CN101760517A - 用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片及使用方法、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针具有下述基因序列中的至少一种：不同血清群大肠杆菌的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列中选取的DNA片段中的至少一种；肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因中选取的DNA片段；痢疾志贺氏菌1型基因中选取的DNA片段；上述所述的DNA片段的互补DNA或RNA片段。本发明还涉及上述基因芯片的使用方法。本发明还涉及包含上述基因芯片的试剂盒。上述基因芯片和试剂盒可达到检测肠产毒性大肠杆菌的目的，操作简便，准确性高，重复性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片及其使用方法和检测用试剂盒，特别涉及一种用于肠产毒性大肠杆菌O血清群和毒力基因检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，通常称为大肠杆菌，是人和很多动物肠道中的一种兼性厌氧菌，是最占优势的正常栖居菌。它能发酵多种糖类，产酸产气，在婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
在肠道内正常栖居条件下的大肠杆菌，是不致病的。当机体免疫力低下，或当它侵入肠道以外部位时，可引起肠道内或肠道外疾病，因此大肠杆菌为条件致病菌。在肠道外，大肠杆菌可侵入胆囊、膀胱等处引起肠胃、中枢神经系统的化脓性感染或泌尿道炎症。而在肠道内，主要是由某些特殊血清群的大肠杆菌引起不同症状的腹泻，这些能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌(Diarrheagenic Escherichia coli，DEC)。根据其致病机理和不同的生物学特性将其分为6类：肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli，EAEC)、弥散粘附性大肠杆菌(Diffusely adherentE.coli，DAEC)。
在中国，肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)是由致泻性大肠杆菌引起的腹泻疾病的最常见病原菌。国内不同省市地区关于由DEC引起的腹泻疾病的流行病学调查显示，ETEC无论在地区覆盖范围还是在出现频率上，在引起腹泻的病原菌中始终处于最显著地位。国际上对于ETEC的相关报道也说明，它是在发展中国家引起婴幼儿腹泻和旅游者腹泻的最主要病原菌。
据不完全统计，发展中国家每年受ETEC感染的5岁以下儿童约有2.8-4亿人次，5-14岁儿童大约1亿人次，15岁以上成年人大约4亿人次之多；在非洲、亚洲和拉丁美洲所出现过的旅游者腹泻事件中有1/5-1/3都是由ETEC所引起的；世界上每年都有30-50万人死于ETEC引起的腹泻，其中大部分为婴幼儿。
根据国际上关于肠产毒性大肠杆菌的报道统计，ETEC最常见的O血清群有：O6，O8，O11，O15，O25，O27，O78，O85，O114，O115，O126，O128，O139，O148，O149，O159，O166，O167，O173等19种。MARCIA WOLF统计分析了遍布世界各地的18个国家和地区的相关报道，建立了一套覆盖ETEC的O血清群、H血清群、黏附因子、表面抗原、毒素、地理位置和出现数目等多项信息的ETEC数据库。根据该数据库，大肠杆菌O6、O78、O8和O128为ETEC最常见血清群，在该数据库中这些血清群的菌株出现频率各占17％、12％、11％和8％，四种血清群的菌株数量总合(464株)大约占整个数据库菌株数量(954株)的一半。
肠产毒性大肠杆菌区别于其它致泻性大肠杆菌的一项最显著特征是产生肠毒素，包括不耐热肠毒素(Heat Labile Toxin，LT)和耐热肠毒素(Heat Stable toxin，ST)。肠产毒性大肠杆菌可表达LT、ST两者的一种，或者两者同时都表达。事实上，大肠杆菌只有表达LT、ST两种肠毒素中的至少一种，才可被鉴定为肠产毒性大肠杆菌。因此，该两种毒素的编码基因为鉴定ETEC提供了有效的分子标记。
不耐热肠毒素(Heat Labile Toxin，LT)是一种寡聚体毒素，在结构和功能上与霍乱弧菌素十分相似，其存在形式包括LT-I和LT-II两种。LT-I在人和动物中均常见，具有致病性；而LT-II很少在人体中出现，对人或动物，均无致病性。文献中通常所提到的LT，均指具有致病性的LT-I。LT-I是由分子量为28kDa的一个A亚基和分子量为11.5kDa大的五个相同的B亚基构成的大分子量寡聚体。而不同于大分子寡聚体LT的耐热肠毒素(Heat Stable toxin，ST)是个小分子单体小肽，其耐热性源于其氨基酸组成中所富含的半胱氨酸残基的二硫键。ST的存在形式也有两种：STa和STb(有的文献中称作ST-I和ST-II)。STa是由18或19个氨基酸组成的小肽，分子量为2kDa，除了ETEC以外还可由小肠结肠炎耶尔森氏菌和霍乱弧菌产生。根据其最早发现时候的菌株分离来源不同，STa还分为猪源STp(STIa)和人源STh(STIb)两大类，编码STp和STh的基因核苷酸序列相似性达70％。STb是由48个氨基酸组成的，分子量为5.1kDa的小肽，在蛋白序列上与STa没有任何同源性，不同于STa的是它会导致肠上皮组织损伤，包括绒毛上皮细胞的损失和局部绒毛萎缩。以上这些肠毒素均由质粒介导产生：编码STa的基因常与编码定居因子的基因同位于一大质粒Ent上；而编码STb的质粒与编码LT的质粒同位于一个质粒上；也有些ST基因位于转座子上。
肠产毒性大肠杆菌的致病机理是，它首先通过具有高度专一性的定居因子(colonization factor)黏附于宿主小肠黏膜表面，释放出肠毒素。毒素经过内吞作用进入粘膜细胞内腔，通过高尔基体-小囊泡运输机制运输至极化的肠上皮细胞基底外侧，与受体GM1结合。LT与GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶，使细胞质中的cAMP含量持续增高；ST与GM1结合后，激活肠上皮细胞的鸟甘酸环化酶，促使细胞浆中cGMP水平上升。cAMP和cGMP均能引起肠腺分泌增强，使大量液体集聚于小肠内，大大超过了其吸收能力，于是出现腹泻，使水、钠离子、碳酸根离子大量丧失，造成脱水、代谢性酸中毒、高血钾症，致使心力衰竭，有部分病例还会死亡。
受污染的水和食品是ETEC最常见的传播载体。为了尽早发现造成ETEC传播的水和食品源，建立一种快速、准确、有效的ETEC检测技术是当前迫在眉捷的需要。
美国食品药物管理局(FDA)制订的关于食品卫生检验的标准方法中，对大肠杆菌的检测是基于稀释培养和对生化反应结果的观察，沿用了费时繁琐的传统技术。而中国国家商检局当前所采用的对出口食品中大肠杆菌的检测标准，也大体等效采用了美国FDA的标准方法，同样在检测精度和效率上受着很大的限制。
中国现行的国家标准方法对于ETEC的检测也是通过分离培养，生化反应，血清分型，毒素测定等一系列步骤，整个流程大约需要4-5天，不但耗时长，操作繁琐，费用高，而且易受人为因素影响。此外，大部分血清极难生产，在血清型检测中容易出现漏检或假阳性结果。
