JPS59500548A - 微生物学的試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物学的試験方法と装置 本発明は微生物学的試験方法と装置、そして特に微生物同定試験と病厚微生物の 臨床分離株に対する抗生物質の最小比ＩＦ！１度試験（ＭＩＣ！試、験）に関す る。

患者やその他から臨床的に分離した微生物の抗菌物質に対する感受性や、代謝発 育条件を試験することは、臨床検査室で長い間行なわれてきている。このような 試験の目的は微生物を同定すること、及び／又は臨床的な面から微生物の抗菌剤 に対する感受性を評価することである。

これらの試験を補助するための多くの方法や装置が開発されている。この目的の ために特に便利なのは一連の培養ウェルを有するマイクロタイタープレートであ る。各ウェルは段階的に量の異なる抗菌剤（たとえば抗生物質）、及び／又は発 育促進物質（たとえばビタミン）を時に微生物培地の他の成分と共に、しばしば 乾燥状態又は他の安定化された状態で含有している。

このようなマイクロタイタープレートとその使用例は米国特許第５，７１３，９ ８５号明細書（Ａｓｔｌｅ　）、フランス国特許第１．４８８，８６６号明細書 （５ｃｌａｖｏ　）、そして英国特許明＠筈第１５７４７０７号（Ｕｎｉ１５ｖ ｅｒ）に記載されている。後者の明細書は特に安定化した形のマイクロタイター プレートが記載しである。

特表昭５９−５００５４８（３） 使用に際しては上記のゾレートや他の適当な装置に、必要な培養材料や接種菌を 接種し、培養結果が現われるまで培養する。この培養結果は多くの場合マイクロ タイターウェルの底に発育の「ボタン」として見られ、ふつう少なくとも１８時 間培養する必要がある。（ある種の増殖速度の早い微生物では７時間ですでに「 ボタン」形成のみられるものがあるが、この段階ではふつう感受性試験結果を判 定することは不可能である。）培養結果が検出できるまでの培養時間を減少させ ることが好ましい。

この目的のためにいくつかの方法がすでに提案されている。特殊な方法がたとえ ば米国特許第４．２３６，２１１号（Ｐｆｉｚｅｒ　）　（限られた数の菌株に ついて培養約５時間後に微生物による光の散乱を測定、さらに米国特許第３．８ ３２．５６２号及び英国特許第１．５５４，１３４号（Ｐｆｉｚｅｒ　）も参照 ）に記載されている。これらの方法を用（・るには複雑で高価な装置及び／又は 観察された光散乱に基く膨大な計算が必要である。特に米国特許第４．２４２， ４４７号（Ｂｉｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）は、微生物に汚染された試験液を酵素 誘導培地に約１５−ろ００分間接触させた後、この混合液にフルオレセイン減＝ ベーターガラクトシドを反応させ螢光測定し℃液体中の微生物含量をめるという 螢光検出方法を記載している。

米国特許第３５０９０２６号明細書（ＬｉｔｔｏｎＳｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、　 ）は、培地、抗生物質そして加水分解可能な基質としてフラボ゛／−３−シフオ スフェートを含有する不活性の紙を台紙の上に使用して螢光による微生物の発育 を調べて、微生物の抗生物質感受性を調べる培養方法を記載しているため特に関 係がある。米国特許第３５０９０２６号は記載の系により抗生物質感受性が迅速 に評価可能であることを示唆しておシ、４時間の培養の後に螢光下に培養液を調 べた結果を示す例を掲げている。４時間培養の後に抗生物質感受性の若干の指標 が得られているが、例の中にも不明瞭と指示された結果かいくつかあり、水洗に より単純で信頼性のある系を作ることは少なくとも困難と思われる。

さらに最近Ｔ、　ＵｒｂａｎとＣ，ＪａｒｓｔｒａｎｄはＪ、　Ａｎｔｉｍｉｃ ｒｏｂｉａｌ　（！ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　（１９８１）　８　＋ろ６３−３ ６９に、ニトログルーテトラゾリウムと７エナジンメトサルフエートを４時間培 養の後微生物の発育があった場合に青いフォルマザンの色を得る方法を追加して 、市販の５ｅｎｓｉｔｉｔｒｅ試験プレートによる微生物の同定法とＭＩＣ測定 法を記載している。ＮＥＴとＦＭＳは培養微生物に対し毒性を有しているためＭ ＩＣ測定又は同定の後さらに試験するために培養液全捨でない方か好ましい場合 か多い。

従来の方法は、種々の起源（既知、市販されている。。

そして酵素学的方法に用いられている〕の酵素のいくつかの螢光原性基質を用い ている。これらの例として種々の螢光性４−メチル−ウンベリフェリル誘導体（ ４−メチル−ウンベリフェロンに加水分解可能）や７−アミノ−４−メチル−ク マリンの誘導体がある（たとえば英国特許第１，５４７，７４７号明細書及びヨ ーロッパ特許第０．０００，０６３号明細書（味の素））。

本発明は、簡単な方法を用いて培養後わずか４時間で又ある場合にはさらに短時 間で有用に広範囲の微生物のいかなるものについても、しばしば信頼できる培養 結果の得られる改良した装置及び方法を供する。この装置は必要な場合にはあと で確認のため通常の培養を続けふつうの培養状態が得られる。

本発明では、培地の中に螢光原性基質を含有させて微生物の培養試験（たとえば ＭＩＣ測定又は微生物の同定）をスピードアソノし、培養液の螢光を調べて発育 の有無を測定する。

