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Die Erfindung betrifft ein Schnellverfahren zur Bestimmung
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von Mikroorganismen durch Fluoreszenzanalyse unter Verwendung von
Umbelliferonderivaten.
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Normalerweise wird gefordert, Nahrungsmittel und Getränke von mikrobiellen
Verunreinigungen freizuhalten und es gibt in Japan yesetzliche Bestinnungen, wonach
Nahrungsmittel wie Fleisch, Erfrischungsgetränke und Fischpasten keine Colibakterien
enthalten dürfen. Die gesundheitliche Qualität dieser Produkte muß daher während
der Herstellung und des Vertriebs genau kontrolliert werden. Zu diesem Zweck ist
es wichtig, daß die mikrobielle Untersuchung schnell durchgeführt und das Ergebnis
bezüglich der mikrobiellen Verunreinigung so schnell wie möglich erhalten werden
kann.
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Bekannte Methoden zur Bestimmung von Mikroorganismen erfordern jedoch
zum Nachweis eine mindestens 24-stündige Inkubation. Als herkömmliche Methoden zur
Bestimmung von Mikroorganismen sind die Plattenzählmethode und die Most Probable
Number-Methode bekannt (offizielle Analysenmethoden der Official Analytical Chemists,Official
First Action, 11. Ausgabe, S. 843, 1970, U.S.A.), die folgendermaßen durchgeführt
werden: Plattenzählmethode (geeignet für die Analyse von Nahrungsmitteln, in denc'n
eine groB} Anzahl von Mikroben erwartet wird).
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Die Probe (Nahrungsmittel) wird homogenisiert und mit sterilem Wasser
verdünnt. Je eine Dezimalverdünnung des Homogenats von 10 1 bis 10 4 wird zusammen
mit einem Nähr-Agarmedium in eine Petrischale gegossen. Hierauf inkubiert man die
Schalen 24 bis 48 Stunden und zählt alle auf der Platte gewachsenen Kolonien. Auf
Basis des Ergebnisses wird die Zahl pro g bestimmt.
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Most Probable Number (MPN -Methode) (empfohlen für die Routineüberwachung
von Nahrungsmitteln, bei denen eine kleine Anzahl von Mikroben, insbesondere Colibakterien,
erwartet wird).
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Die Homogenatverdünnung wird in drei bis fünf Fermentationsröhrchen
überführt, die ein Nährmedium,wie Lactose-Bouillon-Medium und Brilliantgrün -Lactose
Bie (BGL B), enthalten.
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Die Röhrchen werden 24 bis 48 Stunden inkubiert, worauf man die Anzahl
der Röhrchen zählt, in denen eine Gasentwicklung auftritt (positiver präsumtiverTest).Bei
allen positiven präsumtiven Tests wird dann ein Bestätigungstest auf Colibakterien
durchgeführt. Der MPN-Wert wird unter Verwendung einer MPN-Tabelle auf Basis der
Anzahl von Röhrchen berechnet, die eine Gasentwicklung zeigen.
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In jedem Fall müssen die Mikioorganismen in einem nu Nlihrmcctium
kultiviert werden, bis das Mikroorganismenwachstum mit dem bloßen Auge bestimmt
werden kann. Diese herkömmlichen Methoden erfordern daher eine Inkubationszeit von
mindestens 24 Stunden für den Nachweis und das Produkt muß daher gelagert werden,
bis das Ergebnis erhalten wird. In jüngerer Zeit erschienen eine Anzahl von Veröffentlichungen,
die sich mit Schnellverfahren zum Nachweis von Mikroorganismen befassen. Bei diesen
Methoden werden Veränderungen der Impedanz oder des pH des Kulturmediums oder die
Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder entwickeltem Kohlendioxidgas, die mit dem
Wachstum von Mikroorganismen in Beziehung stehen, ermessen und die Anzahl von Mikroorganismen
wird auf Basis der erhaltenen
Werte bestimmt. Diese Methoden eignen
sich jedoch nur zur Untersuchung von Probenlösungen, die mehr als 105/ml Mikroorganismen
enthalten. Außerdem können diese Werte durch gleichzeitig vorhandene Materialien
beeinflußt werden, so daß diese Schnellverfahren aufgrund ihrer geringen Genauigkeit
und ji>rcs beschränkten Nachweisbereiches für die Praxis nicht zufriedenstellend
sind.
