TWI570241B - 微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置 - Google Patents

微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置 Download PDF

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Description

微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置
本發明係關於一種製造方法、檢測方法、裝置以及套組，特別關於一種用於微生物檢測之微生物檢測裝置的製造方法、檢測方法、裝置以及套組。
微生物檢測在食品安全檢驗以及醫療處所的感染控制的重要性與日俱增。其起因於當食品於加工過程中因不當或是醫療人員於手術前未充分進行人員與器械消毒，均容易發生微生物污染，常見的食品加工所導致或飲用水中常發生的微生物污染例如大腸桿菌O157:H7 型（E. coli O157:H7）污染，而醫療處所常見的院內感染例如抗藥性金黃色葡萄球菌感染（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA），前者會導致受感染者發生出血性腹瀉，後者將導致患者延長住院時間，甚或導致患者死亡。
而在研究致病微生物對食品、飲用水的污染問題或是醫療處所感染控制時，對其數量與活性的檢測是相當重要的。常見的微生物計數方法有比濁法、血球板計數法、平板菌落計數法等。
然而上述方法各有其缺點，其中比濁法和血球計數法均能較快的計算出微生物數量，但不能判斷微生物的活性，易受測試溶液成分與待測微生物代謝物質影響而發生偽陽性結果。平板菌落計數法則須將待測樣本進行序列稀釋後塗布於培養基上進行培養，雖可藉由檢測結果回推算出活體之微生物數量，但其操作複雜、重複性差、耗時長，不適於大批量試驗。並且，上述多種分析方法須仰賴高端的檢測設備，因此必須耗費時間及人力，於實驗室的環境下方可進行檢測。
隨著民眾的健康意識及對於食品安全的重視逐漸提高，居家自我檢測的概念已漸漸盛行。所謂居家自我檢測係指民眾可在家方便隨時檢測，通常可利用檢測試劑的顏色轉變，在簡便儀器或不需儀器肉眼判讀的條件下，可立即觀察有無微生物污染或感染之徵兆。此外當色差變大時，可再到適當處所進一步詳細檢查。因此，居家自我檢測具有方便即時及節省支出的優勢。目前應用於檢測飲水或食品安全的居家自我檢測方法主要是應用比色法或是光度計法的原理，並利用檢測試紙添加檢測試劑以進行檢測。使用者可根據試紙的顏色與顏色表比對，即可判讀樣本中所含微生物含量。這種簡易的量測方法，為民眾帶來了極大的便利性及安全性。惟現有之檢測試紙多數皆經過多重的加工，在製造的過程中所添加的物質（例如含氯之漂白水或其他危險化學物質）則有可能使檢測試紙的安全性產生疑慮。
因此，如何提供一種檢測裝置製造方法、檢測方法、套組及裝置，其具有試紙相當之簡易操作性，並同時具有檢測速度的控制性及實際應用時安全性，已成為課題之一。
有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組以及裝置，其具有試紙的簡易操作性，並同時具有檢測速度的控制性及實際應用時安全性。
為達上述目的，依據本發明之一種微生物檢測裝置之製造方法，包括以下步驟：於基材上定義採樣區以及反應區；設置纖維材料於基材之反應區，其中反應區與纖維材料接觸之表面含有大量之羥基；添加反應試劑至纖維材料；以及以酸性溶液處理反應區之羥基以及纖維材料。
在一實施例中，反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）與硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）所組成之群組其中之一。
在一實施例中，纖維材料為α-纖維素顆粒。
在一實施例中，酸性溶液係經由滲透纖維材料而後接觸到反應區之該表面以處理該些羥基。
在一實施例中，基材為纖維基材。
在一實施例中，反應區具有容置空間，容置空間形成於基材之表面，且纖維材料係設置於容置空間中。
為達上述目的，依據本發明之一種微生物檢測方法，包括以下步驟：準備檢測裝置，檢測裝置包含有第一基材，第一基材包含有採樣區以及反應區，反應區具有纖維材料及反應試劑，其中，反應區與纖維材料接觸之部分表面所含有之羥基與纖維材料係經酸性溶液處理；以待測樣本接觸反應區並與反應試劑反應。
在一實施例中，纖維材料為α-纖維素顆粒。
在一實施例中，以一待測樣本接觸反應區並與反應試劑反應之步驟，係包括：以一待測樣本接觸採樣區，且待測樣本自採樣區移動至反應區與反應試劑反應。
在一實施例中，於以待測樣本接觸採樣區且使待測樣本自採樣區移動至反應區之步驟後，更包括以下步驟：移除纖維材料；以及添加一鹼性溶液於反應區中。
在一實施例中，鹼性溶液係藉由第二基材以一傳送方向傳送至於反應區，且該傳送方向係實質上垂直於待測樣本自採樣區移動至反應區之移動方向。
在一實施例中，第一基材之親水性高於第二基材之親水性。
在一實施例中，第一基材進一步具有傳送區，且該傳送區係分別連接採樣區及反應區，且反應區係設置於該傳送區之一截面上。
在一實施例中，反應區進一步具有第一反應部與第二反應部，且第一反應部與第二反應部係分別設置於傳送區之不同截面上。
