FR2504679A1

FR2504679A1 - Procede rapide de detection de micro-organismes

Info

Publication number: FR2504679A1
Application number: FR8108111A
Authority: FR
Inventors: Ichiro Koumura; Hideo Kanou; Masahiko Okunishi; Kazuhiko Yamada
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1981-04-23
Filing date: 1981-04-23
Publication date: 1982-10-29
Also published as: FR2504679B1

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR LA DETECTION OU LA DETERMINATION RAPIDES D'UN PETIT NOMBRE DE MICRO-ORGANISMES SELON UNE METHODE D'ANALYSE PAR FLUORESCENCE UTILISANT DES DERIVES PARTICULIERS D'OMBELLIFERONE TELS QUE LE PHOSPHATE DE METHYL-4 OMBELLIFERYLE ET LE GALACTOSIDE DE METHYL-4 OMBELLIFERYLE, LA QUANTITE DE DERIVE FLUORESCENT D'OMBELLIFERONE PERMETTANT DE DETERMINER LE NOMBRE DES MICRO-ORGANISMES PRESENTS DANS L'ECHANTILLON; LE PROCEDE DE L'INVENTION S'APPLIQUE EN PARTICULIER A L'INSPECTION SANITAIRE D'ALIMENTS, DE BOISSONS, D'EAUX ET D'ARTICLES DE TOILETTE ET A L'EXAMEN DIAGNOSTIQUE DES INFECTIONS MICROBIENNES.

Description

Lq présente invention concerne un procédé rapide de détection de micro-organismes.

Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé rapide de détection de micro-organismes par analyse par fluorescence avec un dérivé d'ombelliférone.

La Société actuelle exige que les aliments et les boissons soient exempts de contamination microbienne et, en particulier, la loi japonaise exige que des aliments tels que la viande, les boissons non alcooliques et la pate de poisson ne contiennent aucun coliforme.

La qualité sanitaire de ces produits doit donc être rigoureusement contrée lors de la fabrication et dans les circuits de vente.

Il est très important 9 cet égard que l'inspection microbienne soit effectuée rapidement et qu'on obtienne dès que possible le résultat concernant la contamination microbienne.

Cependant, les procédés connus de détection des micro-organismes nécessitent une période d'incubation d'au moins 24 h. Comme méthodes classiques de détection des micro-organismes, on connaît la méthode de numération sur boîte et la méthode du nombre le plus probable (Official Methods of Analysis of the
Association of Official Analytical Chemists, Official First Action,
Eleventh Edition, page 843, 1970, Etats-Unis d'Amérique) que l'on réalise de la façon suivante - Méthode de numération sur boîte (convenant pour l'analyse d'ali
ments dans lesquels on prévoit la présence d'un grand nombre de
microbes).

On homogénéise l'échantillon (aliment) et on le dilue avec de l'eau stérile. On coule des dilutions décimales de 10 à à 10 4 de l'homogénat dans des boites de Petri avec un milieu nutritif gélosé. On incube les boîtes pendant 24 A 48 h et on compte toutes les colonies présentes sur une boite et on rapporte ce nombre à 1 g d'échantillon.

- Méthode du nombre le plus probable (recommandée pour une surveil
lance de routine des aliments lorsqu'on peut prévoir un petit
nombre de microbes, en particulier de coliformes).

Ou transfère la dilution de l'honogénat dans 3 à 5 tubes de fermentation contenant du milieu nutritif tel que du bouillon lactosé et du brillant Green Lactose Bile (BGL B) et on incube les tubes pendant 24 à 48 h. On compte ensuite le nombre de tubes présentant une production de gaz (test présomptif positif).

On effectue ensuite le test de confirmation des coliformes pour tout test présomptif positif.

.On calcule le nombre le plus probable au moyen d'un tableau à partir du nombre de tubes présentant une production de gaz.

Dans les deux cas, on doit cultiver les microorganismes dans un milieu nutritif jusqu'à ce qu'on puisse observer à l'oeil nU le déeloppement des micro-organismes.

Par conséquent, la détection selon ces méthodes courantes nécessite une période d'incubation d'au moins 24 h et le produit manufacturé doit être stocké jusqu'à l'obtention du résultat. Récemment, de nombreux articles concernant une méthode rapide de détection des micro-Qrganismes ont été publiés.