本発明の態様の一つは、試験する微生物（たとえば敗血症の臨床分離株の同定し てないもの）に関して抗菌性物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）測定の改良された方 法において、（ａ）ＭＩＣを測定すべき抗菌性物質の連続的に量の異なるシリー ズの一つ（シリーズのひとつとしてゼロの量をおそらく含有する）全個々の一分 に追加した栄養培地の一連の別個の培養部分のおのおのの中で微生物を培養する こと、（１））　数個の培養部分で微生物の発育の程度を検出すること、及び（ Ｃ）個々の検出された発育の程度を示すデータよＱＭＭＩＣ評５ 価することを特徴とする上記改良法：この改良法は基本的に（ｄ）個々の培養部 分に接種菌として約５　Ｘ　１０’細胞／　ｍｌから１０６細胞／　ｍｌの範囲 の微生物濃度（又必ずしも５ｘ１０５ｍ／である必要はなく好ましくはこれと同 じか又はこれ以下の数）を用いること：（ｅ）微生物を適切な発育条件、たとえ ば好ましい実施態様として１ｌ−１：５時間以下好ましくは約４時間培養すると と；（ｆ）　各培養部分を培養時間中及び／又は培養後、酵素的に修飾（たとえ ば加水分解）されて螢光がかなシ修飾（たとえば加水分解）されて螢光がかなシ 修飾を受けたか又は増加した螢光性誘導体を与えることができる化合物としてこ こに定義される少なくとも１つの螢光原物質（そのような螢光原物質としてはた とえば螢光性クマリン、又おそらくはフルオレセイン、インドール化合物とその 誘導体のリン酸塩、ペゾチド、エステルそしておそらくは配当体など複合体より 選んだ螢光を有する複合体がある）、又は複数個のそのような螢光原物質に螢光 物質の酵素的加水分解が起きるのに充分な時間（たとえば培養時間の間及び／又 は螢光源物質が培養後加えられるときのために培養後約６０分間）接触させるこ と、（ｇｌ非破壊的な機器による螢光測定すなわち螢光光度法によシ各培養部分 の螢光全評価することによシ、培養時間（たとえばある好ましい実施態様では約 ４−７時間以下、たとえば約３．５−５時間、好ましくは約４時間）後のＭＩＣ 値の評価に関する情報を得ること、の組み合せより成る。結果を得る前に培養微 生物が少なくとも６世代時間培養されることが好ましい。特に下記の例において は４時間をルーチン的に使用した。

下記の実施態様において、結果が培養時間が４時間で得られ、もし必要な場合は 従来の１６時間培養又はそれ以外の時間に達するまでの間培養液を保持したり培 養を続けたりして別の方法（たとえば−晩珊養仮に肉眼で調べるうによって結果 が確認できるという点で、本法は現在のＭＩＣ測定法よりすぐれている。もちろ んこのように結果が早く得られることは治療決定が早くなり患者の治療の役に立 つ。螢光発色が無いことを確認するために、抗生物質のはいってないウェルとい う形で、この方法には容易に陽性コントロールを組み入れることができる。一般 的に不法は他の検出方法に比較して試験全体に必要な時間について改良されてい る。

有益な結果を得るためには当然（ｆ）段階において使用される螢光原物質は、発 育の有無を調べるべき微生物の生産する酵素により加水分解可能でなければなら ない。

原則としてこの微生物としては未同定の微生物すべてが含まれるため当然この条 件を維持するのか困難であることは考えられる。

驚いたことに螢光原物質又はその混液が下記の１５種類のスクリーニング試験用 微生物のおのおのについて有効な発育の指標を示すなら、それは普通の微生物学 的方法で得られた臨床分離菌の圧倒的多数のものに対して、本法の迅速ＭＩＣ法 における使用に適することを木発明者らは見出した。これらの１５種類のヌクリ ーニノグ試験微生物が必ずしも圧倒的多数の場合に現われるわけではないが、本 発明の螢光源物質の有効性をチェックするのに役立つ。これらの菌株は。

バチルス　ズグチリヌ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）プロテウス　 グルがリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）エンエリヒア　コリ　（Ｂ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃ０１ｉ　）エルギノーヂ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　） セラチア　マルヌセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）サルモ ネラ　アナ−タム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｎａｔｕｍ　）誤解を避けるため にこれらの微生物はすべてふつうの微生物で、その野生株は本発明に使用して螢 光原物質の測定を実施するのにきわめて適しているものであり、従って特別の分 離培養菌を選んだり特殊な培養菌株保存施設にあるものを選ぶ必要がないことを 強調しておく。本発明者らはふつうの菌種の６種類のおのおのについて６個の臨 床分離株を使用する実験において本発明の正しいことを証明１−だ。

従ってこの知見に従い、本発明の態様の一つは（ｆ）工程の螢光原物質として前 記した１５種の微生物のおのおのを培養することにより加水分解されて螢光物質 を生成する螢光原物質又はそれらの混合物を用いる。

適当な螢光原物質の具体例としては４−メチル−クーマリンの加水分解可能な誘 導体、たとえば（ａ）　４−’−メチルウンベリフェリル７オヌフエートと４− メチルウンヘリフエリル脂肪酸エヌテル（たとえばヘキサノエート、オクタンエ ート、又はノナノエート）、又は他の脂肪酸エステル（たとえば炭素鎖の長さが ０６−Ｃ工。

９ 以内）との混合物、そして（′ｏ）４−メチルウンベリフェリルエステル（たと えば好ましくはフォスフェート）と７−　（Ｎ）　−（アミノアシル又はペゾチ ジル）−４−メチル−７−アミノ−クマリン（たとえば７−　（Ｎ）−アラニル −４−メチル−７−アミノ−クマリン）又はこのアラ二ノ誘導体のかわりに対応 するロイシン誘導体との混合物がある。上記化合物の他の組み合せよシ成る混合 物でもよい。他のクマリンの対応する螢光原性誘導体も又使用可能である。

