JP2003199568A - Ｄｎａ増幅反応の効率向上方法 - Google Patents
Ｄｎａ増幅反応の効率向上方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡの増幅反応の効率を向上させる方法及
びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性を向上
させる方法の提供。 【解決手段】 ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であっ
て、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、ｇｃ
含量が１５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチド等
を結合したものをプライマーとして用いることを特徴と
するＤＮＡ増幅反応の効率向上方法；並びにオリゴヌク
レオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法であって、
ＤＮＡにハイブリダイズさせるものとして、オリゴヌク
レオチドの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５等を結合した
ものを使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチド
のＤＮＡへの特異的結合性向上方法。
びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性を向上
させる方法の提供。 【解決手段】 ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であっ
て、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、ｇｃ
含量が１５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチド等
を結合したものをプライマーとして用いることを特徴と
するＤＮＡ増幅反応の効率向上方法；並びにオリゴヌク
レオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法であって、
ＤＮＡにハイブリダイズさせるものとして、オリゴヌク
レオチドの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５等を結合した
ものを使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチド
のＤＮＡへの特異的結合性向上方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ増幅反応の
効率向上方法及びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異
的結合性向上方法に関する。
効率向上方法及びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異
的結合性向上方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＤＮＡ
の増幅は、遺伝子の検出の際等に極めて重要であり、こ
のうちＰＣＲ法は、ＤＮＡの目的とする一部分の塩基配
列のみを大幅に増幅させることができる方法であり、バ
イオテクノロジーをはじめ、多くの分野で利用されてい
る。
の増幅は、遺伝子の検出の際等に極めて重要であり、こ
のうちＰＣＲ法は、ＤＮＡの目的とする一部分の塩基配
列のみを大幅に増幅させることができる方法であり、バ
イオテクノロジーをはじめ、多くの分野で利用されてい
る。
【０００３】ところで、特異的な検出プライマーをデザ
インする場合、プライマーは、標的配列に特異的な塩基
ポジションを含むことが必要である。しかしながら、そ
のようなポジションを含む配列がプライマーとして適し
ていないことがしばしばある。すなわち、例えばａｔ含
量が極端に高かったり、フォワードとリバースの融解温
度（Ｔｍ）が合わないような場合には、増幅効率が悪く
なるため、プライマーとして実用的でない。特に、微量
のＤＮＡを検出しようとする場合には非常に不利であ
る。
インする場合、プライマーは、標的配列に特異的な塩基
ポジションを含むことが必要である。しかしながら、そ
のようなポジションを含む配列がプライマーとして適し
ていないことがしばしばある。すなわち、例えばａｔ含
量が極端に高かったり、フォワードとリバースの融解温
度（Ｔｍ）が合わないような場合には、増幅効率が悪く
なるため、プライマーとして実用的でない。特に、微量
のＤＮＡを検出しようとする場合には非常に不利であ
る。
【０００４】また、ＰＣＲ法では、増幅効率を向上させ
るため、増幅の至適温度条件を見出す必要がある。しか
しながら、至適温度条件を見出すには、煩雑な予備実験
が必要である。
るため、増幅の至適温度条件を見出す必要がある。しか
しながら、至適温度条件を見出すには、煩雑な予備実験
が必要である。
【０００５】したがって、本発明は、至適温度条件を見
出すための操作を簡略化でき、かつＤＮＡ増幅反応の効
率向上方法を提供することを目的とする。また、本発明
は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上
方法を提供することを目的とする。
出すための操作を簡略化でき、かつＤＮＡ増幅反応の効
率向上方法を提供することを目的とする。また、本発明
は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上
方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、５’末端
にＭ１３プライマー配列を結合させたデジェネレートプ
ライマーを用いてデジェネレートＰＣＲを行い、得られ
た増幅産物についてダイレクトシークエンスを行ってい
たが、このとき驚くべき事実を見出した。すなわち、デ
ジェネレートプライマーの５’末端に、Ｍ１３プライマ
ー配列のような非特異的配列が結合していると、ＰＣＲ
の増幅効率が低くなるのではないかと考え、Ｍ１３プラ
イマー配列を除去してＰＣＲを行ったところ、ＰＣＲの
増幅効率はかえって低下した。