在一實施例中，反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）與硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）所組成之群組其中之一。
為達上述目的，依據本發明之一種微生物檢測套組，包括：檢測裝置以及酸性溶液。檢測裝置包含有基材，基材包含有採樣區以及反應區，反應區具有纖維材料及反應試劑。反應試劑包含有反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）與硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）所組成之群組其中之一。酸性溶液用以處理反應區與纖維材料接觸之部分表面所含有之羥基與纖維材料。
在一實施例中，纖維材料為α-纖維素顆粒。
在一實施例中，纖維材料係先經酸性溶液處理後再置入反應區。
為達上述目的，依據本發明之一種檢測裝置，包含有一基材，該基材包含有一採樣區以及一反應區，該反應區具有纖維材料以及反應試劑。反應試劑包含有反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）與硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）所組成之群組其中之一。並且，反應區與纖維材料接觸之部分表面所含有之羥基與纖維材料係經酸性溶液處理。
承上所述，本發明之微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置，係製出並應用包含有於反應區中設置有纖維材料以及反應試劑的微生物檢測裝置，以有效檢測活體之微生物，例如是飲品或食物中備受關注的大腸桿菌生菌數或是葡萄球菌生菌數，或者是醫療處所為控制感染所進行之術前細菌檢測或傳染物篩檢。並且，所使用的微生物檢測裝置更具有價格便宜、加工方便等優勢。而反應區中設置有纖維材料可降低待測樣本之傳輸速率並將增加反應面積，使反應速率增加並有較長的時間進行反應，可增強反應訊號。而添加酸性溶液之後會使反應區中的纖維材料呈現糊狀並保持潮濕狀態，如此會使得待測樣本更易於反應區中進行反應，而使最終反應訊號更為明顯。相較之下，本發明的微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置，無需將待測樣本進行培養，即可迅速檢測出樣本中是否帶有一定量之活體微生物，因而具有操作簡便之優勢。除此之外，由於本發明之微生物檢測裝置之製造方法、微生物檢測方法、微生物檢測套組及裝置利用酸性溶液於進行檢測反應前來處理纖維材料，可藉此中和基材中原本會妨礙後續MTT檢測反應之羥基，因此能降低於檢測的偽陰性，增加檢測的敏感度。
以下將參照相關圖式，說明依本發明較佳實施例之一種檢測裝置，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
首先，請同時參考圖1A、圖1B、圖3。圖1A為本發明較佳實施例之一種微生物檢測裝置的製造方法的流程示意圖。圖1B為圖1A所示之微生物檢測裝置的製造方法所製得的微生物檢測裝置的示意圖。圖3為圖1B所示之微生物檢測裝置沿A-A線的剖面示意圖。
本較佳實施例所提供的微生物檢測裝置製造方法所製得之微生物檢測裝置1並不限定應用於特定種類的待測樣本，而係適用於食品安全檢測裝置以及生醫檢測。若以食品安全檢測來說，本較佳實施例所製得之微生物檢測裝置可應用於檢測食品中的大腸桿菌或金黃葡萄球菌等生菌數，以預防食物中毒。而於生醫檢測方面，本較佳實施例所製得之微生物檢測裝置微生物檢測裝置1則可適用於檢測患者之發炎反應是否為細菌感染所導致（例如：尿道感染、角膜感染、陰道發炎感染），或者是於外科手術（例如：開放性骨折創傷修復或關節鏡鏡檢手術）的術前細菌檢測，或是傳染性疾病篩檢（例如：肺結核）等。而本較佳實施例中所稱之「微生物」可為真核細胞、細菌、黴菌等。
本較佳實施例之微生物檢測裝置之製造方法包括以下步驟：步驟S11：於基材11上定義採樣區12以及反應區13。由於本實施例中的基材11可為纖維基材、玻璃、聚二甲基矽氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）。而纖維基材可為木質纖維基材、棉花或紙。其中，所稱之「木質纖維基材」意指植物的木質化纖維組織。木質化組織係為植物形成層向內部所發展的植物組織的統稱。較佳地，本實施例所使用之木質化組織係包括其內的纖維素、半纖維素、果膠質及／或木質素，且上述物質對於水分子有較佳的吸附力；因此，來自採樣區12的待測樣本可經由木質纖維基材內部的孔道，以毛細作用將待測樣本依序經傳送區14至反應區13運送。當然，本實施例並不限制待測樣本輸入微生物檢測裝置1的方式，例如亦可將待測樣本直接接觸反應區13並與反應試劑反應，從而減少檢測所需耗費的時間，並降低待測樣本於傳輸過程中的消耗量。
本較佳實施例中的微生物檢測裝置1的基材11若為木質纖維材料時，其來源可為木材或竹材，較佳可以選自木質化組織較為發達的木本植物，如灌木或喬木。是故，於實際應用及製造時，以木質化組織所製成的攪拌棒、木筷或牙籤。此外，當基材11為玻璃或是聚二甲基矽氧烷時，其於本步驟中則會一併加工製備出流道或微流道結構，以利後續檢測時藉由毛細作用來傳輸待測樣本。