Dans ces méthodes, on mesure des variations de l'impédance ou du pH du milieu de culture, ou la quantité d'oxygène consommée ou la quantité de dioxyde de carbone gazeux produite lors de la croissance des micro-organismes et on détermine le nombre des micro-organismes à partir de la relation entre les résultats et le nombre des micro-organismes. Cependant, ces méthodes ne permettent d'examiner qu'une solution échantillon contenant plus de 10 microorganismes/ml.

De plus, les valeurs peuvent être modifiées par des matières coexistantes et ces méthodes rapides ne sont pas satisfaisantes en pratique en raison de leur faible précision et de la gamme limitée de détection.

L'invention concerne un procédé rapide pour détecter des micro-organismes dans une solution échantillon au moyen d'une méthode d'analyse par fluorescence utilisant un dérivé d'ambelliférone.

Le nouveau procédé de l'invention consiste à (a) incuber une solution aqueuse contenant la solution échantillon
et un dérivé non fluorescent d'ombelliférone à une température
comprise entre 20 et 500C jusqu'à ce qu'un dérivé fluorescent
d'ombelliférone soit libéré dans la solution par les micro
organismes contenus dans la solution échantillon, (b) mesurer la quantité de dérivé d'ombelliférone libérée, et (c) déterminer le nombre des micro-organismes dans la solution
échantillon partir de la quantité de dérivé d'ombelliférone
libérée.

Dans ce procédé, le dérivé non fluorescent d'ombelliférone est hydrolysé et un dérivé fluorescent d'ombelliférone, tel que l'ombelliférone ou la méthyl-4 ombelliférone, est libéré par les micro-organismes contenus dans la solution échantillon et la quantité de dérivé d'ombelliférone libérée est approximativement proportionnelle au nombre des micro-organismes. On peut donc déterminer le nombre des micro-organismes à partir de cette relation de proportionnalité.

Selon le procédé de l'invention, on peut effectuer en I à 12 h l'inspection microbienne de divers types de matières, tels que des aliments, des boissons, de lteau ou des articles de toilette ou l'examen diagnostique d'une infection microbienne.

L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée.

Les dérivés non fluorescents d'ombelliférone que l'on utilise dans l'invention sont des composés répondant à la formule générale suivante

où R1 représente un reste d'hexose ou un radical phosphate, pyrophosphate ou acyle, et R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur.

On peut citer comme exemples de dérivés d'ombelliférone le phosphate de méthyl-4 ombelliféryle (EXP), le pyro phosphate de méthyle-4 ombelliféryle (!UPP), l'o-D-galactoside de méthyl-4 ombelliféryle (UaCal), le g-D-galactoside de méthyl-4 ombelliféryle (MUssGal), le ss-D-galactoside d'ombelliféryle (UssGal), l'arabinoside de méthyl-4 ombelliféryle (MUAra), l'acétate de méthyl-4 ombelliféryle (MUAce), l'acétoamido p-D-glucoside de méthyl-4 ombelliféryle (MUAG) et le glucoside d'ombelliféryle.

Parmi ces dérivés d'ombelliférone, on préfère partir culièrement utiliser le tUP car il est hydrolysé par divers types de micro-organismes comme indiqué dans le tableau I de l'exemple 1, et il est particulièrement préférable d'utiliser le MUP avec le bSPP, le MUAG, le MUGal, le MUAce et/ou le MUAra, pour accrottre la sensibilité de la détection et réduire sa durée.

D'autre part, le MUCal et le MUAra conviennent à la détection sélective des coliformes, car ils ne sont hydrolysés que par les coliformes.

Lorsqu'on incube le dérivé d'ombelliférone avec des micro-organismes, il est hydrolysé et une ombelliférone ou une méthyl-4 ombelliférone fluorescentes sont libérées. La solution incubée contenant un dérivé fluorescent d'ombelliférone emet une fluorescence bleu clair à la longueur d'onde de 450 nm lorsqu'on l'expose à une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde de 360 nm et on peut détecter la fluorescence avec un détecteur classique de fluorescence si la concentration du dérivé d'ombelliférone libéré dans la solution est supérieure à 10 ss M.

Pour détecter une fluorescence, on préfère ajuster le pH de la solution a une valeur alcaline supérieure à 10,0 pour accroître la sensibilité.

Les micro-organismes détectés ou déterminés selon l'invention sont des bactéries aérobies et des champignons vrais que l'on observe généralement dans divers types d'aliments et d'eaux et qui peuvent se développer sur un milieu gélosé nutritif standard.

On peut citer comme exemples de bactéries aérobies, des bactéries à gram négatif telles que celles appartenant aux genres Escherichia, Serratia, Pseudomonas, Klebs.iella et
Alcaligenes et des bactéries h gram positif appartenant aux genres
Staphylococcus, Bacillus, Nocardia, Brevibacterium et Streptococcus.