にＭ１３プライマー配列を結合させたデジェネレートプ
ライマーを用いてデジェネレートＰＣＲを行い、得られ
た増幅産物についてダイレクトシークエンスを行ってい
たが、このとき驚くべき事実を見出した。すなわち、デ
ジェネレートプライマーの５’末端に、Ｍ１３プライマ
ー配列のような非特異的配列が結合していると、ＰＣＲ
の増幅効率が低くなるのではないかと考え、Ｍ１３プラ
イマー配列を除去してＰＣＲを行ったところ、ＰＣＲの
増幅効率はかえって低下した。
【０００７】そこで、本発明者らは、非特異的配列を結
合させることにより、ＰＣＲの増幅効率が向上するので
はないかと考え、さらに研究した結果、全く意外にも、
非特異的配列のみならず、ＬＣＲｅｄ７０５等の化合物
を５’末端に結合させることにより、アニーリングの至
適温度範囲が広がるため、アニーリング条件の検討等の
予備実験を簡略化でき、操作を大幅に簡素化することが
できるとともに、ＰＣＲの増幅効率を向上させることが
でき、結果としてＤＮＡ増幅反応の効率を向上させるこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
合させることにより、ＰＣＲの増幅効率が向上するので
はないかと考え、さらに研究した結果、全く意外にも、
非特異的配列のみならず、ＬＣＲｅｄ７０５等の化合物
を５’末端に結合させることにより、アニーリングの至
適温度範囲が広がるため、アニーリング条件の検討等の
予備実験を簡略化でき、操作を大幅に簡素化することが
できるとともに、ＰＣＲの増幅効率を向上させることが
でき、結果としてＤＮＡ増幅反応の効率を向上させるこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明の第一の発明は、ＤＮＡ
増幅反応の効率向上方法であって、プライマーの５’末
端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、ＰＯ4 3-、ビオチ
ン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅ
ｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４
０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩ
ＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩ
ＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、Ｂ
ＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９
１（以下、「特定化合物群」という）及びｇｃ含量が１
５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチド（以下、
「特定塩基」という）より選ばれる化合物を結合したも
のをプライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡ増
幅反応の効率向上方法を提供するものである。また、本
発明の第二の発明は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの
特異的結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイ
ズさせるものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端
に、特定化合物群より選ばれる化合物を結合したものを
使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮ
Ａへの特異的結合性向上方法を提供するものである。
増幅反応の効率向上方法であって、プライマーの５’末
端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、ＰＯ4 3-、ビオチ
ン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅ
ｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４
０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩ
ＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩ
ＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、Ｂ
ＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９
１（以下、「特定化合物群」という）及びｇｃ含量が１
５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチド（以下、
「特定塩基」という）より選ばれる化合物を結合したも
のをプライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡ増
幅反応の効率向上方法を提供するものである。また、本
発明の第二の発明は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの
特異的結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイ
ズさせるものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端
に、特定化合物群より選ばれる化合物を結合したものを
使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮ
Ａへの特異的結合性向上方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の第一の発明及び第二の発
明において、特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合
物を結合させるプライマー又は特定化合物群より選ばれ
る化合物を結合させるオリゴヌクレオチドとしては、通
常のＤＮＡの増幅に用いることができるプライマー又は