基因芯片作为上个世纪九十年代末刚刚开始发展起来的一项新兴技术，目前已经广泛应用到了分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药研发、环境污染监测等诸多领域。基因芯片综合运用了生物技术、微制造、微加工、微电子等学科的最新成果，体现出高速度、高通量、集约化和低成本等多项优点。它从生命的本质——核酸分子水平入手，利用最忠实、特异的DNA碱基互补原则，通过分子杂交过程来对细菌、病毒等进行区分和鉴定，因此其准确度和可靠性也是毋庸置疑的。
基因芯片，在今后的食品安全检测，饮用水和环境卫生的监督，以及临床感染性疾病的诊断工作中，具有重大的影响和作用。以肠产毒性大肠杆菌的检测为例，它就能够在同一时间，快速准确地给出待检样品中大肠杆菌的血清群鉴定结果和毒素测定结果两方面的重要报告。
在基因芯片检测中，靶基因的扩增环节是极为重要的。采用的随机引物PCR扩增法，先后只用两条引物便可完成对任何细菌DNA进行全基因组范围的扩增。
随机引物PCR扩增法，克服了以往在Multiplex PCR中不可避免的引物相互干扰问题，成功实现了对多种靶标DNA的同步有效的扩增。通过该方法，一些检测范围以外的细菌也能被扩增DNA，从而有望发现新的致病菌株。
综上所述，有必要发明出一种结合最有发展意义的随机引物PCR扩增法和最先进的基因芯片技术的检测方法，使对肠产毒性大肠杆菌的检测工作变得更加快速、准确和全面。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片，以弥补传统大肠杆菌分型检测技术存在的不足，实现肠产毒性大肠杆菌检测的快速、准确和可靠。
本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针具有下述基因序列中的至少一种：
1)不同血清群大肠杆菌的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列(包括转运酶基因wzx和聚合酶基因wzy)中选取的DNA片段中的至少一种；
2)肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因中(如：LT、STp、STh、STb四种肠毒素的编码基因elt、estA(p)、estA(h)、estB中)选取的DNA片段；
3)痢疾志贺氏菌1型的基因(如痢疾志贺氏菌半乳糖苷基转移酶RfpB的编码基因rfpB)中选取的DNA片段，其作用是将O-抗原寡糖单位处理酶基因序列十分相近的大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型进行区分鉴别。
4)上述1)、2)或3)中所述的DNA片段的互补DNA或RNA片段。
上述1)中所述不同血清群大肠杆菌包括O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中的一种或多种。
本发明的优选实施例中，固定在固相载体上的特异寡聚核苷酸探针具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列中的至少一种。
本发明所述的基因芯片中，固相载体上还固定有阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。
本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针为从细菌16S rRNA基因序列中选取的DNA片段，具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；荧光探针和阴性对照探针，分别具有SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本发明还提供上述的基因芯片的使用方法，其主要包含步骤：
1)根据不同血清群大肠杆菌的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列、肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因或痢疾志贺氏菌1型半乳糖苷基转移酶RfpB的编码基因rfpB基因设计并制备出用于芯片杂交检测的寡核苷酸特异探针；
2)将步骤1)中所得的寡核苷酸特异探针与阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针一同点置于芯片片基，制备出所需基因芯片；
3)制备待测样品的基因组DNA，利用随机引物PCR法对其进行扩增，获得靶序列；
4)荧光标记步骤3)中得到的靶序列，并将标记样品与步骤2)所述基因芯片进行杂交；
5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并鉴定结果。
其中步骤3)中所述随机引物PCR法中包括使用PCR引物，该PCR引物优选具有SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列。
在基因芯片检测中，靶基因的扩增环节是极为重要的。本发明所采用的随机引物PCR扩增法，先后只用两条引物便可完成对任何细菌DNA进行全基因组范围的扩增。
随机引物PCR扩增法基本原理是，首先由引物A引导合成第一步PCR产物，由于该引物3’末端有长度为9bp的随机序列，所以很容易与变性的模板DNA各相应区段互补结合，随机产生长短不一致的DNA片断。这些第一步反应的产物的总体序列基本覆盖整个基因组序列，故其琼脂糖凝胶电泳结果也是亮度均匀的，大小为250-1000bp之间的拖影(smear)。经纯化后的第一步PCR产物用来作为第二步PCR的模板，在引物B的引导下扩增和富集第一步的产物，其中的tag为标签标记(见图1)。
随机引物PCR扩增法，克服了以往在Multiplex PCR中不可避免的引物相互干扰问题，成功实现了对多种靶标DNA的同步有效的扩增。通过该方法，一些检测范围以外的细菌也能被扩增DNA，从而有望发现新的致病菌株。
本发明所述的基因芯片可用于检测大肠杆菌O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中至少一种血清群、肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子。
本发明还提供一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的试剂盒，其包括上述的基因芯片。
上述试剂盒还包括PCR引物，该PCR引物优选具有SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：53所示的DNA序列或其互补DNA序列。
上述试剂盒还包括杂交盒、杂交液配方试剂以及芯片洗液配方试剂。
本发明所述的试剂盒可用于检测大肠杆菌O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中至少一种血清群、肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子。
由上述的技术方案可见，本发明弥补了肠产毒性大肠杆菌的传统检测法的不足，相比于以往的分离培养、生化反应、血清鉴定、毒素测定的一系列繁琐步骤，提供了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的肠产毒性血清型检测的基因芯片及其检测方法。
