JP2015522271A - 下痢性病原体の存在を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
中国特許出願公開 CN101113471 号、中国特許出願公開 CN101245384 号、および中国特許出願公開 CN101235410 号は、食品サンプルから下痢性病原体を迅速に検出するためのPCR法を開示している。
本発明は、下痢性病原体、特にETECおよびカンピロバクター属を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイ法を提供する。更に本発明は、本発明の方法に用いるための材料となる、プライマー、プライマーペアおよびプローブ等も提供する。
i)サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、2つ以上の個別のPCR反応を包含するマルチプレックスPCRアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号55〜72、好ましくは配列番号61〜63と配列番号65〜68で定義されるアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅するものであり、
ii)上記工程i)で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
iii)反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法を提供する。
リバースプライマー:5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'(配列番号2);
B)フォワードプライマー:5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'(配列番号3),
リバースプライマー:5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'(配列番号4);
C)フォワードプライマー:5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'(配列番号5),
リバースプライマー:5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'(配列番号6);
D)フォワードプライマー: 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'(配列番号7),
リバースプライマー:5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'(配列番号8);
E)フォワードプライマー:5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'(配列番号9),
リバースプライマー:5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'(配列番号10);
F)フォワードプライマー:5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'(配列番号11),
リバースプライマー:5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'(配列番号12);
G)フォワードプライマー:5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'(配列番号13),
リバースプライマー:5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'(配列番号14);
H)フォワードプライマー:5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'(配列番号15),
リバースプライマー:5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'(配列番号16);
I)フォワードプライマー:5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'(配列番号17),
リバースプライマー:5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'(配列番号18);
J)フォワードプライマー:5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'(配列番号19),
リバースプライマー:5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'(配列番号20);
K)フォワードプライマー:5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'(配列番号21),
リバースプライマー:5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'(配列番号22);
L)フォワードプライマー:5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'(配列番号23),
リバースプライマー:5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'(配列番号24);
M)フォワードプライマー:5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'(配列番号25),
リバースプライマー:5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'(配列番号26);
N)フォワードプライマー:5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'(配列番号27),
リバースプライマー:5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'(配列番号28);
O)フォワードプライマー:5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'(配列番号29),
リバースプライマー:5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(配列番号30);
P)フォワードプライマー:5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'(配列番号31),
リバースプライマー:5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'(配列番号32);
Q)フォワードプライマー:5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'(配列番号33),
リバースプライマー:5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'(配列番号34);および
R)フォワードプライマー:5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'(配列番号35),
リバースプライマー:5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'(配列番号36)。
− プライマーペアA)またはB)の産物は、EHECの存在の指標となり、
− プライマーペアC)の産物は、EHEC/EPECの存在の指標となり、
− プライマーペアD)の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアE)またはF)の産物は、Shigella/EIECの存在の指標となり、
− プライマーペアG),H)またはI)の産物は、ETECの存在の指標となり、
− プライマーペアJ)の産物は、EAECの存在の指標となり、
− プライマーペアK)の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアL)の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアM)の産物は、Yersinia enterocolitica/Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアN)の産物は、Yersinia pseudotuberculosis/Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアO)の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアP)の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアQ)の産物は、Entamoeba histolytica(赤痢アメーバ)の存在の指標となり、そして
− プライマーペアR)の産物は、Cryptosporidium sp の存在の指標となる。
− プライマーペアA)のためのプローブ:
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'(配列番号37)
− プライマーペアB)のためのプローブ:
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'(配列番号38)
− プライマーペアC)のためのプローブ:
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'(配列番号39)
− プライマーペアD)のためのプローブ:
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'(配列番号40)
