CN104662167B - 确定致腹泻病原体的存在的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测来自患者、食物或环境样品的致腹泻病原体的领域。具体地，本发明提供了用于检测致腹泻病原体的基于聚合酶链式反应(PCR)的方法。本发明还提供了用于本发明的方法的材料诸如引物、引物对和探针。优选地，本发明的方法是用于快速确定与旅行者腹泻相关的临床上重要的病原体的多重实时PCR(RT‑PCR)测定。

Description

确定致腹泻病原体的存在的方法
发明领域
本发明涉及检测来自患者、食物或环境样品的致腹泻病原体的领域。尤其是，本发明提供了用于检测致腹泻病原体(尤其是产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和弯曲杆菌属物种(Campylobacter species))的基于聚合酶链式反应(PCR)的方法。本发明还提供了用于本发明的方法的材料，如引物、引物对和探针。优选地，本发明的方法是用于快速确定与旅行者腹泻相关的临床上重要的病原体的多重实时PCR(RT-PCR)测定。
发明背景
腹泻是世界范围内导致发病率，在发展中国家还是导致婴儿死亡率的主要健康问题。腹泻是关于旅行者最广为报道的问题，且常由食物或水的污染所导致。在大多数情况下，旅行者腹泻是轻度的，且持续时间短，但也存在伴腹痛、血性腹泻和败血病的严重感染。
旅行者急性腹泻的病因众多、各不相同。除了经典的腹泻细菌，比如，沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、志贺氏菌(Shigella)和耶尔森氏菌(Yersinia)，腹泻大肠杆菌菌株也与旅行者腹泻相关联。(肠出血性大肠杆菌(enterohemorrgenic E.coli)；EHEC，肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)；ETEC，粘附和脱落大肠杆菌(attaching and effacing E.coli)；A/EEC或肠集聚性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli)；EAEC，肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)；EPEC，产vero细胞毒素大肠杆菌(verocytotoxin producing E.coli)；VTEC，肠出血性大肠杆菌；EHEC，肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli)；EIEC)。沙门氏菌感染科导致易变的临床疾病，从轻度的、亚临床感染起始，或导致严重的系统感染、伤寒症。沙门氏菌属物种利用III型分泌系统经过结肠上皮细胞，尤其是M细胞侵入宿主。它们还能够在巨噬细胞的吞噬小体中存活，并通过若干途径逃避宿主免疫系统(Coburn等人，2007)。空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)是大的弯曲杆菌属家族中导致水性腹泻、发烧和通常强烈腹痛的主要人类粪便病原体。通过诊断方式，必须将其与和腹泻不相关的其他弯曲杆菌属物种相剖离。它们能够侵入结肠上皮内层并在细胞内复制和导致凋亡(Poly和Guerry，2008；Allos，2001)。小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)具有含相关粘附和侵入蛋白的毒力质粒，如YadA的毒力质粒(Bottone，1999，El Tahir et al.，2001)。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌，需要导致临床疾病的毒力质粒，而假结核耶尔森氏菌也具有另外的基因组毒力因子。鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)是瘟疫病原体，其含有导致临床疾病所需的基因组毒力因子和毒力质粒(Bottone，1999)。传统的病原体还与迟发症状相关联，比如反应性关节炎、骶髂关节炎和急性前葡萄膜炎。
在一些热带国家中，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是生活于自由水中的高毒力环境病原体，尤其在灾难地区导致流行病。其通常导致大规模的水性腹泻，若无充分救治则引起患者死亡。必需的毒力因子是霍乱毒素，其由两个亚单位A和B组成。霍乱毒素能够在结肠上皮细胞中不可逆地结合G-蛋白，其负责导致非主动连续分泌到肠腔的液体和电解质摄取(Nelson et al.，2009)。
志贺氏菌和EIEC是遗传性上密切相关的。该两种生物体通过位于毒力质粒pINV中的编码例如Ipa蛋白及其转录调节invE的基因介导侵入结肠上皮(Lan和Reeves，2002；Parsot，2005)。EAEC表现出经由特定的菌毛对于Hep-2细胞的特征性粘附类型，特定的菌毛由位于质粒上的处于AggR调控下的基因所编码(Flores和Okhuysen，2009)。EPEC的特征是具有称作肠细胞脱落位点(LEE)的病原性岛。该岛含有诸如eae的基因，用于EPEC菌株与肠上皮细胞的紧密粘附。EPEC与EHEC的区别在于，EHEC菌株具有产生由stx1和stx2基因所编码的志贺样毒素I和II的能力。这些毒素在肠中导致引起腹痛和血性腹泻的急性炎症。并且，EHEC感染可导致罕见的但严重的并发症，比如溶血性尿毒症综合征(HUS)(Chen andFrankel，2005；Karch et al.，2005)。多重PCR测定中的挑战是鉴定EHEC变体从而与志贺氏菌/EIEC属物种无交叉反应，因为在这些细菌中表达毒素的靶基因是非常相似的。
贾第虫病(Giardiasis)是由有鞭毛的原生动物，蓝氏贾第虫(也称作肠贾第虫)引起的小肠的感染。贾第虫病是世界范围最常报道的病原性原生动物疾病。旅行者是贾第虫感染的最大的风险组，尤其是前往发展中国家的旅行者。贾第虫病经由排泄物-口腔途径来传播。大部分人通过摄取污染的水或食物或通过在触摸污染贾第虫囊泡的某物后不洗手而感染疾病。在发达国家，贾第虫病的流行率范围为2-7％，在多数发展中国家为20-30％。CDC估计每年有两百五十万例以上的贾第虫病。贾第虫病感染的最常见的症状包括持续10天以上的腹泻、腹痛、胃肠气胀、胃胀、呕吐和体重减轻。贾第虫病通常通过检测粪便中的囊泡或营养体、小肠中的营养体或通过检测粪便中的贾第虫抗原来诊断。
目前，腹泻的常规诊断大部分基于传统的培养方法和免疫测定，其是费力耗时的。仅用于沙门氏菌、弯曲杆菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌属物种以及肠出血性大肠杆菌(EHEC)，而对于其他主要的腹泻性大肠杆菌属物种无培养方法，包括ETEC、EPEC、EAEC和EIEC存在。在近几年，已公开了用于诊断腹泻性大肠杆菌的基于DNA的方法(Antikainen et al.，2009；Aranda et al.，2004；Brandal et al.，2007；Guion et al.，2008；Kimata et al.，2005；Müller et al.，2007；Vidal et al.，2005；Vidal et al.，2004)。