针对致病菌检测方面的基因芯片大部分为对细菌种的鉴别(如公开号为CN 1536090、公开日为2004年10月13日的专利申请中的食源性致病菌快速检测基因芯片)，而本发明所述的基因芯片不但可鉴别到具体的血清群，还给出与其致病机制相关的毒力因子的具体类型，从而可更准确的指导医疗用药、进出口检验检疫、水和食品安全监督、以及流行病学监控等工作。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明中靶基因扩增环节所采用的随机引物PCR法原理示意图；
图2为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；
图3为本发明基因芯片的一个实施例上55条探针的排布示意图；
图4a至图4s依次表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品分别为大肠杆菌O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O149、O166、O167、O173时的杂交结果；
图4t为利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为痢疾志贺氏菌1型的杂交结果；
图5a-5g表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为具有ETEC所特有肠毒素的至少一种的临床菌株样品时的杂交结果。
具体实施方式
为进一步说明本发明的用于肠产毒性大肠杆菌检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，这些实施例是为了说明而不是以任何方式限制本发明。
基于基因芯片的高准确性、高灵敏度、高通量、高重复性等诸多优点，本发明提供一种能够快速同步检测肠产毒性大肠杆菌的O血清群和毒力因子类型的基因芯片检测方法。
肠产毒性大肠杆菌常见的O血清群包括，O6，O8，O11，O15，O25，O27，O78，O85，O114，O115，O126，O128，O139，O148，O149，O159，O166，O167，O173等19个类型。本发明的用途在于针对以上19个血清群的ETEC进行O血清群和毒力因子的检测。值得说明的是，在O血清群检测中，由于大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型(Shigella dysenteriae 1)的相应寡糖单位处理酶基因彼此相似度很高，故在痢疾志贺氏菌1型的rfpB基因内设计了2条探针以辨别大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型。
实施例1探针的设计和制备
1.序列获得
本发明所涉及到的基因包括细菌的16S rRNA基因、19个不同O血清群大肠杆菌的寡糖单位处理酶基因wzx及wzy(大肠杆菌O8所对应的是wzt、wzm基因)、以及ETEC所特有的肠毒素编码基因elt、estA(包括人源estA(h)和猪源est(p))、estB基因。此外，由于大肠杆菌O148的wzx、wzy基因和痢疾志贺氏菌1型(Shigella dysenteriae 1)的相应基因之间序列相似度很高，故在痢疾志贺氏菌1型所特有的rfpB基因区域内设计2条探针以辨别大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型。这些基因序列的来源详见表1。
表1关于序列来源的说明
2.探针设计
将19个不同血清群大肠杆菌的O抗原寡糖单位处理酶基因wzx、wzy(或wzt、wzm)输入OligoArray软件中，设定参数为长度40bp±5bp、Tm值80℃±2℃，然后运行程序在线设计探针。针对肠产毒性大肠杆菌最常见的19个O血清群，设计大肠杆菌O血清群特异的寡核苷酸探针共38条。为了区分大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型(Shigella dysenteriae 1)，在痢疾志贺氏菌1型的rfpB基因区域内设计2条特异探针以区分两者。毒力基因探针是通过在ncbi网页上对elt、estA(h)、estA(p)、estB四种毒力基因进行在线blast比对后，根据同类保守，异类特异的原则挑选出来的DNA片段。四种毒力基因各2条探针，每条探针都40bp长，Tm值也保持在80℃±2℃范围内。正对照探针是从细菌16s rRNA基因序列中选取的一段保守性很强的DNA片段。
3.探针筛选
通过56次杂交实验进行探针筛选，最终得到51条适用探针，包括38条针对肠产毒性大肠杆菌19个不同O血清群菌株的O抗原特异基因探针、2条辨别大肠杆菌O148和痢疾志贺氏菌1型的探针、8条毒力基因探针、1条阳性对照探针、1条阴性对照探针和1条荧光探针，其碱基序列如表2。
表2本发明基因芯片实施例中选用的探针序列、来源及其相应的检测目标
其中，编号为4-41的38条探针(SEQ ID NO：4-NO：41)分别选自19个不同血清群大肠杆菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因(wzx或wzy)，这些探针用来检测出相应来源菌的O血清群；编号为42-49的8条探针(SEQ ID NO：42-NO：49)分别选自肠产毒性大肠杆菌所能分泌的四种肠毒素的四个编码基因，包括elt、estA(p)、estA(h)、estB，用来检测所表达的肠毒素类型；编号为50-51的两条探针(SEQ ID NO：50-NO：51)是选自痢疾志贺氏菌1型的rfpB基因，用来区分该型的志贺氏菌和大肠杆菌O148。此外，用带有荧光标记Cy3的多聚T序列对玻璃片基的质量进行监控以及对扫描结果图上的探针位置进行定位。用含有多聚T的探针作为阴性对照探针，用于对非特异杂交情况进行监控。编号为SEQ IDNO.3的探针选自细菌的16S rRNA基因，作为阳性对照探针，用于检测样品中是否含有细菌。
4.探针合成：将表1中的探针序列的5’端延长一段T，将全长补足到50bp，并氨基化。该部分委托探针合成公司(北京奥科公司)合成。
实施例2基因芯片制备——芯片点样
1.溶解探针：将上述实施例1中合成好的探针干粉管(由奥科合成)首先进行溶解。步骤如下：将上述探针干粉管在12000转/分钟离心10分钟(注意在离心前不要打开干粉管的盖子)，然后加入1xSpotting Buffer(以1OD加入20μl的比例加入)，用振荡器混匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1小时后，取1.5μl测OD，测出该探针(单链)的核酸浓度(ng/μl)，再利用以下公式将该探针稀释成终浓度为1μg/μl。
公式：
2.加板：将上述溶解后的51条探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10μl探针溶液。
3.点样：利用自动点样仪将上述384孔板中的探针点到玻片上，形成设计好的微阵列。本实施例中利用的是PerkiElmer公司的SpotArraymicroarry printing system生物芯片点样仪(型号为SpotArray 72)，使用SpotArray的控制软件(Tele chem smp3stealty pin)完成全部点样。具体操作步骤如下：以图2所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(购自北京博奥生物芯片有限责任公司)为固相载体，放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，将上述加好探针的384孔板放到样品台处，然后启动控制软件，设置好相应的参数，开始点样，样品按图2所示的排布方式点在上述玻片上的4mm×4mm的点样区内(箭头所示)，构成中低密度DNA微阵列，玻片上的八个点样区内阵列的排布规律相同。在点样过程中，机臂控制针头，每点一个样品要经上样、预点、正式点样、清洗、干燥几个过程。