此外，若本實施例之微生物檢測裝置1之基材11為木質纖維基材時，係指基材11係為至少部分由木質纖維基材組成的結構。於實際製造成形時，基材11較佳係整體皆以木質纖維基材組成；當然，本發明之概念亦涵蓋僅有基材11為供待測樣本流經的部分區域係以木質纖維基材組成，藉以形成如「流道」的概念。
在某些些實施態樣中，基材11上可進一步設置有傳送區14，且傳送區14係分別連接採樣區12及反應區13。於實施上，各區的形狀、大小原則上並未限制，因此可依檢測樣本或檢測標的來進行設計，實際應用的形狀包括但不限於圓柱、長方體、板狀等，此非本發明限制性者。
接著進行步驟S12：設置纖維材料於基材11之反應區13。所稱「纖維材料」可為天然纖維或合成纖維。較佳是包含纖維素且親水性佳之纖維材料，而本實施例的纖維材料則是以α-纖維素顆粒131為例說明。本實施例中的α-纖維素顆粒（particles）131，其粒徑大小不限制（由較大粒徑之顆粒到微米粒徑之粉末均可），且不只限於純α-纖維素顆粒，亦可包含內部部分參雜或表面塗佈α-纖維素之顆粒。由於反應區13與α-纖維素顆粒131接觸之表面132本身含有大量之羥基，其存在會干擾後續檢測樣本與反應試劑之反應；因此，須於後續步驟進行處理，以降低使用製得之微生物檢測裝置1進行檢測所得到的檢測結果的不穩定性。
請再參考圖3。在本較佳實施例中，反應區13可具有一容置空間，容置空間形成於基材11之表面111，且含有α-纖維素顆粒131係設置於容置空間之中。另外，於本實施例中，容置空間如圖3所示係為一V型凹槽的態樣。凹槽的形狀、大小並未特別限制，可視檢測需求而設置。而圖1B及圖3所示的凹槽的形狀僅為示意而非用以限制本發明。實際應時，容置空間的形狀可包含但不限於長方體、正方體、圓柱、半球體、V型或上述之外其餘之形狀組合。反應區13的位置亦可視不同檢測之需求而做彈性設置，本發明於此不限。
接著，進行步驟S13：添加反應試劑至纖維材料（α-纖維素顆粒131）。反應試劑包含至少兩種試劑所組成。其中第一種試劑為5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）或硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）其中之一。第二種試劑則為3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）或是2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）其中之一。而水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）包含但不限於WST-1（2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）、WST-3（2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）、WST-4（2-Benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium）、WST-5（2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy 4,4'-biphenylene)ditetrazolium）、WST-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）、WST-9（2-(4-Nitrophenyl)-5-phenyl-3-[4-(4-sulfophenylazo)-2-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, monosodium salt）、WST-10（2,5-Di-(4-nitrophenyl)-3-[4-(4-sulfophenylazo)-2-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, monosodium salt）、WST-11（2-(4-Nitrophenyl)-5-(2-sulfophenyl)-3-[4-(4-sulfophenylazo)-2-sulfophenyl]-2H-tetrazolium）；而於本實施例中，又以WST-1或WST-8為較佳的選擇。
最後，進行步驟S14：以酸性溶液處理反應區13之羥基以及纖維材料（α-纖維素顆粒131）。請再同時參考圖4，圖4為反應區13加入酸性溶液後呈現潮濕糊狀的α-纖維素顆粒131’的示意圖。本步驟S14中所使用的酸性溶液較佳為鹽酸（HCl）、硝酸（HNO 3）、氫溴酸（HBr）、氫碘酸（HI）、檸檬酸（citric acid）、乙酸（acetic acid）、或是磷酸（phosphoric acid，H 3PO 4）。如前所述，由於α-纖維素顆粒131所帶有的羥基（hydroxyl group）於偵測反應過程中會妨礙反應試劑之反應，例如干擾5-甲基吩嗪硫酸甲酯與3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽以及待測菌體中琥珀酸脫氫酶的反應，故本步驟S14中添加前述酸性溶液之目的，即在於藉由酸性溶液中的氫離子（H +）來中和α-纖維素顆粒131所帶有的羥基，抑制纖維素上之羥基對待測樣本與反應試劑反應的影響，以減低未與微生物反應時的反應；最終目的係來降低於檢測的偽陰性，藉此增加檢測的敏感度（sensitivity）。此外，添加酸性溶液之後，會使反應區13中含有α-纖維素顆粒131’呈現糊狀並保持潮濕狀態。相較於完全乾燥的狀態，反應區13中包含呈現濕潤糊狀的α-纖維素顆粒131’會使得待測樣本更易於反應區13中與反應試劑中的反應試劑（例如5-甲基吩嗪硫酸甲酯與3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽）進行反應，而使最終反應訊號更為明顯。