On peut citer comme exemples de champignons vrais ceux appartenant aux genres Saccharomyces, Candida, Aspergillus et
Penicillium.

Les bactéries coliformes sont des batonnets à gram négatif dépourvus de spores, qui peuvent décomposer le lactose et produire ainsi du gaz. Parmi les coliformes figurent les bactéries appartenant aux genres Escherichia, Erwinia, Serratia,
Proteus et Salmonella.

Selon le procédé de l'invention, on peut déterminer directement une concentration en micro-organismes supérieure à 104/ml par contact d'une solution échantillon avec le dérivé d'ombelliférone et mesure de la quantité libérée de dérivé fluorescent d'ombelliférone.

On ajoute donc une concentration en dérivé d'ombelliferone comprise entre 10 et 10 M à une solution échantillon et on incube le mélange pendant 10 min à 6 h à une température comprise entre 10 et 60"C. Après avoir éliminé un résidu insoluble constitué entre autres de cellules microbiennes, on détecte la fluorescence de la solution avec un détecteur classique de fluorescence et on détermine la quantité de dérivé d'ombelliférone libérée.La quantité de dérivé d'ombelliférone libérée est approximativement proportionnelle au nombre des micro-organismes, comme le montre le tableau III de l'exemple 2 et la figure unique annexée qui illustre la relation entre le nombre de micro-organismes par millilitre détermine selon la méthode classique de numération sur boite et la concentration en 4-MU (méthyl-4 ombelliférone; exemple 4). On peut donc déterminer le nombre des micro-organismes lorsqu'on a au préalable établi une telle relation. Le nombre de micro-organismes que l'on peut détecter selon cette méthode est compris entre environ 10 et 107/ml, comme le montre la figure.

Pour accroître la sensibilité, on peut faire éclater les cellules microbiennes dans la solution échantillon par mise en contact avec un solvant organique tel que le toluène, le chloroforme, une enzyme lytique ou selon une technique physique telle qu'une désintégration par les ultrasons avant l'incubation ou pendant l'incubation. t'éclatement des cellules extrait l'enzyme capable de libérer le dérivez fluorescent d'ombelliférone qui est généralement présente dans les cellules microbiennes, ce qui accroit de plusieurs fois la sensibilité de la détection.

On peut également, pour accroître la sensibilité, prolonger la période d'incubation ou concentrer les cellules microbiennes pour qu'une solution d'échantillon contienne plus de 10 cellules microbiennes/ml.

Cependant, ce procédé direct est insuffisant pour détecter un nombre plus faible de micro-organismes,inférieur par exemple à 103/ml.

On peut, pour déterminer un nombre plus faible plus faible de micro-organismes, inférieur à 104/ml, propager les micro-organismes de la solution échantillon, avant la détermination, dans un milieu de culture nutritif pendant 1 12 h, jusqu ce qu'on obtienne une concentration supérieure a 104/ml dans le milieu de culture.

Comme le nombre des micro-organismes dans le bouillon de culture obtenu est proportionnel à la durée de culture, on peut déterminer le nombre des micro-organismes selon la durée de culture et par mesure du nombre de micro-organismes dans le bouillon.

On détermine également le nombre de façon plus précise selon la méthode classique du nombre le plus probable précédemment décrit. Pour cela, on dilue une solution échantillon ou un homogénat d'échantillon avec de l'eau stérile pour préparer des dilutions décimales de 10 a lo de la solution échantillon et on place chacune des dilutions dans 3 ou 5 tubes contenant un milieu de culture nutritif classique. On incube ensuite les tubes pendant 1 à 12 h pour que les micro-organismes se propagent dans les tubes en présence du dérivé d'ombelliférone.

On ajoute le dérivé d'ombelliférone au milieu de culture après l'incubation lorsqu'on effectue l'incubation sans addition de dérivé d'ombelliférone et on effectue une incubation complémentaire de 1 à 2 h.

Ensuite, on compte pour les 3 ou 5 tubes correspondant a chaque dilution le nombre des tubes présentant une fluorescence et on détermine le nombre de cellules microbiennes selon la méthode du nombre le plus probable précédemment indiquée. Les milieux nutritifs utilisés dans ce procédé sont classiques et couramment utilisés pour la détection des microbes. On peut citer coma exemples de tels milieux, le milieu peptoné, le bouillon à l'infusion de coeur et le bouillon nutritif.

