JP7248513B2 - イムノクロマトグラフィー装置用パッド、これを用いたイムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトキット並びにイムノクロマト検出方法 - Google Patents
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Description
すなわち本発明は、以下の通りである。
前記パッドは、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物を含有することを特徴とするパッド。
2.前記酸無水物の25℃の蒸気圧が、2×10-2Pa以下であることを特徴とする前記1に記載のパッド。
3.前記酸無水物が、ビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物、ピロメリット酸無水物、1,2,4,5-シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、4-(2,5-ジオキソテトラヒドロフラン-3-イル)-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン-1,2-ジカルボン酸無水物、3-アセトアミドフタル酸無水物、及び4-(1-プロピニル)フタル酸無水物から選択された1種以上であることを特徴とする前記1または2に記載のパッド。
4.前記パッド中の前記酸無水物の含有量が、1パッドあたり0.4μmol~8.4μmolであることを特徴とする前記1~3のいずれか1に記載のパッド。
5.検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置において、
前記1~4のいずれか1に記載のパッドを備えてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。
6.試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物とを含有する、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、
前記検出部よりも上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記酸無水物を含有する部位とを有し、
前記酸無水物を含有する部位が、前記1~4のいずれか1に記載のパッドによって構成されることを特徴とする前記5に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
7.前記亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする前記6に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
8.前記5~7のいずれか1に記載のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、イムノクロマトキット。
9.前記8に記載のイムノクロマトキットを用いて、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程(i)~(v)を含むイムノクロマト検出方法。
(i)検体希釈液により前記検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
(ii)亜硝酸化合物と、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、前記検体から被検出物質を抽出する工程
(iii)標識物質保持部材において前記被検出物質を標識化する工程
(iv)前記検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において前記被検出物質を検出する工程
(v)前記検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
また、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物を使用することにより、当該装置の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度で検出することができる。
本発明の一実施形態は、検体中の検出対象から被検出物質(抗原)を抽出し、その被検出物質(抗原)に特異的に結合する結合物質(抗体)との反応(抗原-抗体反応)により形成される複合体をクロマトグラフ媒体に展開させることで、検出対象を各種の検出手段により確認するためのイムノクロマトグラフィー装置に用いるためのパッド、これを用いたイムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトキット、イムノクロマト検出方法(以下、単に「イムノクロマト検出系」と言うことがある)に基づくものである。
蒸気圧を上記のように設定することにより、パッドからの酸無水物の昇華が抑制され、パッド使用時の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度に検出できる。
なお、蒸気圧は公知のデータベースの値(計算値)を用いることができる。また、前記酸無水物は25℃、20Paで12時間減圧したときの重量増減が5%以内であるものが好ましい。
溶解度を上記のように設定することにより、酸無水物が検体含有液に速やかに溶解することができるため、亜硝酸の発生効率が高まり、被検出物質の検出感度をさらに向上させることができる。
なお、溶解度は、データベースの値(計算値)を用いることができる。
本発明のイムノクロマトグラフィー装置は、被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置であって、前記本発明のパッドを備えてなることを特徴とする。
また、必要に応じて酸無水物含有部材(7)を設けずに、試料滴下部材(1)として、本発明のパッドを使用することができる。さらに、酸無水物含有部材(7)に、亜硝酸化合物を含有する部位12を設けてもよいが、亜硝酸化合物を含有する部位12と酸無水物を含有する部位とは同一箇所となることはない。
なお試料滴下部位11は、通常、亜硝酸化合物を含有する部位12よりも上流側に設けられる。
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈するための検体希釈液とを含む。
また、緩衝液のpH範囲は7.1~9.8が最適である。
また、各部材の全体ではなく一部分にスポット的に各種試薬を含有させる場合は、例えば、部材をマスクした後にスプレーにより噴霧する方法などが挙げられる。
本発明のイムノクロマト検出方法は以下の工程(i)~(v)を含み、上記のイムノクロマトキットを用いて検体中の検出対象を検出する。
(i)検体希釈液により検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
(ii)亜硝酸化合物と、酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、検体中の検出対象から被検出物質を抽出する工程
(iii)標識物質保持部材において被検出物質を標識化する工程
(iv)検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において検出対象を検出する工程
(v)検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
各工程についての詳細は、判定の原理で上述した内容と同様である。
<イムノクロマトキットの作製>
本実施例では、検体希釈液、および、亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部材(1)と、標識物質保持部材(2)と、ビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物を含む酸無水物含有部材(7)と、検出部(4)を有するクロマトグラフ媒体部材(3)と、吸収部材(5)とをこの順に試料が展開されるように各部材を有するイムノクロマトグラフィー装置を含むイムノクロマトキットを作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF120、250mm×25mm)を用いた。5質量%のイソプロパノールを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mLの濃度になるようにウサギ由来抗溶連菌ポリクローナル抗体(第二試薬)(Meridian社製)を希釈し、その希釈された溶液150μLを抗体塗布機(BioDot社製)によりメンブレン上に1mmの幅で塗布し、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部材(3)上に検出部(4)を作製した。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.9mLに、50mM リン酸緩衝液(pH7.5)で0.03mg/mLの濃度になるように希釈したウサギ由来抗溶連菌モノクローナル抗体(Virostat社製)0.1mLを加え、4℃で10分間静置した。
