ES2321405T3 - Sistema de ensayo mejorado para la determinacion de la presencia de un antibiotico en un fluido. - Google Patents

Abstract

Un método para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido que comprende los pasos de: (a) contactar una muestra del fluido con un medio de ensayo que comprende un microorganismo, al menos una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador, (b) incubar el microorganismo por un período de tiempo para el crecimiento del microorganismo en caso de que ningún antibiótico esté presente en la muestra de fluido, y (c) detectar el crecimiento o la inhibición de crecimiento del microorganismo con el indicador, caracterizado porque el indicador es el Azul de Bromotimol.

Description

Sistema de ensayo mejorado para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido.

Campo de la invención

La presente invención se refiere un novedoso sistema de ensayo microbiológico mejorado y un método nuevo para la determinación rápida de la presencia de compuestos antibactericidas en fluidos como leche, jugo cárnico, suero y orina usando dicho sistema de ensayo.

Antecedentes de la invención

Los métodos microbiológicas de ensayo para la determinación de compuestos antibactericidas, particularmente los residuos de antibióticos como cefalosporina, penicilina, tetraciclina y derivados de estos y quimioterapéuticos como los sulfas, en fluidos como leche, jugo cárnico, suero y orina han sido conocidos por mucho tiempo. Los ejemplos de tales pruebas han sido descritos en CA 2056581, DE 3613794, EP 0005891, EP 0285792, EP 061 1001, GB A 1467439 y US 4,946,777. Todas estas descripciones se relacionan con ensayos listos para el uso que hacen uso de un microorganismo y darán un resultado mediante el cambio indicado por una molécula indicadora adicionada al sistema de ensayo. El principio es que cuando un compuesto antibactericida está presente en el fluido en una concentración suficiente para inhibir el crecimiento del microorganismo el color del indicador permanecerá igual, mientras que, cuando no ocurre inhibición, el crecimiento de este microorganismo está acompañado por la formación de ácido o metabolitos reducidos u otros fenómenos que inducirán una señal del indicador.

Los sistemas de ensayo mencionados anteriormente incluyen un medio de ensayo, tal como un medio de agar, inoculado con un microorganismo, preferiblemente una cepa de Bacillus, Escherichia coli o Streptococcus, y un indicador de pH y/o un indicador de redox. El microorganismo y el indicador son introducidos en una solución de agar opcionalmente tamponada, opcionalmente los nutrientes son adicionados a la solución y opcionalmente las sustancias que cambian la sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos son adicionadas a la solución. Finalmente la solución de agar se deja solidificar para formar el medio de ensayo de manera que los microorganismos permanezcan vivos pero no se puedan multiplicar debido a la falta de nutrientes y/o la baja temperatura. Una prueba apropiada debería tener la sensibilidad deseada con relación a los compuestos a ser probados.

El problema con los sistemas de ensayo actualmente distribuidos en el mercado y/o descritos en la literatura es que tienen una sensibilidad limitada hacia ciertos antibióticos. Una de las consecuencias de este problema es que para ciertas aplicaciones, por ejemplo cuando los requisitos del umbral son cambiados, un sistema de ensayo adecuado no puede estar disponible con la tecnología actual. Existe por lo tanto una necesidad de un método de ensayo mejorado que no tenga este problema.

Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado para la determinación de antibióticos en los fluidos. Sorprendentemente, hemos encontrado que hay un efecto positivo alcanzable cuando aplicamos el indicador de acuerdo con la invención.

Aplicando el indicador de la presente invención en los sistemas microbiológicos de ensayo, una ventaja en la sensibilidad hacia los antibióticos, como por ejemplo \beta-lactámicos y aminoglucósidos puede ser lograda. Aplicando dicho indicador en un método para la determinación de antibióticos en los fluidos, pueden ser logrados incrementos en la sensibilidad. Dichos incrementos pueden ascender a 25% e igualar el 100% dependiendo del antibiótico en cuestión. Adicionalmente, ha sido encontrado que el uso de dicho indicador también resulta en un sistema de ensayo que muestra un contraste visual mejorado cuando se comparan las muestras positivas y negativas. Este último fenómeno facilita grandemente la evaluación visual exacta de resultados de ensayo.