これらの螢光原物質は大多数の臨床分離菌のＭ工Ｃ測定に適している。時におき る運が悪い場合でも均一な弱い螢光しか得られていないことが肉眼で判定でき、 したがってＭＩＣ値を間違えることはない。

螢光原物質の具体的な例は培養液中で下記の濃度で用いるのが都合がよい： ４−メチルウンベリフェリルノナネート：１２０マイクロモル； ４−メチルウンベリフェリルフォスフェート：１２０マイクロモル；そして ４−メチル−７−アミツークマリｙ−７−Ｎ−アラニルペプチド：１００マイク ロモル。

ふつう基質濃度はほとんどの場合３０−３００マイクロモルの範囲である。

４−メチルウンベリフェリルノナネートを用いる時はある実施態様では培養時間 の最後又はその少し前１０　慈唱９−５００５４８　（５） （たとえば３百−４時間後）にエマルジョンの形（たとえばこのエステルと９４ ％の水を含有する６　％　ｖ／メチルセロソルグより成るもの）で加え、螢光収 量とＭＩＣをめる前に約３０分培養することが好ましい、。

もし必要な場合は培養時間中このフォスフェートとペプチドを加えておいてもよ い。

本発明は又ここに示した螢光原物質と共に微生物の発育を促進及び／又は阻害す る活性物質を含有するいくつかのマイクロタイターウェルを含有するあらかじメ 調製したマイクロタイタープレートを与える。

このあらかじめ調製したマイクロタイタープレートでは螢光原物質や他の成分の 量や種類は、通常の栄養成分や抗生物質の場合は通常の条件に従って選定でれ、 螢光原物質の場合は本明細書に示した方法に従って選定される。

たとえば約５０−１００マイクロリツトル添加することを前提とした（たとえば 通常使用する場合は培養液を０．０５ｍ１加える）約ＣＪ、５ｍｌ容の普通の標 準マイクロタイターウェル（これが本発明の使用に適している）の場合は、各螢 光原物質の量はウェル当たシロナノモルのオーダーが最も適している。

薄膜形成安定化剤（たとえばポリビニルアルコール）を用いて螢光原基質（特に ノナネートのようなエステル）ヲエマルゾヨン（たとえばメトキシエタノール） にしてから乾燥させて、たとえば英国特許第１５７４７ＣＩ７１ 号明細書に記載されているような安定化薄膜を形成させると便利である。

本発明の実施態様のひとつでは、微生物の接種と同時にウェルに螢光原物質を添 加する。多くの通常の抗生物質感受性試験では、安定化し乾燥した抗生物質を含 有スる乾燥したマイクロタイタープレートが使われる（たとえば本発明者らの英 国特許明細書第１５７４７０７号に記載）。この乾燥したウェルのおのおのに微 生物の浮遊液を含有する培地を一定量添加する。接種菌の培地浮遊液はバッチ（ たとえば１０ｍ／）として調製することが可能でメジ、ウェルの中へ手で又は自 動接種器を用いて加えてもよい。本発明の実施態様のひとつでは、抗生物質感受 性試験用の１セツトのマイクロタイターウェルに添加するだめの接種液は、本明 細書に記載した種類の螢光原物質の少なくとも１つ又は２つ以上を、本明細書に 記載した濃度で含有するように調製する。たとえば抗生物質感受性試験をするた めの大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｉ　）の臨床分離株の一種を接種した１０ｍ１の培地 に、約１マイクロモルのＡＡＭＯ（４−メチル−７−アミノクマリン７　（Ｎ） −Ｌ−アラニルペプチド〕を加え、培地中のＡＡＭＣ濃度を約１［］０マイクロ モルとしている。未同定の臨床分離株については、接種培地１０ｍ１１′当たり 各基質を約１マイクロモル含有する２−成分又は６−成分螢光原基質グループを 用いると特に便利である。

もし必要な場合は接種菌を調製用の１０＋＋＋／試験管、又はキャップ又はフタ 又は試験管やその他の容器の上部のネジの部分に、１種類又は２種類以上の螢光 原物質を、たとえば英国特許明細書第１５７４７０７号に記載した水溶性の薄膜 形成安定化剤（たとえば水溶性ポリビニルアルコール）の薄層で安定化し乾燥し たものを調製しておいてもよい。接種菌に基質混合物を添加する別の方法は、接 種液調製用の接種試験管又はその他の容器の中に、あらかじめ決められた適轟な 量の基質の乾燥調製物を結合した固体の担体（たとえばビーズ、又は穴のおいて ないンートや紙片）を挿入することである。

従って本発明の抗生物質感受性試験用キットの好ましい実施態様は、種々のウェ ルに公知の方法であらかじめ抗生物質を加えであるマイクロタイタートレイと、 培地による稀釈後、および試験管中の培養後、および菌の発育がある場合には加 水分解後に螢光が検出され、しかし菌の発育がない場合は明らかに異なるか又は より弱い螢光を発するような量で、ここに記載した１つ又は２つ以上の螢光原物 質を乾燥し安定化させた形で含有する、トレイのウェルに接種するために培地で 接種液を調製するための接種液調製容器とから成る。

（螢光原物質とはそれ自身は螢光が無いか又は変螢光、すなわち対応する酵素に よシ修飾された生成物とは明らかに異なる方法（たとえば色又は強度）で現わ１ ろ れる螢光を有するものであり、酵素による修飾により現われる螢光を共存する他 の螢光β・ら分離するために、螢光装置使用者には公知の適当な励起及び検出波 長を用いる。） 一般的培養条件に適切な注意を払えば、この方法は培養４時間後に大多数の臨床 分離菌株が感度よく検出でき、又電気光学的螢光検出器（たとえばパルス−キセ ノンＵＶ源のようなキセノンランプ源と光増幅螢光検出器の組み合せ）を用いた 場合は特にすぐれている。

