BRPI0911330B1

BRPI0911330B1 - método e kit para a detecção e identificação em uma amostra de teste do vírus da herpes e uso dos mesmos para a detecção e identificação do dito vírus em uma amostra de teste

Info

Publication number: BRPI0911330B1
Application number: BRPI0911330A
Authority: BR
Inventors: Núria Manjón; Maria L. Villahermosa
Original assignee: Genomica S.A.U.
Priority date: 2008-04-03
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2020-05-19
Also published as: CA2720421A1; BRPI0911330A2; EP2271778B1; BRPI0911330B8; GB0806041D0; EP2271778A1; MX2010010698A; ATE533863T1; RU2010144964A; WO2009122201A1; ES2377300T3; RU2470999C2; CA2720421C

Abstract

método e kit para a detecção e identificação em uma amostra de teste do vírus da herpes e uso dos mesmos para a detecção e identificação do dito vírus em uma amostra de teste um método e kit para detecção e identificação do vírus da herpes em uma amostra de teste, em particular, hsv-1, hsv-2 e/ou hhv-6, são descritos. a amostra de teste é submetida à amplificação com combinações particularmente vantajosas de iniciadores de amplificação. a amplificação pode ser seguida por hibridização com sondas de vírus específicos. um método e kit que adicionalmente permitem detecção eficiente de vzv, cmv, ebv, enterovírus, hhv-7 e hhv-8 são descritos.

Description

“MÉTODO E KIT PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO EM UMA AMOSTRA DE TESTE DO VÍRUS DA HERPES E USO DOS MESMOS PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DO DITO VÍRUS EM UMA AMOSTRA DE TESTE”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere a um método e kit para detecção e identificação de herpes vírus em uma amostra de teste, em especial o HSV-1 e o HSV-2. Opcionalmente, HHV-6 também pode ser detectado na amostra, enquanto que em modalidades preferidas o método e kit ainda permitem a detecção eficiente de VZV, CMV, EBV, enterovírus, HHV-7 e HHV-8.

[002]Combinações particularmente vantajosas de iniciadores de amplificação são fornecidas.

[003]A invenção também se refere à utilização do método e kit para a detecção e identificação, se presentes em uma amostra de teste, de um ou mais agentes virais selecionados a partir do grupo consistindo em HSV-1, HSV2, HHV-6, VZV, CMV, EBV, enterovírus, HHV-7 e HHV-8.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004]Existem mais de 100 herpes vírus conhecidos na família de Herpesviridae. Destes, oito são conhecidos por infectar seres humanos: O vírus herpes simplex 1 (HSV-1), vírus herpes simplex 2 (HSV-2), vírus varicela-zoster (VZV), vírus Epstein-Barr (EBV), citomega-lovírus (CMV) , herpes vírus 6 (HHV6), herpes vírus 7 (HHV-7) e 8 herpes vírus (HHV-8).

[005]Herpes vírus são agentes infecciosos que, após uma infecção aguda inicial, estabelecem uma infecção latente, produzindo, em condições específicas, os retornos periódicos. A recorrência da infecção pelo herpes vírus está associada com a patologia neurológica e alteração. As manifestações clínicas mais comuns das infecções do sistema nervoso central associadas com

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2/28 este grupo de vírus são meningite asséptica, encefalite, meningoencefalite e Poliradiculopatia.

[006]Na sequência de infecções neurológicas produzidas por herpes vírus, outras doenças neurológicas de origem viral são aquelas produzidas por vírus do grupo enterovírus, conforme descrito em EP0789081. Ambos os enterovírus e herpes vírus são capazes de produzir síndromes neurológicas, tanto em pacientes imunocompetentes, bem como em imunodeprimidos. Portanto, há um grande interesse no estabelecimento de uma efetiva identificação do agente associado com sintomas neurológicos.

[007]Técnicas laboratoriais gerais para a detecção viral incluem o isolamento de vírus em células de cultura, técnicas sorológicas, bem como a detecção de material genético por PCR. As duas técnicas antigas são lentas e de baixa sensibilidade, assim, focando os esforços recentes na última técnica.

[008]Herpes vírus são vírus envelopados, cujo genoma é uma molécula de DNA de fita dupla, enquanto os enterovírus são vírus não-envelopados, cujo genoma é constituído por uma molécula de RNA de fita simples de polaridade positiva.

[009]Alguns exemplos de ensaios de PCR multiplex para detecção de herpes vírus são descritos em WO93/25707, WO2004/016219 e US2007/0207453.

[010]WO 2004/016219 descreve um método para a detecção e identificação de um ou mais herpes vírus em uma amostra, onde o método compreende o uso de iniciadores de consenso para a sequência de gene polimerase de DNA de herpes vírus conservados. Detecção e identificação são ainda realizadas através de ensaio de alteração de mobilidade de heteroduplex (HMSA), ensaio de dot blot ou PCR em tempo real.

[011]Além disso, EP0789081 descreve um método para detectar al

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3/28 guns vírus pertencentes à família de Herpesviridae (HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6 e EBV), bem como Enterovírus.

[012]EP0789081 descreve misturas de iniciadores de reação que são utilizados para a amplificação enzimática do genoma de vírus pertencentes à família Herpesviridae, tais como o HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6, ou EBV, bem como Enterovírus. Os iniciadores são utilizados em uma reação de multiplex que gera fragmentos de amplificação do mesmo tamanho, uma vez que a identificação do agente infeccioso em uma amostra só pode ser realizada por meio de uma segunda reação de amplificação sobre os produtos resultantes da primeira reação de amplificação, ou outra, por hibridização das sequências amplificadas com sondas de oligonucleotídeos específicos.

[013]WO 2007/056463 descreve métodos e composições para uso em análise quantitativa e simultânea de dois ou mais patógenos virais, bacterianos ou protozoários em uma amostra. Os métodos desta invenção envolvem a adição de iniciadores de oligonucleotídeo específicos para cada patógeno a ser detectado, juntamente com moléculas competidoras de ácido nucléico que são amplificadas com os iniciadores específicos de patógeno de uma eficiência similar.

[014]Markoulatos P et al. (2000, Journal of Clinical Laboratory Analysis, vol. 14, N°. 5, páginas 214-219), descreve um método para a detecção simultânea de HSV-1, HSV-2 e VZV em uma amostra biológica por PCR multiplex. Da mesma forma Shin CH, et al. (2003, Yonsei Medical Journal, Vol. 44. N° 6, páginas 1001-7), descreve um método para a detecção simultânea de HSV-1, HSV-2, CMV e EBV em uma amostra também por PCR multiplex.