La presente invención proporciona un sistema de ensayo para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido que comprende un medio de ensayo que comprende un microorganismo, una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador apropiado para la detección de la penicilina G, caracterizado porque dicho indicador es el Azul de Bromotimol.

Además, se proporciona un método para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido que comprende los pasos de:

(a) contactar una muestra de dicho fluido con un medio de ensayo que comprende un microorganismo, al menos una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador;

(b) incubar el microorganismo por un período de tiempo para el crecimiento del microorganismo en caso de que ningún antibiótico esté presente en la muestra de fluido; y

(c) detectar el crecimiento o inhibición de crecimiento del microorganismo con el indicador, caracterizado porque dicho indicador es el Azul de Bromotimol.

Además, se proporciona un kit apropiado para la determinación de un antibiótico en un fluido que comprende un recipiente parcialmente lleno con un medio de ensayo que comprende un microorganismo, un agente gelificante, y un indicador, caracterizado porque dicho indicador es el Azul de Bromotimol.

Finalmente se proporciona el uso del Azul de Bromotimol como indicador de un sistema de ensayo para un antibiótico.

Descripción detallada de la invención

Los términos y las abreviaturas dados debajo son usados a todo lo largo de esta divulgación y son definidos como sigue.

El término "CFU" es una abreviatura de Unidades Formadoras de Colonias y se refiere al número de microorganismos, esporas de microorganismos, esporas de microorganismos parcialmente germinativos o células vegetativas capaces de producir colonias de microorganismos.

El término "fluido" se refiere a una sustancia (como un líquido) que tiende a fluir o conformar el perfil de su recipiente.

El término "agente gelificante" se refiere a un compuesto que ayuda en el cambio de una mezcla en o tomando la forma de un gel.

El término "indicador" se refiere a una sustancia usada para medir (por ejemplo mediante el cambio de color o fluorescencia) el estado de un medio de ensayo con relación a la presencia de un material particular (por ejemplo un ácido, una base, agentes oxidantes o reductores). Por ejemplo, el término "indicador" se puede referir a uno o más compuestos que son conocidos como indicador de pH, pero también a uno o más compuestos que son conocidos como indicadores redox. También, el término "indicador" se puede referir a las mezclas de dos o más tipos diferentes de indicadores, como una combinación de un indicador de pH y uno de redox. En general, cuando dos o más indicadores son usados, estos indicadores están cooperando para aumentar el efecto indicador de cada uno de los indicadores cuando tomados solos.

El término "nutriente" se refiere a uno o más sustancias nutritivas o ingredientes que estimulan y/o son requeridos para el crecimiento de microorganismos que son usados en el método de la presente invención.

El término "dispositivo de muestra" se refiere a un dispositivo con la ayuda del cual una muestra de fluido puede ser adicionada a un medio de ensayo. Tal dispositivo puede ser un recipiente, opcionalmente con marcas de volumen. Tal recipiente puede ser un capilar, una jeringuilla, una pipeta o un sistema automatizado de pipeteo. Tal jeringuilla o tal pipeta pueden ser diseñadas de tal manera que con sólo un modo de operación un volumen predeterminado a partir del fluido puede ser retirado para ser analizado.

El término "sensibilidad" se refiere al grado de receptividad de un sistema dado para sentir un cierto estado. Más particularmente, en el presente caso "sensibilidad" se refiere al grado por el cual las concentraciones de antibióticos en una muestra pueden ser determinadas.

El término "espora" se refiere a un cuerpo unicelular usualmente primitivo a menudo ambientalmente resistente e inactivo o cuerpo reproductivo producido por microorganismos y capaces de desarrollarse en un microorganismo nuevo e individual.