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Ziel der Erfindung ist es daher, ein Schnellverfahren zum Nachweis
von Mikroorganismen in Probenlösungen durch Fluoreszenzanalyse unter Verwendung
von Umbelliferonderivaten bereitzustellen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine wäßrige Lösung, die die Probenlösung und ein nichtfluoreszierendes Umbelliferonderivat
enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 500C inkubiert, bis ein fluoreszierendes
Umbelliferonderivat durch die in der Probenlösung enthaltenen Mikroorganismen in
der Lösung freigesetzt wird, b) die Menge des freigesetzten Umbelliferonderivats
mißt und c) die Anzahl der Mikroorganismen in der Probenlösung auf Basis der Menge
an freigesetztem Umbelliferonderivat bestimmt.
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Bei diesem Verfahren wird das nicht-fluoreszierende Umbelliferonderivat
hydrolysiert und ein fluoreszierendes Umbelliferonderivat, wie Umbelliferon oder
4-Methylumbelliferon, wird durch die in der Probenlösung enthaltenen Mikroorganismen
freigesetzt, wobei die Menge des freigesetzten Umbelliferonderivats annähernd proportional
zur Anzahl von Mikroorganismen ist. Die Anzahl der Mikroorganismen kann daher auf
Basis dieser proportionalen Beziehung bestimmt werden.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die mikrobielle Untersuchung
verschiedener Materialien, wie Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser und Toilettenartikeln,
oder die klinische Untersuchung von mikrobiellen Infektionen in 1 bis 12 Stunden
durchgeführt werden.
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Das erfindungsgemäß angewandte nicht-fluoreszierende Umbelliferonderivat
hat die allgemeine Formel
in der R1 einen Hexoserest, eine Phosphat- oder Acylgruppe bedeutet und R2 ein Wasserstoffatom
oder eine niedere Alkylgruppe ist.
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Beispiele für derartige Umbelliferonderivate sind 4-Methylumbelliferylphosphat
(MUP), 4-Methylumbelliferylpyrophosphat (MUPP), 4-Methylumbelliferyl-a-D-galactosid
(MU«Gal), 4-Methylumbelliferyl-B-D-galactosid (MUßGal), Umbelliferyl-B-D-galactosid
(UßGal), 4-Methylumbelliferylalabinosid (MUAla), 4-Methylumbelliferylacetat (MUAce),
4-Methylumbelliferylacetoamido-B-D-glucosid (MUAG) und Umbelliferylglucosid.
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Unter diesem Umbelliferonderivaten ist MUP besonders bevorzugt, da
es von verschiedenen Mikroorganismenarten hydrolysiert wird, wie in Tabelle I von
Beispiel 1 gezeigt ist.
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Vorzugsweise wird MUP zusammen mit MUPP, MUAG, MUGal, MUAce und 1
oder MUALa verwendet, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht und die Nachweisz<?it
verkürzt werden können.
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Andererseits eignen sich MUGal und MUALa zum selektiven Nachweis von
Colibakterien, da sie nur durch Colibakterien hydrolysiert werden.
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Inkubiert man das Umbelliferonderivat mit Mikroorganismen, so wird
es hydrolysiert und fluoreszierendes Umbelliferon oder 4-Methylumbelliferon wird
freigesetzt. Die das fluoreszierende Umbelliferonderivat enthaltende inkubierte
Lösung fluoresziert mit hellblauber Farbe von 450 nm Wellenlänge, wenn man sie mit
UV-Strahlung von 360 nm Wellenlänge bestrahlt, und die Pluorcszerlz kann mit (JflOflI
herkömmlichen Fluoroszenzdetektor nachgewiesen werden, wtnn mehr als 10 M Umbelliferonderivat
in der Lösung freigesetzt sind.
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Zum Messen der Fluoreszenz wird vorzugsweise der pH der Lösung auf
einen alkalischen Wert von mehr als 10,0 eingestellt, um die Empfindlichkeit zu
erhöhen.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbare oder bestimmbare
Mikroorganismen sind aerobe Bakterien und echte Pilze, die sich in den verschiedensten
Nahrungsmitteln und in Wasser finden und in Standard-Nähr-Agarmedien wachsen können.
Beispiele für aerobe Bakterien sind gram-negative Bakterien, z.B. Bakterien der
Genera Escherichia, Serratia, Pseudomonas, Klebsiella und Alcaligenes, sowie gram-negative
Bakterien der Genera Staphylococcus, Bacillus, Nocaldia, Brevibacterium und Streptococcus.