[015]US 2007/0141559 descreve um método para detecção e diferenciação entre o HSV-1 e o HSV-2 em uma amostra usando iniciadores específicos para o HSV-1 ou HSV-2 por PCR multiplex ou independente.

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[016]Aspectos da presente invenção adicionalmente se referem a métodos para reduzir detecção de hibridização cruzada não-específica de sequências específicas de ácidos nucléicos alvo amplificada, particularmente, mas não exclusivamente, no desempenho de um método de detecção, como descrito acima.

[017]WO 03/033735 descreve um sistema de análise de teste de banho de imersão compreendendo reagentes secos que podem ser usados para detectar a presença da sequência de ácido nucléico específico dentro de uma amostra.

[018]WO 2007/032748 descreve um método para a detecção de metilação em uma amostra de DNA compreendendo quimicamente converter resíduos de citosina não metilados para uracila, amplificar o DNA quimicamente convertido usando iniciadores em que o iniciador superior é biotinilado e hibridar o produto marcado com uma sonda de oligonucleotídeos, juntamente com a adição de estrepavidina.

[019]WO99/25867 descreve um método para a detecção de ácidos nucléicos em várias amostras compreendendo, preparar os ácidos nucléicos na amostra, remover os inibidores de amplificação, gerar produtos PCR de seções do ácido nucléico a ser detectado e detectar automaticamente os produtos de amplificação.

[020]US2005/0287549 descreve um método para a detecção simultânea de um número de SNPs. Em particular, o uso de um par de iniciadores em que um iniciador é biotinilado é descrito. O produto de amplificação é então imobilizado por meio de reações avidina-biotina.

[021]EP0795612 descreve um método para amplificar e detectar um ácido nucléico alvo em uma amostra incluindo uma etapa de incubação de pósamplificação antes da detecção para inativar as enzimas de amplificação. Um

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5/28 produto biotinilado amplificado pode então ser detectado por hibridização com um conjugado estrepavidina-enzima.

[022]WO 01/094638 descreve um método de amplificação de ácido nucléico, incluindo um protocolo de ciclagem térmica, e o uso de iniciadores diretos marcados na etapa de amplificação.

[023]EP1595960 descreve um método para a detecção seletiva de ácido nucléico em uma amostra compreendendo ampliar ácidos nucléicos com dois iniciadores, um dos quais é biotinilado e hibridar o produto marcado com uma sonda de captura.

[024]KR060015668 descreve um método para a detecção de microorganismos patogênicos, compreendendo ampliar a sequência alvo com um iniciador marcado e hibridizar o produto marcado com sondas imobilizadas para a superfície de um chip de DNA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[025]O problema a ser resolvido pela presente invenção é a provisão de um método que permite melhorar a detecção de HSV-1 e HSV-2 em relação aos métodos da técnica anterior.

[026]O método contemplado deveria desejavelmente adicionalmente permitir a detecção de HHV-6, VZV, CMV, EBV e enterovírus.

[027]Isto tem sido resolvido pelo projeto de iniciadores de amplificação que, quando usados nas reações de amplificação de acordo com a presente invenção, resultam em uma melhora da sensibilidade de detecção.

[028]Uso dos iniciadores recentemente projetados é compatível com, pelo menos, os níveis de detecção sensíveis de VZV, CMV, EBV e enterovírus, como aqueles dos métodos da técnica anterior.

[029]Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção adicionalmente compreende iniciadores para uma amplificação eficiente e dePetição 870200007841, de 16/01/2020, pág. 16/52

6/28 tecção de HHV-7 e HHV-8.

[030]A presente invenção provê pares de iniciadores que não são alternativas simples para iniciadores já conhecidos do estado da técnica, mas que resultam em níveis de amplificação mais eficientes.

[031]Uma vantagem do método de acordo com a presente invenção é que a eficiência dos iniciadores de amplificação não é afetada negativamente pela presença dos pares de iniciadores de amplificação adicional:

- VV1S e VV1AS (para a amplificação do vírus VZV), no caso do método de amplificação de HSV-1 e HSV-2, ou

- CMVS e CMVAS-21 (para a amplificação de vírus CMV), EBVAS-23 e CMVS (para a amplificação do vírus EBV), HER1 e HER4 (para a amplificação de enterovírus), HV7-FW e HV7-RW (para a amplificação do vírus HHV-7), e HV8S e HV8AS (para a amplificação do vírus HHV-8), no caso do método de amplificação de HHV-6.

[032]As dificuldades na elaboração bem sucedida de PCRs multiplex são amplamente reconhecidas por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo Markoulatos et al, 2000, Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 14, N° 5, páginas 214-219; ou Shin et al. 2003, Yonsei Medical Journal, vol. 44, N°. 6, páginas 1001-7). Assim, será reconhecido que o projeto de iniciadores para uso em tais reações multiplex como não é uma obrigação de rotina.

[033]Uma vantagem adicional da presente invenção é que a amplificação com os iniciadores de amplificação da presente invenção resulta em produtos de amplificação de tamanhos diferentes, permitindo assim que um usuário distingue entre os diferentes vírus de interesse sem a necessidade de etapas adicionais, tais como uma segunda reação de amplificação dos produtos resultantes da primeira reação de amplificação, ou de hibridização das sequências amplificadas com sondas de oligonucleotídeos específicos.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[034]Figura 1. eletroforese em gel de agarose correspondente fragmentos de amplificação do Exemplo 1.

[035]Figura 2. eletroforese em gel de agarose correspondente fragmentos de amplificação do Exemplo 2.

[036]Figura 3. eletroforese em gel de agarose correspondente fragmentos de amplificação obtidos em condições experimentais do Exemplo 2.

[037]Figura 4. Lista dos iniciadores de amplificação.

[038]Figura 5. Comparação dos resultados obtidos, com ou sem biotinilação seletiva de iniciador, e na presença de um controle interno, para o HSV-1 e HSV-2. Painel A: Sem biotinilação seletiva dos iniciadores; Painel B: Com biotinilação seletiva dos iniciadores.

[039]Figura 6. Comparação dos resultados obtidos, com ou sem biotinilação seletiva de iniciador, e na presença de um controle interno, para CMV e EBV. Painel A: Sem biotinilação seletiva dos iniciadores; Painel B: Com biotinilação seletiva dos iniciadores.