Pour la détection des champignons, on préfère le milieu de Czapek Dox, le milieu à l'extrait de malt, le milieu pomme de terre-glucose ou le milieu à l'infusion de nais.

Pour détecter sélectivement les champignons, on ajoute au milieu nutritif des antibiotiques tels que le chloramphénicol ou la pénicilline qui inhibent la croissance des bactéries.

Pour détecter les coliformes, il est préférable d'ajouter au milieu de culture nutritif, un acide biliaire ou de l'acide désoxycholique qui inhibent la croissance des micro-organismes autres que les coliformes. Comme les coliformes possèdent de façon spécifique une galactosidase, il est préférable d'ajouter au milieu nutritif un inducteur de la galactosidase tel que le lactose, l'isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IPTG), le propyl-ss-D-thiolactopyranoside (FiC) et le MJGal lorsqu'on utilise le MUGal comme dérivé d'ombelliférone.

Comme précédemmenr décrit, l'invention permet la détection ou la détermination rapides du nombre de micro-organismes selon un procédé d'analyse par fluorescence que l'on peut utiliser en pratique pour l'inspection microbienne de divers types d'aliments, de boissons et d'eaux et pour l'examen diagnostique dans le cas d'une infe=tion microbienne.

L'invention est illustrée pur les exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLE 1
On prépare un milieu ayant un pH de 7,0 contenant 0,5% de peptone et 10-3 3 M an les dérivés de méthyl-4 ombelliférone indiqués dans le tableau II ci-après. On filtre sur un filtre Elillipore et on répartit de façon aseptique das portions de 3,0 ml de milieu dans des tubes à essai de 20 ml. On ensemence chaque tube de milieu peptoné avec 10 h 100 cellules microbiennes de souches connues indiquées dans le tableau I et on incube en agitant pendant 24 h à 3O > C dans le cas des bactéries ou 25 C dans le cas des champignons et levures. Le nombre des micro-organismes culti
vés dans le milieu de culture varie mais est compris entre 106 et 109/ml.

Après avoir ajusté le pH de chaque bouillon de culture à 11,0 avec un alcali, on centrifuge le milieu pour éliminer les cellules microbiennes insolubles et on éclaire avec une lunière ultraviolette ayant une longueur d'onde de 360 nm. On detecte une fluorescence ayant une longueur d'onde de 450 nm eoec le détecteur de fluorescence (modEle 204S de Hitachi, Ltd., Tokyo) et on détermine la quantité de méthyl-4 ombelliférone (4-MU) libérée. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-après. Comme le montre le tableau II, le MUP est hydrolysé par toutes les souches étudiées. D'autre part, le MUssGa;, le MUαCal et le MUAra sont hydrolysés sélectivement par une bactérie appartenant aux coliformes.

EXEMPLE 2
On prépare quatre solutions échantillons constituea d'eau de la rivière Tamia, d'eau résiduaire d'une usine de fabrication d'aliments, d'eau de puits et d'eau d'égout. On verse des portions de 10 ml de seize solutions échantillons dans des tubes è essai avec 1,0 ml de solution de tampon phosphate 1,1 x 10-2 M en MUP.

On laisse séjourner chaque tube à 370C pendant 2 h. Apres avoir éliminé les résidus insolubles par centrifugation, on ajuste le pH de la solution à 10,5 et on détermine la quantité de 4-MU libérée avec un détecteur de fluorescence.

D'autre part, on détermine le nombre des microorganismes de chaque solution échantillon selon la méthode habituelle de numération sur botte avec un milieu gélose standard.

La relation entre le nombre des micro-organismes et la quantité de 4-MU libérée figure dans le tableau III ci-après.

Comtne le montre le tableau III, la quantité de 4-MU libérée est approximativement proportionnelle au nombre des micro-organismes mesuré selon la méthode habituelle de numération sur boîte. Par conséquent, le nouveau procédé de l'invention permet de mesurer de façon extremement rapide le nombre des micro-organismes dans l'eau avec pratiquement la meme précision que la méthode classique de numération sur botte.

EXEMPLE 3
On pèse 10 g d'une salade de pommes de terre du commerce, on ajoute 90 ml d'eau stérile et on mélange. On homogénéise le mélange pendant 1,0 .n4n d 20 000 tr/min et on dilue avec de l'eau stérile pour préparer des dilutions décimales 10-1, 10-2 et 10-3 de l'homogénat. On transfère des portions de 1,0 ml de dilutions dans trois tubes à essai contenant 9,0 ml de milieu peptoné à 0,05%, puis on incube à 30 C pendant 12 h en agitant. Après avoir éliminé les résidus insolubles, on détermine la fluor-scence du milieu avec un détecteur de fluorescence comme décrit dans l'exemple 2.On compte le nombre de tubes présentant une fluorescence et on utilise le résultat pour déterminer le nombre le plus probable avec les tables correspondantes.