ETEC通过产生热不稳定性(LT)肠毒素和/或热稳定性(ST)肠毒素[2-3]导致水性腹泻。在旅行者腹泻中，通常考虑ETEC是最常见的病因(Qadri et al.，2005)。本发明特别涉及在多重RT-PCR测定中提高ETEC的检测。本发明提供了对由est基因编码的ETEC的热稳定性肠毒素特异性的两个引物对和探针，和对由elt基因编码的ETEC的热不稳定性肠毒素特异性的一个引物对和探针。设计这些引物和探针以扩增所述基因中这样的靶序列，从而使其可能有效地检测ETEC的普遍变体。另外的问题是靶基因est包括多个重复性元件，且难以发现对于引物和探针均足够长的保守区域。
本发明进一步涉及在多重RT-PCR测定中提高致腹泻弯曲杆菌属物种的检测。本发明提供了空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的rimM基因和大肠杆菌(C.coli)的gyrB基因。利用这些引物和探针，可对致腹泻弯曲杆菌与其他非病原性弯曲杆菌和其他致腹泻病原体进行区别鉴定。需要两种不同的基因组靶标的组合来解决该问题。
在WO2005/005659中，公开了用于同时筛查致腹泻细菌诸如大肠杆菌(E.coli)组：ETEC(肠毒性大肠杆菌)、A/EEC(粘附和脱落大肠杆菌)EPEC(肠病原性大肠杆菌)、VTEC(产vero细胞毒素大肠杆菌)和EIEC(肠侵袭性大肠杆菌)和志贺氏菌属(Shigella spp)。该方法是实时多重PCR测定，并从粪便样品中直接分离模板DNA。与本发明相似地，WO2005/005659还涉及筛查人类病原性大肠杆菌以提供病原性大肠杆菌组和其他致腹泻病原体之间的区别的问题。然而，ETEC的est和elt基因中的靶序列与WO2005/005659公开的靶标不同。并且，本发明提供了通过使用三种特异性的引物对和探针覆盖普遍的ETEC变体，而表3中的WO2005/005659公开了用于相同目的的四个引物对。本发明的表8显示了ETEC变体可通过利用本发明的三种引物对来检测。
在WO2005/083122中，公开了用于在粪便样品中检测和定量肠病原性细菌的方法，所述肠病原性细菌包括志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、弯曲杆菌属物种、肠出血性大肠杆菌或产vero细胞毒素大肠杆菌、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。方法是基于
Figure BDA0000666402770000041
探针的实时PCR测定。
在WO2007/056463中，公开了利用多个病原特异性引物对以扩增样品而从每个病原特异性的引物对生成不同大小的扩增子。该方法利用实时和多重PCR技术。该方法可用于检测沙门氏菌属物种、弯曲杆菌属物种、腹泻性大肠杆菌、霍乱弧菌、耶尔森氏菌属物种，诸如鼠疫耶尔森氏菌和蓝氏贾第虫。
在WO2005/090596中，公开了基于来自人、动物或环境样品的细菌DNA的多基因型检验而用于检测微生物尤其是细菌的测定。该方法还可用作利用
Figure BDA0000666402770000042
的实时多重PCR技术。该方法可用于检测沙门氏菌属物种、弯曲杆菌属物种、腹泻性大肠杆菌、霍乱弧菌、耶尔森氏菌属物种比如鼠疫耶尔森氏菌。
在US2004/0248148中，公开了用于定量总大肠菌，大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌O157：H7、产毒性的铜绿微囊素(microcystin hepatotoxins)、蓝氏贾第虫和和微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)5’核酸酶实时聚合酶链式反应方法。多重PCR测定还可用于同时检测两种或多种病原。
在WO02/070728中，公开了依赖于“多探针”设计的测定，其中由16S rRNA编码的单一组的高度保守的序列用作引物对，且其用于与内部高度保守的序列、通用探针和内部可变区，物种特异性探针二者相组合。实时系统可靠地鉴定了14种常见的细菌物种。
CN101113471、CN101245384和CN101235410公开了用于快速检测来自食物样品的致腹泻病原体的PCR方法。
Fukushima等人，2003公开了用于检测直接来自粪便样品的17种食物或水传播的病原体的实时PCR测定。检测水平为约105种病原菌每克粪便，因此，用于粪便样本的方案小于104个病原菌每克粪便需要过夜富集步骤以获得足够的敏感性。
Hidaka et al.，2009，公开了用于腹泻性大肠杆菌的详尽检测的多重实时PCR。该方法尤其用于检测来自食物样品比如肉样品的病原菌。
Wang et al.，1997，公开了用于在食物中PCR检测13种食物传播的病原的方案。
已有一些可获得的商业上的基于多重PCR的腹泻病原体检测试剂盒，例如来自Luminex的xTAP GPP和来自Seegene的Diarrhea ACE Detection。两个系统使用了多重PCR作为扩增某些生物体特异性核苷酸序列的手段，但最终检测依赖于在另一独立的仪器中进行的分析。由于检测形式的不同需求，用于检测的手段对扩增子、引物和探针设计具有影响。并且，在本发明中使用的用于检测ETEC或弯曲杆菌(Campylobacter)的基因或扩增子序列尚未公开。
致腹泻病原体的数目巨大，且腹泻检验方法应对其所有进行优化的鉴定。因为所检验的样本的数目通常是巨大的，对每物种进行一个PCR反应可能是繁琐的。最佳的是利用一个反应来检测多个物种。在PCR组中，最明显的选择是“多重”PCR扩增。在多重PCR中，在相同的反应器皿中包括了若干个寡核苷酸组，每个经设计以扩增一个物种/物种组，且每个寡核苷酸组用于在相同的PCR反应中扩增其各自的病原性DNA。在该发明中，我们描述了基于PCR的方法，用于快速检测与旅行者腹泻相关的临床上重要的病原体，尤其是ETEC和/或弯曲杆菌。本发明公开了关于在ETEC和弯曲杆菌的普遍辩题中保守的靶序列的引物和探针。这些引物和探针对确定多种致腹泻病原体的存在的任何多重RT-PCR中的使用是相容的，因为靶位点对于ETEC和弯曲杆菌是独特的。
多重PCR代表了关于定量病原DNA的挑战(qPCR)：不同的扩增子竞争相同的PCR反应成分(例如，DNA聚合酶和MgCl2)，这可损害反应之间的定量性质，尤其是样品之间的定量比较。本领域通常已知的是，在不同的模板量或长度之间存在扩增效率的偏差，从而，例如，短的扩增子在较长的花费上是有利的。
同时，必须避免多重组寡聚物组合的不需要的交叉反应。还必须记得检查对于样品中存在的任何其他序列的错误起始(mis-priming)。
发现用于检测病原微生物的不同的组的适宜的引物和探针序列在种之间具有巨大差异，尤其当设计多重配置(set up)时，其中所有扩增子和模板应当以相等的效率来扩增(例如，贾弟虫病)。许多物种是相互密切相关的，使定位对每个物种独特的序列成为挑战。并且，因为存在大量的普遍变体，难以鉴定普遍保守的区域或最小的区域组的组合来检测所有已知的变体(例如，关于EHEC、ETEC、病原性耶尔森氏菌、病原性弯曲杆菌和志贺氏菌/EIEC)。一些基因具有复杂的密切相关的元件，这从扩增子设计的角度是具有挑战性的，尤其当设计用于多重PCR的扩增子。例如，由于重复性的元件，少量的变体ETEC不能仅利用一种扩增子来检测。
样品基质，在腹泻诊断中其常为粪便或食物样品，可能含有许多PCR抑制剂。这降低了PCR反应的扩增效率并因此预期对扩增子设计步骤进行更仔细的优化以确证所有模板和拷贝数平均地扩增且足够有效的扩增。因此，需要能够产生高PCR效率(尽可能优化约近100％)的寡核苷酸设计。所用的检测方法还可能影响扩增效率和/或偏好。
本发明现已经定位了良好适用于致腹泻病原体的特异性和灵敏性扩增和定量，尤其是ETEC和弯曲杆菌的DNA序列。因此，在本发明中已设计了优化的引物和定量PCR探针，并证实了致腹泻病原体的鉴定和定量。已设计扩增子具有特异性从而可将其相互组合到任何多重组中。通常，其先决条件是已设计所有公开的扩增子在相同的反应和循环条件下来扩增。