[040]Figura 7. Ilustração de técnica de rotulagem de sonda para redução de detecção de hibridização cruzada.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[041]Definições. Os seguintes termos têm o significado indicado na especificação a menos que expressamente indicado para ter um significado diferente:

- Iniciadores de Ampliação: Ácidos nucléicos que se ligam e permitem amplificação de uma ou mais sequências alvo.

- Tubo de matriz: Um frasco de matriz individual, que tem forma e tamanho típico de um frasco de reação de laboratório (por exemplo, um tubo Eppendorf de 1,5 ml) com uma micromatriz disposta nele em que os testes base-

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8/28 ados em micromatriz podem ser realizados.

- Frasco de matriz: Um frasco de reação com fundo plano que compreende uma micromatriz. As moléculas de sonda da micromatriz podem ser impressas sobre um suporte sólido em que este suporte sólido pode ser o fundo de um frasco de matriz, ou um suporte sólido diferente ligado ao fundo de um frasco de matriz.

- Micromatriz: Disposição de sondas moleculares sobre uma superfície, onde a posição de cada sonda é determinada separadamente.

- PCR Multiplex e reações RT-PCR: reações PCR e RT-PCR que permitem a ampliação de duas ou mais sequências de ácido nucléico, se houver.

- Sondas: Ácido nucléico com capacidade para especificamente se ligar a uma sequência de ácido nucléico alvo. Isso inclui DNA, RNA, PNA, e qualquer outra forma ou modificação.

- Sensibilidade de detecção: O número mínimo de cópias detectadas. Sensibilidade melhorada aqui significa que há um menor número de cópia mínima detectável.

- Faixa de frascos: um conjunto de frascos de matriz, geralmente 8, cada um com uma micromatriz disposta no mesmo, em que os testes baseados em micromatriz podem ser realizados.

- Sequências alvo: Sequências a serem detectadas.

- Sondas alvo específicas: Sondas que hibridizam especificamente com as sequências alvo amplificáveis nas reações de amplificação.

[042]Iniciadores de amplificação originais para detecção de HSV-1 e HSV-2:

SEQ ID N° 1 (CGCATCATCTACGGGGACACGGA) e SEQ ID N° 2 (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (Estes são referidos em EP0789081 como SEQ ID N° 4 e 9, respectivamente; ver Figura 2 e Exemplo 1 de EP0789081).

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[043]O produto de amplificação foi comum a HSV-1 e HSV-2.

[044]A fim de distinguir entre eles, uma segunda amplificação do produto de amplificação teve de ser realizada, como no Exemplo 9 de EP0789081.

[045]Condições de amplificação, para a detecção de HSV-1 e HSV-2, de acordo com a presente invenção:

- Ampliação de HSV-1: iniciador recentemente projetado de SEQ ID N°

3, HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG), e iniciador de SEQ ID N° 2 HSV1AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), conhecido como iniciador de SEQ ID N° 9 em EP0789081.

- Ampliação de HSV-2: iniciador recentemente projetado de SEQ ID N°

4, HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) e iniciador de SEQ ID N° 2 HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), conhecido como iniciador SEQ ID N° 9 em EP0789081.

[046]Amplificação com os novos pares de iniciadores de amplificação resulta em uma maior sensibilidade de detecção em comparação com a amplificação com os iniciadores originais, como pode ser observado na Figura 1, correspondente ao exemplo 1.

[047]Além disso, amplificação com iniciadores HSV1S-18 e HSV1-AS é específica para HSV-1, e produz um fragmento de 262 pb no caso de HSV-1 estar presente na amostra, enquanto que com iniciadores HSV2S-20 e HSV1AS é específica para HSV-2, e produz um fragmento de 170 pb no caso de HSV-2 estar presente na amostra.

[048]Produtos de 262 e 170 pb são distinguíveis em eletroforese em gel de agarose, evitando assim a necessidade de ampliação adicional do produto de amplificação.

[049]Iniciadores de amplificação originais para a detecção de HHV-6:

SEQ ID N° 5 (GAGGTAATTTATGGTGATACGGA) e SEQ ID N° 6

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10/28 (TGTCTACCAATGTATCTTTTTTT), conhecido como SEQ ID N° 7 e 12, respectivamente, em EP0789081 (ver figura 2 e Exemplo 1 de EP0789081).

[050]Iniciadores de amplificação para a detecção de HHV-6, de acordo com a presente invenção:

Iniciador recentemente projetado HHV6A-AS (GGCGACTTGAACAGACGATC), de SEQ ID N° 7 e iniciador de SEQ ID N° 5, HV6S (GAGGTAATTTATGGTGATACGGA), conhecido como SEQ ID N° 7 em EP0789081.

[051]Uma melhora adicional é realizada quando, na mistura de iniciadores HHV6A-AS e HV6S, 50% da quantidade de iniciador HHV6A-AS são substituídos pelo iniciador recentemente projetado HHV6B-AS (GGCGATTTGAACAAGCGATC), de SEQ ID N° 8. A razão para a diferença é que o iniciador HHV6A-AS especificamente amplifica o subtipo A de HHV-6, enquanto HHV6B-AS especificamente amplifica o subtipo B de HHV-6.

[052]Exemplo 2 e Figura 2 correspondente, exibe a melhora da sensibilidade obtida com os novos iniciadores de amplificação, em relação aqueles obtidos com a mistura original de iniciadores de amplificação de SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 (referidos em EP0789081 como SEQ ID N° 7 e SEQ ID N° 12, respectivamente).

[053]O método da presente invenção também fornece condições de amplificação que permitem a ampliação de VZV, CMV, EBV e enterovirus em, pelo menos, como níveis de detecção sensíveis como aqueles dos métodos da técnica anterior. Além disso, o método da presente invenção compreende iniciadores para uma amplificação eficiente e detecção de HHV-7 e HHV-8. Algumas imagens representativas são fornecidas nas Figuras 1 a 3, correspondentes aos exemplos 1 e 2 abaixo.

[054]Em uma modalidade preferida da presente invenção, os iniciadoPetição 870200007841, de 16/01/2020, pág. 21/52

11/28 res de amplificação correspondem aos da Figura 4.

[055]Os iniciadores para a amplificação de Enterovirus permitem a amplificação de diferentes tipos de enterovírus: Echovirus, Poliovírus e Cosackievirus, se presentes na amostra.