El término "medio de ensayo" se refiere a una composición tal como una solución, un sólido o, preferiblemente, en la forma de un sol o un gel, por ejemplo que comprenda un agente gelificante. Ejemplos apropiados de agentes gelificantes son agar, ácido algínico y sales de estos, carragenina, gelatina, hidroxipropilguar y derivados de estos, goma de algarrobo (la goma Carob), alga marina de eucheuma procesado y similares. Sin embargo, la persona experta en el arte comprenderá que otros tipos de medios sólidos de ensayo pueden estar basados en materiales portadores como cerámica, algodón, vidrio, partículas de metal, papel, polímeros de cualquier tamaño o forma, silicatos, esponjas, lana y similares. Usualmente, el medio de ensayo contiene uno o más indicadores, sin embargo, estos compuestos pueden también ser adicionados posteriormente cuando el experimento esté siendo realizado. El medio de ensayo comprende uno o más tipos de microorganismos como agentes de detección. Opcionalmente, el medio de ensayo también puede contener uno o más tampones, nutrientes, estabilizadores, sustancias que cambian la sensibilidad para ciertos compuestos antimicrobianos en una manera positiva o negativa y/o agentes que incrementan la viscosidad. Cuando un tampón está presente en el medio, este puede ser adicionado durante la mezcla de los componentes del medio o los componentes pueden ser disueltos y/o suspendidos en el tampón. Opcionalmente el medio de ensayo es esterilizado y usualmente el pH es ajustado al valor requerido. Los ejemplos de sustancias que cambian la sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos son los antifolatos similares a ormetoprima, tetroxoprima y trimetoprima que mejoran la sensibilidad del microorganismo hacia compuestos de sulfa o sales de ácido oxálico o ácido fluorhídrico, los cuales mejoran la sensibilidad hacia la tetraciclina. Los ejemplos de agentes que aumentan la viscosidad son el ascorbil metilsilanol pectinato, carbómero, carboximetil celulosa, alcohol de cetearilo, alcohol de cetilo, ésteres de cetilo, DEA cocamida, cera emulsificante, glucosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, DEA lauramida, DEA linoleamida, silicato de magnesio aluminio, maltodextrinas, distearato PEG-8, poliacrilamida, alcohol de polivinilo, copolímero hexadecano/PVP, cloruro de sodio, sulfato de sodio, soyamidopropil betaina, goma de xantano y similares. Alternativamente, los ingredientes opcionales del medio de ensayo mencionado anteriormente también pueden ser adicionados exógenamente. El medio de ensayo puede estar contenido dentro de cualquier tipo de recipiente; frecuentemente los recipientes usados son los tubos, las placas de microtitulación y las placas petri.

El término "umbral" se refiere al valor de concentración por encima del cual un analito dado debe ser considerado como presente y por debajo del cual dicho analito debe ser considerado como ausente. Generalmente, un valor de umbral es dado por los analitos particulares en muestras particulares por autoridades locales, regionales o interregionales pero también puede ser prefijado para ciertos propósitos de investigación.

En un primer aspecto de la invención se proporciona un sistema de ensayo que comprende un medio de ensayo. El medio de ensayo comprende un microorganismo, una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador, caracterizado porque el indicador es el Azul de Bromotimol.

Preferiblemente, la sustancia que proporciona el estado sólido es un agente gelificante y/o material portador. La cantidad de agente gelificante en el medio de ensayo está entre 2 y 100 g.l^{-1}, preferiblemente entre 5 y 50 g.l^{-1}, más preferiblemente entre 10 y 20 g.l^{-1} lo más preferiblemente entre 12 y 15 g.l^{-1}. Preferiblemente el agente gelificante es agar.