发明详述
本发明提供了用于检测致腹泻病原体(尤其是ETEC和弯曲杆菌(Campylobacter)物种)的基于聚合酶链式反应(PCR)的测定方法。本发明进一步提供了用于本发明的方法的材料，诸如引物、引物对和探针。尤其是，本发明提供了用于在生物样品中确定致腹泻病原体的存在的方法，包括步骤：i)在包括两个或多个分离的PCR反应的多重PCR测定中将从中分离的核酸或样品与引物对相接触，其中所述引物对的引物至少部分地扩增如下所定义的任何扩增子：SEQ ID NOS：55-72，优选地为SEQ ID NOS：61-63和65-68；
ii)利用从步骤i)获得的反应混合物进行聚合酶链式反应，从而特异性地扩增致腹泻病原体的靶序列，若所述序列存在于样品中；和
iii)检测反应混合物中扩增的靶序列的存在，其中任何靶序列的存在指示样品中致腹泻病原体的存在。
所述生物样品可以是粪便样品、食物样品，比如肉样品，或任何环境样品。可在步骤i)之前对样品进行富集。
优选地，本发明的步骤i)中的引物对选自由引物对A)到R)组成的组，更优选地为G)到I)，和K)到N)，包括或由以下寡核苷酸的至少一个组成：
A)正向引物：5’GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3’(SEQ ID NO：1)，
反向引物：5’-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3’(SEQ ID NO：2)；
B)正向引物：5’-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3’(SEQ ID NO：3)，
反向引物：5’-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3’(SEQ ID NO：4)；
C)正向引物：5’-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3’(SEQ ID NO：5)，
反向引物：5’-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3’(SEQ ID NO：6)；
D)正向引物：5’-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3’(SEQ ID NO：7)，
反向引物：5’-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3’(SEQ ID NO：8)；
E)正向引物：5’-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3’(SEQ ID NO：9)，
反向引物：5’-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3’(SEQ ID NO：10)；
F)正向引物：5’-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3’(SEQ ID NO：11)，
反向引物：5’-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3’(SEQ ID NO：12)；
G)正向引物：5’-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3’(SEQ ID NO：13)，
反向引物：5’-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3’(SEQ ID NO：14)；
H)正向引物：5’-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3’(SEQ ID NO：15)，
反向引物：5’-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3’(SEQ ID NO：16)；
I)正向引物：5’-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3’(SEQ ID NO：17)，
反向引物：5’-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3’(SEQ ID NO：18)；
J)正向引物：5’-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3’(SEQ ID NO：19)，
反向引物：5’-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3’(SEQ ID NO：20)；
K)正向引物：5’-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3’(SEQ ID NO：21)，
反向引物：5’-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3’(SEQ ID NO：22)；
L)正向引物：5’-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3’(SEQ ID NO：23)，
反向引物：5’-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3’(SEQ ID NO：24)；
M)正向引物：5’-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3’(SEQ ID NO：25)，
反向引物：5’-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3’(SEQ ID NO：26)；
N)正向引物：5’-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3’(SEQ ID NO：27)，
反向引物：5’-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3’(SEQ ID NO：28)；
O)正向引物：5’-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3’(SEQ ID NO：29)，
反向引物：5’-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3’(SEQ ID NO：30)；
P)正向引物：5’-TTCCGGTCGATCCTGCC-3’(SEQ ID NO：31)，
反向引物：5’-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3’(SEQ ID NO：32)；
Q)正向引物：5’-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3’(SEQ ID NO：33)，
反向引物：5’GGCATCCTAACTCACTTAG-3’(SEQ ID NO：34)；和
R)正向引物：5’-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3’(SEQ ID NO：35)，
反向引物：5’-GGCATGTCGATTCTAATTC-3’(SEQ ID NO：36).