５０−１０ロマイクロリツトルで０−１４マイクロモルの範囲の螢光物質が検出 できるような検出範囲が適当に選ばれるが、この範囲で１．６マイクロモルか又 はそれ以下の濃度変化を検出することが好ましい。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１と２ 本例においては４−メチル−ウンベリフェロン−７オスフエート（ＭＵＰ）（実 施例１）と４−メチル−ウンベリフェロン　ノナ４−）（ＭＵＮ）（実施例２） を培養した菌と接触させ、螢光測定による４−メチル−ウンベリフェロン（４Ｍ Ｕ　）への変換の程度により菌の発育量の度合を示す。

マイクロタニターウエルに（実施例１）カゼイン加水分解物（１，７５％”／ｗ ）　：　Ｄｉｆｃｏ　（商標）グレインハートインフユージョ７　（０，４５％ ）、ＣａＣｆ２（０，０１７％）、Ｍｇｃｆ２（０，０２５チ）、及び（ＭＵＰ の場合は）１２０マイクロモルのＭＵＰを含有する培地０．０５ｍ１を添加した 。実施例２ではあとの工程までＭＵＮをとっておいた。

接種菌を加えた場合と加えない場合、及び通常使用されるいくつかの治療用抗生 物質のおのおのを種々のａ度で加えた場合と加えない場合につき、いろいろな組 み合せを試験した。

試験接種液を作るために、螢光原基質を加えないことを除いては前記１−だもの と同じ培地で、前記した１５種の試験菌を一晩培養した。これらの培養液を、１ ０５細胞／　ｍｌ　（接種したウェル中の最終の細胞数〕の濃度で各５０マイク ロリツトル含有するマイクロターターウェル用の試験接種菌源として使用した。

プレートはろ７°Ｃで４時間以上培養した。ＭＵＮプレートの場合は４時間後メ トキンエタノール中のＭＵＮト水のエマルジョン（１，５ｍ７のメトキシエタノ ールに１５．８２ｍ９のＭＵＮを溶解し純粋で乳化させて２５ｍ１とし、エマル ジョン中の基質濃度が２１１１Ｍとなるように作った〕を１８マイクロリツトル それぞれ関係するウェルに加えた。添加したウェルを３７°Ｃで６０分間培養し た。

使用した螢光検出装置はパルス光キセノン電源と螢光光度計（この場合はキセノ ンランプシステミ３０２１−とパルス光光度計装置６０１０．　Ｃｈｅｌｓｅａ ■ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ロンドン）に、光ガイド長５００　ｉｍ５ と分枝光繊維束径４朋の５ｃｈｏ’ｔｔ　２−分枝光繊維ＵＶ光ｉｆ　イト（５ ｃｈｏｔｔ　Ｇｌａｓｓ社）の付いたものである。

励起波長は３６３　ｎｍ、螢光（検出）波長は４５０ｎｍを使用した。この波長 の組み合せがこれらの基質に対し４−ＭＵ生成物の吸収と競合するＭＵＰとＭＵ Ｎの吸収の相方を満足させる最適の波長であった。

モラ一つの光学装置はパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｆ、１ｍｅｒ　）　１ ０ＯＯ螢光装置で、励起波長３６３ｎｍ。

螢光波長４５０ｎｍ、狭いスリット幅、エネルギーレベル４００、スケール１、 光長０．５　Ｃ１ｎそして温度は６７℃である。

パルス光キセノン装置は培養液をウェルに入れたまま測定ができるという利点が あった。

培養後の螢光濃度がパックグランド濃度の２倍より小さくなったところの抗生物 質の最小濃度を、抗生物質試験のＭ工Ｃとした。

前記の試験では指示した量のＭＵＰを用いると培養４時間後に黄色ブドウ球菌（ Ｅ３．　ａｕｒｅｕｓ　）　、　５ｔｒｅｐ・大腸菌（Ｋ、　ｃｏｌｉ　）　、 　Ｃ１ｔｒ、フロインディー（ＣＬｔ、ｒ。

抗生物質の阻害が入られた。

ＭＵＮのみを使用した場合は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）。

黄色ブドウ球菌（５ｔａｐｈ、　ａｕｒｅｕｓ　）　、表皮ブドウ球菌（５ｔｒ ｅｐ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　）　、肺炎桿菌（Ｋ１．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。

緑膿醒（Ｐｓ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　＋レイ菌（Ｓ＋ｅｒｒ。

追加例（１＋２）として実施例１０ＭＵＰ含有培地を基礎とした培養ウェルを実 施例２のようにＭ　Ｕ　Ｎで処理することにより、ＭＵＮとＭＵＰを一緒に用い た試験を行なった。この組み合せを用いると前記の１５種のすべての試験菌で発 育と抗生物質の阻害がみられた。

実施例１の方法と同家にしてペプチドＬ−アウニル〜７−アミド−４−メチルク マリン（ＡＡＭ　Ｃ）を螢光原基質として用いると、４時間の培養後前記１５種 のすべての微生物について発育と抗生物質阻害がみられた。たとえばある場合に は枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔ４１１ｓ　）と黄色ブドウ球菌（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ 　）についてもう少し７強い結果を得るのにＡ　Ａ　−Ｍ　Ｏが有効であり、ま たある場合はＡＡＭＣｆＭＵＭと組み合せて使用することが有効であった。