En una realización del primer aspecto de la invención, el microorganismo es un microorganismo termoestable como una especie Bacillus, preferiblemente Bacillus stearothermophilus, una especie Escherichia coli, o una especie Streptococcus, preferiblemente Streptococcus thermophilus. Estas especies pueden ser introducidas en el ensayo como unidades capaces de producir colonias o Unidades Formadoras de Colonia (CFU). Dichas CFU pueden ser esporas, células vegetativas o una mezcla de ambas. La concentración de dichas CFU está expresada como Unidades Formadoras de Colonias por ml de medio de ensayo (CFU.ml^{-1}) y está usualmente en el rango de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{12} CFU.ml^{-1}, preferiblemente 1 x 10^{6} a 1 x 10^{10} CFU.ml^{-1}, más preferiblemente 2 x 10^{6} a 1 x 10^{9} CFU.ml^{-1}, lo más preferiblemente 5 x 10^{6} a 1 x 10^{8} CFU.ml^{-1}, o todavía más preferiblemente 5 x 10^{6} a 2 x 10^{7} CFU.ml^{-1}.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona un método para la determinación de un antibiótico en un fluido que comprende los pasos de contactar una muestra de dicho fluido con un medio de ensayo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención en presencia de nutrientes. Ventajosamente, el método proporciona condiciones en las que no hay crecimiento del microorganismo antes de la adición de la muestra de fluido, conservando el medio de ensayo en condiciones que impiden el crecimiento, tal como una temperatura relativamente baja y/o la falta de nutrientes esenciales para el crecimiento. Después de la adición de la muestra de fluido, se deja que tenga lugar el crecimiento del microorganismo durante un período suficientemente largo para que los microorganismos crezcan en caso de que ninguno de los antibióticos estén presentes, adicionando los nutrientes, opcionalmente antes del contacto de dicha muestra de fluido, y/o incrementando la temperatura, y/o proporcionando un valor de pH en el cual el microorganismo es capaz de crecer; y detectar el crecimiento del microorganismo por la observación de la presencia o ausencia de un cambio de un indicador. El método de la presente invención también incluye mezclar las muestras (por ejemplo con otras muestras, pero también con sales, compuestos tamponados, nutrientes, estabilizadores, compuestos marcados con isótopos, compuestos marcados con fluorescencia y similares) concentrar y/o diluir las muestras (por ejemplo con líquidos diluyentes como agua, leche, líquidos derivados de la leche, sangre o líquidos derivados de sangre, orina y/o solventes) antes de la adición al medio de ensayo.

En una realización del segundo aspecto de la presente invención, el antibiótico es un antibiótico \beta-lactámico como una cefalosporina o un derivado de la penicilina. Ejemplos de tales derivados son la amoxicilina, ampicilina, cefadroxil, cefradina, ceftiofur, cefalexina, penicilina G, penicilina V y ticarcilina, pero por supuesto muchos otros derivados
\beta-lactámicos similares son conocidos y aplicables en el método de la presente invención. En otra realización el antibiótico es un aminoglucósido como, por ejemplo, la neomicina.

Ventajosamente, fue establecido que el método de la presente invención demuestra selectividad con relación a los antibióticos, en particular con relación a los antibióticos \beta-lactámicos y aminoglucósidos.

En otra realización del segundo aspecto de la invención, el crecimiento del microorganismo ocurre durante un período predeterminado, preferiblemente dentro de un intervalo de tiempo de 0.5 a 4 horas, más preferiblemente entre 1 a 3.5 horas, lo más preferiblemente entre 2.0 a 3.25 horas. Preferiblemente el crecimiento del microorganismo es conducido a una temperatura predeterminada, preferiblemente la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo. Cuando, por ejemplo, los microorganismos termoestables son usados, dicha temperatura preferiblemente está entre 40 y 70ºC, más preferiblemente entre 50 y 65ºC, lo más preferiblemente entre 60 y 64ºC. Opcionalmente dicha reacción puede ser llevada a cabo con la ayuda de un dispositivo termostático. Alternativamente, el tiempo requerido para el crecimiento del microorganismo es igual al tiempo que es requerido por una muestra de calibración sin analito para inducir un cambio en el indicador.

Todavía en otra realización del segundo aspecto de la invención, los nutrientes se adicionan como una fuente separada, por ejemplo como una tableta, disco o filtro de papel. También otros compuestos como el indicador(s), el microorganismo, los estabilizadores y/o antifolatos pueden ser adicionados como una fuente separada, opcionalmente incorporados en el medio nutriente.