此外，本發明亦提供一種微生物檢測方法。請參考圖2，為本發明另一較佳實施例之微生物檢測方法的流程示意圖。本實施例所例示之微生物檢測方法為利用前述較佳實施例所製得之微生物檢測裝置1進行微生物檢測之檢測方法，包含以下步驟：首先，進行步驟S21：準備檢測裝置，檢測裝置如圖1B所示之微生物檢測裝置1，包含有基材11。基材11中包含有羥基，亦即構成基材11的材質其化學結構中包含有羥基（hydroxyl group）。基材11上設置有採樣區12以及反應區13，在某接些實施態樣中，基材11上可進一步設置有傳送區14，且傳送區14係分別連接採樣區12及反應區13。於實施上，各區的形狀、大小原則上並未限制，因此可依檢測樣本或檢測標的來進行設計，實際應用的形狀包括但不限於圓柱、長方體、板狀等，此非本發明限制性者。
反應區13具有α-纖維素顆粒131以及反應試劑，並且反應區13與α-纖維素顆粒131接觸之部分表面132所含有之羥基與α-纖維素顆粒131係經酸性溶液處理。所適用之反應試劑種類如前一較佳實施例所述，在此不再贅述。進一步而言，將前述之反應試劑固定（immobilized）於反應區13及/或α-纖維素顆粒131之手段包括但不限於以反應試劑的部分特定官能基與反應區13及/或α-纖維素顆粒131形成共價鍵的方式進行連結；而非固定之手段則可例如應用塗佈或其他類似（例如吸附）的方式以將化學檢測試劑設置於反應區13內及/或α-纖維素顆粒131。關於反應試劑吸附於反應區13及/或α-纖維素顆粒131之方法，可藉由將反應區13及/或α-纖維素顆粒131浸泡於對應之化學試劑溶液中以完成製備。
此外，本步驟S21中將酸性溶液添加於反應區13中含有α-纖維素顆粒131的時間點，可以在使用者欲進行微生物檢測前再行添加，以保持反應區13中的α-纖維素顆粒131’呈現潮濕狀態。或者，也可以由微生物檢測裝置1的製造商於製作過程中即將酸性溶液添加於反應區13中含有α-纖維素顆粒131，亦即在微生物檢測裝置1出廠前，反應區13中含有α-纖維素顆粒131所帶有的羥基已係經過酸性溶液的「前處理(pre-treating)」而被中和掉；而為了要同時保留反應區13中的α-纖維素顆粒131’的潮濕狀態，製造商可以於添加酸性溶液添加於反應區13後將微生物檢測裝置1以真空包裝方式進行保存及銷售。藉此，讓使用者可直接使用微生物檢測裝置1來檢測微生物，而無須於進行微生物檢測前再添加酸性溶液於反應區13，亦無礙於α-纖維素顆粒131’呈現潮濕狀態所提供之有利檢測反應之條件。
此外請再同時參考圖3，同前一實施例所述，由於α-纖維素顆粒131所帶有的羥基於偵測反應過程中會妨礙反應試劑與待測樣本間之化學反應，故本步驟S21中添加酸性溶液之目的，即在於降低於檢測的偽陰性，藉此增加檢測的敏感度，並且使得待測樣本更易於已為濕潤環境的反應區13中與反應試劑進行反應，而使最終反應訊號更為明顯。
再接著，進行步驟S22：以待測樣本（未圖示）接觸反應區13並與反應試劑反應。於步驟S22中，待測樣本同樣可自採樣區12移動至反應區13，或者不經由基材11的傳輸，待測樣本直接接觸反應區13之反應試劑，而其原理及方式，則與前述實施例相同於此不再贅述。
最後，進行步驟S23：偵測待測樣本於反應區13中的反應。舉例而言，若使用之反應試劑包含5-甲基吩嗪硫酸甲酯與3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，則因活的微生物所攜帶的琥珀酸脫氫酶會將3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）的四氮唑（tetrazolium）環開裂，使MTT還原為呈現紫色或藍色的甲臢（formazan）結晶，而5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）則做為中介電子接收者（intermediate electron acceptor）來協助上述還原反應。然而，死的微生物細胞不會產生琥珀酸脫氫酶，故不會與MTT及PMS發生上述還原反應。因此，若待測樣本中含有微生物活體，則會與反應區13中的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽及5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）等反應試劑發生反應而產生紫色或藍色的甲臢（formazan）結晶，使用者則可藉由觀察反應區13中是否發生藍色或紫色等呈色反應，來判斷待測樣本是否具有微生物。而由於反應區13中含有α-纖維素顆粒131，對於待測樣本來說，會降低在微生物檢測裝置1中的傳輸速率。亦即α-纖維素顆粒131降低了待測樣本在反應區13中的傳輸速度，也增加了反應面積，使前述的還原反應速率增加，也有較長的時間來進行反應，故有助於增強反應訊號。