Parallèlement à cette expérience, on détermine le nombre des micro-organismes selon la méthode classique du nombre le plus probable. On transfère 1,0 ml de dilution dans trois tubes contenant 9,0 ml de milieu de culture nutritif (contenant 0,25% d'extrait de levure, 0,5% de peptone et 0,1% de glucose à pH 7,1).

On incube les milieux a 30 C pendant 48 h, puis on observe la turbidité des milieux pour déterminer si les micro-organismes s'y sont développés ou non et, à partir du nombre total de tubes présentant une culture de micro-organismes, on détermine le nombre le plus probable au moyen des tables appropriées.

On détermine de façon semblable le nombre de microorganismes d'une salade de macaroni et d'une salade de spaghetti du commerce. Les résultats obtenus figurent dans le tableau IV ciaprès.

On détermine le nombre le plus probable de microorganismes de la meme salade de pommes de terre, comme il vient d'être decrit, si ce n'est que le milieu peptoné a une concentration de 10-3 M en MUP, MUGal ou MJssGal et on obtient le même nombre le plus probable de micro-organismes (1,5 x 105) après 10 h d'incubation.

EXEMPLE 4
On cultive Escherichia coli ATCC 25922 a 37 C en agitant dans du milieu à l'infusion de coeur contenant 0,05% de désoxycholate de sodium et 100-2 M en IPTG. Après 8 h, on dilue le milieu avec une solution de tampon phosphate 3 x 10-4 M tn MUGal pour qu'il contienne 102 cellules microbiennes/ml. On introduit ensuite des portions de 5,0 ml de dilution dans des tubes à essai avec 20 1 de toluène et on laisse les tubes séjourner à 40tC pendant 1 h, puis on mesure la quantité de 4-MU libérée comme décrit dans l'exemple 2.

Les résultats obtenus sont illustres par la figure où l'axe des abscisses indique le nombre de micro-organismes déterminé selon la méthode classique de numération sur boîte et l'axe des ordonnées indique la quantité de 4-MU libérée (x 10 7 M).

Cette figure montre qu'il existe une relation linéaire entre le nombre des micro-organismes et la quantité de 4-MU libérée.

D'autre part, on recueille de façon classique des échantillons d'urine de cinq malades atteints d'injection uretrale et on introduit des portions de 4,5 ml d'urine dans des tubes à essai avec 4,5 ml de milieu à l'infusion de coeur semblable à celui utilisé dans l'expérience ci-dessus, si ce n'est qu'on l'a au préalable concentre au double et on incube les tubes à 37 C pendant 8 h en agitant. On ajoute ensuite à chaque tube 20 1 de toluène et 1,0 ml de solution de tampon phosphate 5 x 10-4 M en MUssGal et on effectue à nouveau une incubation de 1,0 h à 40 c.

On determine ensuite la quantité de 4-MU liberee dans la solution et on détermine le nombre de coliformes à partir de la relation illustree par la figure. Les résultats obtenus figurent dans le tableau V ci-après avec également, à titre de témoin, le nombre des coliformes dans l'urine déterminé selon la méthode classique de numération sur botte.

EXEMPLE 5
On cultive Escherichia coli ATCC 10798 (K-12) à 370C pendant 20 h en agitant dans du bouillon nutritif contenant 0,1% de desoxycholate de sodium.

On dilue le bouillon de culture avec de l'eau stérile pour préparer des dilutions contenant 10, 102, 103 et 104 cellules microbiennes/ml.

On introduit des portions de 1 ml der dilutions dans des tubes à essai avec 9,0 nl de bouillon nutritif 10-3 M en IPTC, et on incube les tubes à 370C pendant 1,0 à 6,0 h en agitant. On transfère des portions de 2,0 nI des milieux cultivés dans d'autres tubes à essai avec 2Oul de toluene et 2,0 ml de solution de tampon phosphate 3 x 10-3 3 M en MUssGal. On laisse les tubes séjourner à 370C pendant 60 min, puis on mesure la quantité de 4-MU libérée comme décrit dans l'exemple 2. Les résultats obtenus figurent dans le
tableau VI ci-après ainsi que le nombre des cellules microbiennes
déterminé selon la méthode classique de numération sur boite.

