SU1700468A1 - Способ обнаружени энтеробактерий в воде - Google Patents

Description

1

(21)4615334/13 (22)01.12.88 (46)23.12.91. Бюл. №47

(71)Кишиневский медицинский институт

(72)В.М.Никитин, А.П.Каланча, Ф.И.Георги- ца, В.М.Скуратов и Л.Б.Загибалова

(53) 586(088.8)

(56) Корш Л.Е., Артемова Т.З. Ускоренные методы санитарно-бактериологического исследовани  воды. М., Медицина, 1978, с. 164-165.

(54)СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНТЕРОБАК- ТЕРИЙ В ВОДЕ

(57) Изобретение относитс  к микробиологии , в частности к способам обнаружени  энтеробактерий в регененированной воде. Цель изобретени  - ускорение и повышение точности определени . Отобранн/ю пробу воды внос т во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор , с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор. 5 табл.

Изобретение относитс  к микробиологии , в частности к способам обнаружени  энтеробактерий в регенерированной воде.

Известны способы ускоренного обнаружени  микроорганизмов в жидкост х по их способности редуцировать соли тетразоли- ев.

Наиболее близким по технической сущности  вл етс  способ обнаружени  кишечных палочек с помощью индикаторных бумажек, пропитанных питательной средой, содержащей м со-пептонный бульон, лактозу , агар и ТТХ.

Недостатком известного способа  вл етс  длительность обнаружени  кишечных палочек (24-48 ч), а также его недостаточна  чувствительность. Это св зано с тем, что в состав среды внесен ТТХ, который при росте оказывает угнетающее действие на рост и размножение микроорганизмов,

Кроме того, способ индикаторных бумажек позвол ет обнаружить только кишечные палочки, тогда как в воде могут

находитьс  и другие представители энтеробактерий .

Цель изобретени  - ускорение и повышение точности определени  энтеробактерий в регенерированной воде.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что способ осуществл ют путем посева отобранной пробы воды во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор , с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор. При этом в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натри  или кали  двухзаме- щенный, фосфорнокислый натрий, глицерин и дистиллированна  вода при следующем соотношении ингредиентов в мас.%:

Сухой питательный

бульон0,014-0,016;

нитрат натри  или

кали 0,001-0,01;

сл

с

XI О О О 00.

Двухзамещенный

фосфорнокислый

натрий0,0025-0,0035;

Глицерин0,0015-0,0025;

Вода дистиллиро-

ванна Остальное,

В качестве индикатора используют раствор , содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и лед ную уксусную кислоту в соотношени х 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды.

Включенный в состав питательно-субстратной пленки нитрат натри  (кали ) используют в качестве субстрата, который редуцируетс  абсолютно всеми знтеробак- тери ми в нитрит натри  (кали ) и определ етс  с помощью индикатора на нитриты по хромогенной реакции. Двухзамещенный. фосфорнокислый натрий создает оптимальный рН 7,2-7,4 дл  роста и размножени  энтеробактерий при растворении питательно-субстратной пленки в пробе регенерированной воды, котора  имеет рН 6,4-6,6. Глицерин совместно с бульоном в сочетании с нитратом натри  (кали ) служат пита- тельной основой дл  энтеробактерий, котора  способствует их оптимальному росту и быстрому размножению (табл.1). Кроме того, глицерин совместно с питательным бульоном создает услови  дл  образовани  пленки и фиксации ее на дне флакона, что способствует сохранности ее питательных качеств и стерильности (табл.2}.

Дл  обнаружени  нитритов используетс  индикатор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и лед ную уксусную кислоту в соотношени х 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды, который  вл етс  наиболее чувствительным (табл.3).

Все это позвол ет повысить чувствительность и ускорить обнаружение энтеробактерий до 6-4 ч при концентраци х . 104-106 и до 9 ч при концентраци х до 1-10 микробных клеток в 1 мл (табл.4).

Способ осуществл ют следующим образом .

1.Приготовление питательно-субстратной пленки. Навеску сухого питательного бульона раствор ют в дистиллированной воде, добавл ют нитрат натри  (кали ), двухзамещенный фосфорнокислый натрий и подогревают. Затем полученный раствор питательной основы фильтруют через бумажный фильтр, добавл ют глицерин и внос т во флаконы. Затем воду выпаривают, получа  питательно-субстратную пленку, фиксированную на дне флакона. Флаконы с пленками закрывают и стерилизуют.

2,Приготовление индикатора на нитриты . Навеску сухого реактива Грисса раствор ют в дистиллированной воде, добавл ют лед ную уксусную кислоту и цинковую пыль. Полученный раствор фильтруют и хран т в холодильнике.

3. Обнаружение энтеробактерий. Испытуемую пробу регенерированной воды в сте- рильных услови х внос т во флакон с питательно-субстратной пленкой, инкубируют при 37°С. Дл  обнаружени  нитритов

0 смешивают каплю среды из флакона с индикатором на нитриты и определ ют их по изменению цвета, что свидетельствует о наличии в водб энтеробактерий.

