FI69315B

FI69315B - Foerpackning foer bestaemning av mikro-organismen streptococcus mutans i maenniskosaliv

Info

Publication number: FI69315B
Application number: FI821676A
Authority: FI
Inventors: Takashi Matsukubo; Kosei Ohta; Mitsuharu Takeuchi; Ichiro Takazoe; Hitoshi Saito; Masayuki Tanimura; Kiyoyuki Matsumoto; Kuniaki Asami
Original assignee: Showa Pharm Chem Ind; Ichiro Takazoe; Mitsuharu Takeuchi; Kosei Ohta; Takashi Matsukubo
Priority date: 1981-05-15
Filing date: 1982-05-12
Publication date: 1985-09-30
Also published as: NO161078B; NO161078C; FI69315C; FI821676A0; JPS57189695A; DK206482A; EP0065137B1; DE3266322D1; FI821676L; EP0065137A1; NO821376L; JPH036798B2

Description

1 69315

Pakkaus Streptococcus mutans-mikro-organismin määrittämi seksi ihmisen syljestä

Ihmisen hammasmätä on niinsanottu monifaktorisairaus, 5 jonka aiheuttavat monet, toisiinsa monimutkaisella tavalla liittyvät tekijät. Eräs päätekijöistä on hammasplakin muodostuminen syljestä ja sakkaroosista, jota suussa aina esiintyvät streptococci-bakteerit käyttävät, ja tämä hammasplakki aiheuttaa helposti hammasmädän. Hammasplakkia syntetisoivina 10 streptococceina oyat tunnettuja Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans sekä Streptococcus salivarius.

Näiden streptococcien joukosta Streptococcus mutans syntetisoi veteen liukenemattomia polysakkarideja ja muodostaa hammasplakkia, joka aiheuttaa hammasmätää. Niinpä hammasmädän 15 estämiseksi on tärkeää tuntea suussa vallitsevat olosuhteet, erityisesti Streptococcus mutans-bakteereiden määrä suussa.

Tätä tarkoitusta varten kehitettiin menetelmä ja ehdotettiin sitä hammaskariesaktiivisuuden määrittämiseksi (katso Japanese Patent Application Laid-Open Specification 20 No 55260/1980). Tavanomaisella tavalla käytetyllä MSB-lie-mellä oli kuitenkin useita puutteita kuten myöhemmin kuvataan. Nimenomaan havaittiin, että MSB-liemen koostumus muuttuu jonkin ajan kuluttua sen valmistamisesta ja Streptococcus mutansin(myöhemmin tässä yhteydessä nimitetty "hammasmätä-25 patogeeniksi") lisäämisen jälkeen, ja muiden bakteereiden kasvun inhibointi tulee epävarmaksi. On ajateltu tämän puutteellisuuden johtuvan MSB-liemen koostumuksesta, ja että se on tämän vuoksi väistämätön. Syynä on se, että on mahdotonta säilyttää antibioottia, kuten esim. basitrasiinia, 30 elatusaineessa, normaalilämpötiloissa pitkiä aikoja elatus-aineen an tibioottiaktiivisuuden vähentymättä. Näin ollen valmistetaan tuore MSB-liemi, kun koe suoritetaan. Tästä syystä hammaslääkärin on käytännössä mahdotonta soveltaa diagnoosiin yllä mainittua menetelmää, jossa käytetään mainittua MSB-lientä.

_ - TT

2 6931 5

Keksintö koskee kariesaktiivisuuden testaamiseen soveltuvaa pakkausta, johon sisältyy kaksi tai kolme nestemäisen elatusaineen aineosaa, jotka voivat selektiivisesti lisätä hammasmätää aiheuttavaa Streptococcus mutans-5 bakteeria. Näitä aineosia ei ole lisätty elatusaineeseen alkuvaiheessa, vaan ne ovat erillään kuivassa muodossa, ja juuri ennen mainitun elatusaineen käyttöä ne lisätään siihen, jotta elatusaineelle saadaan sopiva koostumus. Tutkimustyötä tehtiin parannetun, yksinkertaisen MSB-liemen 10 tuottamiseksi, jolla on sama kapasiteetti kuin alkuperäisellä MSB—liemellä ja jota hammaslääkäri saattaisi mukavasti käyttää tavanomaiseen kliiniseen tutkimukseen ja jota voitaisiin tuottaa alhaisin kustannuksin.