オリゴヌクレオチドであれば、特に制限はない。また、
本発明においては、ＤＮＡの増幅効率を向上させること
ができるのであるから、通常のＤＮＡの増幅には用いる
ことができないプライマーも用いることができる。
明において、特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合
物を結合させるプライマー又は特定化合物群より選ばれ
る化合物を結合させるオリゴヌクレオチドとしては、通
常のＤＮＡの増幅に用いることができるプライマー又は
オリゴヌクレオチドであれば、特に制限はない。また、
本発明においては、ＤＮＡの増幅効率を向上させること
ができるのであるから、通常のＤＮＡの増幅には用いる
ことができないプライマーも用いることができる。
【００１０】本発明の第一の発明及び第二の発明におい
て、特定化合物群は、ＤＮＡ増幅法により増幅させる標
的配列に対して非特異的である。ＤＩＧとはジゴキシゲ
ニンであり、ＤＮＰとはジニトロフェニルであり、ＴＡ
ＭＲＡとはカルボキシテトラメチルローダミンであり、
Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄとは１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−
Ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−
ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，
９−［２（ｏｒ４）−［［［６−（２，５−ｄｉｏｘｏ
−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘ
ｏｈｅｘｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−４
（ｏｒ２）ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２，３，６，
７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，
ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔであり、ＲＯＸとはローダミンＸ
であり、ＸＲＩＴＣとはローダミンＸイソチオシアネー
トであり、ＦＩＴＣとはフルオレセインイソチオシアネ
ートであり、６−ＦＡＭとは６−カルボキシフルオレセ
インであり、ＴＥＴとはテトラクロロフルオレセインで
あり、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０とは４，４−ｄｉｆ
ｌｕｏｒｏ−５−ｓｔｙｒｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，
４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏ
ｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ
ｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０とは
４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｐｈｅｎｙｌ
−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄ
ａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰ
Ｙ５８１／５９１とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−
（４−ｐｈｅｎｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｙｌ）
−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄ
ａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒである。また、本発
明の第一の発明において、特定塩基は、ハイブリダイズ
させる塩基配列に対して非特異的な配列でも特異的な配
列でもよい。
て、特定化合物群は、ＤＮＡ増幅法により増幅させる標
的配列に対して非特異的である。ＤＩＧとはジゴキシゲ
ニンであり、ＤＮＰとはジニトロフェニルであり、ＴＡ
ＭＲＡとはカルボキシテトラメチルローダミンであり、
Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄとは１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−
Ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−
ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，
９−［２（ｏｒ４）−［［［６−（２，５−ｄｉｏｘｏ
−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘ
ｏｈｅｘｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−４
（ｏｒ２）ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２，３，６，
７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，
ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔであり、ＲＯＸとはローダミンＸ
であり、ＸＲＩＴＣとはローダミンＸイソチオシアネー
トであり、ＦＩＴＣとはフルオレセインイソチオシアネ
ートであり、６−ＦＡＭとは６−カルボキシフルオレセ
インであり、ＴＥＴとはテトラクロロフルオレセインで
あり、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０とは４，４−ｄｉｆ
ｌｕｏｒｏ−５−ｓｔｙｒｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，