在靶生物体中扩增的优选的扩增子列于表6中。然而，本领域技术人员已知这些扩增子序列在相关的菌株中存在天然差异。在设计适宜于扩增本发明的方法中的所述扩增子时可考虑到此微小差异。优选地在本方法中扩增了选自由以下组成的组的每个靶扩增子的至少20个、25个、30个或35个核苷酸长序列：SEQ ID NOS：55-72，优选为SEQ ID NOS：61-63和65-68。
本发明的方法是以扩增的靶序列的存在为特征，即，步骤iv)的PCR反应中的每个引物对A)到R)中的产物以如下方式表明样品中致腹泻病原体的存在：
-引物对A)或B)的产物表明EHEC的存在；
-引物对C)的产物表明EHEC/EPEC的存在；
-引物对D)的产物表明沙门氏菌的存在；
-引物对E)或F)的产物表明志贺氏菌/EIEC的存在；
-引物对G)、H)或I)的产物表明ETEC的存在；
-引物对J)的产物表明EAEC的存在；
-引物对K)的产物表明空肠弯曲杆菌的存在；
-引物对L)的产物表明大肠弯曲杆菌的存在；
-引物对M)的产物表明小肠结肠炎耶尔森氏菌/假结核耶尔森氏菌的存在；
-引物对N)的产物表明假结核耶尔森氏菌/鼠疫耶尔森氏菌的存在；
-引物对O)的产物表明霍乱弧菌的存在；
-引物对P)的产物表明蓝氏贾第虫的存在；
-引物对Q)的产物表明溶组织内阿米巴的存在；和
-引物对R)的产物表明隐孢子虫(Cryptosporidium)属物种的存在；
优选地，所述引物对的每个引物少于35个、40个、45个、50个或55个核苷酸长度，且更优选地，少于50个核苷酸长度。所述引物的每个还可定义为由存在于选自由SEQ ID NOS：1-36组成的组的一个引物序列中的至少10个连续的核苷酸组成。
本发明的一个特定的实施方案为进行如实时聚合酶链式反应的所述方方，且在这种情况下将包括或由以下序列组成的核酸探针特异性地与引物对A)到R)，优选地为G)到I)和K)到N)一起使用。
-用于引物对A)的探针：
5’-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3’(SEQ ID NO：37)
-用于引物对B)的探针：
5’-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3’(SEQ ID NO：38)
-用于引物对C)的探针：
5’-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3’(SEQ ID NO：39)
-用于引物对D)的探针：
5’-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3’(SEQ ID NO：40)
-用于引物对E)的探针：
5’-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3’(SEQ ID NO：41)
-用于引物对F)的探针：
5’-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3’(SEQ ID NO：42)
-用于引物对G)的探针：
5’-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3’(SEQ ID NO：43)
-用于引物对H)的探针：
5’-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3’(SEQ ID NO：44)
-用于引物对I)的探针：
5’-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3’(SEQ ID NO：45)
-用于引物对J)的探针：
5’-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3’(SEQ ID NO：46)
-用于引物对K)的探针：
5’-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3’(SEQ ID NO：47)
-用于引物对L)的探针：
5’-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3’(SEQ ID NO：48)
-用于引物对M)的探针：
5’-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3’(SEQ ID NO：49)
-用于引物对N)的探针：
5’-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3’(SEQ ID NO：50)
-用于引物对O)的探针：
5’-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3’(SEQ ID NO：51)
-用于引物对P)的探针：
5’-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3’(SEQ ID NO：52)
-用于引物对Q)的探针：
5’-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3’(SEQ ID NO：53)
-用于引物对R)的探针：
5’-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3’(SEQ ID NO：54)
一些探针(比如用于引物对G)、H)、K)和L)的探针)的融解温度Tm优选地通过添加修饰的核苷酸来提高至少5℃。一个探针中的修饰的核苷酸的量为1、2、3或优选地4。以上列表中的下划线的核苷酸是修饰的核苷酸，每个提高探针的Tm。修饰的核苷酸可以是LNA核苷酸(Exiqon A/S)小沟结合物(MGBTM)、超碱基(SuperBase)或肽核酸(PAN)或提高探针的Tm的任何其他修饰。
优选地，以上探针包括定义的序列并少于40个、45个、50个或55个核苷酸长度，和更优选地，少于50个核苷酸长度。每个目前的探针可定义为由选自由SEQ ID NOS：37-54组成的组的一个探针序列中存在的至少10个连续的核苷酸组成。
本发明的方法基于多重PCR技术，其中将引物对分为独立的PCR反应。作为通用的指南，应设计多重测定从而最频繁出现的病原体(例如，Antikainen et al，2009)在不同的多重反应中出现。
在一个实施方案中，本发明提供了包括或由如以上所定义的引物对G)到I)和K)到N)的任何引物序列组成的核苷酸引物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括或由如以上所定义定的引物对G)到I)和K)到N)中的任何的序列的核苷酸引物对。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括或由以上所定义的任何探针序列组成的核苷酸探针。
本发明优选地涉及用于确定样品中致腹泻病原体的存在的方法，其中在所述样品中检查了至少ETEC、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌病原体的存在。另外的靶病原体可以是小肠结肠炎耶尔森氏菌/假结核耶尔森氏菌，和假结核耶尔森氏菌/鼠疫耶尔森氏菌。
本发明还涉及使用如以上所定义的核苷酸引物对、引物对或探针用于确定样品中的致腹泻病原体的存在。
本发明还提供了用于检测样品中的致腹泻病原体的存在的试剂盒。所述试剂盒包括选自由如以上所限定的引物对A)到R)，优选地为G)到I)和K)到N)组成的组的引物对。试剂盒还可包括选自由如以上所限定的探针。以上描述了和以下的实施例中描述了引物对和探针的使用。优选地，所述试剂盒包括用于进行实时聚合酶链式反应的手段，比如经标记的探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸。优选地，所述试剂盒用于检测样品中的至少ETEC、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌病原体的存在。
本文所用的出版物和其他材料阐释了本发明的背景，且尤其，提供了另外的关于其实践的细节，通过引用并入本文。以下的实施例还进一步描述了本发明，其并不意在限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
患者样品。对于沙门氏菌、耶尔森氏菌、志贺氏菌、弯曲杆菌和EHEC，利用标准的生物化学方法在HUSLAB中培养对照粪便样品。在六个月的时间段中在旅行诊所(TravelClinic)(Medicity，赫尔辛基，芬兰)中募集了总共146个旅行者以参加本研究。年龄范围在1至72岁(平均39.2岁)，84位为男性(57.5％)，和62位为女性(42.5％)。旅行目的地情况，7.5％为欧洲、32.9％为亚洲、44.5％为非洲，1.4％为澳洲和13.7％为美洲。
如Antikainen等人，2009中所描述的利用easyMAG平台用NucliSENS试剂盒从粪便样品中纯化总核酸。简言之，将粪便拭子(swab)重悬于100μl的Tris-EDTA缓冲液，并通过easyMAG平台的通用方法来纯化，并洗脱至25μl。洗脱物(0.5μl)用作PCR中的模板。