Keksinnölle on tunnusomaista, että pakkaus sisältää 15 a) läpinäkyvän astian, johon on suljettu MSB-liemen pää- ravintolähteet, joka liemi on Streptococcus mutans-mikro-organismin nestemäinen viljelyväliaine, jolloin pääravinto-lähteet ovat sinänsä tunnetut ja käsittävät 10 g tryptoosia, 10 g peptonia, 1 g glukoosia, 200 g sakkaroosia 4 g dikalium-20 fosfaattia ja 1000 ml vettä; ja b) basitrasiinin alustan sekä lisäreagenssin alustan, jotka alustat ovat paperia tai muovia ja joille on levitetty ennakolta määrätyt määrät basitrasiinia ja lisäreagensseja kuivassa olotilassa, jolloin lisäreagenssin alusta on yhdis-25 telmä alustoista, jotka sisältävät 1000 ml viljelyväliainetta kohden 0,01 g kalium telluriittia, 0,0008 g kristallivioletti-väri-indikaattoria ja 0,075 g väri-indikaattoria Trypan Blue, ja jolloin basitrasiinin alusta sisältää 200 U basitrasiinia.

Taulukossa 1 on esitetty MSB-elatusaineen sekä kyseessä 30 olevan keksinnön mukaisesti käytetyn elatusaineen koostumus.

69315

Taulukko 1 MSB-elatusaineen sekä kyseessä olevan keksinnön mukaisen elatusaineen koostumukset (fl/1000 mil_ 5

Kyseessä olevan keksinnön mukai-

Aineosat MSB-lietni nen elatusaine tryptoosi1^ 10 10 ) 2) ^ peptoni 10 10 ) nestemäinen glukoosi 1 1 > P^elatus- 3 ) aine sakkaroosi 200 200 ) dikaliumfosfaatti 4 4 j basitrasiini 200 u 200 u) lisäreagen- 15 kaliumtelluriitti 0,01 0,01 Pldetään ·,, kuivassa muo- kristallivioletti ' 0,0008 0.0008 ) dossa erillään * käyttöön saakka

Trypan Blue 0,075 0.075 ;

Huomautukset 20 1) Bacto Tryptose (Difco) 2) Proteose Peptone no 3 (Difco) 3) Kristallivioletti saattaa sisältyä peruselatusaineeseen

Tutkittiin huolellisesti MSB-liemen vastaavien 25 aineosien välisiä reaktioita ja sen tuloksena valmistettiin elatusainekoostumus alla kuvatulla tavalla.

6 9 31 5

Valmistetaan nestemäinen peruselatusaine, jolla on koostumus, josta basitrasiini (tässä yhteydessä merkitty "BA":ksi, kaliumtelluriitti (tässä yhteydessä merkitty "TE":ksiJ sekä Trypan Blue (tässä yhteydessä merkitty 5 "TB":ksi) ja/tai kristallivioletti on poistettu, ja tämä nestemäinen peruselatusaine steriloidaan ja säilytetään aseptisesti. BA, TE, ja TB valmistetaan erikseen, siten että ne ovat lisäreagensseina kuivassa muodossa sopivalla alustalla, ja lisäreagenssin sisältävä alusta steriloidaan 10 ja säilytetään aseptisesti. Testiä suorittaessaan hammaslääkäri liuottaa lisäreagenssit steriilistä nestemäiseen peruselatusaineeseen, jotta yksinkertaisesti muodostuu pika MSB-liemi. Tässä tapauksessa TB, alustaan sisältyvä väriaine liuotetaan nestemäiseen peruselatusaineeseen elatus-15 aineen värjäämiseksi. Tämän värjäyksen avulla varmistetaan muiden aineosien liukenemisen täydellisyys. Keksinnön mukaisten tulosten perusteella havaittiin, että elatus-ainekoostumuksen yllä mainittu yhdistelmä on verrattavissa tavanomaiseen MSB-liemeen käytettäessä sitä kliinisenä 20 elatusaineena syljessä esiintyvän hammaskariespatogeenin selektiiviseen viljelyyn (katso taulukko 2), ja että jos elatusainekoostumus tutkitaan 6 kuukauden säilyvyyskokeen avulla, sen kapasiteetti ei ole vähentynyt (katso taulukko 3). Kyseessä olevaa keksintöä on täydennetty edellä esitettyjen 25 havaintojen perusteella.

Taulukko 2 6931 5 MSB-liemellä ja kyseisen keksinnön mukaisella elatus-aineella määritetyn kariesaktiivisuuden tulokset 5 Näyte MSB Kyseinen keksintö 1 + + 2 +++ +++ 10 3 4 +++ +++ 5 +++ +++ 6 +++ +++ 7 + + 15 8 9 ++ ++ 10 + +

Huomautus 20 Merkki ilmaisee, että hammasmätä- patogeeni ei lisäänny ja merkit "+" - "+++" ilmaisevat hammasmätä-patogeenin lisääntymisasteen, mikä on suhteessa syljessä esiintyvien bakteerisolujen lukumäärään.