Aún en otra realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la presencia o la ausencia de un antibiótico en una muestra de fluido por medio del cual la proporción de la muestra de fluido en el medio de ensayo excede 2:3 (0.68:1) (v/v). Preferiblemente, dicha proporción es al menos 20:27 (0.74:1) (v/v), más preferiblemente dicha proporción es al menos 25:27 (0.93:1) (v/v); lo más preferiblemente dicha proporción es al menos 2:1 (v/v). Ha sido encontrado que no hay razón técnica para un límite superior para la cantidad de muestra de fluido. En la práctica este volumen no debería exceder el contenido máximo del recipiente que contiene el medio de ensayo. Por ejemplo, en un recipiente de 2 ml que tiene 0.2 ml de medio de ensayo, no más de 1.8 ml de la muestra de fluido debería ser adicionada. En la práctica, los recipientes para realizar el método de la presente invención tienen un volumen que raramente excede 50 ml y por lo tanto la cantidad de la muestra de fluido a ser adicionada no debe exceder los 50 ml, preferiblemente 10 ml, más preferiblemente 5 ml, todavía más preferiblemente 2 ml, lo más preferiblemente 1 ml. De esta manera, en general, el límite superior de la proporción del volumen de muestra de fluido al volumen del medio de ensayo es 250:1 (v/v), preferiblemente 50:1 (v/v), más preferiblemente 25:1 (v/v), todavía más preferiblemente 10:1 (v/v), lo más preferiblemente 5:1 (v/v). Preferiblemente, el volumen de la muestra de fluido es mayor que el volumen de medio de ensayo.

El resultado del método de la presente invención es determinado por la observación de la presencia o ausencia de un cambio del indicador o los indicadores usados. Cuando, por ejemplo tal cambio es un cambio de color, dicho cambio de color puede ser observado visualmente. Sin embargo en una realización de la invención dicho cambio de color es determinado usando un arreglo que genera datos de imágenes digitales o un arreglo que genera datos de imágenes analógicas y convierte dichos datos de imágenes analógicas en datos de imágenes digitales seguido por la interpretación de dichos datos de imágenes digitales por un procesador de computadora. Un arreglo tal, que puede ser por ejemplo un dispositivo lector de muestra como un escáner acoplado a una computadora personal, está descrito en la Solicitud Internacional de Patente WO 03/033728, incorporada como referencia, y brevemente resumida a continuación.

El arreglo puede ser apropiadamente usado por ejemplo para detectar residuos de antibióticos en la leche. Con este arreglo es posible escanear el lado inferior de cada una de las muestras en una placa de ensayo. El color y el brillo de la luz reflejada son registrados en tres variables, cada una describiendo un componente de color, por ejemplo el denominado modelo L*a*b*. En el modelo L*a*b*, el espectro de color es dividido en una matriz bidimensional. La posición de un color en la matriz es registrada por medio de las dos variables "a" y "b". La variable L indica la intensidad (por ejemplo, de azul claro a azul oscuro). Es posible hacer un criterio que comprende el valor-a, valor-b y valor-L para hacer una función compuesta como sigue:

Z = W_{L}.L + W_{a}.a + W_{b}.b

donde w_{L} w_{a} y w_{b} son factores de ponderación para el valor-L, valor-a y valor-b, respectivamente. Los valores de estos factores de ponderación pueden ser calculados por medio de "análisis discriminante", de manera que las medias del grupo muestren una distancia máxima en relación con el ensanchamiento. Combinando dos o más de los componentes de color en el modelo L*a*b* de una manera predeterminada que dependa del tipo de residuo y de la muestra, una detección exacta es posible. En la práctica, es experimentalmente predeterminado un cierto valor de Z al cual un ensayo debe cambiar entre los resultados negativos y positivos.

En un tercer aspecto de la invención se proporciona un kit para llevar a cabo el método del segundo aspecto de la presente invención. Un kit de este tipo comprende uno o más recipientes llenos con el medio de ensayo como es descrito en el primer aspecto de la invención y opcionalmente un dispositivo de muestra. Los recipientes pueden ser tubos de ensayo de cualquier forma y tamaño y de cualquier material disponible, con tal de que la observación de los cambios del indicador sea posible. También, los recipientes pueden ser cavidades tales como aquellas incorporadas en las placas de microtitulación.