ム！ｔＡ １７ 本例では接種菌の培地の浮遊液に螢光原性酵素基質を適用することより成る菌の Ｍ　Ｉ　Ｃ測定を改良するのに螢光原性物質を用いる好ましい方法を示す。本例 に使用した器具はＭＩＣ測定用の標準調製プレート（英国のＳｅｗａｒｄ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、米国のＧｉｂｃｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの’　５ｅｎｓ ｉｔｉｔｒｅ　”　（商標〕）であり、０．０５＋＋＋ｌの培地浮遊液を加える ためのウェルが１２×８個ある。

プラスチック裂ネジロのつし）だ、実施例１に記載の培地を滅菌したものを１０ ｉ／含有する、標準形の１０は容の滅菌済接種試験管を用いて菌の培地浮遊液を 調製した。ＢａＳＯ４のＭａＣＦ′ａｒｌａｎ標準浮遊液及び／又は微生物学技 師の熟練した肉眼の判断を用いて１（，１−４０倍１＃縮液（たとえばＩ　Ｑ７ ／ｍｌ　）の濁度の光学的比較により、菌浮遊液の最終濃度を２．５　Ｘ　Ｉ　 Ｄ５個／　ｍｌにした。接種菌を分散させる前に培地を接種試験管中で３７℃に あらかじめ加熱し、できるだけ熱によるショックを避けるようにした。

螢光原基質４−メチルーウンベリフエリルフオヌフ工−ト（ＭＵＰ）、４−メチ ル−ウンベリフェリルノナネート（ＭＵＮ）、そしてＬ−アラニル−７−アミド −４−メチルクマリン（ＡＡＭＣ）は以下のようにして微生物の培地浮遊液に導 入した。

添付の図面の図１と図２に示したような滅菌培地用試験管用の２つ目のスクリュ ーキャップに、調製した基質をあらかじめ加えておき使用するまで乾燥して水衿 表昭５９−５００５４８（７） 分を透過させないように包装して保存した。

下記の組成の基質調製物は以下に述べる順序で調型した。

（ａ）　３０７．３．ｑのＭＵＰを５　ｍｌの０．５％ポリビニルアルコール水 溶液（水溶性、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社のＳｉｇｍａタイプｐ−８１３ ６）に溶解し、次にここに（ｂ）１０ｍｌの２−メトキンエタノールに溶解した ２　４６．２１ｎ９のｈｈＭｃｋ’ｊＪｏｔ、最後ニココｖｃ（ｃ）１０ｉｒの ２−メトキンエタノールに溶解した３８０．０ｍ９のＭＵＮを加えた。

混合液は螢光原性基質をあらかじめ添加したスクリューキャップを１０００個作 るのに充分な量であっ九図１と図２に模式的に示すように接種用標準試験管キャ ップ１を使用し、これを非透過性の包装剤２で密封した。これを使用する時に包 装剤２よりはずし、菌の培地浮遊液４を含む接種用標準（１０ｍ／）試験管３に キャップをした。このキャップ１は水及び溶媒非透過性の密封バッキング５を含 むプラヌテノクキャップ本体より成る。（必要な場合は）各バンキングの中央に 小さなくぼみを作り、ここに調製した基質を一滴Ｃ０，０２５ｍ１）添加した。

添加及び乾燥の方法と条件は「５ｅｎｓｉｔｉｔｒｅ　Ｊ製品の調衾法で常識に なっているものであり、詳細は英国特許明細書第１５７４７０７号、第１５２０ ７４５号及び第１５　［１’　８７４７号に記載されている。こうして各キャッ プの中に基質混合物９ を含有する乾燥部分６（図１と図２）が得られる。次に各キャップに１．２マイ クロモルのＭＵＰ、１マイクロモルのＭＵＮそして１．２マイクロモルのＡＡＭ Ｃを加える。標準接種用試験管中で暖かい（３７℃）菌浮遊培養液を調製した場 合は、そのあとでその試験管のふつうのスクリューキャップ（図面には記してな い）を図２に示したように前記の調製済ヌクリューキャップ１のひとつと交換し 、約３０分攪拌しキャップバッキング上の螢光原性基質を溶解及び／又は分散さ せた。

こうして螢光原性基質を満たした調製済培地浮遊液を通常の方法で「５ｅｎｓｉ ｔｉｔｒｅ　Ｊ　７°レートに添加し、培養時間が通常の１８−２０時間のかわ シに４時間でらる以外は通常の方法で培養した。

０−６マイクロモルと１４マイクロモル濃度までの範囲で遊離の螢光物質（７− アミノ−４−メチルクマリンに換算）より使用可能な読み出し値を得るために、 充分な感度が得られるよう過少及び過負過の運転について調整した螢光検出器を 用いて、培養４時間後の最後に各ウェルの螢光を読んだ−６マイクロモルの７− ＡＭＣの濃度は、本発明に従って調製した接種菌液を４時間培養後にふつうに見 られる螢光の大きさに対応する。

水沫の重要な利点は必要があればいつでも）螢光プレートを通常の方法で一晩培 養し従来の培養結果を得ることができることである。このために臨床関係の使用 者は４時間培養後に得られる結果の正しさに関し安已・できる。

この系を利用したり応用したりする場合の方法上の重要なポイントは、微生物の 発育の有無を判定したり、得られた結果と標準ｒ　５ｅｎｓｉｔｉｔｒｅ　Ｊ法 や互いに相関がよいことが証明されている他の（手を用いる）　ＭＩＣ試験との 相関を判定するときの基準である。（Ｄ、　Ｓ’。

Ｒｅｅｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　 ａｎｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、　１９８０．１８　（ ６月ｐｐ　８４４−８５２を参照） 本例では陰性コントロールは、微生物を加えない以外は全操作を行なったコント ロールウェルの螢光収量をとった。（かわりの方法又は追加の方法としてウェル に加えた微生物が発育しない８ような高濃度の抗生物質を含むウェルの螢光収量 をと一つでもよい。）発育が明らかに認められるンリーズの最初のウェルの前の （単一の抗生物質濃度が顆に減少していくンリーズの）最後のウェルの抗生物質 濃度に基いてＭＩＣを決める。

