CN102297931B

CN102297931B - 基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法

Info

Publication number: CN102297931B
Application number: CN2011101315683A
Authority: CN
Inventors: 徐志南; 郑强; 黄磊; 蔡谨
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2031-05-20
Also published as: CN102297931A

Abstract

本发明公开的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，采用改造的商业化彩色热喷墨式打印机作为抗生素滴加工具，取代了利用滴管或移液枪手工滴加抗生素的方式；另一方面，本发明采用软件编辑的特定图形，取代了管碟法中的小钢管，并对打印抗生素的类型、打印用量、打印位置等因素进行精确控制，从而实现与管碟法一致的基于扩散抑菌原理的抗生素效价测定。采用本发明方法无需在琼脂玻璃双碟上叠加小钢管，且避免了繁琐的手工滴加抗生素的过程，减少了人为操作中的误差，简便、快速、精度高，重现性好。

Description

基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法

技术领域

本发明涉及抗生素效价的测定方法，尤其是基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，属于药物检测技术领域。

背景技术

抗生素效价是衡量抗生素质量或生物效能的指标，精确地对抗生素效价进行测定在医药、免疫、临床诊断等领域具有重要的指导意义。抗生素效价测定方法最常用的是管碟法。管碟法抗生素效价测量是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点，因此被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

抗生素管碟法效价测定的原理是：抗生素在菌层培养基内向四周扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于最低抑制浓度（MIC）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

管碟法抗生素效价测量实验包括配制试验所需的样品及药品、加注培养基、放置小钢管、滴加抗生素溶液、双碟中菌株的培养、抑菌圈测量六个步骤。具体操作方法为：先在平碟内加入20ml底层培养基，待其凝固后在其上均匀地覆盖5ml含一定浓度的试验菌的菌层培养基。凝固后在其上放置小钢管（二剂量法每碟等距放置四个），然后将已知效价的高低剂量的抗生素标准品与未知效价高低剂量的抗生素待测样，分别等量地滴加到相应的小钢管内，培养一定时间后，在小钢管周围一定距离内的细菌生长受到抑制，产生透明的抑菌圈，其直径大小与抗生素浓度的对数成线性关系。分别测量标准品与待测样高低剂量所产生的抑菌圈直径/面积的大小，可利用上述关系计算出待测样的效价。

管碟法抗生素效价测定能够反映抗生素杀菌或抑菌的真实活性，与临床应用的要求相符，具有很高的应用价值。然而该方法需将小钢管小心地放置在涂有细菌的培养基表面，并通过手工操作的方式将抗生素溶液滴加到小钢管内，并需要进行多批次的大量重复实验，不仅操作繁琐，费时费力，更重要的是试验中人为的因素不可避免地容易造成试验批次间的偏差，不同的人员操作可能会得到不一致的检测结果，测定的误差较大，因而试验的可靠性与重现性也相对较差。管碟法抗生素效价测定方法中存在的一些不利的人为因素的影响，具体体现为：（1）由于手工操作的不稳定性，同等大小的小钢管内加入的抗生素溶液的量可能不同，抗生素扩散的浓度就会产生差异，最终形成的抑菌圈大小也会发生变化，偏离平行与碟间差异加大，影响试验的准确性；（2）手工放置小钢管时，可能存在着力不均的缺陷，从而导致抗生素在琼脂中不均匀扩散，影响抑菌圈的圆度。（3）利用滴管或移液器滴加抗生素的过程中，容易出现液滴破裂、溅出小钢管的情况，从而导致试验失败。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种简便快速、经济实用、稳定可靠、精确性与可重复性好的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法。