Koemenetelmä: 25 0,1 ml sylkeä, joka oli koottu 10 terveeltä aikui selta, lisättiin 2 ml:aan tavallista MSB-lientä ja yhteen näytteeseen elatusainetta, jota on kuvattu myöhemmin esimerkissä 2, ja viljeltiin 37°C:ssa 24 tunnin ajan rutiini-menetelmin. Lisääntymisaste määritettiin visuaalisesti 30 kaupallisen, kyseisen menetelmän mukaiseen käyttöön valitun standardin perusteella.

6

Taulukko 3 6931 5

Kyseessä olevan keksinnön mukaisen elatusaineen kapasi- teetti yarastoimisajän jälkeen_ 5 Testin toistokerrat Varas to imis aika_(kuukausia) 0 (kontrolli) 2 1 j> +H—h —l· H—h+ +H—h 2 +++ +++ +++ +++ j»"' '10 3 +++ +++ +++ +++

Koemenetelmä:

Elatusaine: Tutkimustuote erä no 5402, valmistettu alempana esitetyssä esimerkissä 1.

15 Varastoimis- aikakoe: Tutkimustuotteen erää no 5402 säilytettiin inkubaattorissa, jossa pidettiin 40°C:n lämpötilaa. Osa tuotteista otettiin pois 2 kuukauden välein ja varastoitiin välit-20 tömästi pakastimeen, jonka lämpötila pidet tiin - 5°C:n alapuolella.

Kontrolli: Tutkimustuote erä no 5402 säilytettiin pakastimessa, jonka lämpötila pidettiin -5°C:n alapuolella, suoraan ilman varastoi-25 misaikakoetta.

Näyte (tuore sylki): Terveeltä, 23-vuotiaalta mieheltä saatu sylki, jossa esikokeen perusteella havaittiin korkea hammasmätäaktiivisuus.

Työvaihe: 0,1 ml näytettä lisättiin elatusaineeseen 30 (elatusainekontrolli tai elatusaine, joka oli varastoimisaikatestin kohteena) ja viljeltiin 37°C:ssa 24 tunnin ajan noudattaen rutiinimenetelmiä.

7 69315

Meneteltäessä keksinnön mukaisesti astia, jossa on nestemäinen peruselatusaine toimii myös viljelyastiana, ja sen-tähden voidaan hyvin käyttää väritöntä, läpinäkyvää lasi-astiaa, jonka sisäläpimitta on noin 10 mm, esim. ampullia, 5 pulloa, putkimaista pulloa tai koeputkea, Lisäreagenssit, kuten esim. BA, TE ja TB jäähdytyskuivataan erikseen tai levitetään paperille, kuten esim. suodatinpaperille. Kummassakin tapauksessa liuotin poistetaan niin tarkoin kuin mahdollista, jotta saadaan keksinnön mukainen tuote.

10 Kyseistä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti viitaten seuraaviin esimerkkeihin. Näissä esimerkeissä käytettiin yleensä nestemäistä peruselatusainetta, joka on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 1 15 (A) Värittömään, läpinäkyvään lasipulloon, jonka sisäläpimitta oli 12 mm ja läpimitta aukon läheisyydessä oli noin 8 mm, pantiin 2 ml nestemäistä peruselatusainetta ja pullo suljettiin kumitulpalla, Sterilointi suoritettiin 115°C:ssa 15 minuutin ajan.

20 (B) Pyöreää suodatinpaperia, jonka paksuus oli 0,8 mm käytettiin lisäreagenssin alustana. Lisäreagenssit ΒΑ,ΤΕ ja TB liuotettiin erikseen ja sisällytettiin alustaan alla kuvatuin tavoin, ja alusta kuivattiin alennetussa paineessa ja suljettiin astiaan.

25 1) BA:

Liuos, jossa oli 0,4 U basitrasiinia noin 0,002 ml:ssa vettä, siirrettiin mikropipetin avulla alustalle.

2) TE:

Liuos, jossa oli 0,4 mg kaliumtelluriittiä noin 30 0,002 ml:ssa vettä, siirrettiin mikropipetin avulla eri alustalle.

3) TB :

Liuos, jossa oli 0,15 mg Trypan Blueta noin 0,002 ml:ssa yettä, siirrettiin mikropipetin avulla eri alustalle.

35 Kun elatusainekoostumusta varsinaisesti käytettiin, kumisulkija poistettiin peruselatusaineen sisältävästä 8 69315 astiasta, joka oli saatu yllä esitetynkohdan (A) mukaan, ja reagenssia sisältävät alustat, jotka oli saatu edellä esitetyn kohdan (B-l), (B-2) ja (B-3J mukaan, pantiin edellä, kohdassa (A) kuvattuun peruselatusaineeseen, 30 sekunnin 5 kuluttua, alustat otettiin pois ja 0,1 ml potilaan sylkeä lisättiin elatusaineeseen. Sitten astia suljettiin jälleen kumisulkijalla ja viljely suoritettiin 37°C:ssa 24 tunnin ajan.