本例において「明らかな発育」とは４時間の培養後に陰性コントロールに比較し て螢光収量が増加している場合を示す。ただし く１）　ウェルの螢光収量が陰性コントロールと陰性コントロールウェルと問題 の菌の最高収量（抗生物質ゼロ）２１ （１１）そのウェルの螢光収量がそのウェルとその列又はセット、すなわち単一 の抗生物質稀釈ンリーズで試験したウェルの平均との差の１．６マイクロモル（ ４−メチルウンベリフェロンの濃度として）の螢光の差以上でないとき：そして （ｉｉｌ）　ソ（７）ウェルの螢光収量が陰性コントロールよシ、試験したウェ ルの平均の標準偏差の１．９６倍以上大きくないとき は「明らかな発育」とみなさない。

ある−列のウェルを計算するに際しては、ある抗生物質の稀釈系列について最初 のウェルの螢光収量をまずバンクグランド強度と考え、それ以後は調べたウェル で明らかな発育を示さないものの強度の平均をバックグランドの螢光強度とする 。２番目のウェルを計算するときは標準偏差を２．５俤と考え、その次からは列 の中で調べたウェルのうち発育りみられないものの強度から計算する。

この計算方法は本発明者らが考えたものであり現存のＭＩＣ法とは最もよい相関 を示すデータを与えるものと考えている。また誘導耐性現象（下記）があると考 えると本発明の方法は現在のＭＩＣ法と非常によく一致する。

しかしこの計算方法は、現在Ｍ工Ｃであると弊められている濃度の抗生物質が存 在するウェルにときどきみられる低レベルの発育を故意に無視している。実際２ ２１情咽５９−５０［１５４８（８）現存の標準法では１８−２０時間培養の後 でさえこのような低レベルの発育を検出するのは不可能である。

このような場合従来のＭＩＣ値は低くとりすぎており、治療方針決定のだめの適 切なＭＩＣ濃度は、本発明の方法を使用し、現在一般に認められているＭＩＣ値 の近辺でときどきみられる低レベルの菌の発育を無視しない変更した計算方法を 用いることによって得られるこの結果の解釈の基準が選ばれたところでは、「明 らかな発育」のだめの条件（１）は無視されるが又は閾値が陰性コントロールと 最大発育螢光収量の幅の６分の１又は１０分の１まで落としてもよい。

こうして使用すると本発明の方法は迅速で好適な結果を与えるだけでなく、現存 の方法と比較すると感度と判定においても利点があると考えられる。

本発明の方法を使用しそれを解釈するもうひとつの理由を記載する。それは試験 中の抗生物質に対する耐性誘導の現象である。

ある微生物、特に黄色ブドウ球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ 　）では抗生物質、特にペニシリンやセファロスポリン系のベータラクタム系抗 生物質に対する耐性が、その抗生物質の存在下でわずか一晩の培養で現れること がしばしばある。従ってどのような方法を使用す−るにせよ４時間の培養結果は 抗生物質による阻害を示すが、１８時間培養の結果は耐性誘導の後の回復と３ 発育を示す。

この種の影響があると疑われるときは４時間培養の結果は注意深く扱い確認をす るか、又は長期的に耐性が現れると考えられる場合は抗生物質が影響を受けるの を避けるような方法をとることもできる。

たとえばＭＩＣ試験用のベータラクタム系抗生物質耐性株の接種浮遊液を得るた めに前培養をする場合は、それ自体公知の方法で耐性に関与するベータラクタマ ーゼ形成を誘導するのに用いるような濃度で、ベニシリアＧやメチンリンのよう なベータラクタム系抗生物質の非致死量の存在下で前培養をすることができる。

この条件のための濃度としてはたとえばメチシリン誘導体１　ｍｌにつき０．２ ５マイクログラムのオーダーである。

前記した系の変法としてその他の多くの化合物を螢光原性物質として使用可能で ある。たとえばペプチド、ランベリフェロ／、４−メチルウンベリフェロン、６ −カルボキシーツ−ヒドロキシクマリン、３−カルボキザミドー７−ヒドロキシ クマリン、ろ−フェニル−７−ヒドロキシクマリン、６−アセチル−７−ヒトロ キンクマリ／、３−カルボキシエチル−７−ヒｒロキシクマリン、５−ンアノ− ７−ヒドロキシクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４− トリフルオロメチルクマリン、２−ナフチルアミン、４−メトキノ−Ｂ−ナフチ ルアミン、ナフトール−Ａｓ（３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸アニリド）、イ ンドキ／ルおよび酢酸Ｎ−メチルインド千ンルと酢酸イントキシルヲ含む１−（ アルファ）−及び２−（ベータ）−ナフトール誘導体、レソルフイン、ヨウ化１ −メチル−７−ヒドロキシキノリウム、及び６−アミノ−キノリ／のエステル（ それ自身公知の物質である）不例は本発明の態様のいくつかの実施に適した安定 化した螢光原性物質を含むマイクロタイターウェルの調製法を示す。

７０°Ｃの湯浴中で攪拌しながら３０７　ｍｇのリン酸４−メチルウンベリフェ リル（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ　）を５　ｍｌの蒸留水に溶かし、つぎに濾過滅菌 する。１２１℃で１５５分オートクレーブかけてから冷却した５％ｗ／ｖのポリ ビニルアルコール（タグマタイプｎ　、１６゜ｐ８１３６）を混合する。トリフ ルオロ酢酸塩の形で市販されている（　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）７−Ｌ−アラニル−ツーアミド−４−メチル−ク マリン６６０〜を２０ｍ／の２−メトキンエタノールに溶かす。３０４　Ｔｎ９ のノナン酸４−メチルウンベリフェリル（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ　）　ｆ　２０ 　ｍｌの２−メトキシエタノールに溶かす。