− プライマーペアE)のためのプローブ:
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'(配列番号41)
− プライマーペアF)のためのプローブ:
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'(配列番号42)
− プライマーペアG)のためのプローブ:
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'(配列番号43)
− プライマーペアH)のためのプローブ:
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'(配列番号44)
− プライマーペアI)のためのプローブ:
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'(配列番号45)
− プライマーペアJ)のためのプローブ:
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'(配列番号46)
− プライマーペアK)のためのプローブ:
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'(配列番号47)
− プライマーペアL)のためのプローブ:
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'(配列番号48)
− プライマーペアM)のためのプローブ:
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'(配列番号49)
− プライマーペアN)のためのプローブ:
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'(配列番号50)
− プライマーペアO)のためのプローブ:
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'(配列番号51)
− プライマーペアP)のためのプローブ:
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'(配列番号52)
− プライマーペアQ)のためのプローブ:
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'(配列番号53)
− プライマーペアR)のためのプローブ:
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'(配列番号54)
患者サンプル 対照用の糞便サンプルを、標準的な生化学的方法によって、Salmonella、Yersinia、Shigella、Campylobacter および EHEC についてHUSLABにおいて培養した。全部で146人の旅行者をトラベルクリニック(Travel Clinic)(フィンランド国、ヘルシンキ、メディシティ)で募集し、6ヶ月の期間、本研究に参加してもらった。年齢は、1歳から72歳にわたった(平均は、39.2歳)で、84人(57.5%)が女性で、62人(42.5%)が男性であった。渡航の目的地の内訳は、ヨーロッパが7.5%、アジアが32.9%、アフリカが44.5%、オーストラリアが1.4%、アメリカが13.7%であった。
リアルタイムPCR法の有効性の確認 249個の陽性株と他の主要な属に属する243個の株とを含む参照株を用いて、リアルタイムPCRアッセイを最適化し、有効性を確認した(表5)。すべての正の対照株は正しく同定され、偽陽性の増幅はなかった。したがって、アッセイは100%の分析特異性を達成した。
本研究は、新たな分子的手法を用いて旅行者下痢に関連するすべての主要な病原体を分析する、初めての組織的な追跡研究である。旅行前の正常なサンプルが入手できたので、この研究設計では、本発明者らは、熱帯の国への旅行の結果を件ごとに追跡することができた。本研究の最も重要な達成は、簡単な現代の手法を用いて患者群の中のすべての主要な病原体を同定することができたことである。これは、様々な研究の結果に比べ、内在的な偏りを除去するものである。フィンランド国のような衛生の良い諸国において予想されるように、健常者における下痢性病原体の流行は非常に低かった(2.1%)。これと非常に対照的に、本発明者らは、症状を示す患者の74%に病原体を同定した。この数値は、おそらく、ほぼすべての病原体は輸入されたものであってフィンランド人患者の正常な細菌叢には属しないことを確認させる、旅行者下痢の患者についての今までの最高の測定値であろう。すべての下痢性病原体(すべての下痢性大腸菌の種を含む)は、症状を示さない人よりも症状を示す人においてよく見られるものである。このことは、これらすべてが重要性のある下痢性病原体であって、単に正常な細菌叢の乱れを反映するというものではないということを示唆する。症状を示す患者のサンプルのうちの26%が、研究したすべての細菌病原体において陰性であった。本研究は、下痢性大腸菌の種が旅行者下痢を有する患者における最も主要な細菌病原体であることを示唆する他の最近の研究と合致している。
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Claims (29)
- 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
i)サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、2つ以上の個別のPCR反応を包含するマルチプレックスPCRアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号61〜63で定義されるETECのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅するものであり、
ii)上記工程i)で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
iii)反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法。 - 工程i)において、該プライマーペアのプライマーが更に配列番号65〜66で定義されるカンピロバクターのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 工程i)において、該プライマーペアのプライマーが更に配列番号67〜68で定義されるエルシニアのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 工程i)において、以下の配列:
G)フォワードプライマー:5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'(配列番号13),
リバースプライマー: 5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'(配列番号14);
H)フォワードプライマー:5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'(配列番号15),
リバースプライマー:5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'(配列番号16);
I)フォワードプライマー:5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'(配列番号17),
リバースプライマー:5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'(配列番号18)
からなる群より選ばれる少なくとも1種を包含する、または少なくとも1種からなるプライマーペアと、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を接触させることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、それぞれが配列番号13〜18に示したヌクレオチド配列中の少なくとも10個の連続したヌクレオチドからなるプライマーと接触させることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 該プライマーペアが、以下の配列:
K)フォワードプライマー:5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'(配列番号21),
リバースプライマー:5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'(配列番号22)、および
L)フォワードプライマー:5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'(配列番号23),
リバースプライマー:5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'(配列番号24)
からなる群より選ばれる少なくとも1種を更に包含するか、または少なくとも1種からなることを特徴とする、請求項4に記載の方法。 - 工程i)において、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、以下の配列:
A)フォワードプライマー:5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'(配列番号1),
リバースプライマー:5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'(配列番号2);
B)フォワードプライマー:5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'(配列番号3),
リバースプライマー:5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'(配列番号4);
