CN101002097A - 测定装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了横流测定装置及其生产方法。用于鉴定生物样品中的糖抗原的装置包括具有以下的基材：a)样品接收区，b)接收来自所述的样品接收区的样品的提取区并且该提取区包括固定在其中或以其它方式吸收在其中的至少一种或多种反应物或试剂，所述的反应物或试剂当合并时发生反应从而形成用于所述样品中所需抗原的提取试剂，要被添加到所述的样品接收区中的所述样品任选包括要不然则存在于所述提取区中的形成所述提取试剂所需的其余的反应物，c)任选的能够使所得样品的pH处在测定的操作pH范围内的中和试剂，和d)所述的待检测抗原的标记特异性结合剂或捕获剂的检测区。
Description
本发明涉及用于检测糖抗原，特别是以微生物/细菌生物体诸如例如家庭链球菌(Streptococcacae)，包括A群和B群链球菌为特征的抗原的装置和方法。
用于生物体如家庭链球菌检测的免疫测定法通常依赖特异性糖抗原的检测。细菌壁外表面上附加的抗原大分子(多糖、多肽等等)对细菌物质、型组(type group)或菌株具有特异性。当这些抗原大分子暴露于相应的特异性抗体时，抗体和抗原结合形成沉淀素(precipitin)。然而，抗原分子必须首先从生物体的细胞壁释放，然后它们才可被检测到。现有的许多用于进行这些提取处理的方法使用例如亚硝酸、链霉蛋白酶B酶、热甲酰胺或热HCl。在亚硝酸的情况下，当亚硝酸接触微生物的外壁时，类属抗原(group antigen)被释放进入溶液中，其抗体特异性反应性保持完好。
大多数采用横流技术的免疫测定法采用例如亚硝酸用于从生物体中提取糖抗原，然后使含有被提取抗原的样品与测定装置接触。然而，亚硝酸是化学不稳定的，已知其在溶液形式中，在水的存在下形成硝酸和一氧化氮。结果是，通常通过亚硝酸提取多糖，所述亚硝酸通过无机硝酸盐和酸的水溶液之间的反应在预处理步骤中、在抗原提取之前立刻产生。然后在提取之后，通过添加中和试剂如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)中和该溶液，然后将所得溶液添加到测定装置中。
因此，糖抗原的提取及其随后检测通常如下：从例如喉咙背侧取得抽汲样品，并且将棉拭插入含有亚硝酸的小瓶中，所述亚硝酸通过添加亚硝酸钠的水溶液和醋酸产生。随后搅动棉拭以释放抗原进入溶液。
在提取抗原后，溶液必需先进行中和，然后将其添加到横流或其它适当的测定装置中。在横流装置的情况下，该装置通常含有可移动的能够与抗原结合的标记结合试剂，以及在标记结合试剂下游提供的能够与被分析物结合的固定化结合试剂。之后，可通过常规方法，通过形成固定化微粒标记三明治结合试剂复合物检测抗原。这种测定装置在EP291194中公开。
上述方法，以及其它现有技术的操作法，都要求首先通过使样品接触前体亚硝酸盐和酸而提取抗原的分离步骤。酸和亚硝酸盐二者都包含在溶液中，或者，所述的前体反应物之一为干燥形式，并随后与样品一起接触包含在溶液中的其余的前体反应物。尽管如此，这些操作法中的每一种都要求在提取抗原后使用横流测定装置进行随后的样品接触步骤，以检测所需的抗原，并且该装置与样品提取单独地提供。
本发明设法解决与所述的现有技术操作法有关的问题，并且提供了用于检测生物体中的抗原或被分析物的试剂盒和测定装置，其中本质上减少了处理步骤的数目，并且因此，所述的试剂盒和测定装置特别易于使用。本发明的测定装置在护士或医师营业所、外界或家庭环境中具有特别的实用性，并且因此特别适于非专业人员使用。
因此，根据第一方面，本发明提供：
用于鉴定生物样品中的糖抗原的横流测定装置，所述装置包括具有以下的基材：
a)样品接收区，
b)用于接收来自所述的样品接收区的样品的提取区并且该提取区包括固定在其中或以其它方式吸收在其中的至少一种或多种反应物或试剂，所述的反应物或试剂当合并时反应从而形成用于所述样品中所需抗原的提取试剂，
要被添加到所述样品接收区中的所述样品任选包括要不然则存在于所述提取区中的需要形成所述的提取试剂的其余的反应物，
c)任选的能够使所得样品的pH处在测定的操作pH范围内的中和试剂，和