請再參考圖2及圖5，圖5為執行下述步驟S221及S222後，生物檢測裝置1中反應區13的狀態示意圖。此外，為了要使使用者更易於察反應之呈色，在其他實施態樣中，於進行步驟S22使待測樣本自採樣區12傳送至反應區13進行反應後，可更進行步驟S221：移除含有纖維材料（α-纖維素顆粒131），以及步驟S222：提供鹼性溶液，添加於反應區13中。鹼性溶液可為氫氧化鈉（NaOH）、氫氧化鉀（KOH）、碳酸氫鈉（NaHCO 3）、氫氧化鈣（Ca(OH) 2）溶液，但本發明並不以此為限。
由於活的微生物所攜帶的琥珀酸脫氫酶與PMS及MTT進行還原反應會產生紫色或藍色的甲臢（formazan）結晶。而此種甲臢（formazan）結晶會沉積在V型凹槽的反應區13鄰近流動方向（亦即沿微生物檢測裝置1的長軸方向，如圖5中實線箭頭所示）的斜側表面132a（亦為反應區13與α-纖維素顆粒131所接觸之表面132）；因此，移除α-纖維素顆粒131後將使使用者更易於觀察於表面132a上所呈現的呈色反應。並且，添加前述鹼性溶液，則是提供氫氧離子（hydroxyl cation）來協助電子移轉，可進一步協助沾附於表面132a上的PMS與MTT等反應試劑與移動至該處之微生物的琥珀酸脫氫酶進行還原反應，故有放大訊號（增強於表面132a的呈現顏色深度）的功能。
請參考圖6，為可適用於本較佳實施例之另一種微生物檢測裝置示意圖。如圖所示，微生物檢測裝置2具有與前述之微生物檢測裝置1實質上相同的結構，惟微生物檢測裝置2係額外進行表面處理以增加基材21的穩定性，亦即在微生物檢測裝置2的基材21之上表面211以及下表面212上鋪設有疏水層25，且反應區23係為疏水層25所定義。其中，表面處理例如但不限於疏水處理，疏水試劑包含但不限於以PDMS（聚二甲基矽氧烷，Polydimethylsiloxane）塗佈於至少部分的基材21的上表面211及下表面212。透過上述的處理可進一步界定及縮小反應區23包含的親水區域，以使待測樣本可準確地經由未被疏水性表面處理而保留親水性之基材21的其餘區域傳送至反應區23，並與反應試劑進行反應。
關於疏水處理的方式亦非本發明所限制性者。於實際應用時，亦可藉由於微生物檢測裝置2的上表面211及/或下表面212上塗佈指甲油或光阻層；具體而言，例如當使用負型光阻SU-8負環氧樹脂（SU-8 epoxy-based negative photoresist）時，以UV光照射的區域不會溶於光阻顯影液，即可形成疏水層25，而未以UV光照射的區域則維持其親水的特性。惟類似之形成方式係為本發明所屬技術領域之通常知識者所能理解者，於此不再贅述。
請再參考圖7A與7B，各為可適用於本較佳實施例之又一種微生物檢測裝置示意圖。如圖7A所示，微生物檢測裝置3具有與前述之微生物檢測裝置1實質上相同的結構，惟微生物檢測裝置3之反應區33呈現一開放凹槽，設置於傳送區34之截面341上。亦即，反應區33設置於基板31之末端，而α-纖維素顆粒331則塗布傳送區34之截面341上。
此外，請參考圖7B，係適用欲同時針對一待測樣本中之不同微生物進行測試時之裝置。如圖所示，生物檢測裝置3’具有與前述之微生物檢測裝置1實質上相同的結構，惟微生物檢測裝置3’之反應區33’包含兩個呈現開放凹槽構型的第一反應區33a與第二反應區33b，分別對應設置於傳送區34’之截面341a及341b上，亦即，反應區33’設置於基板31’之末端，而α-纖維素顆粒331a與331b則塗布傳送區34’之截面341a及341b上。而在截面341a及341b上的α-纖維素顆粒331a與331b及第一反應區33a與第二反應區33b上，可各自添加不同種類的反應試劑，以偵測一待測樣本中之不同微生物。
此外，請參考圖9A至9C，各為可適用本實施例之再一種微生物檢測裝置示意圖。請先參考圖9A。為增進檢測時進行添加鹼性溶液步驟S222的操作便利性，本實施例中亦提供一第二基材4，而微生物檢測裝置1的基材11於反應區13的下方進一步設置有一凹陷部16。第二基材4包含有一凸部41，凸部41之構型則以對應凹陷部16為佳，原則上使凸部41與凹陷部16兩者可對應卡合即可。第二基材4可利用浸泡（soaking）等方式事先載有（loading）前述之鹼性溶液。而此時，當基材11與第二基材4接觸卡合後，鹼性溶液會沿著第二基材4的長軸方向移動（即移動方向X2），並經由第二基材4以傳送方向Y1通過凹陷部16傳送至反應區13，且傳送方向Y1係實質上垂直於待測樣本自採樣區（本圖中未繪出）移動至反應區13之移動方向X1。並且，若基材11之親水性高於第二基材4之親水性時，則可加速鹼性溶液通過凹陷部16傳送至反應區13之速率，有助於加快於表面132上的呈色反應。
請再參考圖9B，圖中所示之第二基材4’與前述之第二基材4之差異僅在於圖9B中所示的第二基材4’實質上僅包含凸部41’以及由凸部41’些許延伸之本體，亦即不包含圖9A中所示之第二基板4之長軸延伸本體，然其餘第二基材4’與基材11之特徵與構件對應連接關係則與前段所述相同，在此不再贅述。而此時，當基材11與第二基材4’接觸卡合後，鹼性溶液直接以傳送方向Y1’通過凹陷部16傳送至反應區13，且傳送方向Y1’係實質上垂直於待測樣本自採樣區（本圖中未繪出）移動至反應區13之移動方向X1，增進表面132上的呈色反應。