C)フォワードプライマー:5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'(配列番号5),
リバースプライマー:5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'(配列番号6);
D)フォワードプライマー: 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'(配列番号7),
リバースプライマー:5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'(配列番号8);
E)フォワードプライマー:5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'(配列番号9),
リバースプライマー:5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'(配列番号10);
F)フォワードプライマー:5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'(配列番号11),
リバースプライマー:5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'(配列番号12);
J)フォワードプライマー:5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'(配列番号19),
リバースプライマー:5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'(配列番号20);
M)フォワードプライマー:5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'(配列番号25),
リバースプライマー:5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'(配列番号26);
N)フォワードプライマー:5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'(配列番号27),
リバースプライマー:5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'(配列番号28);
O)フォワードプライマー:5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'(配列番号29),
リバースプライマー:5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(配列番号30);
P)フォワードプライマー:5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'(配列番号31),
リバースプライマー:5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'(配列番号32);
Q)フォワードプライマー:5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'(配列番号33),
リバースプライマー:5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'(配列番号34);および
R)フォワードプライマー:5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'(配列番号35),
リバースプライマー:5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'(配列番号36)。
からなる群より選ばれる少なくとも1種を包含する、または少なくとも1種からなるプライマーペアと更に接触させることを特徴とする、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。 - 各核酸プライマーが、配列番号1〜36に示したヌクレオチド配列中の少なくとも10個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- PCR反応におけるそれぞれのプライマーペアの産物である増幅された標的配列の存在が、以下の基準に基づく、サンプル中の下痢性病原体の存在の指標となることを特徴とする、請求項7または8に記載の方法。
− プライマーペアA)またはB)の産物は、EHECの存在の指標となり、
− プライマーペアC)の産物は、EHEC/EPECの存在の指標となり、
− プライマーペアD)の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアE)またはF)の産物は、Shigella/EIECの存在の指標となり、
− プライマーペアG),H)またはI)の産物は、ETECの存在の指標となり、
− プライマーペアJ)の産物は、EAECの存在の指標となり、
− プライマーペアK)の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアL)の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアM)の産物は、Yersinia enterocolitica/Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアN)の産物は、Yersinia pseudotuberculosis/Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアO)の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアP)の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアQ)の産物は、Entamoeba histolytica の存在の指標となり、そして
− プライマーペアR)の産物は、クリプトスポリジウム属の存在の指標となる。 - 該生物学的サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- プライマーが前記プライマーペアの配列を包含し、該プライマーペアの各プライマーの長さが50ヌクレオチド未満であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- マルチプレックスPCRアッセイをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で行い、各プライマーペアと共に、以下の配列を包含するか以下の配列からなる特定の核酸プローブを使用することを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
− プライマーペアA)のためのプローブ:
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'(配列番号37)
− プライマーペアB)のためのプローブ:
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'(配列番号38)
− プライマーペアC)のためのプローブ:
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'(配列番号39)
− プライマーペアD)のためのプローブ:
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'(配列番号40)
− プライマーペアE)のためのプローブ:
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'(配列番号41)
− プライマーペアF)のためのプローブ:
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'(配列番号42)
− プライマーペアG)のためのプローブ:
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'(配列番号43)
− プライマーペアH)のためのプローブ:
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'(配列番号44)
− プライマーペアI)のためのプローブ:
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'(配列番号45)
− プライマーペアJ)のためのプローブ:
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'(配列番号46)
− プライマーペアK)のためのプローブ:
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'(配列番号47)
− プライマーペアL)のためのプローブ:
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'(配列番号48)
− プライマーペアM)のためのプローブ:
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'(配列番号49)
− プライマーペアN)のためのプローブ:
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'(配列番号50)
− プライマーペアO)のためのプローブ:
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'(配列番号51)
− プライマーペアP)のためのプローブ:
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'(配列番号52)
− プライマーペアQ)のためのプローブ:
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'(配列番号53)
− プライマーペアR)のためのプローブ:
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'(配列番号54)
但し、上記配列において、下線を引いたヌクレオチドは、好ましくはプローブの融解温度(Tm)を上昇させる修飾ヌクレオチドである。 - 該核酸プローブのそれぞれが、配列番号37〜54に示したヌクレオチド配列中の少なくとも10個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- プライマーペアA)〜F)とG)〜N)とがそれぞれ別のPCR反応に含まれることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 以下のPCR反応を包含することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
プライマーペアA)〜D)を用いた第1反応、プライマーペアK)〜L)を用いた第2反応、プライマーペアE)、F)、M)、N)とO)を用いた第3反応、そしてプライマーペアP)〜R)を用いた第4反応。 - 以下のPCR反応を包含することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
プライマーペアA)〜D)を用いた第1反応、プライマーペアG)〜I)とK)〜N)を用いた第2反応、プライマーペアE)、F)、J)とO)を用いた第3反応、そしてプライマーペアP)〜R)を用いた第4反応。 - 以下の配列:
A)フォワードプライマー:5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'(配列番号1),
リバースプライマー:5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'(配列番号2);
B)フォワードプライマー:5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'(配列番号3),
リバースプライマー:5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'(配列番号4);
C)フォワードプライマー:5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'(配列番号5),
リバースプライマー:5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'(配列番号6);
D)フォワードプライマー: 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'(配列番号7),
リバースプライマー:5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'(配列番号8);
E)フォワードプライマー:5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'(配列番号9),
リバースプライマー:5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'(配列番号10);
F)フォワードプライマー:5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'(配列番号11),
リバースプライマー:5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'(配列番号12);
G)フォワードプライマー:5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'(配列番号13),
リバースプライマー:5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'(配列番号14);
H)フォワードプライマー:5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'(配列番号15),
リバースプライマー:5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'(配列番号16);
I)フォワードプライマー:5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'(配列番号17),
リバースプライマー:5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'(配列番号18);
J)フォワードプライマー:5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'(配列番号19),
リバースプライマー:5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'(配列番号20);
K)フォワードプライマー:5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'(配列番号21),
リバースプライマー:5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'(配列番号22);
L)フォワードプライマー:5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'(配列番号23),
リバースプライマー:5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'(配列番号24);
M)フォワードプライマー:5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'(配列番号25),
リバースプライマー:5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'(配列番号26);
N)フォワードプライマー:5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'(配列番号27),
リバースプライマー:5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'(配列番号28);
O)フォワードプライマー:5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'(配列番号29),
リバースプライマー:5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(配列番号30);
P)フォワードプライマー:5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'(配列番号31),
リバースプライマー:5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'(配列番号32);
Q)フォワードプライマー:5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'(配列番号33),
リバースプライマー:5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'(配列番号34);および
R)フォワードプライマー:5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'(配列番号35),
リバースプライマー:5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'(配列番号36)
からなる群より選ばれる少なくとも1種を包含する、または少なくとも1種からなるプライマーからなるプライマーペアの、サンプル中の下痢性病原体の検出のための使用であって、該検出を2つ以上の個別のPCR反応を包含するマルチプレックスPCRアッセイで実施することを特徴とする使用。 - 該サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項17に記載の使用。
- 検出のために、少なくともETEC、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出可能なプライマーペアを使用することを特徴とする、請求項17または18に記載の使用。
- 配列番号1〜36に示したプライマー配列のいずれかからなるヌクレオチドプライマー。
- 請求項17および配列番号1〜36に示したプライマーペアのいずれかの配列からなるヌクレオチドプライマーペア。
- 配列番号37〜54に示したプローブ配列のいずれかからなるヌクレオチドプローブ。
- 請求項17〜19のいずれかにおいて定義したヌクレオチドプライマー、プライマーペアまたはプローブの、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための使用。
- サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するためのキットであって、請求項20のヌクレオチドプライマー、請求項21のヌクレオチドプライマーペアまたは請求項22のヌクレオチドプローブを包含するキット。
- ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー、塩類、界面活性剤および/または他の添加剤からなる群より選ばれる他のPCR用試薬成分を包含する、請求項24に記載のキット。
- 少なくとも1種の対照用のプライマー、プローブまたはヌクレオチド配列を更に包含する、請求項24または26に記載のキット。
- 少なくともETEC、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出するためのキットであって、以下のプライマーペア:
G)フォワードプライマー:5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'(配列番号13),
リバースプライマー:5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'(配列番号14);
H)フォワードプライマー:5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'(配列番号15),
リバースプライマー:5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'(配列番号16);
I)フォワードプライマー:5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'(配列番号17),
リバースプライマー:5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'(配列番号18);
K)フォワードプライマー:5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'(配列番号21),
リバースプライマー:5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'(配列番号22);
L)フォワードプライマー:5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'(配列番号23),
リバースプライマー:5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'(配列番号24);
M)フォワードプライマー:5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'(配列番号25),
リバースプライマー:5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'(配列番号26);および
N)フォワードプライマー:5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'(配列番号27),
リバースプライマー:5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'(配列番号28)
からなる群より選ばれるプライマー配列を包含する、または該プライマー配列からなることを特徴とする、請求項24〜26のいずれかに記載のキット。 - 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
i)サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、2つ以上の個別のPCR反応を包含するマルチプレックスPCRアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるそれぞれのプライマーは、以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも1種を包含する、または少なくとも1種からなるプライマーであり:
A)フォワードプライマー:5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'(配列番号1),
リバースプライマー:5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'(配列番号2);
B)フォワードプライマー:5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'(配列番号3),
リバースプライマー:5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'(配列番号4);
C)フォワードプライマー:5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'(配列番号5),
リバースプライマー:5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'(配列番号6);
D)フォワードプライマー: 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'(配列番号7),
リバースプライマー:5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'(配列番号8);
E)フォワードプライマー:5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'(配列番号9),
リバースプライマー:5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'(配列番号10);
F)フォワードプライマー:5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'(配列番号11),
リバースプライマー:5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'(配列番号12);
G)フォワードプライマー:5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'(配列番号13),
リバースプライマー:5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'(配列番号14);
H)フォワードプライマー:5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'(配列番号15),
リバースプライマー:5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'(配列番号16);
I)フォワードプライマー:5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'(配列番号17),
リバースプライマー:5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'(配列番号18);
J)フォワードプライマー:5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'(配列番号19),
リバースプライマー:5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'(配列番号20);
K)フォワードプライマー:5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'(配列番号21),
リバースプライマー:5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'(配列番号22);
L)フォワードプライマー:5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'(配列番号23),
リバースプライマー:5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'(配列番号24);
M)フォワードプライマー:5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'(配列番号25),
リバースプライマー:5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'(配列番号26);
N)フォワードプライマー:5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'(配列番号27),
リバースプライマー:5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'(配列番号28);
O)フォワードプライマー:5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'(配列番号29),
リバースプライマー:5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(配列番号30);
P)フォワードプライマー:5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'(配列番号31),
リバースプライマー:5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'(配列番号32);
Q)フォワードプライマー:5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'(配列番号33),
リバースプライマー:5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'(配列番号34);および
R)フォワードプライマー:5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'(配列番号35),
リバースプライマー:5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'(配列番号36)、
ii)上記工程i)で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
iii)反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法。 - 各核酸プローブが、配列番号1〜36に示したヌクレオチド配列中の少なくとも10個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
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