d)用于接收对所述的待检测抗原具有特异性的标记特异性结合剂或捕获剂的检测区。
横流测定装置在本领域是已知的，并且通常包括其中结合了含有试剂的基质的多孔材料。允许样品从样品接收区向下游侧横向流动到包括捕获剂的反应区或检测区。在操作这些装置时，将试验样品施用于装置上的样品接收区，该样品从施用区域或样品接收区移动或流动通过多孔材料到达反应区或检测区，该反应区或检测区中包括适当的捕获剂。
可在样品接收区或样品接收区的下游侧提供提取区。在本发明的一个方案中，两种前体反应物都独立地在所述提取区中被提供，当所述的前体反应物依靠样品通过所述基材的移动而合并时发生反应以形成所述的提取剂。因此，当样品的溶液侧向通过测定装置时，其将连续地接触每一种反应物，从而当所述反应物合并时发生反应以形成提取剂，该提取剂可作用于样品以提取任何存在的所需抗原。因此，本发明的装置仅仅要求添加样品到基材的步骤，从而极大减少了所需步骤的数目和样品及反应物的操作量。
前体反应物或前体试剂包括酸和酸生成试剂，所述的酸生成试剂能够与酸反应形成亚硝酸。
所述的酸优选通过干燥等方式固定在装置的提取区中，并且与另一种前体试剂独立地提供，这样使得当样品移动通过横流测定装置时，样品将连续地接触每一种前体试剂，然后两种前体试剂将合并以形成亚硝酸，然后该亚硝酸可发挥作用，从生物体中提取抗原或进行检测。
固定的酸可以是任何适当的能够与酸生成试剂反应生成亚硝酸的酸，诸如多聚羧酸、多聚磺酸、多聚苯乙烯磺酸(polystyrenesulphoicacid)、多聚磷酸、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。其它的这些酸类也是本领域技术人员已知的。
然而，所述的酸优选包括非挥发性的有机酸，诸如任何的枸橼酸、丙二酸、苯乙酸、草酸、羟基乙酸、氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、苯甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、壬二酸和癸二酸。然而，特别优选聚合物型酸如多聚磺酸，并且可在所述的测定装置上以树脂的形式提供。适当的树脂的例子是聚苯乙烯。
酸可以是聚合物型酸并且可通过与粒子的结合被固定。当酸结合于粒子时，可以有利地选择粒径，使得其大于横流测定装置的孔径，从而其不能沿着具有流体样品的多孔载体的长度移动。
或者，酸可构成样品流体携带基质如样品接收芯的一部分，或作为多孔载体自身。这可以通过包括特定的多孔基质的材料的磺化实现。
可使用任何适当的在干燥状态下是稳定的并且能够与被固定的酸反应生成亚硝酸的酸生成试剂，如碱金属亚硝酸盐。
酸生成试剂优选包括亚硝酸盐，其可包括任何的无机亚硝酸盐如钠、钾、锂、钙、锶、钡、和银的亚硝酸盐，以及有机亚硝酸盐如硝酸丁酯和硝酸异戊酯。优选亚硝酸钠和亚硝酸钾，最优选亚硝酸钠。在提取试剂中合并的亚硝酸盐和有机酸的浓度可以根据使用的特定化合物、它们的水溶性和试验样品中存在的抗原的推测量而有很大变化。
亚硝酸钠可以水性状态或干燥状态被添加到所述装置中。
在必要时还可以提供中和试剂，使得当流体样品在接触提取区后其pH值处在测定的操作pH范围内。测定的pH范围可以改变并且根据捕获剂的性质和类型(例如特定的抗体类型以及其是否是多克隆或单克隆的)以及抗原来确定。在一些情况下，如果得到的样品混合物的pH落在测定的操作pH范围内，则可能不需要中和试剂。
然而，优选需要中和试剂，因为其使反应混合物的pH最佳化，这又使得测定的灵敏性最佳化。典型的pH范围可为6-9。当存在中和试剂时，优选其经过缓冲。本领域已知许多的这些中和缓冲液。尽管优选三羟甲基氨基甲烷(TRIS)。
当存在中和试剂时，其通过捕获剂的操作pH范围进行确定。因此，可在提取区的下游和捕获剂的上游提供中和试剂。或者，可在第一捕获剂的下游和第二捕获剂的上游提供中和试剂。优选在装置内提供在使用前是干燥状态的中和试剂。
在本发明的一个方案中，检测区可以包括对所述的待检测抗原具有特异性的标记结合试剂，并且该结合试剂可以在检测区内以干燥形式或以其它方式被固定的形式提供。或者，标记特异性结合试剂可在添加待检测样品后随后被添加到检测区。因此，该装置通常包括捕获剂，其可以优选首先固定在检测区内，并且其能够捕获特定的被分析物或感兴趣的抗原。或者，所述装置可包括位于检测区或检测区上游的可移动的标记捕获剂，并且该可移动的标记捕获剂还能够捕获感兴趣的被分析物或抗原。