Beispiele für echte Fungi sind solche der Genera Saccharomyces, Candida, Aspergillus
und Penicillium. Colibakterien sind gram-negative, nichtkeimbildende Stäbchen, die
Lactose unter Gasbildung zersetzen können. Bakterien dieser Art gehören zu den Genera
Escherichia, Erwinia, Seratia, Proteus und Salmonella.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Mikroorganismenanzahl von
mehr als 104/ml direkt bestimmt werden, indem man die Probenlösung mit dem Unbelliferonderivat
in nerührung bringt und die Menge an freigesetztem fluoreszierendem Umbelliferonderivat
mißt. Hierzu gibt man 10 ³ bis 10 4 M Umbelliferonderivat zu der Probenlösung und
inkubiert das Lösungsgemisch 10 Minuten bis 6 Stunden bei einer Temperatur von 10
bis 600C. Nach oem Abtrennen des unlöslichen Rückstands,
z.B. der
Mikrobenzellen, wird die Fluoreszenz der Lösung mit einem herkömmlichen Fluoreszenzdetektor
gemessen und die Menge an freigesetztem Umbelliferonderivat bestimmt. Die Menge
an freigesetztem Umbelliferonderivat ist annähernd proportional zur Anzahl von Mikroorganismen,
wie in Tabelle III von Beispiel 2 und in Fig. 1 von Beispiel 4 gezeigt ist. Die
Anzahl der Mikroorganismen kann da1Xer anhand der vorher aufaestellten Beziehung
bestimmt werden. Die Anzahl von Mikroorganismen, die nach diesem Verfahren nachweisbar
ist, beträgt etwa 104 bis 107/ml, wie aus Fig. 1 hervorgeht.
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Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, können die Mikrobenzellen in der
Probenlösung aufgebrochen werden, indem man sie mit einem organischen Lösungsmittel,
wie Toluol oder Chloroform, oder einem lytischen Enzym in Berührung bringt oder
mit physikalischen Methoden zerstört, z .B. durch Ultraschallbenhandlung vor oder
während der Inkubation. Durch das Aufbrechen wird das zur Freisetzung des fluoreszierenden
Umbelliferonderivats befähigte Enzym, das gewöhnlich in den Mikrobenzellen enthalten
ist, extrahiert, so daß die Nachweisempfindlichkeit um das Mehrfache gesteigert
werden kann.
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Die Empfindlichkeit kann auch durch Verlängerung der Inkubationszeit
oder durch Konzentrieren der Mikrobenzellen, so 4 daß die Probenlösung mehr als
104/ml Mikrobenzellen enthält, erhöht werden. Diese direkte Methode ist jedoch zum
Nachweis einer kleineren Anzahl von Mikroorganismen, z.B. weniger als 10³/ml nicht
geeignet. Eine goringere Mikroorganismenanzahl von weniger als 104/ml kann dadurch
bestimmt werden, daß man die Mikroorganismen der Probenlösung vor der Bestimmung
1 bis 12 Stunden in einem Nährmedium vermehrt, bis mehr als 104/ml in dem Kulturmedium
erhalten werden. Die die Anzahl von Mikroorganismen in der erhaltenen Kulturbrühe
proportional zur Züchtungszeit ist, kann die Anzahl von Mikroorganismen entsprechend
der Züchtungszei durch Messen der 7\n'.h von Mikroorganismen in der Brühe bestimmt
werden. Die Anzahl läßt sich noch genauer nach der oben beschriebenen bekannten
MPN-Methode
bestimmen. Hiezu verdünnt man die Probenlösung oder ein Homogenat der Probe mit
sterilem Wasser, um -4 Dezimalverdünnungen von 10 1 bis 10 4 der Probenlösung herzustellen.
Jeweils eine der Verdünnungen wird in 3 bis 5 Röhrchen eingebracht, die ein herkömmliches
Nährmedium enthalten. Die Röhrchen werden dann 1 bis 12 Stunden inkubiert, um die
Mikroorganismen in den Röhrchen in Gegenwart des Umbelliferonderivats zu vermehren.
Das Umbelliferonderivat wird dem Kulturmedium nach der Inkubation zugesetzt, wenn
die Inkubation ohne Zusatz des Umbelliferonderivats durchgeführt wurde, und es wird
eine weitere 1- bis 2-stündige Inkubation durchgeführt. Anschließend zählt man die
Anzahl der Röhrchen jeder Verdünnung; die eine Fluoreszenz zeigen, und bestimmt
die Anzahl der Mikrobenzellen nach der beschriebenen MPN-Methode.