本发明的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，包括以下步骤：

1) 彩色喷墨打印机的改造：拆除打印机主体的基座、卷纸装置及废墨清除装置；拆除墨盒的外盖、墨盒内的吸墨海绵以及墨盒底部的过滤网，彻底清洗干净后用紫外灯灭菌；

2) 编辑用于控制抗生素打印的特定图形：按照管碟法中二剂量方式，用PowerPoint软件绘制4个直径为6mm的实心圆点，将其中的两个圆点的颜色设置为RGB值为255,255,255的黑色，将另外两个圆点的颜色设置为RGB值为255,0,255的洋红色，或者RGB值为255,255,0的黄色，或者RGB值为0,255,255的青色；将两个黑色圆点的灰度分别设置为0%与50%，两个彩色圆点的灰度分别设置为0%与50%；4个圆点按顺时针方向依次以灰度0%的黑色圆点---灰度0%的彩色圆点---灰度50%的黑色圆点---灰度50%的彩色圆点的顺序排列；

或者按照管碟法中三剂量方式，用PowerPoint软件绘制6个直径为6mm的实心圆点，将其中的三个圆点的颜色设置为RGB值为255,255,255的黑色，将另外三个圆点的颜色设置为RGB值为255,0,255的洋红色，或者RGB值为255,255,0的黄色，或者RGB值为0,255,255的青色；三个黑色圆点的灰度分别设置为0%、50%及75%，三个彩色圆点的灰度分别设置为0%、50%及75%；6个圆点按顺时针方向依次以灰度0%的黑色圆点---灰度0%的彩色圆点-灰度50%的黑色圆点---灰度50%的彩色圆点---灰度75%的黑色圆点---灰度75%的彩色圆点的顺序排列；

3) 琼脂玻璃双碟的准备：配制底层培养基：蛋白胨0.5%，牛肉浸出粉0.3%，磷酸氢二钾0.3%，琼脂2%，pH7.8-8.0，115℃灭菌30min；配制顶层培养基：蛋白胨0.5%，牛肉浸出粉0.3%，磷酸氢二钾0.3%，琼脂0.8%，pH7.8-8.0，115℃灭菌30min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，先注入20ml灭菌后的底层培养基，使其冷却凝固；再将浓度为10⁸cfu/ml的实验菌悬液与灭菌后冷却至50℃-60℃的顶层培养基按体积比1：100充分混匀后，取出5ml均匀地覆盖在凝固的底层培养基上，形成一层含有实验菌的菌层培养基，将得到的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱，备用；

4) 抗生素标准品与待测抗生素的准备与打印：用磷酸盐缓冲液分别充分溶解抗生素标准品与待测抗生素粉末，控制抗生素标准品与待测抗生素的浓度在1mg/ml至10mg/ml之间，取出100 μl配置好的抗生素标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测抗生素滴加到与步骤2)中所编辑的彩色圆点颜色相一致的洋红、黄色或青色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3）的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2）所编辑的图形。

按照式 (1) 分别计算抗生素标准品与待测抗生素的打印体积V；按照式 (2) 分别计算抗生素标准品与待测抗生素的打印量M。

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

式中S 为所编辑的圆点的面积，G为圆点的灰度值，R为所使用的打印机的分辨率，V₀为打印机最小喷墨液滴的体积，C₀为滴加到墨盒中抗生素标准品或待测抗生素的初始浓度；

5) 抗生素效价的计算：将打印了抗生素标准品与待测抗生素的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈。利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测抗生素的效价。

上述的彩色喷墨打印机是市售的商业化的彩色喷墨式打印机。

本发明中，所说的抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素或氨基糖苷类抗生素。

本发明中，所说的实验菌为枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

采用本发明的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，无需在琼脂玻璃双碟上叠加小钢管，且避免了繁琐的手工滴加抗生素的过程，减少了人为操作中的误差，本发明方法简便快速、经济实用、稳定可靠、精确性与可重复性好。