４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏ
ｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ
ｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０とは
４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｐｈｅｎｙｌ
−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄ
ａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰ
Ｙ５８１／５９１とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−
（４−ｐｈｅｎｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｙｌ）
−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄ
ａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒである。また、本発
明の第一の発明において、特定塩基は、ハイブリダイズ
させる塩基配列に対して非特異的な配列でも特異的な配
列でもよい。
【００１１】本発明の第一の発明においては、特定化合
物群、特定塩基から選ばれる１種又は２種以上を用いる
ことができる。本発明の第二の発明においては、特定化
合物群から選ばれる１種又は２種以上を用いることがで
きる。
物群、特定塩基から選ばれる１種又は２種以上を用いる
ことができる。本発明の第二の発明においては、特定化
合物群から選ばれる１種又は２種以上を用いることがで
きる。
【００１２】本発明の第一の発明及び第二の発明におい
ては、オリゴヌクレオチド又はプライマーと特定化合物
群より選ばれる化合物とをリンカーを介して結合させて
もよい。リンカーとしては、例えば炭素数が２〜１６の
炭化水素基等が挙げられる。
ては、オリゴヌクレオチド又はプライマーと特定化合物
群より選ばれる化合物とをリンカーを介して結合させて
もよい。リンカーとしては、例えば炭素数が２〜１６の
炭化水素基等が挙げられる。
【００１３】本発明の第一の発明において、プライマー
の５’末端に結合するオリゴヌクレオチド（付加配列）
は、ｇｃ含量が高く、一定塩基以上の塩基配列を有する
ことが必要である。具体的には、ｇｃ含量が１５％以上
で、かつ２塩基以上の塩基配列からなることが必要であ
る。ｇｃ含量が１５％未満のオリゴヌクレオチドを結合
させると、ＤＮＡ増幅反応の効率が低下することもあ
る。ｇｃ含量は高い方がＤＮＡ増幅反応の効率は高くな
り、５０％以上であることが好ましく、７５％以上であ
ることが特に好ましい。塩基配列が長くなりすぎると、
ＤＮＡ増幅反応の効率は低下する場合もあるため、４０
塩基以下であることが好ましい。また、ｇとｃの合計の
含有量に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量が７
０％以上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔのうち
多い方の塩基の含有量が７０％以上であることが好まし
い。
の５’末端に結合するオリゴヌクレオチド（付加配列）
は、ｇｃ含量が高く、一定塩基以上の塩基配列を有する
ことが必要である。具体的には、ｇｃ含量が１５％以上
で、かつ２塩基以上の塩基配列からなることが必要であ
る。ｇｃ含量が１５％未満のオリゴヌクレオチドを結合
させると、ＤＮＡ増幅反応の効率が低下することもあ
る。ｇｃ含量は高い方がＤＮＡ増幅反応の効率は高くな
り、５０％以上であることが好ましく、７５％以上であ
ることが特に好ましい。塩基配列が長くなりすぎると、
ＤＮＡ増幅反応の効率は低下する場合もあるため、４０
塩基以下であることが好ましい。また、ｇとｃの合計の
含有量に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量が７
０％以上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔのうち
多い方の塩基の含有量が７０％以上であることが好まし
い。
【００１４】具体的な好ましい塩基配列として、例えば
以下の２〜８塩基のものを例示することができる。ま
た、９塩基以上の配列については、以下の２〜８塩基の
ものを適宜組み合わせればよい。なお、Ｓとはｃ又はｇ
を表し、Ｗとはａ又はｔを表す。ｇとｃの合計の含有量
に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量が７０％以
上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔのうち多い方
の塩基の含有量が７０％以上であることが好ましい。 ＳＳ、ＳＷ、ＷＳ、ＳＳＳ、ＳＳＷ、ＳＷＳ、ＷＳＳ、
ＳＳＳＳ、ＳＳＳＷ、ＳＳＷＳ、ＳＷＳＳ、ＷＳＳＳ、
ＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳ、Ｓ
ＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＷ、
ＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳ
ＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ
Ｗ、ＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＳ
Ｓ、ＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ
Ｓ、ＳＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳ
ＳＷＳ、ＳＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＳ
ＷＳＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳＳ、Ｗ
ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷＷ、ＳＳＳＳＳＷＳ
Ｗ、ＳＳＳＳＷＳＳＷ、ＳＳＳＷＳＳＳＷ、ＳＳＷＳＳ
ＳＳＷ、ＳＷＳＳＳＳＳＷ、ＷＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳ
ＳＳＷＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳＷＳ、Ｓ
ＳＷＳＳＳＷＳ、ＳＷＳＳＳＳＷＳ、ＷＳＳＳＳＳＷ
Ｓ、ＳＳＳＳＷＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳ
ＷＳＳ、ＳＷＳＳＳＷＳＳ、ＷＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳ
ＷＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＷＳＳＳ、Ｗ
ＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＷＳＳＳ
Ｓ、ＷＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＷＳＳ
ＳＳＳ、ＷＷＳＳＳＳＳＳ また、具体的には、ａｇｔｃ、ａａｇｔ、ｇｇａｃ又は
ｇｇｇｃの繰り返し単位からなる２０塩基までのオリゴ
ヌクレオチドを例示することができる。
以下の２〜８塩基のものを例示することができる。ま
た、９塩基以上の配列については、以下の２〜８塩基の
ものを適宜組み合わせればよい。なお、Ｓとはｃ又はｇ
を表し、Ｗとはａ又はｔを表す。ｇとｃの合計の含有量
に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量が７０％以
上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔのうち多い方
の塩基の含有量が７０％以上であることが好ましい。 ＳＳ、ＳＷ、ＷＳ、ＳＳＳ、ＳＳＷ、ＳＷＳ、ＷＳＳ、
ＳＳＳＳ、ＳＳＳＷ、ＳＳＷＳ、ＳＷＳＳ、ＷＳＳＳ、
ＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳ、Ｓ
ＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＷ、
ＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳ
ＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ
Ｗ、ＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＳ
Ｓ、ＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ
Ｓ、ＳＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳ
ＳＷＳ、ＳＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＳ
ＷＳＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳＳ、Ｗ
ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷＷ、ＳＳＳＳＳＷＳ
Ｗ、ＳＳＳＳＷＳＳＷ、ＳＳＳＷＳＳＳＷ、ＳＳＷＳＳ
ＳＳＷ、ＳＷＳＳＳＳＳＷ、ＷＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳ
ＳＳＷＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳＷＳ、Ｓ
ＳＷＳＳＳＷＳ、ＳＷＳＳＳＳＷＳ、ＷＳＳＳＳＳＷ
Ｓ、ＳＳＳＳＷＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳ
ＷＳＳ、ＳＷＳＳＳＷＳＳ、ＷＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳ
ＷＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＷＳＳＳ、Ｗ
ＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＷＳＳＳ
Ｓ、ＷＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＷＳＳ
ＳＳＳ、ＷＷＳＳＳＳＳＳ また、具体的には、ａｇｔｃ、ａａｇｔ、ｇｇａｃ又は
ｇｇｇｃの繰り返し単位からなる２０塩基までのオリゴ
ヌクレオチドを例示することができる。
【００１５】また、付加配列は、３’末端配列間で塩基
対形成が低いことが好ましく、塩基対形成がないことが
特に好ましい。少なくとも、連続して塩基対が形成され
ないこと、２次構造を形成して増幅反応を阻害しないこ
とが好ましい。さらに、配列が付加されたプライマーに
ついても、塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形
成が無いことが特に好ましい。
対形成が低いことが好ましく、塩基対形成がないことが
特に好ましい。少なくとも、連続して塩基対が形成され
ないこと、２次構造を形成して増幅反応を阻害しないこ
とが好ましい。さらに、配列が付加されたプライマーに
ついても、塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形
成が無いことが特に好ましい。
【００１６】本発明の第一の発明においては、上記特定
化合物群及び特定塩基より選ばれる化合物を、常法に従
ってプライマーの５’末端に結合させることができる。
特定化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合に
は、まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含ん
だオリゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の
配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物