[056]Em uma modalidade preferida da presente invenção um método para detectar HSV-1, HSV-2, HHV-6, VZV, CMV, EBV, HHV-7, HHV-8 e enterovírus compreende amplificação de material genético viral em duas reações independentes:

[057]Uma correspondente a HSV-1, HSV-2 e VZV (tubo 1), e outra correspondente a HHV-6, CMV, EBV, HHV-7, HHV-8 e enterovírus (tubo 2), onde os respectivos iniciadores correspondentes são incubados com a amostra de interesse. Em uma modalidade preferida, a reação de um tubo é um PCR, e a do tubo 2 é um RT-PCR.

[058]Em uma modalidade preferida da presente invenção, os tubos 1 e 2 compreendem os seguintes componentes:

Tubo 1:

Reagentes de PCR Multiplex 1 Volume (pl)

Amostra5

DNA Polimerase 10 X Tampão5

MgCl2, 25mM2 dNTPs, 10 mM1

HSV1S-18, 0,1 pg/ pl0,8

HSV1-AS, 0,1 pg/ pl1,6

HSV2S-20, 0,1 pg/ pl0,8

VV1S, 0,1 pg/ pl0,8

VV1AS, 0,1 pg/ pl0,8

DNA polimerase0,8

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Água livre de Nuclease

Até volume final de 50 μΙ

[059]Em uma modalidade preferida, o par de iniciadores utilizado para amplificação de HSV-1 é formado por HSV1S-18 e HSV1-AS; O par de iniciadores para HSV-2 é formado por HSV2S-20 e HSV1-AS, E o par de iniciadores para VZV é: VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA), SEQ ID N° 9, e

VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT), SEQ ID N° 10. (Estes últimos iniciadores correspondem, respectivamente, aos de SEQ ID N° 5 e 10 da Figura 2 do EP0789081). O tamanho esperado dos iniciadores de amplificação corres pondentes é:

Vírus	Tamanho (bp)
HSV-1	262
HSV-2	170
VZV	193

Tubo 2:

Reagentes de PCR Multiplex 2 Volume (μθ

Amostra5

RT-PCR 5 X Tampão10 dNTPs, 10 mM2

HS6S-18, 0,1 μg/ μl0,8

HHV6A-AS + HHV6B-AS, 0,1 μg/ μl (50% cada) 0,8 CMVS, 0,1 μg/ μl1,6

CMVAS-21, 0,1 μg/ μl0,8

EBVAS-23, 0,1 μg/ μl0,8

HV7-FW, 0,1 μg/ μl0,8

HV7-RW, 0,1 μg/ μl0,8

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HV8S, 0,1 pg/ μΙ 0,7

HV8AS, 0,1 μς|/ μΙ0,7

HER1, 20 μΜ0,4

HER4, 40 μΜ0,2

Água livre de Nuclease Até volume final de 50 μΙ

[060]Em uma modalidade preferida, o par de iniciadores utilizados para amplificação de HHV-6 é formado por HV6S (SEQ ID N° 5, referido como SEQ ID N° 7 na figura 2 de EP0789081) e uma mistura de iniciadores HHV6A-AS e HHV6B-AS, SEQ ID N° 7 e 8, respectivamente, de acordo com a presente invenção (ver acima e na Figura 4 para as sequências correspondentes); O par de iniciadores para CMV é formado por SEQ ID N° 11, CMVS (correspondente a SEQ ID N° 6 da Figura 2 de EP0789081) e SEQ ID N° 12, CMVAS-21 da presente invenção (ver Figura 4); O par de iniciadores para EBV é: SEQ ID N° 13, EBVAS-23 (ver Figura 4) e SEQ ID N° 11, CMVS (correspondente a SEQ ID N° da Figura 2 de EP0789081); Pares restantes de iniciadores são: HV7-FW e HV7-RW, para HHV-7; HV8S e HV8AS para HHV-8; HER1 e HER4 por enterovirus (ver Figura 4).

[061]O tamanho esperado dos iniciadores de amplificação correspondentes é:

Vírus	Tamanho (bp)
HHV-6	122
CMV	106
EBV	132
HHV-7	207
HHV-8	192
Enterovirus	328

[062]Em uma modalidade preferida, as reações de PCR do tubo 1 e 2

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14/28 são executadas em um termociclador programado com o seguinte perfil cíclico:

ciclo 45°C 45 min ciclo 95 °C 15 min ciclos 95 °C 30s °C 1 min 30s °C 1 min ciclo 72 °C 10 min

[063]As diferenças dos tamanhos dos fragmentos permitem distinguir qual o vírus está presente na amostra, sem a necessidade adicional de realizar uma segunda reação de amplificação.

[064]Além disso, os valores de sensibilidade obtidos com o método de acordo com a presente invenção são pelo menos os mesmos que aqueles obtidos com os pares de iniciadores do estado da técnica (ver exemplos 1 e 2, assim como as Figuras 1 a 3).

[065]Em outra modalidade preferida, um ou ambos os tubos de reação adicionalmente compreendem controles internos. Em uma modalidade preferida, o protocolo da presente invenção inclui um controle interno da etapa de extração de ácidos nucléicos. Em outra modalidade preferida, o protocolo da presente invenção inclui um controle interno da etapa de amplificação de ácidos nucléicos.

[066]Um controle interno preferido seria um plasmídeo de DNA que seria amplificável com iniciadores de amplificação RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT, SEQ ID NO 20) e RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT, SEQ ID NO 21). Preferencialmente, o controle interno seria:

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Reagentes Multiplex Volume (μΙ)

DNA de controle interno, 103 cópias5

RTS 20 μΜ0,5

RTA 20 μΜ0,5

[067]Em um volume final de reação de 50 ul.

[068]O produto de amplificação correspondente ao DNA de controle interno é um fragmento de DNA de 885 pb.

[069]Controles internos preferidos adicionais da presente invenção seriam um fragmento de RNA que deveria ser preferencialmente adicionado à amostra de teste antes da extração de ácidos nucléicos. Outro controle interno preferido seria um fragmento de RNA que deveria ser preferencialmente adicionado aos ácidos nucléicos após a extração da amostra de teste. Em uma modalidade mais preferida, o fragmento de RNA estaria presente dentro do frasco que contém os reagentes de amplificação, antes da incubação com os ácidos nucléicos obtidos a partir a amostra de teste.