次いで、0.01質量%の片末端チオール化ポリエチレングリコール(日本油脂社製、分子量20,000)を含む、50mM リン酸緩衝液(pH7.5)を0.1mL加え、十分撹拌した後、15,000Gで5分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%の牛血清アルブミンを含む20mM トリス緩衝液(pH8.0)を0.1mL加え、標準物質溶液を作製した。
20mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に、3Mの亜硝酸ナトリウム水溶液0.5mLを塗布し、減圧乾燥機にて室温で4時間乾燥させ、亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部材(1)を作製した。試料滴下部材(1)が含有する亜硝酸ナトリウムの量は1.5mmolである。また、75μmol/cm2である。
ビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物をジエチルホルムアミドに溶解させ、50mMとした。調製した溶液を20mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に含浸させ、24時間減圧乾燥させ、酸無水物含有部材(7)を作製した。酸無水物含有部材(7)が含有するビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物の量は20μmolである。また、1μmol/cm2である。
上記作製した標識物質溶液50μLに50μLの30質量%トレハロース水溶液と400μLの脱イオン水を加えたものを8mm×150mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように塗布した後、減圧乾燥機にて室温で4時間乾燥させ、標識物質保持部材(2)を作製した。
0.5質量%のTween20、0.6質量%ポリビニルピロリドン(平均分子量36万)、1質量%の牛血清アルブミンと150mM塩化ナトリウムを含む20mMのトリス緩衝溶液(pH8.0)からなる、検体を希釈しイムノクロマトグラフィー装置へ滴下し展開するための検体希釈液とした。
上記作製したイムノクロマトグラフィー装置および検体希釈液を用い、不活化したA群β溶血性連鎖球菌(溶連菌)を5×105org/mLとなるように加えたものを陽性検体試料とした。
該検体試料150μLを前記装置の試料滴下部位に滴下し展開させ、5分後、目視判定を行った。検出部(4)上の赤い線を目視確認できるものを「+」(陽性)、鮮明に目視確認できるものを「++」(強陽性)、赤い線をうっすら目視確認できるものを「±」(弱陽性)、赤い線を目視確認できないものを「-」(陰性)とした。結果を表1に示す。
また上記とは別に、上記作製したイムノクロマトグラフィー装置を50℃で24時間保管した後、上記測定及び目視判定を行った。結果を表1に示す。
なお、上記溶連菌を加えない検体希釈液を陰性検体試料として測定も行ったところ、すべての例において陰性が確認された。
実施例1において、酸無水物の種類を表1に記載したものに変更したこと以外は、実施例1と同様にイムノクロマトキットを作製し、各種測定を行った。結果を表1に示す。
バッキングシート(6)から成る基材に、試料滴下部材(1)、酸無水物含有部材(7)、標識物質保持部材(2)、検出部(4)を有するクロマトグラフ媒体部材(3)、吸収部材(5)を試料展開方向に沿って、この順で連結するように貼り合わせた(図1に示す順)こと以外は、実施例1と同様にしてイムノクロマトキットを作製し、発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス(株)製)で測定した。その結果、5分後の発色強度は48.1mAbsであった。結果をグラフとして図4に示す。
酸無水物の「ビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物」に替えて「りんご酸」を使用したこと以外は、実施例7と同様にしてイムノクロマトキットを作製し、5分後の発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス(株)製)で測定した。その結果、発色強度は4.1mAbsであった。結果をグラフとして図4に示す。
11 試料滴下部位
12 亜硝酸化合物含有部位
2 標識物質保持部材
21 標識物質含有部位
3 クロマトグラフ媒体部材
4 検出部
5 吸収部材
6 バッキングシート
7 酸無水物含有部材
8 亜硝酸化合物含有部材
Claims (9)
- 検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置に用いられるパッドにおいて、
前記パッドは、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物を含有することを特徴とするパッド。 - 前記酸無水物の25℃の蒸気圧が、2×10-2Pa以下であることを特徴とする請求項1に記載のパッド。
- 前記酸無水物が、ビシクロ[2,2,2]オクト-7-エン-2,3,5,6-テトラカルボン酸二無水物、ピロメリット酸無水物、1,2,4,5-シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、4-(2,5-ジオキソテトラヒドロフラン-3-イル)-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン-1,2-ジカルボン酸無水物、3-アセトアミドフタル酸無水物、及び4-(1-プロピニル)フタル酸無水物から選択された1種以上であることを特徴とする請求項1または2に記載のパッド。
- 前記パッド中の前記酸無水物の含有量が、1パッドあたり0.4μmol~8.4μmolであることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載のパッド。
- 検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置において、
請求項1~4のいずれか1項に記載のパッドを備えてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。 - 試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物とを含有する、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、
前記検出部よりも上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記酸無水物を含有する部位とを有し、
前記酸無水物を含有する部位が、請求項1~4のいずれか1項に記載のパッドによって構成されることを特徴とする請求項5に記載のイムノクロマトグラフィー装置。 - 前記亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項6に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
- 請求項5~7のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、イムノクロマトキット。
- 請求項8に記載のイムノクロマトキットを用いて、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程(i)~(v)を含むイムノクロマト検出方法。
(i)検体希釈液により前記検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
(ii)亜硝酸化合物と、25℃の蒸気圧が5×10-2Pa以下であり、25℃の水に対する溶解度が0.1mg/L以上である酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、前記検体から被検出物質を抽出する工程
(iii)標識物質保持部材において前記被検出物質を標識化する工程
(iv)前記検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において前記被検出物質を検出する工程
(v)前記検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
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