02 η NaOH gelöst und mit destilliertem Wasser auf

aufgefüllt.

(b) Glucose
destilliertes Wasser

(e) Trypton Difco 0123 Phyton Pepton BBL 11905 destilliertes Wasser

25 ml

50	S
50	ml
34	g
6	g
100	ml

Die Gemische (a) und (b) werden über ein Seitz-Filter, das Ge-

misch (c) durch 30-minütiges Erhitzen auf 110⁰C sterilisiert. (c) bleibt eine Suspension. Anschließend werden 5 Teile (a), 2, Teile (b) und 3 Teile (c) gemischt und jeweils 0,04 ml des er-j

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haltenen Gemisches auf ein rundes Filterpapier von etwa 8 mm Durchmesser gebracht, das anschließend getrocknet wird.

Beispiel 2 Durchführung eines Nachweises

Es werden Proben mit den Konzentrationen 0,1₉ 0,03, 0,01, 0,003 und 0,001 IE Penicilliu-G pro ml in frischer Kuhmilch sowie eine Probe dieser Milch ohne Penicillin-G zu einem Vergleichsversuch hergestellt. Gemäß Beispiel 1 werden 6 Teströhrchen hergestellt, mit je einem Nährstoff-getränkten Filterpapier oder einer Nährstoff-Tablette versehen und mit 0,2 ml einer der vorgenannten Proben versehen. Unmittelbar darauf werden die Teströhrchen in ein V/asserbad von 65⁰C gebracht und nach 3 und 4 Stunden kontrolliert.

Ergebnis;

Vergleichsversuch: . Gelbfärbung der Agarschicht Proben mit weniger als 0,01 ΙΕ/ml: Gelbfärbung der Agarschicht

Proben mit 0,01 und mehr ΙΕ/ml: Violettfärbung der Agarschicht.

Beispiel 3

Vergleich des erfindungs/?;emäßen Verfahrens mit bekannten Verfahren

In der nachstehenden Tabelle (Werte in y/ml) ist die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Empfindlichkeiten bekannter Verfahren- zum Nachweis von Antibiotika zusammengefaßt. Bei den bekannten Verfahren handelt es sich um einen Nierentest (Schothorst und Peelen-Knol, Tijdschr. v. ·

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Diergeneesk., Bd. 95 (1970), Seiten 438 bis 445} und ein deutsches Untersuchungsverfahren (Levetzow, Bundesgesundheitsblatt, Bd. 14 (1971), Seiten 30 bis 42, sowie Bartels et al., Die Fleischv/irtschaft, Bd. 52 (1972), Seiten 479 bis 482). Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf zwei Arten durchgeführt: Zum einen wird es mit den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Antibiotika in einer physiologischen Kochsalzlösung, zum anderen in Milch durchgeführt, die diese Antibiotika als Verunreinigung enthält.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren für die meisten der angegebenen Antibiotika empfindlicher ist als der Nierentest. Auch im Vergleich mit dem deutschen Verfahren ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafter, da es zum Nachweis von Penicillin empfindlicher ist.

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Tabelle

Antibiotikum

tErfindungsgemäßes j , Verfahren

j obere Grenze in physiologi-:

j scher Koch-

[untere und [obere Gren j ze in , j Milch Nierentest? j Modifizierter Nie-^;
S. lutea, , jrentest, S.lutea,
ί 40 ml pro [20 ml pro Platte
Platte . I. '

deutsches Verfah-ί i ren. B. subtilis

pK 6 i pH S

ί pH 6 jpH 8

Na

2j I

8|

9i 10

11 12 13 14 15!

16 17 18 19 20

iumsalz des j ,

Penicillins !0,004

Kanamycin MO

Neomycin j

Streptomycin

Erythromycin -0,8

Oleandomycin j

Spiramycin i

0-ytetracyclin ; |0,1

ί Chlortetra cyclin '■

Totracyclin-HCl !0.05

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis von Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen eines Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum empfindlich ist, in ein Agar-Nährmedium in einem Gefäß überimpft, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich, bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und.die Sporen aus Mangel an Nährstoffen nicht keimen, aber noch lebensfähig bleiben, daß man auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums die für das Wachstum des Mikroorganismus nötigen Nährstoffe bringt, hierauf gegebenenfalls nach. einer vorausgehenden Inkubationszeit eine vorgegebene Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit zufügt, anschließend den Inhalt des Gefäßes während einer vorgegebenen weiteren Inkubationszeit auf den für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperaturbereich erwärmt und durch das Wachstum oder die Wachstumshemmung des Mikroorganismus die An- oder Abwesenheit eines Antibiotikums in der untersuchten Flüssigkeit entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gefäß mit einem Innendurchmesser von 3 bis 20 mm verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dödurch gekennzeichnet, daß man ein Gefäß mit einem Innendurchmesser von 6 bis 14 mm verwendeti

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Agar-Nährmedium und die zu untersuchende Probe im Gefäß bis zu einer Gesamthöhe von 3 bis 30 mm zugibt. - -

5. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß man das Agar-Nährmedium und die zu untersuchende Probe im Gefäß bis zu einer Gesamthöhe von 5 bis 10 mm zugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium einen Indikator zugibt. :

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährstoffen einen Indikator zugibt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7_f dadurch gekennzeichnet, daß man als Indikator einen Säure-Base-Indikator verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Indikator Bromkresolpurpur oder Phenolrot verwendet.

TO. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Indikator einen Redox-Indikator verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Redox-Indikator 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid verwendet.

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12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Beginn des Verfahrens das zu untersuchende Gemisch auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Beginn des Verfahrens das zu untersuchende Gemisch auf einen pH-Wert von etwa 8 einstellt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen der Gattung Bacillus verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen von Bacillus calidolactis, Bacillus subtilis, Bacillus
stearothermophilus oder Bacillus stearothermophilus var.
calidolactis verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolactis

(L.M.D. 74.1) verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von Sporen verschiedener Mikroorganismen verwendet .