在可移动的标记捕获剂在使用前提供于装置中的情况中，该捕获剂优选位于任选的中和试剂的下游侧。可移动的捕获剂可以在单独的多孔载体上和/或内提供，所述多孔载体布置为流体接触多孔载体和多孔载体的上游，如US6352862中公开的。单独的多孔载体可以是大孔的，或者可以是与多孔载体的材料不同的材料。根据一个方案，多孔载体是硝化纤维，并且大孔载体选自玻璃纤维或合成聚合材料中的一种，如聚丙烯。
或者，可移动的捕获剂可以提供于样品接收芯或多孔载体区域内。
捕获剂可选自任何能够与糖抗原形成结合对的物质，例如，抗体或其片段、外源凝集素、硼酸或硼酸衍生物。捕获剂可以是特异性捕获剂。抗体可以是多克隆的或单克隆的。
样品中被分析物的存在或含量可通过检测检测区中存在的标记捕获剂来确定。标记捕获剂可通过眼睛或其它合适的方法测定。
标记可选择任何适当的标记，如染色的胶乳小球或小珠或吸入染料的脂质体。特定的标记还可包括金属溶胶如金溶胶。
还可在本发明的装置内提供对照区，该对照区在检测区或检测区的下游被提供。对照区用于指示测定是否正确地进行。通常，对照区包括其它固定的能捕获标记捕获剂的捕获剂。
在本发明装置的一个方案中，多孔材料优选包括多孔芯，其可得自任何能迅速地吸收液体的吸水性材料、多孔材料或纤维材料。所述材料的多孔可以是单向的(即孔或纤维全部或主要与元件的轴平行布置)或多向的(即各个方向，使得元件具有无定形的类似海绵的结构)。可以使用泡沫塑料材料，如聚丙烯、聚乙烯(优选极高分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯、乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。然而，在选择性的方案中，测定装置可包括一种或多种微流体通道，其尺寸达到允许液体样品在毛细管作用下移动通过一个或多个通道移动的程度。可另外提供一个或多个毛细通道或用一个或多个毛细通道代替构成装置的一部分的一种或多种多孔或吸收性基质。
在生产期间可有利地用表面活性剂对载体进行预处理，因为这样可以降低载体的固有的疏水性，并因此提高其吸收和迅速地和有效地递送潮湿样品的能力。多孔样品接受元件还可由纸或其它纤维素材料如硝基纤维素制成。
如果需要，吸收剂“凹槽”可在载体的远端提供。吸收剂凹槽可由例如Whatman 3MM色谱纸组成，并且将提供足够的吸收容量以使任何未结合的标记捕获剂从检测区被洗掉。
作为凹槽的替代物，提供一定长度的延伸超出检测区的多孔固相材料是足够的。
根据本发明的第二方面，提供用于鉴定生物样品中的糖抗原的试剂盒，该试剂盒包括本文上述的装置和使所述样品与所述样品接收区接触的结构。
本发明的另一方面还提供了生产本发明的测定装置的方法，该方法包括在具有样品接收区的横流测定装置中在所述装置的提取区内固定一种或多种试剂，并且所述试剂当合并时形成提取试剂，该提取试剂对于添加到所述样品接收区的样品中的糖抗原具有特异性，在所述提取区的下游和在所述测定装置中固定的捕获剂/检测剂的上游提供中和缓冲液，用于中和在从所述样品提取所述抗原后的所述提取试剂的pH。
在另一方面中，本发明包括用于鉴定生物样品中糖抗原的方法，该方法包括将所述的生物样品施用于本文前述的装置的样品接收区，监控所述检测区内所述抗原的存在。
附图说明
本发明可从以下示例性的方案更清楚地得以了解，所述的方案仅仅是示例性的，参见附图，其中：
图1是本发明装置的示意图；和
图2是使用本发明的测定装置检测A群和C群链球菌的肉眼观察结果的示意图。
在图1-2所示的本发明的装置中提供了由参考数字1表示的横流测定装置，其包括样品接收区2和提取区4，用于接受在从样品接收区到检测区8的方向上横向移动通过装置1的样品。在提取区中，提供了干燥形式的或以其它方式固定在其中的酸生成试剂4a和有机酸4b。优选的酸生成试剂是亚硝酸钠，而优选的酸是以树脂形式提供的多聚磺酸。多聚磺酸被提供在在装置中切割或蚀刻的凹槽或沟道5中。
在酸生成试剂的下游和在捕获区或检测区8中提供的捕获剂的上游(根据测定装置中的流动方向所定义的)提供中和缓冲液6。