由图3可见点样区内的探针排布情况，每个探针点为对应表2所示的探针编号的探针，其中NO.1表示荧光探针，NO.2表示阴性对照NO.3表示阳性对照。
4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。
5.交联：用UVP公司的交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)进行紫外交联，600J两次。交联好的芯片放回洁净的芯片盒中，以备使用。
6.预杂交：芯片按以上步骤点样完成后，在使用之前需通过预杂交来封闭表面：将预杂交液置于42℃杂交箱预热1小时后，放入芯片，继续在42℃预杂交液里预杂交1小时，然后用预洗液1和2分别洗5分钟，预洗液3洗30秒(预杂交液配方见表3，预洗液成分见表4)。
表3预杂交液配方
表4预洗液成分
实施例3利用上述制备好的基因芯片快速检测肠产毒性大肠杆菌的O血清群及毒力因子类型
在利用上述制备好的基因芯片检测肠产毒性大肠杆菌的方法中，本发明对检测步骤、检测条件等因素均作了一系列的实验摸索，如全基因组随机引物PCR反应混合物中各成分比例，模板浓度，芯片杂交反应的杂交温度，杂交时间，以及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见下述)，均为经过梯度实验后得到的优良比例。肠产毒性大肠杆菌检测基因芯片的实验流程亦为优化后结果。以下为利用上述制备好的基因芯片检测肠产毒性大肠杆菌的较佳实施例的具体说明：
1.提取基因组：从保菌的甘油管中挑取小量菌块，转接于LB培养基中，37℃，200rpm，振荡培养12小时后按照常规提取普通革兰氏阴性菌基因组的方法提取大肠杆菌培养物的基因组DNA。
2.扩增靶序列：靶序列的扩增要通过两个步骤来完成，分别利用两条引物A和B，序列见表5，均引自Sushma Shivaswamy and Vishwanath R.Iyer，Genome-wide Analysis of Chromatin Status Using Tiling Microarrays，Methods.Volume 41，Issue 3，March 2007，P.304-311。
表5全基因随机引物PCR法所用的引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| A(SEQ ID NO：52) | GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN |
| B(SEQ ID NO：53) | GTTTCCCAGTCACGATC |
在第一步扩增中，用引物A在全基因组范围内进行随机PCR扩增。首先，按表6配方配制混合液1之后，置PCR仪95℃解链5分钟。然后，迅速取出样品，埋于冰下2-5分钟，随后加入30μl按照表7配方配制的PCR混合液2，混匀后放回PCR仪中，4℃保持10秒，再以0.1℃/s的速度从4℃逐渐升至72℃，然后72℃延伸1分钟。将以上步骤循环2次之后取出产物，用MontageR PCR离心超滤管(来自美国Millipore公司UFC7PC250)对PCR产物进行纯化。以下所提到的引物A和引物B均由上海英骏生物技术有限公司合成，dNTP Mixture中四个成分分别来自上海生工D4026A、D4027A、D4028A、D4029A，Taq酶与10×PCR缓冲液来自宝生物DR100M，Cy3-dUTP来自Amersham PA53022。
表6随机扩增PCR反应混合液1配方
表7随机扩增PCR反应混合液2配方
第二步扩增时，以第一部扩增产物的纯化样品为模板，用引物B来富集在第一步扩增时产生的随机扩增片段，PCR体系见表8，循环条件为：95℃5分钟，95℃30秒，45℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，返回第二步进行35个循环后72℃补充延长5分钟。
表8第二步PCR反应体系
第二步扩增产物经电泳检测，若出现250-1000bp的均匀的拖影(smear)，就可以对其进行荧光标记反应，即取5μl第二步扩增产物作为模板，加入按表9配方混合好的PCR体系中，混匀。
表9荧光标记PCR体系
荧光标记PCR的循环条件与第二步扩增时所用的程序完全一致，即95℃5分钟，95℃30秒，45℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，进行35个循环后，72℃补充延伸5分钟。
3.杂交：将荧光标记好的PCR产物放到65℃烘箱中烘干(要避光)，等完全烘干后加入按表10配方配制好的杂交液20μl，避光静止2分钟，使其溶解。放入PCR仪中，95℃解链5分钟，45℃保温5分钟。
表10杂交液配方
在杂交盒内均匀加入80μl灭菌超纯水，放入洗好的芯片，点有探针的一面向上并盖好盖片。(注意：盖片有凸起的一面朝下，使盖片的加样孔朝向操作者，切勿放反)。将变性好的反应液从PCR仪中取出迅速的加入相应的加样孔中，盖好杂交盒的盖子放到45℃水浴中杂交16小时(注意：杂交过程中要避光)。芯片杂交完毕后，从水浴锅中取出杂交盒，取走盖片，将芯片放入42℃预热好的洗液1中42℃洗5分钟，洗液2-1，2-2中室温洗5分钟，洗液3中室温洗4分钟，最后在洗液4中洗15秒，洗液配方见表11。室温避光晾干芯片，以备扫描。
表11芯片洗液成分
4.扫描：打开扫描仪(Gene Pix 4100A)，并使机器预热15分钟。将芯片放到扫描仪中(点有探针的一面朝下)后盖好扫描仪的盖子，启动GenePix Pro 6.0扫描程序。选用532通道，GMT值设定为650进行扫描。分别将扫描的图片保存为.gif和.GIF两种格式。
用上述制备好的基因芯片分别检测19个不同血清群的大肠杆菌以及痢疾志贺氏菌1型，杂交扫描结果如图4a～4s所示，其中图4a.E.coli O6；图4b.E.coli O8；图4c.E.coli O11；图4d.E.coli O15；图4e.E.coli O25；图4f.E.coli O27；图4g.E.coli O78；图4h.E.coli O85；图4i.E.coli O114；图4j.E.coli O115；图4k.E.coli O126；图41.E.coli O128；图4m.E.coli O139；图4n.E.coli O148；图4o.E.coli O149；图4p.E.coli O159；图4q.E.coli O166；图4r.E.coli O167；图4s.E.coli O173；当所检菌株为肠产毒性大肠杆菌时的芯片扫描结果如图5a～5g所示，其中图5a.E.coli O114；图5b.E.coli O114；图5c.E.coli O149；图5d.E.coli O149，图5e.E.coli O149；图5f.E.coli O149；图5g.E.coli O149。
实施例4对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测
1.特异性鉴定实验
用本发明的基因芯片对不同菌株进行检测，其检测范围包括以下三类菌株：
(1)属于前述19个O血清群大肠杆菌和痢疾志贺氏菌1型的标准菌株，共30株(详见表12)。
表12用于芯片特异性鉴定的标准菌株
| 大肠杆菌O血清群 | 菌株数目 |
| O6 | 3a |
| O8 | 1a |
| O11 | 1b、2a |
| O15 | 1a |
| O25 | 1b |
| O27 | 1a |
| O78 | 1a |