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Bei diesem Verfahren werden herkömmliche, für den Mikrobennachweis
übliche Nährmedien verwendet, z.B. Peptonmedium, Herzinfusionsbrühe und Nährbrühe.
Zum Nachweis von Fungi werden Zapek-Dox-Medium, Malzextraktmedium, Kartoffel-Dextrose-Medium
und Maismehl-Medium bevorzugt. Um Fungi selektiv nachzuweisen, können den Nährmedium
Antibiotika, wie Chloramphenicol oder Penicillin, die das Bakterienwachstum hemmen,
zugesetzt werden.
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Um Colibakterien nachzuweisen, setgt man dem Nährmedium vor zugsweise
eine Gallensäure oder Desoxychol säure zu, die das Wachstum anderer Mikroorganismen
als der Colibakterien hemmen. Da Colibakterien spezifisch Galactosidase enthalten,
wird dem Nährmedium vorzugsweise ein Induktor für Galactosidase zugesetzt, z.B.
Lactose-isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), Propyl-B-D-thiolactopyranosid
(PTG) und MUGal, wenn MUGal als Umbelliferonderivat verwendet wird.
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Die Erfindung stellt somit ein Schnellverfahren zum Nachweis oder
zur Bestimmung der Anzahl von Mikroorganismen durch Fluoreszenzanalyse zur Verfügung,
das sich in der Praxis insbesondere zur mikrobiellen Untersuchung verschiedener
Arten von Nahrungsmitteln, Getränken und Wasser sowie zur klinischen Untersuchung
von mikrobiellen Infektionen eignet.
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B e i 5 p i e 1 1 Ein Medium, das 0,5 % Pepton und 10 3 M der in
Tabelle I genannten 4-Methylumbelliferonderivate enthält und einen pH von 7,0 hat,
wird durch ein Millipore-Filter filtriert, worauf man jeweils 3,0 ml des Mediums
in aseptische 20 ml Teströhrchen gießt. Jedes Röhrchen mit Peptonmedium wird mit
10 bis 100 Mikrobenzellen der in Tabelle I genannten bekannten Stämme beimpft und
24 Stunden bei 30°C im Falle von Bakterien bzw. 25 0C im Falle von Fungi und Hefen
unter Schütteln inkubiert. Die Anzahl der in dem Kulturmedium gewachsenen Mikroorganismen
variiert, liegt jedoch im Bereich von 106 bis 109/ml.
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Tabelle I Liste der Teststämme Colibakterien ATCC-Nummer Escherichia
coli 25922 Enterobacter cloacae 23355 Proteus vulgaris 13315 Serratia marcescens
8100 Salmonella typhimurium 14028 Klebsiella pneumoniae 13883 Andere gram-negative
Bakterien Pseudomonas aeruginosa 27853 Alcaligenes faecalis 25094 Gram-posi Live
Bakterien Staphylococcus aureus 25923 Staphylococcus epidernidis 12228 Bacillus
cereus 14579 Nocardia asteroides 3308 Brevibacterium flavum 14067 Streptococcus
faecalis 12984 Streptococcus pyogenes 19615 Hefen Saccharomyces cerevisiae (CBS
1171) Candida albicans 10231 Fungi Aspergillus niger 6275 Penicillium citrinum 9849
Acinetobacter calcoaceticus 23055
Nachdem der pH jeder Kulturbrühe
mit Alkalibase auf 11,0 eingestellt ist, zentrifugiert man unlösliche Mikrobenzellen
ab und belichtet das Medium mit W-Strahlung von 360 nm Wellenlänge. Hierauf wird
die Fluoreszenz bei 450 nm Wellenlänge mit einem Fluoreszenzdeektor (Modell 204S
der Hitachi, Ltd. Tokyo) gemessen und die Menge an freigesetztem 4-Methylumbelliferon
(4-MU) wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II genannt. Aus Tabelle II
geht hervor, daß MUP durch alle Teststämme hydrolysiert wird. Andererseits werden
MUßGal, MUaGal und MUAla durch spezielle Bakterien, die zu den Colibakterien gehören,
selektiv hydrolysiert.
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Beispiel 2 Vier Probenlösungen werden gesammelt aus Wasser des Flusses
Tama, Abwasser einer Lebensmittelfabrikt Brunnenwasser bzw.