П р и м е р 1. Методика приготовлени 

5 питательно-субстратной пленки. Навеску питательного сухого бульона в 15 г тщательно размешивают в колбе со 100 мл холодной дистиллированной воды. Кип т т на медленном огне 1-2 мич, посто нно помеши0 ва . В полученный раствор внос т 2 г нитрата натри  (кали ) и 3 г двухзамещенно- го фосфорнокислого натри , посто нно перемешива  до полного растворени . Затем полученный раствор дважды фильтруют че5 рез двойной бумажный фильтр, после чего добавл ют 2 мл глицерина. Питательна  основа имеет вид жидкости темно-коричневого цвета. Далее пипеткой-дозатором перенос т по 0,2 мл жидкой питательно-суб0 стратной основы в химически чистые сухие флаконы емкостью 10 мл. Дл  получени  питательно-субстратных пленок выпаривают жидкую часть путем помещени  флаконов под струю нагретого до 60°С

5 воздушного потока на 1 ч. После получени  пленок светло-коричневого цвета флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками и стерилизуют.

Флаконы с питательно-субстратными

0 пленками хран т при +4-7°С в услови х холодильника и используют дл  ускоренного обнаружени  энтеробактерий в регенерированной воде.

2.Методика приготовлени  индикатора , 5 на нитриты. В фарфоровую ступку внос т 1 г

( сухого реактива Грисса и тщательно его гомогенизируют пестиком до получени  мелкодисперсной пудры, затем приливают 10 мл дистиллированной воды, посто нно

0 перемешива  до полного растворени  реактива . После чего раствор перенос т в бактериологическую пробирку, к нему приливают 0,25 мл лед ной уксусной кислоты и внос т 0,01 г цинковой пыли. Полученный индика5 тор фильтруют и хран т в пробирке с плотно закрытой пробкой в холодильнике пыли в темном месте при комнатной температуре.

3.Обнаружение энтеробактерий в регенерированной воде. Дл  этого используют питательно-субстратные пленки во флаконах , приготовленные из ингредиентов в пределах указанных граничных значений (табл.5). Все примеры состава реагента, приведенные в табл.5, выполн ют аналогично .

Исследуемую регенерированную воду забирают стерильным шприцем в объеме 1 мл и внос т во флакон с питательно-субстратной пленкой путем прокола резиновой пробки иглой шприца. После легкого встр - хивани  дл  полного растворени  и равномерного распределени  питательной основы, флаконы направл ют в термостат при 37°С. Регистрацию результатов провод т через 6 и 9 ч инкубации. Дл  этого с помощью шприца забирают 0,1 мл индикатора на нитриты и внос т во флакон путем прокола резиновой пробки иглой шприца. При положительной реакции на нитриты происходит окрашивание содержимого флакона в течение 1 мин в вишнево-красный цвет, а при отрицательной - остаетс  первоначальный цвет (соломенно-желтый). При положительной реакции через б ч в 1 мл регенерированной воды до подращивани  содержитс  105-10е микробных клеток в 1 мл, а при положительной реакции через 9ч- 1-100 клеток в 1 мл.

Предлагаемый способ  вл етс  более быстрым и позвол ет повысить чувствитель- ность обнаружени  энтеробактерий при наличии единичных микробных клеток в 1 мл регенерированной воды.

Т а б л и ч а 1

Вли ние ингредиентов питательно-субстратной пленки на рост и размножение эчтеробактерий

5.Концентраций энтеробактерий В 1 мл через Э ч инкубации

6.Обнаружение энтеробактерий в 1 мл через 9 ч инкубации

Примечание. Вода дл  посева содержала 1-10 микробных клеток в t мл.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ обнаружени  энтеробактерий в воде, предусматривающий посев отобранной пробы воды в питательную срэду. содержащую сухой питательны оульон, углевод и индикатор, последующую инкубацию и регистрацию энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  и повышени  точности определени , в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натри  или кали , двухэамещенный фосфорнокислый натрий, и глицерин и дистиллированна  вода при этом ингредиенты вз ты в следующем соотношении , мас.%:

   Сухой питательный

   бульон

   Нитрат натри  или

   кали 

   Двухзамещенный

   фосфорнокислый

   натрий

   Глицерин

   Вода дистиллированна 

   а в качестве индикатора твор, содержащий реактивую пыль и лед ную укс соотношени х 1,0:0,001:0тиллированной воды.

   10

   более 10

   обна руже

   НЫ

   Таблица2

   Сохранность питательных качеств и стерильности питательно-субстратной пленки

   „ ТаблицаЗ

   Чувствительность и скорость определени  энтеробэктерий а зависимости от количественных соотношений ингредиентов индикатора на нитриты

   Примечание. Регистраци  результатов обнаружени  энтеробэктерий проводилась через 9 ч инкубации при 37°С

   - - реакци  отрицательна ; С - реакци  сомнительна ; РП - реакци  резко положительна  . Скорость и чувствительность обнаружени  энтеробэктерий предлагаемым и известным способом

   г. В предлагаемом способе энтеробактерии в концентраци х 10-10 обнаруживались через 6-Ц ч, а в концентраци х 1-100 - через 9 ч инкубации при 37°С.

   В известном способе обнаруживались только E.coli   концентраци х 10 и более при инкубации а течение 2 ч,.

   Таб лица

   Примечание,, Регистраци  результатов обнаружени  энтеробактерий проводилась через

   9 ч инкубации при 37°С.

   Чувствительность и скорость обнаружени  энтеробактерий в зависимости от количественных соотношений ингредиентов питательно-субстратной пленки