[070]Em uma modalidade mais preferida, o fragmento de RNA poderia ser obtido através da transcrição do RNA de um plasmídeo. Em outra modalidade preferida o fragmento de RNA poderia ser obtido por síntese química.

[071]Um problema inerente de PCRs multiplex é que a presença de vários iniciadores na mesma reação de amplificação pode levar a uma interação entre os iniciadores presentes, que podem impedir a sua hibridização com suas sequências alvo e amplificação correspondente. Este obstáculo técnico foi superado pela combinação específica de iniciadores de amplificação do Multiplex correspondente ao tubo 1 e ao tubo 2.

[072]Em uma modalidade preferida, tipos de amostras que podem ser

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16/28 processados pela presente invenção são cotonetes, biópsias embebidas em parafina, bem como solução salina, plasma e fluido cefalorraquidiano.

[073]Em outra modalidade preferida, a extração de material genético pode ser realizada tanto por meio de técnicas de extração automática, bem como por meio de técnicas de extração manual do estado da técnica.

[074]Em uma modalidade ainda mais preferida, um sistema de extração automática que pode ser usado para o isolamento de DNA e RNA das amostras da presente invenção é o easyMAG NucliSENS da bioMerieux (EP1694813), que usa partículas magnéticas em combinação com tecnologia bioMerieux BOOM® para o isolamento universal de ácido nucléico total a partir de uma ampla gama de volumes de amostra e tipos.

[075]O versado deve ter conhecimento de técnicas e métodos para o processamento manual de amostras para extração de DNA e outros ácidos nucléicos; e qualquer tal método adequado pode ser usado.

[076]Em um exemplo particular, ácidos nucléicos são extraídos de 50 ul de amostra de teste. Após a etapa de extração, um precipitado é ressuspenso em 25 pl de água livre de RNase.

[077]Em uma modalidade preferida / particular, 5 pl dos 25 pl que compõem o material genético extraído da amostra, são adicionados ao recipiente que contém os reagentes de amplificação, em um volume final de 50 pl.

[078]Em uma modalidade preferida da presente invenção, os produtos de PCR obtidos com os iniciadores de amplificação de acordo com a presente invenção, podem ser adicionalmente caracterizados por meio da tecnologia de micromatriz. A tecnologia de micromatriz provê detecção simultânea de vários marcadores moleculares para uso em diagnóstico, enquanto provê controle necessário para garantir a confiabilidade dos resultados.

[079]Em uma modalidade preferida da presente invenção, um marca

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17/28 dor pode ser introduzido no DNA amplificado durante a sua ampliação para permitir a detecção adicional, de preferência um marcador que provê um sinal que pode ser detectado por métodos colorimétricos. Na modalidade preferida, o marcador é biotina. No entanto, qualquer outro tipo de marcador conhecido na técnica pode ser utilizado (digoxigenina, por exemplo). Marcadores radioativos podem ser usados, ou fluoróforos, em certas modalidades. Em uma modalidade preferida, a rotulagem de DNA amplificado pode ser alcançada pela adição de nucleotídeos modificados portando um marcador (por exemplo, derivados de dUTP biotinilado ou digoxigenina) na mistura de amplificação. Em outra modalidade ainda mais preferida, o marcador está contido nos iniciadores de amplificação.

[080]Em uma modalidade preferida da presente invenção, DNA amplificado, previamente desnaturado, é hibridizado com sondas específicas alvo para minimizar o problema de PCRs multiplex que consistem na obtenção dos fragmentos de amplificação inespecífica, devido à presença de vários iniciadores.

[081]Em uma modalidade preferida, a desnaturação de DNA amplificado pode ser realizada por aquecimento. Outras maneiras de preparar o DNA de fita simples após amplificação podem ser utilizadas, bem como, por exemplo, meios químicos.

[082]Os iniciadores da presente invenção, marcados com biotina, foram testados para verificar sua eficiência de amplificação por eletroforese em gel de agarose. Rotulagem de um ou dois de cada par de iniciadores foi testada. As condições selecionadas foram as seguintes:

	HSV- 1	HSV- 2	VZV	CMV	EBV	HHV- 6	HHV- 7	HHV- 8	Entero
1 iniciador						X			X

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marcado
2 iniciadores marcados	X	X	X	X	X		X	X

X indica condição escolhida.

[083]Em geral, a rotulagem de um ou dois dos iniciadores com biotina não afetou a eficiência de amplificação dos iniciadores. Na maioria dos casos, a rotulagem de ambos os iniciadores foi selecionada.

[084]Não obstante a isso, quando os produtos de amplificação foram desnaturados e hibridizados com sondas que foram específicas para cada vírus, houve problemas de hibridização cruzada (ou seja, de ligação com sondas específicas para um outro vírus): Assim, o produto de amplificação de hibridizado cruzado com HSV-1 com a sonda específica para HSV-2; e o produto de amplificação de hibridizado cruzado com EBV com a sonda específica para CMV. Esse problema não foi resolvido facilmente devido à homologia de sequência entre os vírus.

[085]O problema foi resolvido da seguinte forma: Apenas um iniciador de cada par de iniciadores de amplificação dos vírus que trans-hibridizam (isto é, o HSV-1 ou EBV) 1 foi marcado com biotina. Desse modo, a fita de ácido nucléico dos fragmentos de amplificação que hibridizam com a sonda específica para outros vírus (ou seja, trans-hibridiza) não é marcado, e, portanto, não produz qualquer sinal.

[086]Desta forma, embora a fita complementar hibridize com a sonda correspondente ao outro vírus, nenhum sinal será gerado.

[087]No presente caso, a fita de HSV-1, que trans-hibridiza com HSV-2 não foi marcado, nem foi a fita de EBV que trans-hibridiza com CMV. Especificamente, para a amplificação de HSV-1, HSV1 S-18 foi não marcado e HSV1

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AS foi marcado com biotina. Para amplificação de EBV, EBVAS-23 foi não marcado e CMVS foi marcado com biotina. Ambos os iniciadores para amplificação de HSV-2 (HSV1 e HV2S-AS-20) e de CMV (CMVS e CMVAS-21) foram marcado com biotina.

[088]Qualquer método de rotulagem pode ser utilizado.

[089]Uma ilustração do esquema de rotulagem utilizado é apresentado na Figura 7.