Dicho dispositivo de muestra es un dispositivo con la ayuda de el cual el fluido puede ser adicionado a dicho medio de ensayo. Preferiblemente, un dispositivo tal es un recipiente, opcionalmente con marcas de volumen. Más preferiblemente, un dispositivo tal es una jeringuilla, una pipeta o un sistema automatizado de pipeteo. Tal jeringuilla o pipeta pueden ser diseñadas de tal manera que con sólo un modo de operación un volumen predeterminado a partir del fluido puede ser retirado para ser analizado. Opcionalmente, los sistemas conocidos en el arte pueden aplicarse con los cuales más de una jeringuilla o pipeta pueden ser operadas con una sola manipulación. Es el objeto del segundo aspecto de la presente invención proporcionar un kit que permita la adición simple de las cantidades de fluido a ser adicionadas de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Opcionalmente, dicho kit comprende medios para sellar dichos recipientes llenos con el medio de ensayo durante la incubación y/o un inserto con las instrucciones para usar y/o un medio para fijar el tiempo necesitado para la incubación.

En una realización del tercer aspecto de la invención, dicho kit comprende nutrientes. Preferiblemente dichos nutrientes están contenidos dentro de un medio tal como una tableta, disco, o un papel de filtro. Las ventajas de proporcionar nutrientes contenidos dentro de un medio son que el usuario puede fácilmente adicionarlos al medio de ensayo y que las cantidades pueden ser predeterminadas para evitar los errores en la dosificación de las cantidades requeridas. También otros compuestos tales como el(los) indicador(es), estabilizadores y/o antifolatos pueden ser adicionados como una fuente separada, opcionalmente incorporados en el medio nutriente.

En otra realización del tercer aspecto de la presente invención, dicho kit comprende un dispositivo termostático, con la ayuda del cual las muestras pueden ser conservadas a una temperatura prefijada, como la temperatura a la cual el microorganismo muestra un crecimiento suficiente. Preferiblemente, dicho dispositivo termostático es diseñado de tal modo que pueda sostener dichos recipientes llenos con el medio de ensayo. Opcionalmente el dispositivo termostático es acoplado a medios para fijar el tiempo necesitado para la incubación de manera que el calentamiento y/o enfriamiento sea detenido después del lapso de un período prefijado.

Aún en otra realización del tercer aspecto de la invención, dicho kit comprende un portador de datos cargado con un programa de computadora apropiado para instruir una computadora para analizar los datos digitales obtenidos de un dispositivo lector de muestras. Dicho portador de datos puede ser cualquier portador apropiado para almacenar la información digital como un CD-ROM, un disquete, un DVD, una memoria extraíble, una cinta magnética o similares. Ventajosamente, dicho portador de datos cargado con un programa de computadora proporciona el acceso fácil a los últimos programas de computadora disponibles apropiados para el uso en el método de la presente invención.

En un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona el uso del Azul de Bromotimol para mejorar la sensibilidad para un antibiótico en un ensayo de inhibición microbiana.

Ejemplos Ejemplo 1 Comparación de Azul de Bromotimol y Púrpura de Bromocresol en la determinación de penicilina G

Delvotest® MCS comercialmente disponible, preparado de acuerdo con los métodos descritos en EP 0005891, fue adaptado con la sustitución del indicador Bromocresol Púrpura por el Azul de Bromotimol (160 mg.l^{-1}). La sensibilidad para la penicilina G fue determinada investigando las muestras que contienen concentraciones diferentes de penicilina G en diferentes sistemas de ensayo. Los resultados son resumidos en la Tabla a continuación (valores de sensibilidad en ppb).

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Ejemplo 2 Comparación de Azul de Bromotimol y Púrpura de Bromocresol en la determinación de varios antibióticos

Delvotest® MCS comercialmente disponible, preparado de acuerdo con los métodos descritos en EP 0005891, fue adaptado con la sustitución del indicador Bromocresol Púrpura por el Azul de Bromotimol (160 mg.l^{-1}). La sensibilidad para diferentes antibióticos fue determinada investigando dos grupos de seis experimentos usando cualquier ensayo de placa o un sistema de ensayo de tubo. La sensibilidad fue determinada leyendo el ensayo en el momento en el cual un control libre de antibiótico cambió el color. A partir de los resultados como es resumido en la Tabla a continuación (valores de sensibilidad en ppb), puede ser observado que el Azul de Bromotimol proporciona sensibilidades superiores en comparación con el Púrpura de Bromocresol (BP) para todos los antibióticos investigados con la excepción de la sulfadiazina en cuyo caso los resultados para los dos indicadores son idénticos.