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Kloakenwasser. Jeweils 10 ml von 16 Probenlösungen wer-den zusammen
mit 1,0 ml Phosphatpufferlösung, die 1,1 x 10-2M MUP enthält, in Teströhrchen gegossen.
Jeden der Röhrchen wird dann 2 Stunden bei 37°C stehengelassen. Nach dem Absentrifugieren
unlöslicher Rückstände wird der pH der Lösung auf 10,5 eingestellt und die Menge
an freigesetztem 4-MU wird mit einem Fluoreszendzdetektor bestimmt.
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Daneben wird die Anzahl von Mikroorganismen in jeder Probenklösung
nach der bekannten Plattenzählmethode unter Verwendung eines Standard-Agarmediums
bestimmt. Die Beziehung zzischen der Anzahl von Mikroorganismen und der Menge an
freigesetztem 4-MU ist in Tabelle III gezeigt.
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Tabelle III Beziehung zwischen der Anzahl von Mikroorganismen und
der Menge an freigesetztem 4-MU Anzahl 4-MU Anzahl 4-MU pro 10 ml) (x10-7) pro 10
m£) (x10-/M) 1,1 x 102 0 613 x 106 285 2,0 x 103 0 812 x 106 493 5r0 x 103 0 lt3
x 107 890 3,0 x 104 1,5 4,2 x 107 630 7,2 x 104 3,2 7,1 x 107 952 3t6 x 10³ 82 8
2 x 108 1300 4,2 x 10³ 93 1,9 x 10² 930 5,1 x 106 305 2,1 x 108 1250
Tabelle
II Aktivität der Teststämme bei der Freisetzung von 4-MU Menge an freigesetztem
4-MU Test- getestete MU-Derivate stamm (ATCC Nr.) MUP MUGal MUPP MUAce MUAG MUαGal
MUßGal MUALa 25922 +++ + ++ + ++ +++ +++ +++ 23355 +++ ++ ++ + ++ +++ +++ +++ 13315
+++ -- ++ + + - - -8100 +++ ++ ++ ++ - ++ - ++ 14028 +++ + - + - - -13883 +++ -
++ + ++ - - ++ 27853 +++ - - + - - - -25094 + - - + - - - -25923 ++ - - - - - -
-12228 ++ - - - - - - -14579 ++ + - + - - - -3304 + + - + + - - -12984 + + - - +
- - -14067 + - - + - - - -19615 ++ - - - - - - -CBSl171 ++ - - + - - - -10231 ++
++ - - - - - -6275 + ++ - + ++ - - -9849 + + - - + - - -23055 ++ + - - - - - -(-)
@ MU nicht nachgewiesen (+) : Menge an 4-MU beträgt mehr als 10-7M.
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(++) : Menge an 4-MU beträgt mehr als 10-6M.
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Menge an 4-MU beträgt mehr als 10-5M.
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Aus Tabelle III geht hervor, daß die Menge an freigesetztem 4-MU annähernd
proportional zu der nach der Plattenzählmethode bestimmten Anzahl von Mikroorganismen
ist. Die Anzahl von Mikroorganismen in Wasser kann daher mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren äußerst schnell mit fast derselben Genauigkeit wie nach der herkömmlichen
Plattenzählmethode gemessen werden.
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Beispiel 3 10 g handelsüblicher Kartoffelsalat werden abgewogen,
mit 90 ml sterilem Wasser versetzt und gemischt. Das Gemisch wird 1 Minute bei 20
000 U/min homogenisiert und mit sterilem Wasser auf Dezimalverdünnungen von 10@,
10@ und 10@ des Homogenats verdünnt. Jeweils 1,0 ml der Verdünnungen wird in drei
Teströhrchen überführt, die 9,0 ml eines ,05 % Peptonmediums enthalten, und 12 Stunden
bei 300C unter Schütteln inkubiert. Nach dem Abtrennen unlöslicher Rückstände wird
die Fluoreszenz des Mediums mit einem Fluoreszenzdetektor gemäß Beispiel 2 gemessen.
Hierauf zählt man die Zahl der Röhrchen, die eine Fluoreszenz zeigen, und bestimmt
den MPN-Wert unter Verwendung von MPN-Tabellen.