| O85 | 1b、1a |
| O114 | 1a |
| O115 | 1a |
| O126 | 1a |
| O128 | 1a |
| O139 | 1b、1a |
| O148 | 1b、1a |
| O149 | 1a |
| O159 | 1a |
| O166 | 1a |
| 大肠杆菌O血清群 | 菌株数目 |
| O167 | 1a |
| O173 | 1a |
| S.dysenteribe 1 | 3b |
注：a代表菌株来自于Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Adelaide，Australia；b代表菌株来自于CMCC(中国医学微生物菌种保存管理中心/中国药品生物制品检定所)。
在本实施例中，大肠杆菌标准株的杂交结果为：荧光探针、正对照探针以及样品所相应的2条O-特异探针显示阳性；其余O-特异基因探针和负对照探针显示阴性；由于本实施例中所选用的大肠杆菌标准株大部分都不属于肠产毒性大肠杆菌，不具有肠毒素基因，因此大部分样品的杂交结果中毒力基因探针都显示阴性信号，只有个别菌株，例如E.coli O148和E.coli O167的杂交结果有estA(h)、estB等毒力基因的阳性荧光信号，相关例图见图4a～4s所示。
在本实施例中，痢疾志贺氏菌1型标准株的杂交结果为：荧光探针、正对照探针、大肠杆菌O148的2条O-特异探针以及痢疾志贺氏菌D1型所相应的rfpB特异基因探针显示阳性；其余O抗原特异基因探针、负对照探针和所有毒力基因探针均显示阴性，其例图见图4t。
(2)属于前述的19个O血清群大肠杆菌的临床菌株，共26株，(详见表13)。
表13用于芯片特异性鉴定的一些临床菌株
| 大肠杆菌O血清群 | 菌株数目 |
| O8 | 3、2a |
| O11 | 1a |
| O15 | 2 |
| O78 | 4a |
| O114 | 5、1a |
| O139 | 3a |
| O149 | 5 |
注：以上临床菌株均来自Dr.Lothar Beutin Federalinstitute for RiskAssessment(B fR)National Reference Laboratory for Escherichia coli，BerlinGermany。其中，标有a者为非ETEC菌株。
该组样品区别于(1)类样品的是，所选菌株为临床菌株，其中有些属于肠产毒性大肠杆菌，具有肠毒素的编码基因。因此，其杂交扫描结果中除了荧光探针、正对照探针和O抗原特异基因探针显示阳性信号之外，相应毒力基因探针也可显示阳性，相关例图见图5a～5g所示。
(3)对于除以上19型以外的其它O血清群的大肠杆菌进行检测，包括O1，O2，O3，O4，O5，O7，O9，O10，O12，O13，O14，O16，O17，O18，O19，O20，O21，O22，O23，O24，O26，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O37，O39，O40，O41，O42，O43，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O53，O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61，O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70，O71，O73，O74，O75，76，O77，O79，O80，O81，O82，O83，O84，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O100，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O107，O108，O109，O110，O111，O112，O113，O116，O117，O118，O119，O120，O121，O123，O124，O125，O127，O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O140，O141，O142，O143，O144，O145，O146，O147，O150，O151，O152，O153，O154，O155，O156，O157，O158，O160，O161，O162，O163，O164，O165，O168，O169，O170，O171，O172，O174，O177，O180，共150株菌。
以上样品经本发明所研制的基因芯片检测后，除了荧光探针和正对照探针显示阳性结果之外，其余探针均显阴性。
(4)对于与大肠杆菌亲缘关系较近的志贺氏菌属和沙门氏菌属，各挑10株菌，进行芯片杂交检测。其中，弗氏志贺氏菌有S.flexneri 1a，S.flexneri 2a，S.flexneri 3a，S.flexneri 4a，S.flexneri 4b五个型；痢疾志贺氏菌有S.dysenteriae 2，S.dysenteriae 3，S.dysenteriae 5三个型；鲍氏志贺氏菌有S.boydii4，S.boydii9二个型；沙门氏菌有Salmonella M，Salmonella O52，Salmonella E1，Salmonella I，Salmonella J，Salmonella X，Salmonella N，Salmonella V，Salmonella D1，Salmonella F十个型。
以上菌株经本发明的方法检测后，除正对照探针和荧光探针显示阳性信号之外，其余所有探针均显示阴性。
2.灵敏度检测实验
针对前述19型的大肠杆菌的38株不同时间和地点分离到的分离菌株进行检测，每个菌株做3次平行实验，将欲检测的模板以10ng、50ng、100ng及500ng四个梯度加入到PCR体系中进行反应。最后，经芯片扫描能够得到正确且稳定的检测结果的最低模板量即为其灵敏度的值。
灵敏度试验结果：本发明的基因芯片以DNA为起始检测标本的灵敏度为50ng。该结果说明本发明的基因芯片对大肠杆菌O血清群和毒力因子的检测具有很高的灵敏度。
综上所述，本发明从肠产毒性大肠杆菌的O-抗原基因簇中高度特异的基因序列中选取特异的核酸探针片段，并固定到芯片的载体上，制成基因芯片。通过全基因组范围随机扩增PCR的方法扩增和标记特异的基因和寡核苷酸片段，然后与基因芯片进行杂交反应，最后利用基因芯片信号分析设备及软件，就可以检测出样品中存在致病菌情况。本发明的优点在于：继承和发展了传统的血清学检测方法，并且弥补了传统检测的不足，使检测过程变得快速、灵敏且特异性和准确率高。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>8P13006-CN
<130>用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片及使用方法、检测试剂盒
<160>53
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>荧光探针序列
<400>1
tttttttttt tttttttttt ttttttttt_cy3 31
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>阴性对照探针序列
<400>2
tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>阳性对照探针序列
<400>3
ttgtacacac cgcccgtcac accat 25