可选地，可将拭子直接重悬于裂解缓冲液中。将该样品洗脱至100μl的体积，并将2μl的洗脱物用作PCR中的模板。该方案适宜于完全自动化的、集成的样品制备和PCR板配置步骤。
分离物的鉴定。培养PCR中对于沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌和EHEC阳性的排泄物样品，并利用常规的诊断方法来鉴定。由于对于腹泻大肠杆菌菌株不存在基于常规方法的培养，通过先前开发的多重PCR(Antikainen等人，2009)分析了阳性样品。
从那些细菌菌株的分离不成功的样品，利用表1中所列的引物独立扩增了对应的基因，并在Haartman研究所(Helsinki，Finland)的Sequence Core Facility中进行了测序。通过基本局部比对检索工具(BLAST，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)鉴定了序列。
实时PCR的设计。设计PCR以在已建立的通用基因(表1)中鉴定特定的毒力基因，种特异性基因或种特异性区域。利用Allele ID和Beacon Designer软件(Palo Alto，CA)设计实时PCR引物和探针以识别正确的靶基因及其普遍变体，包括利用NCBI数据库的BLAST搜索和二级结构预测。
在Mx3005P检测系统(Agilent Technologies，Garden Grove，CA)中进行RT-PCR，且热循环条件为：95℃持续15分钟，40个循环的以下反应：94℃持续1分钟和60℃持续1分钟。在每个退火步骤记录荧光。20μl的反应包含1x Qiagen Multitect NoROX master mix(Qiagen，Hilden，Germany)，1μl的引物/探针混合物(表1和2)和0.5μl的DNA模板。
PCR的特异性。通过利用包括沙门氏菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、耶尔森氏菌和弧菌菌株以及腹泻大肠杆菌菌株(表1和2)的249种细菌菌种作为阳性对照分析PCR的分析特异性。菌株来源于赫尔辛基大学医院实验室(HUSLAB)，国立健康福利研究院(THL)，和由M.Alexander Schmidt和Inga Benz(
Figure BDA0000666402770000141
Wilhelms-
Figure BDA0000666402770000142
Müünster，Germany)、Isabel Scaletsky(Universidade Federal de
Figure BDA0000666402770000143
Paulo，Brazil)以及LinThorstensen Brandal(The Norwegian Institute of Public Health，Norway)所惠赠。如Antikainen et al.，2009中所描述的，将来自全部主要的属的243种细菌菌种作为阴性对照。
为进行PCR分析，收集细菌细胞至100μl的水，煮沸15分钟，在13000rpm下离心1分钟，并将上清液(0.5μl)用于PCR反应中，或利用easyMAG核酸纯化平台用NucliSENS试剂盒如制造商所描述的纯化细菌DNA(bioMérieux，Marcy l′Etoile，France)。
PCR的分析灵敏性。为分析临床应用的灵敏性，将含通过easyMAG纯化的用于每个扩增子的所有模板的DNA的混合物稀释10倍，并通过PCR进行分析。此外，利用煮沸的细菌团在10倍稀释中独立地分析每个报告子的扩增。简言之，细菌在琼脂培养板上生长，收集至TE缓冲液并确定活菌数(集落形成单位(CFU))。将细菌稀释10倍并煮沸15分钟，在13000rpm下离心1分钟并将上清液(0.5μl)用于PCR反应中。
临床灵敏性和特异性。在HUSLAB通过常规培养方法利用已知对沙门氏菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、耶尔森氏菌或EHEC呈阳性的临床样品(n＝119)分析了临床特异性和灵敏性。此外，分析了65个培养阴性的样品。
结果
实时PCR方法的验征。利用包括249种阳性菌株的参考菌株和属于其他主要属的243种菌株优化和验证了实时PCR测定(表5)。所有阳性对照菌株是正确鉴定的，并获得了无假阳性的扩增。因此，测定获得了100％的分析特异性。
从获自常规诊断的粪便样品中分析了临床特异性和灵敏性。在PCR中分析了在以下中阳性的常规样品：沙门氏菌(n＝50)、弯曲杆菌(n＝50)、耶尔森氏菌(n＝4)和志贺氏菌(n＝6)以及EHEC(n＝9)，除一个以外均得到正确的扩增(表5)。此外，分析了64种培养阴性样品，且没有对于沙门氏菌、弯曲杆菌、耶尔森氏菌或志贺氏菌呈阳性的。利用该方法不能鉴定腹泻大肠杆菌菌株，因为不存在培养方法。因此，测定的临床灵敏性是99.2％且临床特异性为100％。
通过由PCR分析的模板DNA混合物的10倍稀释物确定了PCR的分析灵敏性。含40个扩增循环的灵敏性对于EHEC和沙门氏菌为0.1ng/ml，和对于其他为1ng/ml。此外，从利用煮沸细菌菌株获得的DNA中测量了灵敏性。在该测定中，检测的极限为5-50CFU每反应。这些结果表示正确鉴定所需的最低的浓度(＞90％阳性)。
PCR的临床验征。在出国旅行之前或之后在146位旅行者的粪便样品的分析中使用了实时PCR方法。数据示于表3和4中。所有样品是内部参照阳性的；未检测到PCR抑制。在旅行前样品中，仅三例(2.1％)是阳性的，且其对于EAEC是阳性的。从这些样品中，分离了得到适合的PCR结果的大肠杆菌菌株。最常见的发现是致腹泻性大肠杆菌菌株(EPEC；41.1％，EAEC；38.4％，ETEC；18.5％，EHEC；7.5％)，然后为弯曲杆菌(4.1％)，沙门氏菌(2.1％)和志贺氏菌/EIEC(1.4％)。
通过培养或通过PCR产物的测序确定对弯曲杆菌、耶尔森氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌或EHEC阳性的所有样品为阳性的。
从45位患者中发现了两个或多个发现。
致腹泻性大肠杆菌属物种的分泌。在两个月随访期中，研究了未出国旅行的60位患者的DEC动力学。在60个样品中的7个中发现了相同的发现(四次为EAEC，两次为EPEC)，在5位患者中发现了与先前发现不同的发现，但全部这些在随访期曾出国旅行，而其他随访样品是阴性的。该动力学与先前描述的其他肠杆菌病原体相一致。
在5，5％患者中检测到诺如病毒(norovirus)，提示该细菌是旅行者腹泻中的主要病原体。
讨论
这是利用新分子方法分析与旅行者腹泻相关联的所有主要病原体的首次系统随访研究。该研究设计允许发明人逐例随访旅行至热带国家的结果，因为旅行之前的正常样品是可获得的。本研究最重要的结果是患者组中的所有主要病原体能够利用直接的现代方法来鉴定，其与来自不同的研究的结果相比较消除内在偏差。如在高度卫生的国家诸如芬兰所预期的，在健康个体中存在极低的腹泻病原体的流行率(2.1％)。在显著的对照中，本发明人能够在74％的有症状的患者中鉴定病原体，其可能是目前具有旅行者腹泻的患者的最佳评估，其确证了事实上所有的病原体是输入的，且其不属于芬兰患者的正常菌群。所有腹泻病原体在有症状的患者中比无症状的个体中更频繁，包括全部的致腹泻性大肠杆菌属物种，提示其均是相关的腹泻病原体，且并不仅仅反应了正常菌群的扰乱。在来自有症状的患者的样品中，在所有研究的细菌病原体中，26％是阴性的。该研究与最近的研究相一致，提示了致腹泻性大肠杆菌属物种是患有旅行者腹泻的患者中的最主要的细菌病原体。
研究覆盖了所有的主要细菌病原体，排除了气单胞菌属物种(Aeromonas sp)、假单胞菌(Plesiomonas)、产肠毒素的脆弱类杆菌(enterotoxigenic Bacteroidesfragilis)、弓形杆菌(Arcobacter)和DAEC。基于先前的研究其相对比例是低的，且其病原性作用和发生率尚未完全知晓(von Graevenitz，2007)。实时PCR方法识别了病原体的毒力基因或种特异性的基因。例如，为鉴定毒力的EAEC，选择了aggR基因，因为其是有助于聚集类型和腹泻症状的最佳表征的基因(Monteiro et al.，2009)；(Huang et al.，2007；Mohamed et al.，2007)。为包括所有可能的临床相关靶物种，需要筛查多个不同的靶基因和其保守区域以用于测定的最佳灵敏性和特异性。例如，利用仅一个引物探针组检测耶尔森氏家族和弯曲杆菌家族中的病原性物种是不可能的。与独立的参考方法相比较，测定灵敏性和特异性是高的，约100％，提示可能替换粪便培养作为针对旅行者腹泻的初步筛查方法。在任何情况下，患有腹泻的患者中的高比例的DEC提示了至少应该通过能鉴定DEC的方法对其进行分析，比如PCR。
测定设计允许在最佳条件下利用对照样品同时鉴定13种病原体。本发明能够从一个患者样品中鉴定高达四种不同的病原体，表明了可平行鉴定多个病原体。这与这样的事实相一致：经常存在多个致病病原体。然而，典型的PCR反应固有地有利于最富集的靶标。当在相同的多重反应中存在一种或两种高度富集的病原体且一种是低拷贝的，则很可能产生假阴性结果。该选择可通过其他方法来控制，和/或当将该测定应用于任何诊断目的时重新取样和进行警报报告。为将假阴性结果的风险最小化，设计多重组合物从而最频繁的病原体处于不同的多重反应中。