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Parallel zu diesem Experiment wird die Anzahl der Mikroorganismen
nach der herkömmlichen MPN-Methode bestimmt. Hierzu überführt man 1,0 ml der Verdünnung
in drei Röhrchen, die 9,0 ml Nährmedium mit 0,25 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton und
0,1 % Glucose sowie einem pH von 7,1 enthalten. Das Medium wird 48 Stunden bei 300C
inkubiert, worauf man anhand der Trübung des Mediums untersucht, ob Mikroorganismen
in dem Medium wachsen oder nicht. Die Anzahl der Röhrchen, die ein Mikroorganismenwachstum
zeigen, wird bestimmt und der MPN-Wert wird anhand von MPN-Tabellen ermittelt.
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Auf dieselbe Weise wird die Anzahl von Mikroorganismen in handelsüblichem
Makaronisalat und Spaghettisalat bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle IV genannt.
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Tabelle IV MPN-Wert von Salaten (pro 10 g) Salat erfindungsgemäßes
herkömmliches Verfahren (12 Std.) Verfahren (48 Std.) Kartoffel 1,5 x 105 1,1 x
105 Makaroni 4,3 x 10³ 7,5 x 10³ Spaghetti 7,5 x 104 9,3 x 104 Der MPN-Wert desselben
Kartoffelsalates wird wie vorstehend bestimmt, jedoch. verwendet man ein Peptonnedlum,
das 10-3M MUP, 10-3M MUGal und 10-3M MUßGal enthält. Derselbe MPN-Wert (1,5 x 105)
wird nach 10stündiger Inkubation erhalten.
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B e i s p i e l 4 Escherichia coli ATCC 25922 wird unter Schütteln
bei 37°C in einem Herzinfusions (HI)-Medium gezüchtet, das 0,05 % Natriumdesoxycholat
und 10 M IPTG enthält. Nach 8 Stunden wird das Medium mit Phosphatpufferlösung,
die 3 x 10 M MUßGal enthält, so verdünnt, daß es 10²/ml Mikrobenzellen enthält.
Jeweils 5,0 ml der Verdünnung werden in Teströhrchen mit 20 µl Toluol gegossen und
die Röhrchen werden 1 Stunde bei 40°C stehengelassen. Hierauf bestimmt man die Menge
an freigesetztem 4-MU gemäß Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, wobei
auf der Abszisse die Anzahl der nach der herkömmlichen Plattenzählmethode bestimmten
Mikroorganismen und auf der Ordinate die Menge an freigesetztem 4-M.U(x 10-7 M)
aufgetragen sind. Aus Fig. 1 ist die lineare Beziehung zwischen der Anzahl von Mikroorganismen
und der Menge an freigesetztem 4-MU ersichtlich.
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Daneben werden Urinproben auf übliche Weise von f?:nf Patienten mit
Harninfektion gesammelt. Jeweils 4,5 ml des Urins werden zusammen mit 4,5 ml NI-Medium
in Teströhrchen gegossen,
wobei dasselbe Medium, wie in dem vorangehenden
Experiment vorwendet wird, das jedoch vorher zweimal konzentriert worden ist. Die
Röhrchen werden dann 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend
versetzt man mit 20 iil Toluol und 1,0 ml Phosphatpufferlösung, die 5 x 10 4M MUBGal
enthält, und inkubiert eine weitere Stunde bei 400C.
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Anschließend wird die Menge an freigesetztem 4-MU in der Lösung bestimmt
und die Anzahl von Colibakterien wird anhand der Beziehung von Fig. 1 ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V genannt, wobei die Anzahl an Colibakterien in dem
Urin, die nach der herkömmlichen Plattenzählmethode ermittelt wurde, als Kontrollwert
angegeben ist.
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Tabelle V Anzahl von Colibakterien in Urin Urinprobe Erfindungsgemäßes
Plattenzählmethode Verfahren (pro 1 ml) (pro 1 ml) A 4,6 x 10 4,8 x 105 B 2,0 x
10 1,8 x 107 C 1,0 x 106 2,0 x 106 D über 4,8 x 107 E 3,5 x 106 3,0 x 106 B e i
s p i e 1 5 Escherichia coli ATCC 10798 (-12) wird 20 Stunden bei 370C unter Schütteln
in Bouillon-Medium gezüchtet, das 0,1 % Natriumdesoxycholat enthält. Die Kulturbrühe
wird stufenweise mit sterilem Wasser zu Lösungen verdünnt, die 10, 10² 103 bzw.
104/ml MikrobenzeJlen enthalten. Jeweils 1 ml der Verdünnungen wird zusammen mit
9,0 ml Bouillon-Medium, das 10 M IPTG enthält, in TeströhSchen gegossen, die man
hierauf
1 bis 6 Stunden bei 370C unter Schütteln inkubiert.