Esimerkki 2 10 ^ (Ai 3 ml:n vetoiseen ampulliin, jonka sisäläpimitta oli noin 9,5 mm ja aukon läpimitta noin 4 mm (aukon läpimitta ampullin katkaisun jälkeen), pantiin 2 ml nestemäistä peruselatusainetta, ja ampullin pää sulatettiin umpeen, ja steriloitiin 115°C 15 minuutissa.

15 (B) Alustana käytettiin neliömäistä suodatinpaperia, jonka paksuus oli 0,5 mm ja yksi sivu oli 3,5 mm. Lisä-reagenssien BA, TE ja TB liuokset kaadettiin erikseen alustoille kohdassa (B) esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jotta tuote saatiin.

20 Kun elatusainekoostumusta varsinaisesti käytettiin, ampulli (A) katkaistiin, ja reagenssia sisältävät paperi-alustat (B-l), (B-2) ja (B-3) lisättiin peruselatusaineeseen (A) samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 1. Sitten elatusaineeseen lisättiin 0,1 ml potilaan sylkeä 25 ja aukko peitettiin steriloidulla alumiininkannella.

Viljely suoritettiin 37°C:na 24 tunnin ajan.

Esimerkki 3 (A) Peruselatusaine valmistettiin samalla tavalla kuin esimerkin 1 kohdassa (A) paitsi, että kristalli- 30 violettia ei lisätty. Sitten peruselatusainetta pantiin pieneen lasiputkeen, jonka sisäläpimitta oli noin 10 mm ja pituus 60 mm, ja aukko peitettiin tiiviisti sulkevalla polypropyleenitulpalla. Sterilointi suoritettiin 115°:C:ssa 15 minuutin ajan.

9 69315 (B), Lisäreagenssia sisältävät kolme suodatinpaperi-alustaneliötä, joiden paksuus oli 0,5 mm ja yksi siyu 3,5 mm, valmistettiin samalla tavalla kuten on kuvattu esimerkissä 2, ja ne liitettiin riviin läpinäkyvälle 5 muovikalvolle, jonka leveys oli 3,5 mm, pituus 50 mm ja paksuus 0,3 mm, käyttäen sopivaa sideainetta. Tässä tapauksessa kolme alustaa ei ollut erillään vaan toisiinsa yhdistettyinä ja sentähden niitä voitiin käsitellä hyvin helposti.

10 BA- ja TE-alustat valmistettiin esimerkissä 2 kuva tulla tavalla, mutta TB-alusta valmistettiin alla, kohdassa 3) kuvatulla tavalla.

3) TB: Väri-indikaattoriliuos, jossa oli 0,15 mg Trypan Blueta ja 0,0016 mg kristalliviolettia noin 0,00+ ml:ssa 15 vettä, siirrettiin pipetin avulla alustalle (suodatinpaperi) .

Claims

6931 5 10

1. Pakkaus Streptococcus mutans-mikro-organismin pitoi-5 suuden määrittämiseksi ihmisen syljestä, tunnettu siitä, että se sisältää a) läpinäkyvän astian, johon on suljettu MSB-liemen pääravintolähteet, joka liemi on Streptococcus mutans-mikro-organismin nestemäinen viljelyväliaine, jolloin pääravinto- 10 lähteet ovat sinänsä tunnetut ja käsittävät 10 g tryptoosia, 10 g peptonia, 1 g glukoosia, 200 g sakkaroosia 4 g dikalium-fosfaattia ja 1000 ml vettä; ja b) basitrasiinin alustan sekä lisäreagenssin alustan, jotka alustat ovat paperia tai muovia ja joille on levitetty 15 ennakolta määrätyt määrät basitrasiinia ja lisäreagensseja kuivassa olotilassa, jolloin lisäreagenssin alusta on yhdistelmä alustoista, jotka sisältävät 1000 ml viljelyväliainetta kohden 0,01 g kaliumtelluriittia, 0,0008 g kristallivioletti-väri-indikaattoria ja 0,075 g väri-indikaattoria Trypan Blue, 20 ja jolloin basitrasiinin alusta sisältää 200 U basitrasiinia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pakkaus, tunnet-t u siitä,että lisäreagenssin alusta on levy, kalvo, sauva, pallo tai kuutio, joka koostuu paperista, paperimassasta, synteettisistä kuiduista, lasikuiduista, kankaasta tai vettä 25 absorboivasta muovista.