附图说明

图1为编辑的用于控制抗生素打印的特定图形。

具体实施方式

实施例1

1) 选择分辨率为1200×4800d.p.i.的佳能PIXMA ip1880热喷式彩色喷墨打印机作为滴加抗生素的工具，首先对打印机主体进行改造：将打印机主体的外壳揭开，拆除位于墨盒下方的卷纸装置及废墨清除装置，并将其下方的塑料基座锯掉，空出的位置即可放置涂有菌层的琼脂玻璃双碟。之后改装墨盒：将其外盖撬开，用镊子将吸满墨水的海绵夹出来，用清水将墨盒底部的墨汁彻底冲洗干净，直到没有任何残留为止。最后将位于喷头上方的过滤网取出，并用清水反复冲洗干净，装载抗生素前需用70%乙醇清洗3-5次，风干后放置在紫外灯下灭菌1小时左右；

2) 本例按照管碟法中二剂量方式，用PowerPoint软件绘制4个直径与常规抗生素效价测定方法中使用的小钢管内径一致，即6mm大小的实心圆点，将其中的两个圆点的颜色设置为RGB值为255,255,255的黑色，将另外两个圆点的颜色设置为RGB值为255,0,255的洋红色；将两个黑色圆点的灰度分别设置为0%与50%，两个彩色圆点的灰度分别设置为0%与50%；4个圆点按顺时针方向依次以灰度0%的黑色圆点1---灰度0%的彩色圆点2---灰度50%的黑色圆点3---灰度50%的彩色圆点4的顺序排列（如图1所示）；

3) 琼脂玻璃双碟的准备：配制底层培养基：蛋白胨0.5%，牛肉浸出粉0.3%，磷酸氢二钾0.3%，琼脂2%，pH7.8-8.0，115℃灭菌30min；配制顶层培养基：蛋白胨0.5%，牛肉浸出粉0.3%，磷酸氢二钾0.3%，琼脂0.8%，pH7.8-8.0，115℃灭菌30min；将内径为90mm的玻璃双碟放置在水平台上，先注入20ml灭菌后的底层培养基，使其冷却凝固；再将浓度为10⁸cfu/ml的枯草芽孢杆菌悬液与灭菌后冷却至50℃的顶层培养基按体积比1：100充分混匀后，取出5ml均匀地覆盖在凝固的底层培养基上，形成一层含有枯草芽孢杆菌的菌层培养基，将得到的含有枯草芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱，备用；

4) 阿米卡星标准品与待测阿米卡星的准备与打印：用磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.8%，pH6.0, 121℃灭菌30min）分别充分溶解阿米卡星标准品与待测阿米卡星粉末，配制浓度为2mg/ml的阿米卡星标准品与待测阿米卡星，取出100 μl配置好的阿米卡星标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测阿米卡星滴加洋红色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3) 含有枯草芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2) 所编辑的图形；

按照式 (1) 分别计算阿米卡星标准品与待测阿米卡星的打印体积V；按照式 (2) 分别计算阿米卡星标准品与待测阿米卡星的打印量M；

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

式中S 为所编辑的圆点的面积，G为圆点的灰度值，R为所使用的打印机的分辨率，V₀为打印机最小喷墨液滴的体积，C₀为滴加到墨盒中阿米卡星标准品或待测阿米卡星的初始浓度；

根据公式可计算出打印在灰度设置为0%的黑色圆点1上的阿米卡星标准品的体积V₁为0.5μl，打印的量M₁为1μg；打印在灰度设置为0%的洋红色圆点2上的待测阿米卡星的体积V₂为0.5μl，打印的量M₂为1μg；打印在灰度设置为50%的黑色圆点3上的阿米卡星标准品的体积V₃则为0.25μl，打印的量M₃为0.5μg，打印在灰度设置为50%的洋红色圆点4上的待测阿米卡星的体积V₄则为0.25μl，打印的量M₄为0.5μg；

5) 待测阿米卡星效价的计算：将打印了阿米卡星标准品与待测阿米卡星的含有枯草芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈。利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测阿米卡星的效价。

本例中选择阿米卡星标准品作为待测样，因此待测阿米卡星效价的理论值应为100%。利用本发明的方法实际测得的效价为101.7%，而利用传统管碟法测定的阿米卡星标准品效价则为103.1%。