捕获剂或检测剂包括对待检测抗原具有特异性的标记抗体，并且其可通过检测区/捕获区中的抗原-抗体复合物被观察到。优选抗体对链球菌A抗原具有特异性。
实验
在距离48mm长×7mm宽×4mm深的多孔样品接收芯(Filtrona，Richmond Inc，Colonial Heights，Virginia，USA)近端的10mm处制造大约2mm宽×3mm深的凹槽。
将250μl 1M的亚硝酸钠施用于芯的一端并且允许渗入。随后在芯的顶端施加200μl的1.6M TRIS(pH 8.5)并且允许渗入，如图1所示。将芯在50℃干燥过夜，随后向凹槽中填充大约20mg的磺酸树脂(MP70-90目，Novabiochem商品目录号01-64-0432，1.6毫摩尔Ig)。
包括可移动的微粒标记结合试剂的多孔释放基质的制备
抗链球菌A糖抗体(Biotech Inc.)以30μg/ml(0.5％胶乳固体)的浓度被吸收到400mm的蓝色胶乳粒子(Duke Scientific，USA)上，制备涂有抗体的冻干胶乳粒子。将抗体敏化的胶乳粒子注入20mm×8mm×1.2mm的具有开孔结构的玻璃纤维垫(Sintair，USA)并冻干。
含有干燥后的提取试剂的芯随后被置于制备的玻璃纤维垫的顶端。
包括固定捕获剂的多孔载体的制备
通过微处理机控制的微量调节注射器在8mm宽的多孔硝化纤维载体条(Schleicher and Schuell基8μ多孔度)上淀积浓度为1.9mg/ml的抗链球菌A多克隆抗体，流速为0.8μl/mm。在与位于标记抗体下游的检测区中的液体样品流动方向垂直的方向施加条形抗体，并且该抗体随后用1％(w/v)聚乙烯醇/3％(w/v)蔗糖封闭，以使其固定到多孔载体上。
装置的构造
横流载体装置的构造如图1所示，使用如上所述制备的材料。含有干燥提取剂的多孔样品接收芯置于含有冻干抗体敏化的胶乳粒子(涂有抗链球菌A多克隆抗体)的玻璃纤维垫的顶端。
随后放置玻璃垫使其接触硝化纤维多孔载体，从而施用于多孔样品接收芯一端的液体样品能够渗入玻璃纤维垫并沿着硝化纤维多孔载体渗入。
在固定捕获剂的下游位置固定其它的抗小鼠抗体，其起对照区的作用。最后，放置吸收剂凹槽垫使其接触硝化纤维条的远端。
还如上所述构建了另外的装置，用于检测链球菌C，不同之处在于使用抗链球菌A抗体代替抗链球菌C抗体。
链球菌A和C的样品分别在水中稀释到10e9cfu/毫升。细菌悬浮液(100μl)施用于装置的近端(亚硝酸钠端部)，然后施加1000μl的水(用于使液体移动通过该装置)。
作为对照，重复测定，不同之处在于对装置施用100μl的不含细菌的水。测定结果如图2所示。从图2可以看出，蓝色胶乳敏化抗体的存在可在指示链球菌A和C糖抗原存在的检测区中观察到。
这些结果表明，各自的糖抗原通过装置内所含试剂再次水合生成的亚硝酸从细菌中释放，并且这些抗原然后能特异性地在随后的免疫测定法中被检测到。
Claims (24)
1.用于鉴定生物样品中的糖抗原的横流测定装置，所述装置包括具有以下的基材：
a)样品接收区，
b)用于接收来自所述的样品接收区的样品的提取区并且该提取区包括固定在其中或以其它方式吸收在其中的至少一种或多种反应物或试剂，所述的反应物或试剂当合并时发生反应从而形成用于所述样品中所需抗原的提取试剂，
要被添加到所述样品接收区中的所述样品任选包括要不然则存在于所述提取区中的形成所述提取试剂所需的其余的反应物，
c)任选的能够使所得样品的pH处在测定的操作pH范围内的中和试剂，和
d)所述的待检测抗原的标记特异性结合剂或捕获剂的检测区。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述的提取区包括所述的前体反应物二者，二者当合并时发生反应以形成所述的提取试剂。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述的待检测抗原是链球菌抗原。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述的链球菌抗原是链球菌A抗原。