−この２棟類の２−メトキンエタノール溶液を合わせてから上記のｐｖＡＢ液を 加える。各マイクロタイタ２５ 一ウェルに１００マイクロリツトルずつ分注し５５°Ｃ１２０Ｔｃｒｒで１時間 乾燥させる。使用するときまで乾燥剤を入れて遮光密封した容器に保持する。こ うして標準量の栄養培地中の微生物を接種すべき各マイクロタイターウェルがで きあがる。

マイクロタイターウェル中で培養するのに必要な標準発育阻害物質又は発育促進 物質の適当量をメトキノエタノール／ポリビニルアルコール混合液中に加えてお くと便利である。あるいはこれらの物質を別に分注乾燥して加えておくか、又は 菌の接種前に液体添加物として加えてもよい。

培養のその他の詳細は標準的な方法であり、螢光の結果の読み万は本明細書にお いて前記したとおシである。

実施例６ 本例は培養試験プレートへの接種用の菌の培地中の浮遊液に加えるための添加済 紙片の調製方法を示す。

この方法は実施例６に記載した乾燥キャップ調製法とは又別の方法である。方法 は下記の通シである。

１５３．５ｍ９のり／酸４−メチルウ／ベリ７エリル（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ　 ）を７５℃の湯浴中で攪拌しながら２．５ｍｌの蒸留水に溶かし、次に濾過滅菌 する。１２１℃で１５５分オートクレーブ冷却し、３０％ｗ／／ｖポリビニルア ルコール（ンク゛マクイｆ　ＩＩ　Ａ　Ｐ８１３６　）２．５ｍｊ！に混合させ る。トリフルオロ酢酸塩の形で市販２６　持υＨ５９−５００５４８（９）され ている７−Ｌ−アラニル−７−アミド−４−メチルーフマリｙ　（Ｃａｍｂｒｉ ｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）３６０　ｍ９　ヲ１ 　［１ｍｌの２−メトキンエタノールに溶かす。

この２種類の２−メトキンエタノール溶液を合わせ次に前記のＰＶＡ溶液を加え る。抗生物質の乾燥に用いられる非多孔性の９　ｍｍＸ　１４．７　ｍｍの紙片 に１００マイクロリツトル添加し、５５°Ｃ，２０Ｔｏｒｒで１時間乾燥させる 。使用するときまで乾燥剤を入れて遮光密封した容器（で保存する。

結論として本発明は広範囲の抗生物質感受性試験改良法、それらに対応する培養 法、添加済試験プレーｈ及びそれら（Ｃ適合するマイクロタイタープレート、培 地容器、栓および挿入物を与える。これらの方法より轟業者はおのおのの目的に 適した方法を選択することができる。たとえば大腸菌（Ｅ、　ｃ○１１）やその 他のほとんど全てのグラム陰性腸内細菌にっ論て試験をしたいときはＡＡＭＯを 用いる方法が好適であり、大量の未同定の母集団からの分離株の感受性のスクリ ーニングには螢光原性基質を種々組み合わせた方法か有用である。ある場合には 未同定の微生物を螢光原性基質又タグを実施し、充分な量の螢光を発することを 確認することが好適である。