[090]Condições de amplificação adequadas das reações de PCR Multiplex 1 e RT-PCR Multiplex 2 são as seguintes:

Reagentes de PCR Multiplex 1	Volume (pl)
Amostras	5
DNA Polimerase 10 X tampão	5
MgCl2, 25mM	2
dNTPs, 10 mM	1
HSV1S-18, 0,1 pg / pl	0,8
B- HSV1-AS, 0,1 pg / pl	1,6
B- HSV2S-20, 0,1 pg / pl	0,8
B- VV1S, 0,1 pg / pl	0,8
B- VV1AS, 0,1 pg / pl	0,8
DNA Polimerase	0,8
Água livre de nuclease	Até o volume final de 50 pl
Reagentes de PCR Multiplex 2	Volume (pl)
Amostras	5
RT-PCR 5x tampão	10
DNTPs 10 mM	2
HV6S, 0,1 pg / pl	0,8

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B- HHV6A-AS + B- HHV6B-AS, 0,1 pg / pl (50% cada) 0,8

B- CMVS, 0,1 μg / μl	1,6
B- CMVAS-21, 0,1 μg / μl	0,8
EBVAS-23, 0,1 μg / μl	0,8
B- HV7-FW, 0,1 μg / μl	0,8
B- HV7-RW, 0,1 μg / μl	0,8
B- HV8S, 0,1 μg / μl	0,7
B- HV8AS, 0,1 μg / μl	0,7
B- GER1, 0,1 μg / μl	0,4
HER4, 40 μΜ	0,2
Água livre de nuclease	Até o volume final de 50 μl

[091]De preferência, uma ou ambas das reações Multiplex ainda compreendem um DNA de Controle Interno, por exemplo, na forma de um plasmídeo de DNA, e iniciadores para a sua ampliação. Por exemplo:

Reagentes

Volume (pl)

DNA de controle interno, 103 cópias 5

RTS 20 μΜ

RTA 20 μΜ

0,5

[092]Introdução de componentes acima citados em qualquer reação

Multiplex não afeta o resultado obtido.

[093]A comparação dos resultados obtidos sob as condições preferidas acima mencionadas, com ou sem biotinilação de iniciador seletiva, e na presença dos controle interno acima mencionado, é apresentada, para o HSV-1 / HSV-2 e CMV / EBV, respectivamente, nas Figuras 5 e 6.

[094]Os fragmentos amplificados obtidos foram hibridizados em um tubo de matriz com diferentes sondas seletivas correspondentes a cada vírus, como indicado.

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[095]Em uma modalidade preferida da presente invenção, o DNA de fita simples é incubado com uma pluralidade de sonda alvo específica provida em uma micromatriz. Pelo menos uma, mas de preferência mais de uma sonda com capacidade para hibridizar com cada sequência alvo, são fornecidas na micromatriz. Em certas modalidades da invenção, o DNA de fita simples pode ser incubado com as sondas específicas alvo providas em solução, no entanto, é preferível que as sondas sejam providas em um suporte sólido.

[096]Em uma modalidade preferida da presente invenção, as sondas estão contidas em uma micromatriz, que pode ser colocada sobre uma lâmina ou contida em um recipiente de reação, que é então chamado de um frasco de matriz. Frascos de matriz podem ter diferentes formatos de apresentação, incluindo frascos de matriz individual, em particular tubos de matriz, ou conjuntos de frascos de matriz dispostos em faixas ou placas planas. Normalmente, as placas consistem em conjuntos de tiras de frascos de matriz. Assim, uma micromatriz da presente invenção pode estar contida em um recipiente individual da matriz. Alternativamente, duas ou mais micromatrizes podem estar contidas em uma faixa de frascos. Em uma modalidade preferida, a faixa de frascos é constituída por oito frascos. Além disso, três ou mais frascos de matriz podem ser organizados em um conjunto de tiras de frascos. Em uma outra modalidade preferida, o conjunto de tiras de frascos é uma placa de microtitulação.

[097]Em modalidades preferidas, as moléculas de sonda de micromatriz podem ser impressas sobre um suporte sólido em que este suporte sólido pode ser o fundo de um frasco de matriz ou um suporte sólido diferente ligado ao fundo de um frasco de matriz. Isto significa que a superfície da micromatriz pode ser o fundo plano do frasco de matriz. Alternativamente, a superfície da micromatriz pode ser um suporte sólido ligado ao fundo do frasco da matriz.

[098]Em uma modalidade da presente invenção, o frasco de reação

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22/28 tem um tamanho típico para um frasco de reação em laboratório. Os volumes de enchimento estão na faixa de 100 μl para 2,5 ml, mas também podem ser maiores ou menores em modalidades especiais. Especialmente de preferência, o frasco de reação é um tubo de matriz, ou seja, um frasco de matriz com um volume normal de enchimento para um tubo Eppendorf padrão de até 1,5 ml. Além disso, volumes de enchimento preferidos são até 0,4 ml, até 0,5 ml até 0,7 ml até 1,0 ml, ou até 2,0 ml.

[099]Devido à rotulagem do DNA amplificado, sempre que moléculas de amostra interagir com moléculas da sonda na superfície da micromatriz, um reagente repórter liga o marcador e produz sinais visíveis que podem ser detectados por um dispositivo de detecção. A sonda interagindo e moléculas de amostra são identificadas pela posição do sinal na superfície da micromatriz. No caso particular onde moléculas de DNA de amostra são rotuladas com biotina, o agente repórter pode ser peroxidase de rábano silvestre covalentemente ligada a estreptavidina. Esta última liga-se especificamente à biotina, e a peroxidase desencadeia a precipitação de substratos como tetrametilbenzidina (TMB). Qualquer outra reação que resulta em um precipitado sobre os elementos de matriz, e que pode ser usada para detectar a interação entre moléculas de sonda e alvo de acordo com a presente invenção pode ser usada.

[0100]As sondas da presente invenção podem ser obtidas por diferentes métodos, tal como a síntese química (por exemplo, o método de fosfotriéster convencional) ou técnicas de engenharia genética, por exemplo, clonagem molecular de plasmídeos recombinantes em que sequências de nucleotídeos correspondentes foram inseridas e podem ser mais tarde obtidas por digestão com nucleases.

[0101]Sondas específicas podem ser projetadas usando o programa de alinhamento de ácido nucléico Oligo 6. Os parâmetros de Tm e relação G/C

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23/28 são analisados em todos os casos, e formação da estrutura secundária foi evitada. Sondas preferidas da presente invenção são aquelas com o mesmo Tm sob a concentração de sal que é usada na etapa de hibridização. Em uma modalidade preferida, as sondas são selecionadas para ligar a suas sequências alvo equivalentes nas mesmas condições de hibridização. O versado na técnica deve ter conhecimento de outras maneiras em que as sondas específicas podem ser projetadas.