請再參考圖9C，圖中所示之第二基材4’’與前述圖9A之第二基材4之差異僅在於圖9C中所示的第二基材4’’之凸部41’’為一方型，其所對應之基材11’的凹陷部16’亦為方形構型，然其餘第二基材4’’與基材11’之特徵與構件對應連接關係則與前段所述相同，在此不再贅述。亦即此時，基材11’與第二基材4’’接觸卡合後，鹼性溶液會沿著第二基材4’的長軸方向移動（即移動方向X2’’），並經由第二基材4’’以傳送方向Y1’’通過凹陷部16’傳送至反應區13’，且傳送方向Y1’’係實質上垂直於待測樣本自採樣區（本圖中未繪出）移動至反應區13’之移動方向X1’，增進表面132’上的呈色反應。
特別須說明的是，圖9A～圖9C所述的第二基材4、4’、4’’皆可於部分之表面進行疏水處理，較佳是於第二基材4、4’、4’’的凸部41、41’、41’’與基材11、11’的凹陷部16、16’接觸處以外的表面接近進行疏水處理，以進一步界定及縮小鹼性溶液由第二基材4、4’、4’’傳送至基材11、11’的位置，使待測樣本可準確地經由未被疏水性表面處理而保留親水性之區域傳送至反應區13、13’，增進表面132、132’上的呈色反應。其中，疏水試劑的實施方式同前方實施例所述，於此不再贅述。
本發明亦提供另一較佳實施例，為一種微生物檢測裝套組，包括微生物檢測裝置以及酸性溶液。微生物檢測裝置包括基材，基材包含有採樣區以及反應區，反應區具有α-纖維素顆粒及反應試劑。酸性溶液則用以處理反應區與α-纖維素顆粒接觸之部分表面所含有之羥基與α-纖維素顆粒。反應試劑包含至少兩種試劑，其一為5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）或硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）其中之一，其二為3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）或2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）其中之一。而本較佳實施例中微生物檢測套組各部件之細部組成、變化態樣與其他部件之連接關係，以及酸性溶液之添加方式與時機，則同於前面較佳實施例中所述，於此不再贅述。
另外，本發明亦提供一種微生物檢測裝置，包含有基材，基材包含有採樣區以及反應區，反應區具有α-纖維素顆粒以及反應試劑。並且反應區與α-纖維素顆粒接觸之部分表面所含有之羥基與α-纖維素顆粒係經一酸性溶液處理。而反應試劑包含至少兩種試劑，其一為5-甲基吩嗪硫酸甲酯（5-Methylphenazinium methosulfate）或硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase，又稱黃遞酶）其中之一，其二為3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT）、碘硝基氯化四氮唑藍（2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride，INT）、水溶性四氮唑鹽（Water-soluble tetrazolium salts，WSTs）或2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽（2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）其中之一。本較佳實施例中微生物檢測裝置各部件之細部組成、變化態樣與其他部件之連接關係，則同於前面較佳實施例中所述，於此不再贅述。
接下來將以實驗例具體說明本發明之前述較佳實施例之微生物檢測方法及經由前述實施例所製得之微生物檢測裝置1之實際操作方式及效果。然需注意的是，以下之說明是用來詳述本發明以使此熟習該項技術者能夠據以實現，且同樣可應用本發明其他實施例的微生物檢測裝置或微生物檢測套組來進行，但並非用以限定本發明之範圍。
實驗例1：以微生物檢測裝置進行大腸桿菌的測試
首先，將0.023至0.026公克（gram）的α-纖維素顆粒添加於反應區13的容置空間S中。以微量滴管將15.63毫莫耳濃度（mM）的4微升（μL）鹽酸滴入反應區13中的α-纖維素顆粒131上，進行前處理。接著，將混合有3.26毫莫耳濃度的PMS(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)與6.03毫莫耳濃度的MTT(Invitrogen Life Sciences,Carlsbad,CA.)的反應試劑4微升滴入反應區13中的α-纖維素顆粒131。完成上述試劑的添加後，將微生物檢測裝置1於攝氏25度環境下風乾2分鐘。
接著，將經過上述步驟處理後之微生物檢測裝置1以採樣區12之一端浸入含有經序列稀釋所製備出的不同濃度(每毫升0、4×103、4×104、4×105、4×106、4×107、以及4×108菌落形成單位(colony forming unit,cfu/ml)，各樣本進行9重複(N=9))大腸桿菌菌液中，浸置時間為8分鐘，使大腸桿菌菌液移動至反應區13。