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Jeweils 2,0 ml des Kulturmediums wird zusammen mit 20 µl Toluol und
2,0 ml Phosphatpufferlösung, die 3 x 10 M MUBGal enthält, in ein anderes Teströhrchen
überführt. Die Röhrchen werden dann 60 Minuten bei 37 0C stehengelassen, worauf
man die Menge an freigesetztem 4-MU gemäß Beispiel 2 mißt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle VI genannt, wobei die Anzahl von Zellen nach der herkömmlichen Plattenzählmethode
bestimmt wird.
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Tabelle VI Beziehung zwischen der Anzahl von Mikrobenzellen /10 ml
und der Kultivierungszeit Größe des Kultivierungszeit Inoculats 1 2 3 4 5 (Zahl/10
ml) Zahl 4-MU Zahl 4-MU Zahl 4-MU Zahl 4-MU Zahl 4-MU 0 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -1,0 4
- 3,2 - 260 - 2,1x10³ - 1,6x104 1,3x107 10 40 - 320 - 2,7x10³ - 2,3x104 1,5x107
1,6x105 1,5x106 10² 400 - 3,2x10³ - 2,6x104 2,1x10-7 2,2x105 1,4x106 1,6x107 1,4x105
10³ 4x10³ - 3,2x104 2,5x10-7 2,6x105 1,7x10-6 104 4x104 2,6x10-7 3,2x105 1,8x10-6
Aus
Tabelle VI ist die Beziehung zwischen der Anzahl von Mikrobenzellen und der Kultivierungszeit
für jedes Kultur-4 medium, das 10 bis 10 Mikrobenzellen enthält, ersichtlich.
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Auf Basis dieser Beziehung Kann eine kleine Anzahl von Mikrobenzellen
von E.coli bestimmt werden.
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Beispiel 6 Ein Herzinfusions (HI)-Medium, das 10 M IPTG, PTG oder
1,0 t Lactose, das ein Induktor für B-Galactosidase ist, wird hergestellt. Jeweils
10 m dieses Mediums werden mit 100 Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 10798
(K-12) beimpft und 5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Anzahl von
Mikrobenzellen in dem erhaltenen Kulturmedium beträgt jeweils 1,6 x 106/ml.
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Jeweils 2 ml des Mediums werden zusammen mit 2,0 ml Phosphatpufferlösung,
die 3 x 10 4M MUIsGal enthält, in Teströhrchen überführt, die man hierauf 1 Stunde
bei 400C stehen läßt. Die Menge an freigesetztem 4-MU wird gemäß Beispiel 2 gemessen.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle VII genannt.
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Tabelle VII Effekt des Induktorzusatzes Induktor 4-MU-Menge (M) kein
1,5 x 10 6 IPTG 1,5 x 10 PTG 1,5 x Lactose 8,7 x 10 Zerstört man die Mikrobenzellen
des Kulturmediums, das 10 3 IPTG enthält, indem man sie 1 Stunde bei 37 0C mit 5
ßl/ml Äthylacetat kontaktiert oder sie 10 Minuten Ultraschallwellen aussetzt (10
kHz), so nimmt die Menge an freigesetzten
4-MU auf etwa das 10-fache
des Kontrollwerts zu, wie aus Tabelle VIII ersichtlich ist.
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Tabelle VIII Effekt des Zerstörens der Mikrobenzellen Behandlung
4-MU-Menge (M) Keine (Kontrolle) 1,5 x 10-5 Äthylacetat 1,5 x 10 Ultraschall 1,5
x 10-4 Beispiel 7 10 ml HI-Medium, das 10 M IPTG, 0,1 % Natriumdesoxycholat und
10 3M Umbelliferyl-ß-D-galactosid enthält, werden in 5 Teströhrchen eingefüllt und
mit je 0,01 ml Wasser aus dem Fluß Tama versetzt. Hierauf werden die Röhrchen 6
Stunden bei 37 0C unter Schütteln inkubiert.
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Auf dieselbe Weise werden 0,1 ml, 1,0 ml bzw. 10 ml Flußwasser anderen
fünf Röhrchen zugesetzt und 6 Stunden bei 37 0C inkubiert.
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Nach dem Abzentrifugieren unlöslicher Rückstände mißt man die Fluoreszenz
der Lösung und bestimmt den MPN-Wert auf Basis der Zahl von Teströhrchen mit Fluoreszenz
unter Verwendung von MPN-Tabellen. Daneben wird der MPN-Wert des Flußwassers nach
der herkömmlichem MPN-Methode bestimmt.