[0102]Em uma modalidade particular da presente invenção, as sondas são selecionadas de modo que elas não hibridizam com DNA genômico, e não hibridizam de forma inespecífica com fragmentos amplificados correspondentes a outros vírus.

[0103]Em uma modalidade preferida, uma ou mais sondas da presente invenção são fornecidas em um suporte sólido.

[0104]Em outra modalidade preferida, duas ou mais sondas alvo específicas para a mesma sequência alvo são fornecidas sobre o suporte sólido, a fim de melhorar a detecção dos agentes virais de interesse.

[0105]Em uma modalidade preferida, as sondas da presente invenção são de 30 nt de comprimento ou menos.

[0106]As sondas ou misturas de sondas podem ser imobilizadas em um único local do suporte sólido, de preferência em dois locais distintos do suporte sólido e mais preferencialmente em três locais distintos do suporte sólido.

[0107]Em uma modalidade preferida, as sondas da presente invenção são fornecidas em um suporte sólido localizado dentro de um frasco de matriz.

[0108]Em outra modalidade, as sondas da presente invenção são fornecidas em um suporte sólido localizado dentro de uma tira de matriz.

[0109]Em uma modalidade mais preferida, a tira de matriz da presente invenção tem 8 frascos de matriz.

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[0110]Em uma modalidade preferida, o suporte sólido é uma lâmina de vidro revestida.

[0111]Em uma outra modalidade preferida, o suporte sólido é o fundo de um frasco de matriz, o frasco de matriz sendo um tubo de matriz individual, ou um componente de uma faixa de frascos ou conjunto de tiras de frascos, tal como uma placa de microtitulação.

[0112]Em uma modalidade preferida, as interações tomadas em placas entre o DNA amplificado com os pares de iniciadores da presente invenção, e sondas de detecção correspondentes, ocorrem em um frasco de matriz individual, em uma tira de frascos, ou em um conjunto de tiras de frascos.

[0113]Em uma modalidade preferida, a visualização de tais interações consiste nas seguintes etapas:

[0114]Primeiro, a imagem da matriz é captada usando um dispositivo óptico,

[0115]Em seguida, a imagem é analisada,

[0116]Por último, um relatório contendo uma interpretação do resultado é fornecido.

[0117]De preferência, a imagem é analisada por meio de software apropriado.

[0118]Qualquer dispositivo adequado para este tratamento pode ser utilizado.

[0119]Em uma modalidade particular, sondas para detecção específica de controle interno amplificáveis com iniciadores de amplificação RTS e RTA também estão presentes na micromatriz. Em particular, as sondas Cl 1 5' (CAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG, SEQ ID NO 22), Cl 1 3' (TTGAAGTGGTGGCCTAACTACGG, SEQ ID NO 23) e Cl 2 5' (CGTTCCACTGAGCGTCAGACCC, SEQ ID NO 24) podem ser usada.

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Exemplos

[0120]Os exemplos providos a seguir meramente ilustram a invenção e de forma alguma limitam o escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1

[0121]5 pl da amostra a ser analisada foram adicionados aos reagentes de amplificação de PCR Multiplex 1, em um volume final de reação de 50 pl, conforme segue:

Reagentes de PCR Multiplex 1	Volume (pl)
Amostra	5
Tampão Taq Gold DNA Polimerase	5
MgCl2, 25mM	2
dNTPs, 10 mM	1
HSV1S-18, 0,1 pg/ pl	0,8
HSV1-AS, 0,1 pg/ pl	1,6
HSV2S-20, 0,1 pg/ pl	0,8
VV1S, 0,1 pg/ pl	0,8
VV1AS, 0,1 pg/ pl	0,8
DNA de Controle Interno, 103 cópias	5
RTS 20 pM	0,5
RTA 20 pM	0,5
Taq Gold DNA polimerase	0,8
Água livre de Nuclease	Até volume final de 50 pl

[0122]As reações de PCR foram realizadas em um termociclador programado com o seguinte perfil de ciclismo:

1 ciclo	45°C 45 min
1 ciclo	95 °C 15 min
45 ciclos	95 °C 30s

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26/28 ciclo °C 1min 30s °C 1 min °C 10 min

[0123]O par de iniciadores formados pelo iniciador recentemente projetado de SEQ ID N° 3 HSV1 S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) e SEQ ID N° 2, HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), este último referido como iniciador SEQ ID N° 9 em EP0789081, produz um fragmento de 262 pb que corresponde a HSV-1 (ver figura 1); Além disso, o par de iniciadores formado pelo iniciador recentemente projetado de SEQ ID N° 4, HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) e SEQ ID N° 2, HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), este último conhecido como iniciador

SEQ ID N° 9 em EP0789081, produz um fragmento de 170 pb que corresponde a HSV-2.

[0124]Alternativamente, em uma reação separada, o par de iniciadores utilizado em EP0789081, formado por SEQ ID N° 1 (CGCATCATCTACGGGGACACGGA), conhecido como SEQ ID N° 4 em EP0789081 e SEQ ID N° 2 (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), conhecido como SEQ ID N0 9 em EP0789081, (Figura 2 e Exemplo 1 de EP0789081), foi utilizado, sob as mesmas condições acima, em vez de HSV1S-18, HSV1-AS e HSV2S- 20. Um volume de 1,8 pl de uma solução de 0,1 pg/pl de cada iniciador, foi utilizado. O produto de amplificação desses iniciadores é comum para o HSV-1 e HSV-2.

[0125]Os resultados comparativos obtidos com os iniciadores de amplificação diferentes são mostrados na Figura 1.

[0126]Em ambas as reações, o par de iniciadores utilizado para amplificação de VZV foi: SEQ ID N° 9, VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA), e SEQ ID N° 10, VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT). Os iniciadores cor

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27/28 respondem, respectivamente, aqueles de SEQ ID N° 5 e 10 da Figura 2 de EP0789081. O tamanho esperado do fragmento de amplificação correspondente é de 193 pb.