利用每个样品检验内部阳性的对照以监测推定的PCR抑制物的存在，但未检测到抑制。这提示半自动的DNA提取方法满足需要的品质，且其适宜于粪便病原体分析。
总体而言，本研究与最近其他研究相一致，提示了致腹泻大肠杆菌属物种是旅行者腹泻中的主要的粪便病原体。应用新型的实时PCR技术，现在可直接从粪便样品中在与其一起的其他粪便病原体将其进行成功筛查。
Figure BDA0000666402770000181
Figure BDA0000666402770000191
Figure BDA0000666402770000201
Figure BDA0000666402770000211
Figure BDA0000666402770000221
Figure BDA0000666402770000231
表3.出国旅行之前和之后的发现
Figure BDA0000666402770000241
表4.出国旅行之后具有或没有症状的发现
Figure BDA0000666402770000242
表5.已知的阳性对照菌株和样品的总结
Figure BDA0000666402770000251
表6.在靶生物体中扩增的扩增子(5’-＞3’)
EHEC stx1
GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAAGGTTGAGTAGTGTCCTGCCTGATTATCATGGACAAGACTCTGTTCGTGTAGGAAGAATTTCT(SEQ ID NO：55)
EHEC stx2
TGCATCCAGAGCAGTTCTGCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGCTTCAGGCAGATACAGAGAGAATTTCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCCTGTGTATACGATGACGCCG(SEQ ID NO：56)
EHEC/EPEC eae
CCAGGCTTCGTCACAGTTGCAGGCCTGGTTACAACATTATGGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAGAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTG(SEQ ID NO：57)
沙门氏菌invA
GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAACGGTACAGTCTCTGTAGAGACTTTATCGAGATCGCCAATCAGTCCTAACGACGACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGTTTTAGGTTTGGCGGCGCTACGTTTTGCTTCACGGAATTTAAAATAGA(SEQ ID NO：58)
志贺氏菌/EIEC ipaH
TGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCC(SEQ ID NO：59)
志贺氏菌/EIEC invE
TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTCAGAAAATTAAGACCAATACCAAGTTCTCGGATGCTATGCTCTTTTGCTGTTTGTATATCGTTTGCTAGTTTTCTGGCATCAAGAGTAGATA(SEQ ID NO：60)
ETEC est
AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGGGAGGTAACATGAAAAAGCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTATTATCTTTCCCCTCTTTTAGTCAGTC(SEQ ID NO：61)
ETEC est
TCCTGAAAGCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGCTATTAATAA(SEQ ID NO：62)
ETEC elt
CCGGCAGAGGATGGTTACAGATTAGCAGGTTTCCCACCGGATCACCAAGCTTGGAGAGAAGAACCCTGGATTCATCATGCACCACAAGGTTGTGGAAATTCATCAAGAACAATTACAGGTGATACTTGTAATGAGGAGACCCAGAATCTGAGCACAATATATCTCAGGGAATATCAATCAA(SEQ ID NO：63)
EAEC aggR
GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTCATATTTCTTGAGAGAGGAATAAATATATCAGTAAGATTGCAAAAGAAGAAATCAACAGTAAATCCATTTATCGCAATCAGATTAAGCAGCGATACATTAAGACGCCTAAAGGATGCCCTGATGATAATATACGGAATATCAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCGA(SEQ ID NO：64)
空肠弯曲杆菌rimM
GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTGCAAAACTTGGTAAAACTGTGGGTCTTAAGGGTTATGTAAAATTGCATAACCTGAGCGACTTTT(SEQ ID NO：65)
大肠弯曲杆菌gyrB
AGTGCCTGAACCTCAATTTGAAGGACAAACTAAAGGAAAACTTGGCTCTTCTTATGTGCGTCCTATAGTTTCAAAAGCAAGTTTTGAATATCTTAGTAAATATTTTGAAGAAAATCCTATCGA(SEQ ID NO：66)
小肠结肠炎耶尔森氏菌/假结核耶尔森氏菌virF
GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCACCACGCGCCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGCTCACCAATTACTTCTTAATTGTAAGATGAGTATTGTTGATATTGCCATG(SEQ ID NO：67)
假结核耶尔森氏菌/鼠疫耶尔森氏菌rumB
CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATGTGGGATCTGTTCTGTGGTGTGGGCGGCTTTGGTTTACATTGTGCGGGGCCAGAGA(SEQ ID NO：68)
霍乱弧菌ctx
GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAAGAGCCGTGG(SEQ ID NO：69)
蓝氏贾第虫18S rRNA基因
TTCCGGTCGATCCTGCCGGAATCCGACGCTCTCCCCAAGGACACAAGCCATGCATGCCCGCGCACCCGGGAGGCGGCGGACGGCTCAGGACAAC(SEQ ID NO：70)
溶组织内阿米巴18S rRNA基因
AGACGATCCAGTTTGTATTAGTACAAAATGGCCAATTTATTTAAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCC(SEQ ID NO：71)
隐孢子虫属物种cowp
TCTGGAAAACAATGTGTTCAATCAGACACAGCTCCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAGGCACTATACTGGAGAATGGCACATGTAAATTAATTCAACAAATTGATACCGTTTGTCCTTCTGGTTTTGTTGAAGAAGGAAATAGATGTGTTCAATATCTCCCTGCAAATAAAATCTGTCCTCCTGGATTCAATTTGTCAGGACAACAATGTATGGCACCAGAATCAGCTGAATTAGAATCGACATGCC(SEQ ID NO：72)
表7：用于水稻，顶生花基因控制的引物和探针
CTAATCCCAGCAACCCAACC(SEQ ID NO：73)
CTAATCAATGTGAGACATATGATAGAAATC(SEQ ID NO：74)
CCTGCACTGGTAAGCTATG(SEQ ID NO：75)
表8.ETEC毒素变体在对照菌株和患者样品中的分布。结果显示了所有ETEC变体通过本发明的至少一个引物对进行了检测。
ST＝热稳定毒素
LT＝热不稳定毒素
寡核苷酸对扩增了靶标(菌株/患者样品)
Figure BDA0000666402770000271