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 1Cr bis 10 Sporen eines Mikroorganismus-pro ml enthaltendes Agar-Nährmedium verwendet.

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19. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß man ein 10 bis 10 Sporen eines Mikroorganismus pro ml enthaltendes Agar-Nährmedium verwendet.

20» Verfahren nach Anspruch 1-, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen verwendet, die durch Züchten des Mikroorganismus in einer Oberflächenkultur auf. einem Ägar-Nährmedium oder in einer flüssigen Submerskultur erhalten wurden.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums gegebenen Nährstoffe in trockener Form verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nährstoffe mittels runder Filterpapiere oder in Form von Tabletten auf das Agar-Nährmedium bringt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nährstoffe in Form von Tabletten verwendet, die mit einer Schicht überzogen sind, die bei Raum- oder Lagertemperatur den übergang von Feuchtigkeit aus den.Agar-Nährmedium in die Tabletten verhindert, jedoch unter den Verfahrensbedingungen den übergang der Nährstoffe aus den Tabletten in das Agar-Nährmedium gestattet.

.24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,, daß man Tabletten verwendet, die mit einer Wachsschicht mit einem Schmelzpunkt von etwa 35 bis 55°C, vorzugsweise 40 bis 45⁰C, überzogen sind. 4 0 9 8 51/10 27 j

25. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation bei Temperaturen von etwa 55 bis 70⁰C durchführt.

26. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation bei 60 bis 65°C durchführt.

27. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während eines Zeitraums von 1 1/2 bis 4 Stunden durchführt.

28. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während eines Zeitraums von 2 bis 3 Stunden durchführt.

29. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Gefäß besteht, das Sporen eines Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum sehr empfindlich ist, in einem Agar-Nährmedium enthält, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und die Sporen in das Agar-Nährmedium so überimpft sind, daß sie nach der Zugabe von Nährstoffen und einer Inkubationszeit bei etwa der für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperatur in kurzer Zeit so weit wachsen, daß ihr Wachstum entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator nachgewiesen wird, und das Gefäß einen Innendurchmesser, der so klein ist, daß für das Verfahren möglichst wenig Agar-Nährmedium benötigt wird, aber so groß ist, daß eine V/achstumshemraung des Mikroorga-_j

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nismus nachgewiesen werden kann, und eine Höhe aufweist, die gestattet, eine ausreichende Menge des Agar-Nährmediums und der zu untersuchenden Flüssigkeit aufzunehmen.

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Gefäß-Innendurchmesser 3 bis 20 mm beträgt.

31. Vorrichtung nach Anspruch.29, dadurch gekennzeichnet, daß der Gefäß-Innendurchmesser 6 bis '^k mm beträgt.

32. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie in dem die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium einen Indikator enthält.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator ein Säure-Base-Indikator ist.

2Λ· Vorrichtung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß dei Indikator Bromkresolpurpur oder Phenolrot ist.

35. Vl-richtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator ein Redox-Indikator ist.

36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Redox-Indlkator 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid ist.

37. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Agar-Nährmedium enthält, das auf einen pH-Wert von etwa

7 eingestellt ist:
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38. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Agar-Nährmedium enthält, das auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellt ist.

39» Vorrichtung nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß sie Sporen der Gattung Bacillus enthält.

40. Vorrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß sie Sporen von Bacillus calidolactis, Bacillus subtilis,
Bacillus stearotherriiophilus oder Bacillus stearothermoph:!"! us vsr calidolactis enthält.

41. Vorrichtung ηε.οη Anspruch AO, dadurch gekennzeichnet, daß sic Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolacto ;;
(L. 14.D. 74.1) enthält.

42. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kombination von Sporen verschiedener Mrkroorganjvmon

fnthält.

43. Vorrichtung noch Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10"' Με 10 Sporon eines Mikroorganismus pro ml des Agar-Jiubrmediums enthält.

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44. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10 bis 10 Sporen eines Mikroorganismus pro ml des Agar-Nährmediums enthält.

45. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zu dem. die Sporen enthaltenden Agar-Nährmcdium noch Nährstoffe in Form von Tabletten enthält, die mit einer Schicht überzogen sind, die bei Rauva- oder Lagert emp era tür den Übergang von Feuchtigkeit aus dem Agar-Nährmedium in die Tabletten verhindert, jedoch unter den Veriahrensbedingungen den Übergang der Nährstoffe aus den Tabletten in das Agar-Nährmedium gestattet.

46. Vorrichtung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet', daß sie Tabletten enthält, die mit einer Wachsschicht mit einer Schmelztemperatur von 35 bis 55⁰C überzogen sind.

47. Vorrichtung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß sie Tabletten enthält, die mit einer Wachsschicht mit einer Schmelztemperatur von 40 bis 45°C überzogen sind.

48. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Block eines durchsichtigen Materials besteht, der mit entsprechenden Öffnungen versehen ist und so mehrere Vorrichtungen gemäß Anspruch 29 bis 47 zur Durchführung des Verfahrens bildet.

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49. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Vorrichtungen nach Anspruch 29 bis 44 oder 48 enthält jund zusätzlich die entsprechende Menge trockener Nährstoffe auf runden B'ilterpapieren als Trägermaterial oder in Form von Tabletten enthält.

50. Vorrichtung nach Anspruch 49,. dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Geräte enthält, mit denen eine vorgegebene Menge der flüssigen zu untersuchenden Probe auf die. Oberfläche des Agar-Kährmediuns gebracht v/erden kann.

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