[0127]Como pode ser observado na Figura 1, a reação de acordo com a presente invenção resulta em valores de sensibilidade melhorada de detecção de HSV-1, HSV-2 e VZV, quando comparada com a reação realizada com os iniciadores do estado da técnica. No caso de VZV, isto pode ser devido à combinação particular vantajosa de iniciadores da reação de acordo com a presente invenção. Comparação dos valores de sensibilidade obtida é a seguinte:

Vírus	Sensibilidade (HSV1S-18, HSV2S-20, HSV1- AS)	Sensibilidade (HSV1-AS, SEQ ID NO 4 ((CGCATCATCTACGGGGACACGGA))
HSV-I	10	10²
HSV-II	10	>10
VZV	10	>10

Exemplo 2.

[0128]5 μΙ da amostra a ser analisada foram adicionados aos reagentes de amplificação de RT-PCR Multiplex 2, em um volume final de 50 μΙ, conforme segue:

Reagentes de RT-PCR Multiplex 2	Volume (μθ
Amostras	05
5x QIAGEM OneStep tampão RT-PCR	10
5x Q-solução	10
HV6S, 0,1 μg / μl	0,8
HHV6A-AS + HHV6B-AS, 0,1 μg / μl (50% ca-	0,8

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da)
dNTPs, 10mM	2
CMVS, 0,1 pg / pl	1,6
CMVAS-21, 0,1 pg / pl	0,8
EBVAS-23, 0,1 pg / pl	0,8
HV7-FW, 0,1 pg / μ	0,8
HV7-RW, 0,1 μg / μl	0,8
HV8S, 0,1 μg / μl	0,7
HV8AS, 0,1 μg / μl	0,7
HER1,20 μM	0,4
HER4, 40 μM	0,2
DNA de controle interno, 103 cópias	5
RTS 20 μM	0,5
RTA 20 μM	0,5
QIAGEM OneStep mistura de enzima RT-PCR	2
Água livre de nuclease	Até o volume final de 50 μl

Condições de amplificação foram as mesmas de PCR Multiplex 1.

[0129]Alternativamente, em uma reação separada, o par de iniciadores descrito na EP0789081 para HHV-6, CMV, EBV e Enterovírus (ver figura 2 e Exemplo 1 de EP0789081) foi utilizado. Comparação de sensibilidades correspondente a HHV-6 é mostrada na Figura 2 abaixo. A Figura 3 fornece fragmentos de amplificação adicionais obtidos nas condições experimentais descritas acima.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detecção de HSV-1, HSV-2 e VZV CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a amplificação em um único tubo de uma amostra compreendendo material genético viral com os pares de iniciadores:

HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) (SEQ ID NO: 3) e HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID NO: 2);

HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) (SEQ ID NO: 4) e HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID NO: 2); e

VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) (SEQ ID NO: 9) e VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID NO: 10), para obter produtos de amplificação que compreendem partes de material genético de HSV-1, HSV-2 e VZV, se houver.

2/4

e) detectar oligonucleotídeos hibridizados.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 CARACTERIZADO pelo fato de que o iniciador HSV1S-18 (SEQ ID NO: 3) não é marcado e o iniciador HSV1-AS (SEQ ID NO: 2) é marcado, tal que o produto de amplificação relevante compreende uma fita de amplificação marcada e uma fita de amplificação não marcada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende a desnaturação dos produtos de amplificação; e a hibridização dos produtos de amplificação com uma ou mais sondas que podem ser sondas alvo específicas e alvo não específicas, em que a fita marcada obtida do iniciador HSV1-AS (SEQ ID NO: 2) marcado pode hibridizar com uma sonda alvo específica, e a fita não marcada obtida do iniciador HSV1S-18 (SEQ ID NO: 3) não marcado pode hibridizar com a sonda alvo não específica (se houver).

6. Kit para a detecção e identificação em uma amostra de teste de HSV-1, HSV-2 e VZV, o kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

i) uma mistura de amplificação de ácido nucléico compreendendo os pares de iniciadores de amplificação HSV1S-18 (SEQ ID NO: 3) e HSV1-AS (SEQ ID NO: 2), HSV2S-20 (SEQ ID NO: 4) e HSV1-AS (SEQ ID NO: 2), e VV1S (SEQ ID NO: 9) e VV1AS (SEQ ID NO: 10), ii) um frasco de matriz ou conjunto de frascos de matriz, cada um compreendendo uma micromatriz em que as sondas alvo específicas são providas, iii) reagentes para uso na visualização da hibridização de ácidos nucléicos com as sondas da micromatriz.

7. Kit, de acordo com reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende reagentes para a extração e/ou purificação de ácidos nucléicos.

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2. Método, de acordo com reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende desnaturar os produtos de amplificação e hibridizar os produtos com sondas alvo específicas.

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8. Kit, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o par de iniciadores constituído por HSV1S-18 e HSV1-AS compreende o iniciador HSV1S-18 (SEQ ID NO: 3) não marcado, e iniciador HSV1-AS (SEQ ID NO: 2) marcado.

9. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende, como controle interno, iniciadores de amplificação RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT) (SEQ ID NO: 20) e RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT) (SEQ ID NO: 21), bem como um ácido nucléico amplificável por tais iniciadores.

10. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o frasco de matriz é um tubo de matriz.

11. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjunto de frascos de matriz é uma tira de matriz.

12. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que as moléculas de sonda da micromatriz são impressas sobre um suporte sólido, o suporte sólido sendo o fundo de um frasco de matriz.

13. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que as moléculas de sonda da micromatriz são impressas sobre um suporte sólido, o suporte sólido sendo fixado no fundo de um frasco de matriz.

14. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a micromatriz compreende sondas que se ligam a suas sequências alvo equivalentes nas mesmas condições de hibridização.

15. Uso do método, como definido em qualquer uma das reivindicações

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3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

a) colocar em contato a amostra com o conjunto de iniciadores de amplificação;

b) submeter a amostra de teste misturada com o conjunto de iniciadores de amplificação para uma reação de amplificação de ácidos nucléicos, a reação de amplificação sendo destinada a amplificar sequências alvo presentes na amostra;

c) obter oligonucleotídeos de fita simples a partir de quaisquer produtos de amplificação;

d) permitir que oligonucleotídeos de fita simples de c) hibridizem com uma pluralidade de sondas alvo específicas,

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1a 5, ou do kit, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a detecção e identificação, se presentes em uma amostra de teste, de um ou mais agentes virais selecionados a partir do grupo compreendendo HSV-1, HSV-2 e VZV.