实施例2

1) 步骤1同实施例1中的步骤1；

2) 步骤2同实施例1中的步骤2；

3) 除使用的实验菌改为短小芽孢杆菌外，其余步骤同实施例1中的步骤3；

4) 庆大霉素标准品与待测庆大霉素的准备与打印：用磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.8%，pH6.0, 115℃灭菌30min）分别充分溶解庆大霉素标准品与待测庆大霉素粉末，配制浓度为4mg/ml的庆大霉素标准品与待测庆大霉素，取出100 μl配置好的庆大霉素标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测庆大霉素滴加到洋红色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3) 含有短小芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2) 所编辑的图形；

按照式 (1) 分别计算庆大霉素标准品与待测庆大霉素的打印体积V；按照式 (2) 分别计算庆大霉素标准品与待测庆大霉素的打印量M；

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

式中S 为所编辑的圆点的面积，G为圆点的灰度值，R为所使用的打印机的分辨率，V₀为打印机最小喷墨液滴的体积，C₀为滴加到墨盒中庆大霉素标准品或待测庆大霉素的初始浓度；

根据公式可计算出打印在灰度设置为0%的黑色圆点1上的庆大霉素标准品的体积V₁为0.5μl，打印的量M₁为2μg；打印在灰度设置为0%的洋红色圆点2上的待测庆大霉素的体积V₂为0.5μl，打印的量M₂为2μg；打印在灰度设置为50%的黑色圆点3上的庆大霉素标准品的体积V₃则为0.25μl，打印的量M₃为1μg，打印在灰度设置为50%的洋红色圆点4上的待测庆大霉素的体积V₄则为0.25μl，打印的量M₄为1μg；

5) 待测庆大霉素效价的计算：将打印了庆大霉素标准品与待测庆大霉素的含有短小芽孢杆菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈。利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测庆大霉素的效价。

本例中选择庆大霉素标准品作为待测样，因此待测庆大霉素效价的理论值应为100%。利用本发明的方法实际测得的效价为97.6%，而利用传统管碟法测定的庆大霉素标准品效价则为104.1%。

实施例3

1) 步骤1同实施例1中的步骤1；

2) 步骤2同实施例1中的步骤2；

3) 除使用的实验菌改为金黄色葡萄球菌外，其余步骤同实施例1中的步骤3；

4) 链霉素标准品与待测链霉素的准备与打印：用磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.8%，pH6.0, 115℃灭菌30min）分别充分溶解链霉素标准品与待测链霉素粉末，配制浓度为5mg/ml链霉素标准品与待测链霉素，取出100 μl配置好的链霉素标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测链霉素滴加到洋红色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3) 含有金黄色葡萄球菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2) 所编辑的图形，

按照式 (1) 分别计算链霉素标准品与待测链霉素的打印体积V；按照式 (2) 分别计算链霉素标准品与待测链霉素的打印量M；

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

式中S 为所编辑的圆点的面积，G为圆点的灰度值，R为所使用的打印机的分辨率，V₀为打印机最小喷墨液滴的体积，C₀为滴加到墨盒中链霉素标准品或待测链霉素的初始浓度；

根据公式可计算出打印在灰度设置为0%的黑色圆点1上的链霉素标准品的体积V₁为0.5μl，打印的量M₁为2.5μg；打印在灰度设置为0%的洋红色圆点2上的待测链霉素的体积V₂为0.5μl，打印的量M₂为2.5μg；打印在灰度设置为50%的黑色圆点3上的链霉素标准品的体积V₃则为0.25μl，打印的量M₃为1.25μg，打印在灰度设置为50%的洋红色圆点4上的待测链霉素的体积V₄则为0.25μl，打印的量M₄为1.25μg；

5) 待测链霉素效价的计算：将打印了链霉素标准品与待测链霉素的含有金黄色葡萄球菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈。利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测链霉素的效价。