Le tableau VI montre la relation entre le nombre des
cellules microbiennes et la durée de culture pour chaque milieu de
culture contenant 10 à 104 cellules microbiennes.

On voit que cette relation permet de déterminer un nombre faible de cellules microbiennes de E. coli.

EXEMPLE 6
On prépare des milieux à l'infusion de coeur ayant une concentration de 10-3 M an IPTG ou en PTG ou de 1,0% en lactose,
ces substances étant des inducteurs de la ss-galactosidase. On ensemence des portions de 10 ml de ces milieux avec 100 cellules microbiennes d'Escherichia coli ATCC 10798 (K-12) et on incube à 370C en agitant pendant 5 h. Le nombre des cellules microbiennes du milieu
de culture obtenu est dans tous les cas de 1,6 x 106/ml.

On transfère des portions de 2 ml de milieu dans des
tubes à essai avec 2,0 ml de solution de tampon phosphate 3 x 10-4 4 M en MUssCal. On laisse les tubes reposer à 400C pendant 1 h. On mesure ensuite la quantité de 4-MU libérée comme décrit dans l'exemple 2.

Les résultats figurent dans le tableau VII.

Lorsqu'on fait éclater les cellules microbiennes du milieu de culture ayant une concentration de 10 M en IPTG ainsi obtenu par contact avec 5/ul/ml d'acétate d'éthyle à 370C pendant 1 h, ou par exposition à des ondes ultrasonores (10 kHz, 10 min) la quantité de 4-MU libérée décuple par rapport à celle du témoin comme le montre le tableau VIII ci-après.

EXEMPLE 7
On introduit dans cinq tubes à essai 10 ml de milieu à l'infusion de coeur ayant une concentration de 10-3 M en IPTG, 0,1% en désoxycholate de sodium et de 10-3 M en -D-galactoside d'ombelliféryle et on ajoute à chaque tube des portions de 0,01 ml d'eau de la rivière Tama. On incube ensuite les cinq tubes à 370C
pendant 6 h en agitant.

De façon semblable, on ajoute des portions de 0,1 mî, 1,0 rnl et 10 ml d'eau de rivière à d'autres groupes de cinq tubes et on incube également à 370C pendant 6 h.

Apres avoir éliminé par centrifugation les résidus insolubles, on mesure la fluorescence des solutions et on détermine le nombre le plus probable de micro-organismes à partir du nombre de tubes à essai présentant une fluorescence au moyen des tables correspondantes.

D'autre part, on détermine le nombre le plus probable de micro-organismes de l'eau de rivière selon la méthode classique utilisée pour cette détermination.

A titre comparatif, on introduit du milieu à l'infusion de coeur ne contenant que 0,1% de désoxycholate de sodium dans cinq tubes de fermentation et on ajoute de l'eau de rivière aux cinq tubes.

On cultive ensuite à 370C pendant 48 h et on détermine de façon classique le nombre des tubes présentant une production de gaz. On détermine ensuite le nombre le plus probable des micro-organismes à partir du nombre de tubes au moyen des tables appropriées. Les résultats obtenus figurent dans le tableau IX ci-après.

EXEMPLE 8
On mélange une croquette de 100 g du commerce qu'on a laissée pendant une nuit å la température de la pièce avec 100 ml de solution de tampon phosphate (pH 7,0; 0,1 M). On homogénéise le mélange pendant 1,0 min à 20 000 tr/min, puis on dilue avec la meme solution tampon pour préparer des dilutions décimales 10-1 10-2 et 10-3 de l'homogénat.

On introduit des portions de 1 ml de chaque dilution dans cinq tubes à essai avec 9,0 ml de milieu b l'infusion de coeur contenant 0,1% de désoxycholate de sodium. On incube ensuite chaque tube h 44,50C en agitant.

On introduit dans d'autres tubes des portions de 2 m1 du milieu incubé, 20 1 de toluene et 2,0 ml de solution tampon phosphate 3 x 10-3 M en MUP et on laisse séjourner à 37 C pendant 1 h. Après avoir éliminé les résidus insolubles, on détermine le nombre de tubes présentant une fluorescence. Les résultats obtenus figurent dans le tableau X avec les résultats obtenus-selon la méthode classique de détermination du nombre le plus probable des coli formes.