Figure BDA0000666402770000281
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Figure IDA0000666402820000011
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Claims (21)

1.引物对在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于执行在未富集的生物样品中确定致腹泻病原体的存在的方法，其中所述方法包括以下的步骤：
i)在包括两个或多个分离的PCR反应的多重PCR测定中将所述样品或从中分离的核酸与引物对相接触，其中所述引物对的所述引物识别并扩增如通过SEQ ID NOS:61-63所定义的ETEC扩增子中的每个；
ii)利用从步骤i)中获得的反应混合物进行聚合酶链式反应，从而特异性扩增致腹泻病原体的靶序列，若所述样品中存在所述序列；和
iii)在所述反应混合物中检测扩增的靶序列的存在，其中任何所述靶序列的存在表示所述样品中的致腹泻病原体的存在。
2.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤i)中，所述引物对的引物进一步扩增如通过SEQ ID NOS:65-66所定义的弯曲杆菌(Campylobacter)扩增子中的每个。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中在步骤i)中，所述引物对进一步扩增如通过SEQID NOS:67-68所定义的耶尔森氏菌(Yersinia)扩增子中的每个。
4.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤i)中，将所述样品或从中分离的核酸与由以下序列组成的引物对相接触：
G)正向引物：5’-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3’(SEQ ID NO:13),
反向引物：5’-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3’(SEQ ID NO:14)；
H)正向引物：5’-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3’(SEQ ID NO:15),
反向引物：5’-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3’(SEQ ID NO:16)；
I)正向引物：5’-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3’(SEQ ID NO:17),
反向引物：5’-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3’(SEQ ID NO:18)。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述引物对进一步包括或由以下序列组成：
K)正向引物：5’-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3’(SEQ ID NO:21),
反向引物：5’-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3’(SEQ ID NO:22)；和
L)正向引物：5’-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3’(SEQ ID NO:23),
反向引物：5’-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3’(SEQ ID NO:24)。
6.根据权利要求4所述的用途，其中在步骤i)中，将所述样品或从中分离的核酸与包括或由以下序列中的至少一个组成的另外的引物对相接触：
A)正向引物：5’-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3’(SEQ ID NO:1),
反向引物：5’-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3’(SEQ ID NO:2)；
B)正向引物：5’-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3’(SEQ ID NO:3),
反向引物：5’-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3’(SEQ ID NO:4)；
C)正向引物：5’-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3’(SEQ ID NO:5),
反向引物：5’-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3’(SEQ ID NO:6)；
D)正向引物：5’-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3’(SEQ ID NO:7),
反向引物：5’-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3’(SEQ ID NO:8)；
E)正向引物：5’-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3’(SEQ ID NO:9),
反向引物：5’-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3’(SEQ ID NO:10)；
F)正向引物：5’-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3’(SEQ ID NO:11),
反向引物：5’-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3’(SEQ ID NO:12)；
J)正向引物：5’-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3’(SEQ ID NO:19),
反向引物：5’-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3’(SEQ ID NO:20)；
M)正向引物：5’-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3’(SEQ ID NO:25),
反向引物：5’-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3’(SEQ ID NO:26)；
N)正向引物：5’-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3’(SEQ ID NO:27),
反向引物：5’-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3’(SEQ ID NO:28)；
O)正向引物：5’-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3’(SEQ ID NO:29),
反向引物：5’-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3’(SEQ ID NO:30)；
P)正向引物：5’-TTCCGGTCGATCCTGCC-3’(SEQ ID NO:31),
反向引物：5’-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3’(SEQ ID NO:32)；
Q)正向引物：5’-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3’(SEQ ID NO:33),
反向引物：5’-GGCATCCTAACTCACTTAG-3’(SEQ ID NO:34)；和
R)正向引物：5’-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3’(SEQ ID NO:35),
反向引物：5’-GGCATGTCGATTCTAATTC-3’(SEQ ID NO:36)。
7.根据权利要求6所述的用途，其中经扩增的靶序列，即PCR反应中的每个引物对的产物的存在以如下方式表明样品中致腹泻病原体的存在：
-引物对A)或B)的产物表明EHEC的存在；
-引物对C)的产物表明EHEC/EPEC的存在；
-引物对D)的产物表明沙门氏菌的存在；
-引物对E)或F)的产物表明志贺氏菌/EIEC的存在；
-引物对G)、H)或I)的产物表明ETEC的存在；
-引物对J)的产物表明EAEC的存在；
-引物对K)的产物表明空肠弯曲杆菌的存在；
-引物对L)的产物表明大肠弯曲杆菌的存在；