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O6的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>4
ccatgttgtt catcttaaac ctaatgaatg cattgtggaa 40
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O6的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>5
tcgtagtgaa gctataacgt ttcttttaac ggttacatgt 40
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇中wzm基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>6
tcacacccat tgtttatgta ctgaattcat tacctgc 37
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O8的O-抗原基因簇中wzt基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>7
gccgataaac aaaatcagtc cattaaacaa gttgagcata 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O11的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>8
cgttcaaggt ggcaattata tatttccatt ggtcacactg 40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O11的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>9
cagatggagt gtttatgtat gttcatttat gctaggggta 40
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O15的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>10
gagtcattgg tgtatcgaat tttggtgatc tgagtttttc 40
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O15的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>11
gcaataagtc agggtgccaa ttacctactg ccattattaa 40
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O25的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>12
atccagaact taacgatgtt agtaggcatt gtgattagtg 40
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O25的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>13
aaattaagcc atgcaagtag ttttacagcg tcatatgcag 40
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O27的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>14
tcctgtgcta tttatgggtt agttctgatc aattaacctt 40
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O27的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>15
ttgctctgtt cataaaaggc attagcactt attatgtcgt 40
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O78的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>16
tcttttatca cattgattgg tgtttgtttt ctctacccaa 40
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O78的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>17
ttatgaaagg ctaactgttt acttcgaatt ttctcatgct 40
<210>18
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O85的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>18
tttcagtacg ttaacttttg gttgagtgat gaacaacgta 40
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O85的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>19
agtattaact cgtttagaaa ccttacaagc tgggaatgat 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O114的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>20
tcataggaaa ggattagaac attgctacaa gtggtggatt 40
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O114的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>21
ggatggaatg ttaatgggtt atttatttca gaagcatggg 40
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>22
cagtttagat gttgtccgat ggattaatat aacgctgttt 40
<210>23
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O115的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>23
aggcagaagg atgtttgctg ttatttaatt gtatgcatgt 40
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O126的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>24
acgtagtatt ctaataatcg tgctaacaat atgtgcgcta 40