EXEMPLE 9
On mélange 10 g de terre d'un verger avec 90 ml d'eau stérile et on homogénéise pendant 1,0 min. On dilue ensuite avec de l'eau stérile pour préparer des dilutions décimales de l'homogénat de 10-1 et de 10-2 et on transfère des portions de 1,0 ml de chaque dilution dans trois tubes à essai contenant 5,0 ml de milieu YM contenant 0,05% d'extrait de levure, 0,05% d'extrait de malt, 100 fg/ml de chloramphénicol, 10-3 M en MUssGal et 10-3 M en MUP (pH 6,0). On incube ensuite chaque tube à 27 C pendant 12 h en agitant.

On compte les tubes présentant une fluorescence comme décrit dans l'exemple 2 et le nombre le plus probable des microorganismes déterminé à partir du nombre des tubes fluorescents au mayen des tables appropriées est de 1 500/10 g de terre, Parallèlement à cette expérience, on détermine le nombre des micro-organismes selon la méthode classique de numération sur boîte. Pour cela, on mélange 1,0 ml de la dilution de l'homogénat avec 9 ml de milieu YM constitué de 0,3% d'extrait de levure, 0,3" d'extrait de malt, 0,5% de peptone, 100/ug/ml de chloramphénicol et 1,5% de gélose à pH 6,5.

On coule le mélange dans des boites de Petri et on incube a 275C.

Après 48 h d'incubation, on compte le nombre des colonies présentes sur la boîte et le nombre des micro-organismes (principalement des levures et des champignons) est de 1 300/10 g de terre.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

TA.13LEAU I
Liste des souches étudiées.

Coliformes n ATCC Eschericbie coli 25922
Enterobacter cloacae 23355
Proteus vulgaris 13315
Serratia marcescens 8100
Salmonella typhimurium 14028 Klebsiella pneumoniae 13883
Autres bactéries à gram négatif
Pseudomonas aeruginosa 27853
Alcaligenes faecalis 25094
Bactéries à gram positif
Staphylococcus aureus 25923
Staphylococcus epidermidis 12228
Bacillus cereus 14579
Nocardia asteroides 3308
Brevibacterium flavum 14067
Streptococcus faecalis 12984
Streptococcus pyogenes 19615
Levures
Saccharomyces cerevisiae (CBS 1171)
Candida albicans 10231
Champignons
Aspergillus niger 6275 Penicillium citrinum 9849
Acinetobacter calcoaceticus 23055
T A B L E A U II
Activités de libération de la 4-MU des souches étudiées.

Souche quantité de 4-MU libérées étudiée Dérivés de MU étudiés (ATCC n ) MUP MuGal MUPP MUAce MUAG MUαGal MUssGal MUAra
25922 +++ + ++ + ++ +++ +++ +++
23355 +++ ++ ++ + ++ +++ +++ +++
13315 +++ - ++ + + - -
8100 +++ ++ ++ - ++ - ++ +++
14028 +++ + - + + - -
13883 +++ - ++ + +t - - ++
27853 +++ - - + - - -
25094 + - - + - - -
25923 ++ - - - - - -
12228 ++ - - - - - -
14579 ++ + - + - - -
3304 + + - + + - - -
12984 + + - - + - -
14067 + - - + - - -
19615 ++ - - - - - - cbs1171 ++ - - + - - -
10231 ++ ++ - - - - -
6275 + ++ - + ++ - -
9849 + + - - + - - -
23055 ++ + - - - - - -
(-) : 4-MU non détectée.

(+) : La quantité de 4-MU est supérieure à 10-7M.

(++) : La quantité de 4-MU est supérieure à 10-6M.

(+++) : La quantité de 4-MU est supérieure à 10-5M.

T A B L E A U III
Relation entre le nombre de micro-organismes et la quantité de 4-MU libérée.

Nombre 4-MU 7 Nombre 4-MU (pour 10 ml) (x10-1M) (pour 10 ml) (x10-1 M) 1,1 x 10 0 6,3 x 106 285 2,0 x 103 0 8,2 x 106 493 5,0 x 103 0 1,3 x 107 890 3,0 x î 104 1,5 4,2 x 107 630 7,2 x 104 3,2 7,1 x 107 952 3,6 x 105 82 8,2 x 108 1300 4,2 x 10) 93 1,9 x 108 930 5,1 x 106 305 2,1 x 108 1450
T A B L E A U IV
Nombre le plus probable de micro-organismes (pour 10 g de salade)
Type de salade Procédé de l'invention Procédé classique
(12 h) (48 h)
Pomme de terre 1,5 x 105 1,1 x 105
Macaroni 4,3 x 103 7,5 x 103
Spaghetti 7,5 x 104 9,3 x
TABLEAU V
Nombre de coliformes dans l'urine
Echantillon Procédé de l'invention Numération sur botte d'urine (pour 1 ml) (pour 1 ml)
A 4,6 x 105 4,8 x 105
B 2,0 x 107 1,8 x
C 1,0 x 106 2,0 x 106
D excès 4,8 x 107
E 3,5 x 106 3,0 x 106 TABLEAU VI
Relation entre le nombre de cellules microbiennes/10 ml et la durée de culture.