5.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的提取试剂是亚硝酸，所述的前体反应物各自是酸和亚硝酸盐并且它们当合并时形成亚硝酸。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述的酸是树脂形式的磺酸并且所述的亚硝酸盐是亚硝酸钠。
7.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的基材包括横流多孔载体。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述的基材包括微流体沟道，该微流体沟道的尺寸达到允许液体样品在毛细管作用下移动通过所述沟道的程度。
9.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的标记特异性结合试剂在所述的检测区或所述检测区的上游被固定。
10.根据前述权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述的标记特异性结合试剂与所述样品一起或在添加所述样品之后被添加到所述基材。
11.根据前述权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述的基材包括可移动的标记特异性捕获剂，该可移动的标记特异性捕获剂在任选的中和试剂的下游被提供。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述的可移动的捕获剂在单独的多孔载体上和/或多孔载体内提供，所述的多孔载体布置为流体接触多孔载体和多孔载体的上游。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述的单独的多孔载体是大孔的并且可以具有与多孔载体不同的材料。
14.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的标记特异性结合试剂是标记抗体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述标记是酶标记或特异性染料。
16.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的样品接收区包括样品接收芯，该样品接收芯由任何的能够吸收液体样品的吸水性材料、多孔材料或纤维材料制成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的多孔载体是硝化纤维载体。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述的多孔载体是消化纤维素并且大孔载体选自玻璃纤维或合成聚合材料中的任一种，如聚丙烯。
19.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述的基材包括在其远端的吸收剂凹槽。
20.根据前述权利要求中任一项所述的装置，还包括在检测区或检测区下游的对照区，该对照区包括另外固定的能够捕获标记捕获剂的捕获剂。
21.用于鉴定生物样品中的糖抗原的试剂盒，该试剂盒包括前述权利要求中任一项所述的装置和使所述样品与所述样品接收区接触的机构。
22.生产权利要求1-20中任一项所述的测定装置的方法，该方法包括在具有样品接收区的横流测定装置中在所述装置的提取区内固定一种或多种试剂并且所述试剂当合并时形成提取试剂，该提取试剂是添加到所述样品接收区的样品中的糖抗原的提取试剂，在所述提取区的下游和在所述测定装置中固定的捕获剂/检测剂的上游提供中和缓冲液，用于在从所述样品提取所述抗原/被分析物后中和所述提取试剂的pH。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法包括用表面活性剂预处理所述的基材。
24.用于鉴定生物样品中的糖抗原的方法，该方法包括将所述的生物样品施用于权利要求1-20中任一项所述的装置的样品接收区并且监控所述检测区内的所述抗原的存在。
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