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Ejemplo 3 Efecto de la concentración en la comparación de Azul de Bromotimol y Púrpura de Bromocresol

Fueron preparados dos sistemas de ensayo. El primer sistema sólo difiere del Delvotest® MCS comercialmente disponible en que la concentración del Púrpura de Bromocresol es 160 mg.l^{-1}, y la segunda serie es como la primera con el Púrpura de Bromocresol sustituido con el Azul de Bromotimol (160 mg.l^{-1}). La sensibilidad para la penicilina G fue determinada leyendo el ensayo en el momento en el cual un control libre de antibiótico cambió el color. A partir de los resultados como se muestra en la Tabla a continuación (valores de sensibilidad en ppb) puede ser observado que la sensibilidad del Azul de Bromotimol es mejor que la del Púrpura de Bromocresol a las mismas concentraciones del indicador.

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Ejemplo 4 Comparación de Azul de Bromotimol y Púrpura de Bromocresol en el ensayo de inhibición microbiológico a escala de producción

Se prepararon dos series de sistemas de ensayo a escala de producción. La primera serie es el Delvotest® MCS comercialmente disponible y la segunda serie es como la primera con Púrpura de Bromocresol sustituido con Azul de Bromotimol (160 mg.l^{-1}). La sensibilidad para los diferentes antibióticos fue determinada leyendo el ensayo en el momento en el cual un control libre de antibiótico cambió el color. Los resultados están en la Tabla a continuación (valores de sensibilidad en ppb).

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Claims (13)

1. Un método para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido que comprende los pasos de:

(a)

contactar una muestra del fluido con un medio de ensayo que comprende un microorganismo, al menos una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador,

(b)

incubar el microorganismo por un período de tiempo para el crecimiento del microorganismo en caso de que ningún antibiótico esté presente en la muestra de fluido, y

(c)

detectar el crecimiento o la inhibición de crecimiento del microorganismo con el indicador,

caracterizado porque el indicador es el Azul de Bromotimol.

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, donde el antibiótico a ser determinado es seleccionado a partir del grupo que consiste en un antibiótico \beta-lactámico y un aminoglucósido.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, donde el fluido en el cual los antibióticos serán determinados es un fluido asequible a partir de un cuerpo animal o humano.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la proporción de volumen de la muestra de fluido al volumen del medio de ensayo excede 0.68:l (v/v).

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 4, donde la proporción del volumen de la muestra del fluido al volumen del medio de ensayo excede 2:l (v/v).

6. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el volumen de la muestra de fluido es mayor que el volumen del medio de ensayo.

7. Un sistema de ensayo para la determinación de la presencia de un antibiótico en un fluido que comprende un medio de ensayo que comprende un microorganismo, al menos una sustancia que proporciona un estado sólido y un indicador, caracterizado porque dicho indicador es el Azul de Bromotimol.

8. Kit apropiado para la determinación de un antibiótico en un fluido que comprende un recipiente parcialmente lleno con un medio de ensayo que comprende un microorganismo, un agente gelificante y un indicador, caracterizado porque dicho indicador es el Azul de Bromotimol.

9. Kit de acuerdo a la reivindicación 8 que comprende además nutrientes apropiados para permitir al microorganismo crecer.

10. Kit de acuerdo a las reivindicaciones 8 ó 9 que comprende además un dispositivo termostático, con la ayuda del cual las muestras de ensayo pueden ser mantenidas a una temperatura prefijada.

11. Kit de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8-10 que comprende además un portador de datos cargado con un programa de computadora apropiado para instruir una computadora a analizar los datos digitales obtenidos a partir de un dispositivo lector de muestras.

12. Uso del Azul de Bromotimol para mejorar la sensibilidad para un antibiótico en un ensayo de inhibición microbiana.

13. Uso de acuerdo a la reivindicación 12, donde el antibiótico es seleccionado del grupo que consiste en un antibiótico \beta-lactámico y un aminoglucósido.