Importance Durée de culture (h) de l'ino culum 1 2 3 4 5 (n /10 ml) Nombre 4-MU Nombre 4-MU Nombre 4-MU Nombre 4-Mu Nombre 4-MU
0 0 - 0 - 0 - 0 - 0
1,0 4 - 3,2 - 260 - 2,1x10 - 1,6x104 1,3x10-7
10 40 - 320 - 2,7x10 - 2,3x104 1,5x10-7 1,6x105 1,5x10-6
10 400 - 3,2x10 - 2,6x104 2,1x10-7 2,2x105 1,4x10-6 1,5x107 1,4x10-5
10 4x10 - 3,2x104 2,5x10-7 2,6x105 1,7x10-6
104 4x104 2,8x10-7 3,2x105 1,8x10-6
T A B L E A U VII
Effet de l'addition d'un inducteur
Inducteur quantité de 4-MU (M)
Néant 1,5 x 10 6
IPTG 1,5 x
PTG 1,5 x
Lactose 8,7 x 10-6
T A B L E A U VIII
Effet de l'éclatement des cellules microbiennes
Traitement quantité de 4-MU (M)
Néant (témoin) 1,5 x
Acétate d'éthyle 1,5 x 10-4
Désintégration par 1,5 x 10-4
les ultrasons
T A B L E A U IX
Nombre le plus probable de micro-organismes de l'eau de rivière.

Volume de Nombre de tubes positifs l'échantillon Fluorescence Production de gaz
(ml)
(6 h) (48 h)
iO* 5 5
1,0 3 3
0,1 0 0
0,01 0 0
Nombre le plus 79
probable / 100 ml
* On utilise le milieu l'infusion de coeur concentré au double.

T A B L E A U X
Nombre le plus probable de micro-organismes dans une croquette
Nombre de tubes positifs
Fluorescence Production de gaz
Dilutions (10 h) (48 h)
1,0 5
10-1 2 2
10-2 0 0
10-3 0 0
Nombre le plus 49 49 probable/100 g

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé rapide pour la détection ou la dCtermination de micro-organismes dans une solution échantillon, caractérisé en ce qu'il consiste à a) incuber une solution aqueuse contenant cette solution échantillon et un dérivé non fluorescent d'ombelliférone è une température comprise entre 10 et COC jusqutch ce qu'un drivé fluorement d'ombelliférone soit libéré par les micro-organismes contenus dans la solution échantillon, b) mesurer la quantité de dérivé d'ombelliférone libérée avec un détecteur de fluorescence et c) déterminer le nombre demicro-organismes dans la solution échantillon a partir de la quantité de dérivé d'ombelliférone libérée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé non fluorescent d'ombelliférone est un composé répondant a la formule générale

où R1 représente un reste d'hexose ou un radical phosphate, pyrophosphate ou acyle et R2 représente un atome d'hydrogcne ou un radical alkyle inférieur.
3. procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R1 représente un reste glucogide, arauinoside ou galach@side ou un radical phosphate, pyrophosphate ou acétyle et R2 represellte le radical méthyle.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R1 représente un radical phosphate et R2 représentc un radical méthyle.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait éclater les cellules desmicro-organismes dans la solution échantillon avant ou pendant l'incubation.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse contient un milieu de culture nutritif, le dérivé d'ombelliférone non fluorescent et la solution échantillon ou contient le dérivé d'ombelliférone et une culture de la solution échantillon cultivée dans un milieu de culture nutritif pendant 1 à 12 heures.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les micro-organismes 8 déterminer sont des coliformes.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ajoute un acide biliaire ou de l'acide désoxycholique au milieu de culture nutritif.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme dérivé d'ombelliférone, le galactoside de méthyl-4 ombelliféryle et/ou l'arabinoside de méthyl-4 ombelliféryle.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on ajoute un inducteur de la B-galactosi.dase au milieu de culture nutritif.
11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on détermine le nombre de micro-organismes selon la méthode classique de détermination du nombre le plus probable des micro-organismes.