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Zum Vergleich wid III-Medium, das nur 0,1 % Natriumdesoxycholat enthält,
in fünf Fermentationsröhrchen eingefüllt und mit Flußwasser versetzt. Hierauf inkubiert
man 48 Stunden bei 37 0C. Die Zahl der Röhrchen, die eine Gasentwicklung zeigen,
wird
auf übliche Weise bestimmt. Hierauf bestimmt man den MPN-Wert auf Basis der Zahl
von Röhrchen unter Verwendung von MPN-Tabellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII
genannt.
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Tabelle VIII MPN-Wert von Flußwasser Zahl der positiven Röhrchen
Probengröße (ml) Fluoreszenz (6 Std.) Gasentwicklung (6 Std.) (48 Std.) 10 * 5 5
1,0 3 3 0,1 0 0 0,01 0 0 MPN/100 ml 79 79 *) Es wird doppelt konzentriertes HI-Medium
verwendet.
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Beispiel 8 100 g handelsübliche Croquetten werden über Nacht bei
Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 100 ml Phosphatpufferlösung (0,1 M; pH
7,0) vermischt. Das Gemisch wird 1 Minute bei 20 000 U/min homogenisiert und dann
mit derselben Pufferlösung zu Dezimalverdünnungen von 10 1, 10 2 und 10 3 des Homogenats
verdünnt.
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Je 1 ml jeder Verdünnung wird zusammen mit 9,0 ml HI-Medium, das 0,1
% Natriumdesoxycholat enthält, in 5 Teströhrchen überführt, die dann unter Schütteln
bei 44,50C inkubiert werden.
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Jc 2 ml des inkui>ierten Mediums, 20 Al Toluol und 2,0 ml Phosphatpufierlösung,
die 3x10-3M MUP enthält, werden in andere Röhrchen eingefüllt und dann 1 Stunde
bei 37°C stehengelassen. Nach dem Abtrennen unlöslicher Rückstände wird die Zahl
der Röhrchen mit Fluoreszenz bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sowie die nach
der herkömmlichen MPN-Methode zum Nachweis von Colibakterien erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle IX genannt.
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Tabelle IX MPN von Colibakterien in Croquetten Zahl der positiven
Röhrchen Verdünnung Fluoreszenz Gasentwicklung (10 (10 Std.) (48 Std.
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1,0 5 5 10-1 2 2 -2 0 0 10-3 3 0 0 MPN/100 g 49 49 Beispiel 9 10
g Erde aus einem Obstgarten werden mit 90 ml sterilem Wasser vermischt und 1 Minute
homogenisiert. Hierauf stellt man durch Verdünnen mit sterilem Wasser Dezimalverdünnungen
von 10-1 und 10-2 des Homogenat her. Jeweils 1,0 ml jeder Verdünnung weitdeii in
drei Röhrchen überführt, die 5,0 ml YM-Medium enthalten, das aus 0,05 % Hefeextrakt,
0,05 % Malzextrakt, 100 y/ml Chloramphenicol, 10-3M MUßGal und 10 M MUP besteht
und einen pH von 6,0 hat. Hierauf wird jedes Röhrchen 12 Stunden bei 270C unter
Schütteln inkubiert.
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Die Zahl der Röhrchen mit Fluoreszenz wird gemäß Beispiel 2 bestimmt
und der MPN-Wert wird auf Basis dieser Zahl unter Verwendung von MPN-Tabellen zu
1500/10 g Erde ermittelt.
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Parallel zu diesem Experiment wird die Anzahl von Mikroorganismen
nach der herkömmlichen Plattenzählmethode bestimmt.
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Hierzu vermischt man jeweils 1,0 ml der Verdünnung des Homoyenats
mit 9 ml YM-Medium, das aus 0,3 % Hefnextrakt, 0,3 % Malzextrakt, 0,5 % Pepton,
100 y/ml Chloramp}lenicol und 1,5 % Agar besteht und einen pH von 6,5 hat. Anschließend
gießt man das Gemisch in eine Petrischale und inkubiert bei 27°C. Nach 48 stündiger
Inkubation wird die Zahl der auf der Platte gewachsenen Kolonien, die hauptsächlich
aus Hefen und Fungi bestehen, gezählt. Die bestimmte Anzahl von Mikroorganismen
beträgt 1300/10 g Erde.
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L e e r s e i t e