之後，移除反應區13中的α-纖維素顆粒131’，將微生物檢測裝置1於攝氏25度環境下風乾45分鐘。接著，以微量滴管將31.25毫莫耳濃度(mM)的4微升(μL)氫氧化鈉溶液滴入反應區13中，以增強反應區13中的呈色反應。最後以數位相機(EOS 5D Mark III,Canon,Japan)拍攝反應區13之呈色反應情況，並利用影像分析軟體(ImageJ Software,NIH,USA)計算反應區13中呈色反應的強度，並將呈色反應的強度進行線性迴歸分析。
請參考圖8，為以微生物檢測裝置依上述流程進行大廠桿菌檢測之相對強度結果示意圖。結果如圖所示，在大腸桿菌濃度為0至每毫升107菌落形成單位之範圍間，微生物檢測裝置1之呈色反應強度與大腸桿菌濃度大致成一線性正相關(R2=0.99)。
實驗例二：添加HCl與未添加HCl對於PMS及MTT反應試劑的影響結果比較
首先，將0.023至0.026公克(gram)的α-纖維素顆粒添加於反應區13的容置空間S中。以微量滴管將15.63毫莫耳濃度(mM)的4微升(μL)鹽酸滴入反應區13中的α-纖維素顆粒131上，進行前處理。此外，同步準備另一微生物檢測裝置，但不將鹽酸滴入反應區13中。接著同樣地，將混合有3.26毫莫耳濃度的PMS(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)與6.03毫莫耳濃度的MTT(Invitrogen Life Sciences,Carlsbad,CA.)的反應試劑4微升滴入反應區13中的α-纖維素顆粒131。完成上述試劑的添加後，將微生物檢測裝置1於攝氏25度環境下風乾2分鐘。
結果如圖10所示，添加有鹽酸之反應區無反應產生（無變色），說明了鹽酸有效地抑制了反應試劑（PMS、MTT）與α-纖維素顆粒131的反應，而未添加鹽酸之反應區則產生了顏色變化，顯示添加酸性溶液於反應區13中的α-纖維素顆粒131中的確可以抑制纖維素上之羥基對反應試劑反應的影響，以減低未與微生物反應時的反應，以進一步使最終反應訊號更為明顯。
綜上所述，本發明之檢測裝置及其製造方法，係應用包含有化學檢測試劑的反應區，以有效檢測特定的檢測標的，例如是食品安全中備受關注的亞硝酸鹽或硝酸鹽檢測。由於本發明之檢測裝置包含有以木質纖維基材形成的結構，因此能藉由木質纖維基材對於水分子較佳的吸附性，從而增強液體樣本於檢測裝置中的毛細作用，提升檢測的速度。再者，因傳統的檢測試紙需要經額外加工，且於加工過程中可能使用到禁用於食品或對人體有危害的化學試劑，故若於檢測時與待測食品直接接觸將導致檢測後的待測物品無法食用；相較之下，由於本發明的檢測裝置可使用天然的木質纖維基材，故在檢測時，可直接接觸甚或部分插入待測樣本中進行檢測，而檢測後的待測食品仍可繼續食用。除此之外，更具有價格便宜、加工方便等優勢。更佳地是，由於木質纖維基材具有強韌的機械結構並相對耐酸鹼，因此可較傳統上使用的濾紙更具有結構強度方面的優勢。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
1、2、3、3’‧‧‧微生物檢測裝置
11、11’、21、31、31’‧‧‧基材
111、211‧‧‧上表面
12‧‧‧採樣區
13、13’、23、33、33’‧‧‧反應區
131、131’、131、231、331、331a、331b‧‧‧α-纖維素顆粒
132、132’、132a‧‧‧表面
14、34、34’‧‧‧傳送區
16、16’‧‧‧凹陷部
212‧‧‧下表面
25‧‧‧疏水層
33a‧‧‧第一反應區
33b‧‧‧第二反應區
341、341a、341b‧‧‧截面
4、4’、4”‧‧‧第二基材
41、41’、41”‧‧‧凸部
A-A‧‧‧剖面線
S11、S12、S13、S14、S21、S22、S221、S222、S23‧‧‧步驟
X1、X1’、X2、X2”‧‧‧移動方向
Y1、Y1’、Y1”‧‧‧傳送方向
圖1A為本發明較佳實施例之微生物檢測裝置的製造方法的流程示意圖。 圖1B為圖1A所示之製造方法所製得的微生物檢測裝置示意圖。 圖2為本發明另一較佳實施例之微生物檢測方法的流程示意圖。 圖3為圖1B所示之微生物檢測裝置沿A-A線的剖面示意圖。 圖4為圖1B所示之微生物檢測裝置加入酸性溶液後反應區的示意圖 圖5為圖1B所示之微生物檢測裝置於移除α-纖維素顆粒與添加鹼性溶液後其反應區的呈色狀態示意圖。 圖6為本發明之另一種微生物檢測裝置示意圖。 圖7A為本發明之又一種微生物檢測裝置示意圖。 圖7B為本發明之又一種微生物檢測裝置示意圖。 圖8為以圖1B所示之微生物檢測裝置進行大廠桿菌檢測之相對強度結果示意圖。 圖9A為本發明之再一種微生物檢測裝置示意圖。 圖9B為本發明之再一種微生物檢測裝置示意圖。 圖9C為本發明之再一種微生物檢測裝置示意圖。 圖10為本發明實驗例二之實驗結果圖。
S11、S12、S13、S14‧‧‧步驟

Claims (19)