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O126的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>25
tggcatctaa aattataagt tcgttaggat tagtggcgat 40
<210>26
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O128的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>26
gcccattgca ttcctaaatt tgaaatgatt aatgctatcc 40
<210>27
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O128的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>27
gctaggtatt tagcaaattc aacagatttg gctgactttg 40
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O139的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>28
ggatttcagg gccaatattt tatgagtttt gtagccttat 40
<210>29
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O139的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>29
atggaaccgt atgtacaata ctttataatc atgggcctgg 40
<210>30
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O148的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>30
gcaatatttg atacgttaag ggtttatctt ttctcgggat 40
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O148的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>31
caatgagcaa tatttcgtac cattaagtgc aacaaccttg 40
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O149的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>32
tatggtatgc aattactgat tcattaagat ttggaggcgt 40
<210>33
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O149的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>33
cggtgcaaag ttaattccgc taacgataat atgttgtttt 40
<210>34
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O159的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>34
gttataatga cagtagattc aatccttttc ttgggttgca 40
<210>35
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O159的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>35
gcactgagct atttgggtgt taattattat ggtgtatgga 40
<210>36
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O166的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>36
gcatgatggt ttattttaga gtggatcggt attttgttga 40
<210>37
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O166的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>37
taggaacaat agtttcgttt cgagatataa gcgttgatcg 40
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O167的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>38
gccatatata cttctgcaaa taaaatatta caggcggctc 40
<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O167的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>39
accgcagttg ttaatatcag tagtggcagt atatatcatt 40
<210>40
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O173的O-抗原基因簇中wzx基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>40
agctgtacta atgtcatcat acacgatggt aattggtatt 40
<210>41
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌O173的O-抗原基因簇中wzy基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>41
tcttagaaaa gttagagttc cacctctttt agcattgtgt 40
<210>42
<211>40
<212>DNA
<213>基于ETEC不耐热肠毒素LT的编码基因(elt)设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>42
acacattaag aatcacatat ctgaccgaga ccaaaattga 40
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>基于ETEC不耐热肠毒素LT的编码基因(elt)设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>43
gcaaaagaga aatggttatc attacattta agagcggcg 39
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STp的编码基因(estA(p))设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>44