本例中选择链霉素标准品作为待测样，因此待测链霉素效价的理论值应为100%。利用本发明的方法实际测得的效价为103.6%，而利用传统管碟法测定的链霉素标准品效价则为104.9%。

实施例4

1) 步骤1同实施例1中的步骤1；

2) 步骤2同实施例1中的步骤2；

3) 除使用的实验菌改为大肠杆菌外，其余步骤同实施例1中的步骤3；

4) 氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素的准备与打印：用磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.8%，pH6.0, 115℃灭菌30min）分别充分溶解氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素粉末，配制浓度为5mg/ml氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素，取出100 μl配置好的氨苄霉素标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测氨苄霉素滴加到洋红色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3) 含有大肠杆菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2) 所编辑的图形，

按照式 (1) 分别计算氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素的打印体积V；按照式 (2) 分别计算氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素的打印量M；

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

式中S 为所编辑的圆点的面积，G为圆点的灰度值，R为所使用的打印机的分辨率，V₀为打印机最小喷墨液滴的体积，C₀为滴加到墨盒中氨苄霉素标准品或待测氨苄霉素的初始浓度；

根据公式可计算出打印在灰度设置为0%的黑色圆点1上的氨苄霉素标准品的体积V₁为0.5μl，打印的量M₁为2.5μg；打印在灰度设置为0%的洋红色圆点2上的待测氨苄霉素的体积V₂为0.5μl，打印的量M₂为2.5μg；打印在灰度设置为50%的黑色圆点3上的氨苄霉素标准品的体积V₃则为0.25μl，打印的量M₃为1.25μg，打印在灰度设置为50%的洋红色圆点4上的待测氨苄霉素的体积V₄则为0.25μl，打印的量M₄为1.25μg；

5) 待测氨苄霉素效价的计算：将打印了氨苄霉素标准品与待测氨苄霉素的含有大肠杆菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈。利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测氨苄霉素的效价。

本例中选择氨苄霉素标准品作为待测样，因此待测氨苄霉素效价的理论值应为100%。利用本发明的方法实际测得的效价为105.4%，而利用传统管碟法测定的链霉素标准品效价则为107.7%。

实施例1至4的数据显示：与传统管碟法相比，基于喷墨打印原理的效价测定结果更接近100%的理论值，由此证明本发明方法不仅操作更为便捷，效价测定的精确性也更好。

Claims

1.基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，其特征是包括以下步骤：

4) 抗生素标准品与待测抗生素的准备与打印：用磷酸盐缓冲液分别充分溶解抗生素标准品与待测抗生素粉末，控制抗生素标准品与待测抗生素的浓度在1mg/ml至10mg/ml之间，取出100 μl配置好的抗生素标准品滴加到黑色墨盒，取出100 μl配置好的待测抗生素滴加到与步骤2)中所编辑的彩色圆点颜色相一致的洋红、黄色或青色墨盒内，作为打印用的“墨”；将步骤3）的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在墨盒喷头下方1mm处，作为抗生素打印用的 “纸”，打印出按照步骤2）所编辑的图形，所说的抗生素为青霉素类抗生素或氨基糖苷类抗生素；

按照式 (1) 分别计算抗生素标准品与待测抗生素的打印体积V；按照式 (2) 分别计算抗生素标准品与待测抗生素的打印量M；

V = S *（1－G）* R * V₀; ---------- (1)

M = V* C₀; ----------------------------- (2)

5) 抗生素效价的计算：将打印了抗生素标准品与待测抗生素的含有实验菌的琼脂玻璃双碟放置在37℃恒温培养箱培养16h，得到与编辑图形相对应的圆形抑菌圈；利用抑菌圈自动测量分析仪分别测量出各个抑菌圈直径大小，由自动测量分析仪附带的分析软件测算出待测抗生素的效价。

2.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，其特征是所说的彩色喷墨打印机为商业化的彩色喷墨式打印机。

3.根据权利要求1所述的基于喷墨打印原理的抗生素效价测定方法，其特征是所说的实验菌为枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。