  1. 一種微生物檢測裝置之製造方法，包括： 於一基材上定義一採樣區以及一反應區； 設置纖維材料於該基材之該反應區，其中該反應區與該纖維材料接觸之表面含有大量之羥基； 添加一反應試劑至該纖維材料；以及 以一酸性溶液處理該反應區之羥基以及該纖維材料。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯與硫辛酰胺脫氫酶所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽、碘硝基氯化四氮唑藍、水溶性四氮唑鹽以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽所組成之群組其中之一。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該纖維材料為α-纖維素顆粒。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該酸性溶液係經由滲透該纖維材料而後接觸到該反應區之該表面以處理該些羥基。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該基材為一纖維基材。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中該反應區具有一容置空間，該容置空間形成於該基材之一表面，且該纖維材料係設置於該容置空間中。
  7. 一種微生物檢測方法，包括： 準備一檢測裝置，其中該檢測裝置包含有一第一基材，該第一基材包含有一採樣區以及一反應區，該反應區具有纖維材料及一反應試劑，且該反應區與該纖維材料接觸之部分表面所含有之羥基與該纖維材料係經一酸性溶液處理；以及 以一待測樣本接觸該反應區並與該反應試劑反應。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之微生物檢測方法，其中該纖維材料為α-纖維素顆粒。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之微生物檢測方法，其中該以一待測樣本接觸該反應區並與該反應試劑反應之步驟，係包括：以一待測樣本接觸該採樣區，且該待測樣本自該採樣區移動至該反應區與該反應試劑反應。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之微生物檢測方法，其中於該以該待測樣本接觸該採樣區且使該待測樣本自該採樣區移動至該反應區之步驟後，更包括：移除該纖維材料；以及添加一鹼性溶液於該反應區中。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之微生物檢測方法，其中該鹼性溶液係藉由一第二基材以一傳送方向傳送至於該反應區，且該傳送方向係實質上垂直於該待測樣本自該採樣區移動至該反應區之一移動方向。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之微生物檢測方法，其中該第一基材之親水性高於該第二基材之親水性。
  13. 如申請專利範圍第7項所述之微生物檢測方法，其中該第一基材進一步具有一傳送區，且該傳送區係分別連接該採樣區及該反應區，且該反應區係設置於該傳送區之一截面上。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之微生物檢測方法，其中該反應區進一步具有一第一反應部與一第二反應部，且該第一反應部與該第二反應部係分別設置於該傳送區之不同截面上。
  15. 如申請專利範圍第7項所述之微生物檢測方法，其中該反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯與硫辛酰胺脫氫酶所組成群組其中之一，以及由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽、碘硝基氯化四氮唑藍、水溶性四氮唑鹽以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽所組成之群組其中之一。
  16. 一種微生物檢測套組，包括： 一檢測裝置，包含有： 一基材，該基材包含有一採樣區以及一反應區，該反應區具有： 纖維材料；及 一反應試劑，該反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯與硫辛酰胺脫氫酶所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽、碘硝基氯化四氮唑藍、水溶性四氮唑鹽以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽所組成之群組其中之一；以及 一酸性溶液，用以處理該反應區與該纖維材料接觸之部分表面所含有之羥基與該纖維材料。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之微生物檢測套組，其中該纖維材料為α-纖維素顆粒。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之微生物檢測套組，其中該纖維材料先經該酸性溶液處理後再置入該反應區。
  19. 一種微生物檢測裝置，包括： 一基材，該基材包含有一採樣區以及一反應區，該反應區具有： 纖維材料；以及 一反應試劑，該反應試劑包含有由5-甲基吩嗪硫酸甲酯與硫辛酰胺脫氫酶所組成群組其中之一，以及由3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽、碘硝基氯化四氮唑藍、水溶性四氮唑鹽以及2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲醯胺內鹽所組成之群組其中之一； 其中，該反應區與該纖維基材接觸之部分表面所含有之羥基與該纖維基材係經一酸性溶液處理。
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