ttatctttcc cctcttttag tcagtcaact gaatcacttg 40
<210>45
<211>40
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STp的编码基因(estA(p))设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>45
cgtttaacta atctcaaata tccgtgaaac aacatgacgg 40
<210>46
<211>40
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STh的编码基因(estA(h))设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>46
gtagcaatta ctgctgtgaa ttgtgttgta atcctgcttg 40
<210>47
<211>40
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STh的编码基因(estA(h))设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>47
tttcaccttt cgctcaggat gctaaaccag tagagtcttc 40
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STb的编码基因(estB)设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>48
ttctattgct acaaatgcct atgcatctac acaatcaaa 39
<210>49
<211>39
<212>DNA
<213>基于ETEC耐热肠毒素STb的编码基因(estB)设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>49
aggtttttta ggggttagag atggtactgc tggagcatg 39
<210>50
<211>40
<212>DNA
<213>基于痢疾志贺氏菌D1型rfpB基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>50
tgggagaaga aagttataag ttagcaagag aaagattcga 40
<210>51
<211>40
<212>DNA
<213>基于痢疾志贺氏菌D1型rfpB基因设计的寡聚核苷酸特异探针
<400>51
aatttattat acttggcgct atagataagg aaaaccccgg 40
<210>52
<211>26
<212>DNA
<213>随机PCR引物A
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(26)
<223>n is a，c，g，or t
<400>52
gtttcccagt cacgatcnnn nnnnnn 26
<210>53
<211>17
<212>DNA
<213>随机PCR引物B
<400>53
gtttcccagt cacgatc 17
Claims (11)
1.一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针，其特征在于固定在固相载体上的寡聚核苷酸特异探针具有下述基因序列中的至少一种：
1)不同血清群大肠杆菌的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列中选取的DNA片段中的至少一种；
2)肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因中选取的DNA片段；
3)痢疾志贺氏菌1型基因中选取的DNA片段；
4)上述1)、2)或3)中所述的DNA片段的互补DNA或RNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于1)中所述不同血清群大肠杆菌包括O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述固定在固相载体上的特异寡聚核苷酸探针具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基因芯片，其特征在于所述固相载体上还固定有阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述的基因芯片的使用方法，其特征在于包含步骤：
1)根据不同血清群大肠杆菌的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因序列、肠产毒性大肠杆菌肠毒素的编码基因或痢疾志贺氏菌1型基因设计并制备出用于芯片杂交检测的寡核苷酸特异探针；
2)将步骤1)中所得的寡核苷酸特异探针与阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针一同点置于芯片片基，制备出所需基因芯片；
3)制备待测样品的基因组DNA，利用随机引物PCR法对其进行扩增，获得靶序列；
4)荧光标记步骤3)中得到的靶序列，并将标记样品与步骤2)所述基因芯片进行杂交；
5)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并鉴定结果。
7.权利要求6所述的基因芯片的使用方法，其特征在于步骤3)中所述随机引物PCR法中包括使用PCR引物，该PCR引物具有SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列。
8.权利要求1所述的基因芯片在检测大肠杆菌O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中至少一种血清群或肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子中的应用。
9.一种用于检测肠产毒性大肠杆菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的基因芯片。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR引物，该PCR引物具有SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：53所示的DNA序列或其互补DNA序列。
11.权利要求9或10所述的试剂盒在检测大肠杆菌O6、O8、O11、O15、O25、O27、O78、O85、O114、O115、O126、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O167、O173中至少一种血清群或肠产毒性大肠杆菌中至少一种毒力因子中的应用。
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2008
- 2008-12-26 CN CN200810189248A patent/CN101760517A/zh active Pending
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