-引物对M)的产物表明小肠结肠炎耶尔森氏菌/假结核耶尔森氏菌的存在；
-引物对N)的产物表明假结核耶尔森氏菌/鼠疫耶尔森氏菌的存在；
-引物对O)的产物表明霍乱弧菌的存在；
-引物对P)的产物表明蓝氏贾第虫的存在；
-引物对Q)的产物表明溶组织内阿米巴的存在；和
-引物对R)的产物表明隐孢子虫(Cryptosporidium)属物种的存在。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品是粪便样品或食物样品。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述引物包括引物对的序列，和所述引物对的每个引物少于50个核苷酸长度。
10.根据权利要求6所述的用途，其中所述多重PCR测定作为实时聚合酶链式反应来进行，和将包括或由以下序列组成的核酸探针特异性地与每个引物对一起使用：
-用于引物对A)的探针：
5’-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3’(SEQ ID NO:37)
-用于引物对B)的探针：
5’-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3’(SEQ ID NO:38)
-用于引物对C)的探针：
5’-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3’(SEQ ID NO:39)
-用于引物对D)的探针：
5’-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3’(SEQ ID NO:40)-用于引物对E)的探针：
5’-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3’(SEQ ID NO:41)
-用于引物对F)的探针：
5’-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3’(SEQ ID NO:42)
-用于引物对G)的探针：
5’-5’-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3’-3’(SEQ ID NO:43)
-用于引物对H)的探针：
5’-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3’(SEQ ID NO:44)
-用于引物对I)的探针：
5’-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3’(SEQ ID NO:45)
-用于引物对J)的探针：
5’-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3’(SEQ ID NO:46)
-用于引物对K)的探针：
5’-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3’(SEQ ID NO:47)
-用于引物对L)的探针：
5’-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3’(SEQ ID NO:48)
-用于引物对M)的探针：
5’-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3’(SEQ ID NO:49)-用于引物对N)的探针：
5’-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3’(SEQ ID NO:50)
-用于引物对O)的探针：
5’-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3’(SEQ ID NO:51)
-用于引物对P)的探针：
5’-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3’(SEQ ID NO:52)
-用于引物对Q)的探针：
5’-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3’(SEQ ID NO:53)
-用于引物对R)的探针：
5’-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3’(SEQ ID NO:54)
其中所述下划线的核苷酸是提高探针的融解温度Tm的优选修饰的核苷酸。
11.根据权利要求7所述的用途，其中引物对A)到F)和G)到N)处于独立的PCR反应中。
12.根据权利要求7所述的用途，其中所述方法包括以下PCR反应：利用引物对A)到D)进行的第一反应，利用引物对K)到L)进行的第二反应，利用引物对E)、F)、M)、N)和O)进行的第三反应和利用引物对P)到R)进行的第四反应。
13.根据权利要求7所述的用途，其中所述方法包括以下的PCR反应：利用引物对A)到D)进行的第一反应，利用引物对G)到I)和K)到N)进行的第二反应，利用引物对E)、F)、J)和O)进行的第三反应和利用引物对P)到R)进行的第四反应。
14.寡核苷酸组，其核酸序列在SEQ ID NOS:13-18中给出。
15.根据权利要求14的寡核苷酸组，进一步包含探针，其核酸序列在SEQ ID NOS:43-45中给出。
16.根据权利要求14的寡核苷酸组，进一步包含引物，其核酸序列在SEQ ID NOS:21-24中给出。
17.如权利要求14-16中任一项所限定的核苷酸引物或探针在制备用于确定样品中的致腹泻病原体的存在的试剂盒中的用途。
18.一种确定样品中ETEC的存在的试剂盒，其中所述试剂盒包括根据权利要求14或15的寡核苷酸组。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，包括选自由以下组成的组的其他PCR试剂成分：聚合酶、核苷酸、缓冲液、盐、去污剂和/或其他添加剂。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，进一步包括一种或多种对照引物、探针或核苷酸序列。
21.根据权利要求18所述的试剂盒，其用于检测至少ETEC、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌病原体的存在，所述试剂盒包括或由来自以下引物对的任何引物序列组成：
G)正向引物：5’-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3’(SEQ ID NO:13)，
反向引物：5’-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3’(SEQ ID NO:14)；
H)正向引物：5’-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3’(SEQ ID NO:15)，
反向引物：5’-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3’(SEQ ID NO:16)；
I)正向引物：5’-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3’(SEQ ID NO:17)，
反向引物：5’-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3’(SEQ ID NO:18)；
K)正向引物：5’-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3’(SEQ ID NO:21)，
反向引物：5’-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3’(SEQ ID NO:22)；
L)正向引物：5’-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3’(SEQ ID NO:23)，
反向引物：5’-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3’(SEQ ID NO:24)；
M)正向引物：5’-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3’(SEQ ID NO:25)，
反向引物：5’-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3’(SEQ ID NO:26)；和
N)正向引物：5’-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3’(SEQ ID NO:27)，
反向引物：5’-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3’(SEQ ID NO:28)。
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