本明細書及び請求の範囲に示した特徴は、いかなる組み合わせでも実施、利用可 能であり、ここに示した国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験微生物の培地が酵素的に加水分解されて螢光性物質を生成する加水分 解可能な螢光原基質を含み、螢光によって発育を測定する微生物培養試験法にお いて、５　Ｘ　１０４細胞／ｍｌ〜１０６細胞／　ｍｌの濃度範囲の接種菌を培 地（で接種し；培地中の各螢光原性基質の濃度が３０マイクロモル〜３００マイ クロモルの範囲であるひとつ又は２つ以上の加水分解可能な螢光原性基質を培地 中に含み：接種培地を培養増殖させた後、培養液の螢光収量を測定し、別の測定 方法によって培養結果を確認できるようにさらに培養するのに適した形で培養液 を保持することを特徴とする、上記改良法。
2. （２）　約４−７時間より短い時間培養する、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）約６．５〜５時間培養する、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）４−メチル−クマリンの加水分解可能な誘導体である螢光原性基質を培地 中に含有させる、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）　リン酸４−メチル−ウンベリフェリル、４−メチル−ウンベリフェリル 脂肪酸エステル、たとえばｃ６−１６脂肪酸エステル、たとえばヘキサノエート 、オクタノエート又はノナノエート及び７−　（Ｎ）−Ｌ−（アミノア７ル又は ペプチジル）−７−アミド−４−メチル−クマリン、たとえば７−　（Ｎ）−Ｌ −アシエル−７−アミド−４−メチル−クマリンより選んだ螢光原性基質のひと つ又は混合物を培地に含ませる、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. （６）　螢光原性基質の濃度が６０〜６００マイクロモルの範囲、たとえば約１ ０ｏマイクロモルである、請求の範囲第４項に記載の方法。
7. （７）　キセノ／ランプ光源及び光増幅検出器を有する螢光光度計で培養液の螢 光収量を特徴する請求の範囲第１項に記載の方法。
8. （８）　培養体積が５０〜１ｏｏマ、イクロリッｉルの範囲の培養液の螢光収量 を、この培養体積中のＯ〜１４マイクロモルの螢光物質の螢光を検出可能な感度 を有する螢光光度計で測定する、請求の範囲第１項に記載の方法。
9. （９）　試験抗生物質の稀釈系列を含有する一連の培養液を形成する一連の培養 容器に、試験微生物の接種浮遊液を接種し、培養液中に少なくとも１つ又は２つ 以上の螢光原性基質を加え、４−７時間培養後に螢光物質の収量を用いて培養液 中の微生物の発育の有無を側車することによりＭ工Ｃ（最小発育阻止濃度）を測 定する、細菌のＭＩＯ測定をするために組み合わせた、請求の範囲第１項に記載 の方法。 αＱ　一連の培養容器に接種する前に、接種浮遊液に１つ又は２つ以上の螢光原 物質を加えることよシ成る、請求の範囲第９項に記載の方法。 ０υ　螢光原性基質の乾燥安定化調製物を容器の艮ト多孔性表面、又はその７タ 又は栓、又はそれらの夛ト多子り性挿入物に付着させ、容器の中で接種浮遊液を 特徴する請求の範囲第１０項に記載の方法。 ａ４　螢光原性基質の乾燥安定化調製物の基質カニ水溶性薄膜形成安定化剤、た とえば水溶性ボ１ノビニルアルコール に記載の方法。 Ｑ３　螢光原性基質全体としては下記の各微生物７５；発育すると加水分解を受 けて螢光物質を産生ずるような少なくとも１つ又は２つ以上の螢光原性基質カー 培養液に含まれている、請求の範囲第１項に記載の方法：バチルス　ズブチリス （　ＢａｃｉｌｌｕＳｓｕｂｔｉｌｉｓ　）ヌタフイｏ　＝ｔ　ツカ：１　（　 ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓオーレウヌａｕｒｅｕＳ） スタフイロコツカス（−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓサフロフイテイカヌｓａ ｐｈｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ　）ヌトレプトコノカス（　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓピオデネヌ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　’　）ヌトレプトコノカヌ　（　ｓｔｒｅ ｐｔＯｃＯｃ．ｃｕｅエトワルド，７　−　ｅｄ’ｗａｒｄｓｉｉ　）クレグノ エラ　（　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａプロテウヌ　グルがリス（　Ｐｒｏｔｅｕｓ　 ＶｕｌｇａｒｉＳ　）プＣ’７ウス　ミラビリヌ（　Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａ ｂｉｌｌｉｓ　）エシェリヒア　コリ　（　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ 　）サルモネラ　アナ−タム（　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｎａｔｕｍ　’）（ 口）（ａ）　細菌の培地浮遊液を接種用試験管中で調製し、の接種浮遊液のいく つかを別々に培養し、螢光測定により発育の程度を測定する微生物培養試験法に おいて、工程（ｂ）の前に、接触すると細菌の培養により加水分解されて螢光物 質を発生させる少なくとも１つの螢光原性基質の水溶性又は分散可能な調製物を 表面に保持している固体の担体に接種菌浮遊液を接触させることにより、螢光原 性基質を培地中に浴解又は分散させ、螢光原性基質に帰因する螢光収量により培 養試験の発育の有無を測定することを特徴とする、 上記改良法。 ２ αＳ　接種用試験管には取りはずし可能なキャップ又はフタが取りつけてあり、 培地中で接種浮遊液を調製した後そのキャソゾ又：はフタを取りはずして、接触 している微生物の培養により加水分解されて螢光物質を発生させ得る少なくとも １つの螢光原性基質をあらかじめ添加し乾燥安定化した調製物をその表面に保持 しているキャップ又はフタと交換して、少なくとも１つの螢光原性基質を接種浮 遊液中に導入する、請求の範囲第１６項に記載の方法。 ＯＱ　接種浮遊液の調製後、水溶性又は分散可能な形で少なくとも１つの螢光原 性基質をその非多孔性表面に保持している小球、ひも、ビーズ又は薄板の形の担 体全接種用試験管に導入する、請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１η　培養液中の螢光原性基質（２つ以上の螢光原性基質を含有する場合はそ のおのおの〕の濃度が３０〜６００マイクロモルの範囲にあシ、その螢光原性基 質が加水分解により螢光性クマリンを生成し、約７時間以下、たとえば５．５〜 ５時間の培養後各培養液の微生物の発育の有無を、少なくとも３マイクロモルま でのクマリン濃度に等しいバンクグランドの螢光の存在下で、螢光のフルスケー ルの読み値が［１．［］５５ｍｌ中なくトモ約１４マイクロモルのクマリン濃度 に等し諭とき、［１，３５ｍ／又はそれ以下の量の中の１．６マイクロモル又は それ以下の螢光（クマリン）濃度の変化に感応する螢光光度計を用いて、各培養 液中の微生物の発育の有無を特徴する請求の範囲第１３項に記載の方法。 ６ｇ　螢光光度計の励起波長が約６６３ｎｍで螢光（検出器）波長が約４　５　 ０　ｎｍである、請求の範囲第１６項に記載の方法。 ０俤　螢光の励起を与えるためにキセノン電源を使用し、螢光の検出のために光 増幅器を男いる、請求の範囲第１６項に記載の方法。 （イ）培地のはいった接種用試験管に合うようにキャップ又はふた（又は挿入物 ）を取りつけ攪拌したとぎ、その非多孔性表面上の螢光原性基質が培地中に適当 に接触し分散するように付着している、キャップ、ふた又は挿入物のついた培地 接種用試験管中又はその上に適合するようなキャップ、７タ又は挿入物の形の、 微生物培養浮遊液の成分用の無菌担体。 Ｑル　無菌の水分非透過性の包装物中の、請求の範囲第１９項に記載の無菌容器 、。 （イ）約１’　［３　ｍｌの有効容積の培地接種管に適合し、約１マイクロモル の少なくとも１つ又は２つ以上の螢光原性基質を乾燥安定化した形で有する、請 求の範囲第１９項に記載の無菌担体。 １