を結合させてもよい。２種以上の化合物群、特定塩基を
結合させるものとしては、例えばＦＩＴＣにｇｇｇｃの
２回繰り返し配列を結合させたものが挙げられる。
化合物群及び特定塩基より選ばれる化合物を、常法に従
ってプライマーの５’末端に結合させることができる。
特定化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合に
は、まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含ん
だオリゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の
配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物
を結合させてもよい。２種以上の化合物群、特定塩基を
結合させるものとしては、例えばＦＩＴＣにｇｇｇｃの
２回繰り返し配列を結合させたものが挙げられる。
【００１７】本発明の第二の発明においては、上記特定
化合物群より選ばれる化合物を、常法に従ってオリゴヌ
クレオチドの５’末端に結合させることができる。特定
化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合には、
まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含んだオ
リゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の配列
を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物を結
合させてもよい。
化合物群より選ばれる化合物を、常法に従ってオリゴヌ
クレオチドの５’末端に結合させることができる。特定
化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合には、
まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含んだオ
リゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の配列
を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物を結
合させてもよい。
【００１８】本発明の第一の発明は、プライマーに特定
化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させるこ
とにより、プライマーの増幅産物との結合速度や結合安
定性が向上するため、通常のＰＣＲに適用することが好
ましい。
化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させるこ
とにより、プライマーの増幅産物との結合速度や結合安
定性が向上するため、通常のＰＣＲに適用することが好
ましい。
【００１９】また、本発明の方法は、非対称ＰＣＲに適
用することが好ましい。非対称ＰＣＲは、標的ＤＮＡ断
片を直接シークエンスしたいとき等、一本鎖ＤＮＡを迅
速に増幅する目的に適した方法である。すなわち、通常
のＰＣＲでは、用いる１組のプライマーの濃度を等しく
するが、非対称ＰＣＲでは、一方のプライマーの濃度を
他方の濃度の数倍から数十倍にしておく。このようにし
ておくと、他方のプライマーのみが先に消費されるた
め、残りのＰＣＲは、過剰な一方のプライマーのみから
進行し、一方のＤＮＡ鎖が大量に生産される。また、非
対称ＰＣＲの一種であるサーマルアシメトリックＰＣＲ
法は、１組のプライマーのＴｍの差が１０℃以上あるも
のを用い、まずＴｍが低い方のプライマーもアニールす
る条件でＰＣＲを行い、次にＴｍが高い方のプライマー
のみがアニールする条件でＰＣＲを行う。
用することが好ましい。非対称ＰＣＲは、標的ＤＮＡ断
片を直接シークエンスしたいとき等、一本鎖ＤＮＡを迅
速に増幅する目的に適した方法である。すなわち、通常
のＰＣＲでは、用いる１組のプライマーの濃度を等しく
するが、非対称ＰＣＲでは、一方のプライマーの濃度を
他方の濃度の数倍から数十倍にしておく。このようにし
ておくと、他方のプライマーのみが先に消費されるた
め、残りのＰＣＲは、過剰な一方のプライマーのみから
進行し、一方のＤＮＡ鎖が大量に生産される。また、非
対称ＰＣＲの一種であるサーマルアシメトリックＰＣＲ
法は、１組のプライマーのＴｍの差が１０℃以上あるも
のを用い、まずＴｍが低い方のプライマーもアニールす
る条件でＰＣＲを行い、次にＴｍが高い方のプライマー
のみがアニールする条件でＰＣＲを行う。
【００２０】しかしながら、非対称ＰＣＲには、以下の
ような問題点がある。すなわち、鋳型になるＤＮＡとプ
ライマーの濃度を最適化しないと、一本鎖の増幅は低い
ものとなる（PRODUCTION OF SINGLE-STRANDED DNA BY
ASYMMETRIC PCR、PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS
AND APPLICATIONS、ACADEMIC PRESS, INC.1990）。しか
しながら、最適化するためには、煩雑な予備実験が必要
である。また、サーマルアシメトリックＰＣＲでは、１
０℃以上の極端なアニール温度差を有する特異プライマ
ーのセットを作成しなければならないが、これは必ずし
も容易ではない。
ような問題点がある。すなわち、鋳型になるＤＮＡとプ
ライマーの濃度を最適化しないと、一本鎖の増幅は低い
ものとなる（PRODUCTION OF SINGLE-STRANDED DNA BY
ASYMMETRIC PCR、PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS
AND APPLICATIONS、ACADEMIC PRESS, INC.1990）。しか
しながら、最適化するためには、煩雑な予備実験が必要
である。また、サーマルアシメトリックＰＣＲでは、１
０℃以上の極端なアニール温度差を有する特異プライマ
ーのセットを作成しなければならないが、これは必ずし
も容易ではない。
【００２１】さらに、一本鎖ＤＮＡを迅速に増幅する他
の方法として、１組のプライマーの増幅能力の差を利用
する方法がある。例えば、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッ
ドプライマーを用いる。ＲＮＡプライマーは、伸長反応
への寄与がＤＮＡプライマーより弱いので、該ハイブリ
ットプライマーを用いてＰＣＲを行うと、純粋なＤＮＡ
側の増幅が大きくなり、ＤＮＡの一本鎖が得られる。
の方法として、１組のプライマーの増幅能力の差を利用
する方法がある。例えば、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッ
ドプライマーを用いる。ＲＮＡプライマーは、伸長反応
への寄与がＤＮＡプライマーより弱いので、該ハイブリ
ットプライマーを用いてＰＣＲを行うと、純粋なＤＮＡ
側の増幅が大きくなり、ＤＮＡの一本鎖が得られる。
【００２２】しかしながら、この方法は、ＲＮＡ側の増
幅能力が低い結果としてＤＮＡ一本鎖が得られたのであ
り、所望するＤＮＡの増幅能力が向上したのではないと
いう問題を有する。
幅能力が低い結果としてＤＮＡ一本鎖が得られたのであ
り、所望するＤＮＡの増幅能力が向上したのではないと
いう問題を有する。
【００２３】しかしながら、本発明の第一の発明におい
ては、１組のプライマーのうちの１本についてのみ特定
化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させてお
くことにより、両プライマーの増幅効率に大きな差が生
じるため、鋳型になるＤＮＡとプライマーの濃度の最適
化という煩雑な操作をする必要がない。このため、本発
明の第一の発明を非対称ＰＣＲに適用することにより、
１本鎖ＤＮＡの増幅効率を大幅に向上させることができ
る。また、本発明の第一の発明は、プライマーの至適温
度範囲を広げることができるため、サーマルアシメトリ
ックＰＣＲに応用することも可能である。
ては、１組のプライマーのうちの１本についてのみ特定
化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させてお
くことにより、両プライマーの増幅効率に大きな差が生
じるため、鋳型になるＤＮＡとプライマーの濃度の最適
化という煩雑な操作をする必要がない。このため、本発
明の第一の発明を非対称ＰＣＲに適用することにより、
１本鎖ＤＮＡの増幅効率を大幅に向上させることができ
る。また、本発明の第一の発明は、プライマーの至適温
度範囲を広げることができるため、サーマルアシメトリ
ックＰＣＲに応用することも可能である。
【００２４】従来の非対称ＰＣＲは、片方のプライマー
の合成を阻害することにより、すなわち全体としてのＰ
ＣＲの効率を低下させることにより行われてきた。これ
に対し、本発明の第一の発明は、片方のプライマーの増
幅効率を向上させることによって非対称ＰＣＲを行うも
のである。すなわち、通常のＰＣＲと比較して、増幅効
率が下がることがない。したがって、本発明の第一の発
明は、病原体等の微量のＤＮＡを迅速、簡便に検出、型
別する場合のように、１本鎖の生成とともに高い増幅効
率が必要な場合に特に有効である。
の合成を阻害することにより、すなわち全体としてのＰ
ＣＲの効率を低下させることにより行われてきた。これ
に対し、本発明の第一の発明は、片方のプライマーの増
幅効率を向上させることによって非対称ＰＣＲを行うも
のである。すなわち、通常のＰＣＲと比較して、増幅効
率が下がることがない。したがって、本発明の第一の発
明は、病原体等の微量のＤＮＡを迅速、簡便に検出、型
別する場合のように、１本鎖の生成とともに高い増幅効
率が必要な場合に特に有効である。
【００２５】また、本発明の方法は、デジェネレートＰ
ＣＲに適用することが好ましい。デジェネレートＰＣＲ
においては、例えば数１００〜数１０００種類程度のプ
ライマーを混合して用いるため、混在するそれぞれの配
列で至適アニール温度が異なる。そのため、増幅温度の
設定が比較的難しい。しかしながら、このような問題
も、本発明により回避可能である。また、アニール温度
を高く設定することが可能であるため、非特異的な増幅
を抑えることができ、効率よく増幅することができる。
ＣＲに適用することが好ましい。デジェネレートＰＣＲ
においては、例えば数１００〜数１０００種類程度のプ
ライマーを混合して用いるため、混在するそれぞれの配
列で至適アニール温度が異なる。そのため、増幅温度の
設定が比較的難しい。しかしながら、このような問題
も、本発明により回避可能である。また、アニール温度
を高く設定することが可能であるため、非特異的な増幅
を抑えることができ、効率よく増幅することができる。
【００２６】本発明の第一の発明に用いる特定化合物群
より選ばれる化合物が結合したプライマーは、プローブ
として用いることもできる。
より選ばれる化合物が結合したプライマーは、プローブ
として用いることもできる。
【００２７】本発明の第二の発明は、オリゴヌクレオチ
ドの５’末端に、特定化合物群からより選ばれる化合物
を結合したものを使用することにより、オリゴヌクレオ
チドのＤＮＡへの特異的結合性を向上させるものであ
る。すなわち、かかる化合物を結合したオリゴヌクレオ
チドは、かかる化合物が結合していないオリゴヌクレオ
チドと比較して、ＤＮＡへの結合速度や結合安定性が向
上する。
ドの５’末端に、特定化合物群からより選ばれる化合物
を結合したものを使用することにより、オリゴヌクレオ
チドのＤＮＡへの特異的結合性を向上させるものであ
る。すなわち、かかる化合物を結合したオリゴヌクレオ
チドは、かかる化合物が結合していないオリゴヌクレオ
チドと比較して、ＤＮＡへの結合速度や結合安定性が向
上する。
【００２８】
【実施例】次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
【００２９】実施例１
増幅可能なアニール上限温度の比較
腸炎ビブリオ検出用プライマーの５’末端に、特定化合
物群より選ばれる化合物を結合させたものを用い、Ｇｒ
ａｄｉｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ Ｍｏｄｕｌｅを装着したＨ
ＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓを用い、下記条
件でＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上限
温度を測定した。腸炎ビブリオ検出用プライマーとし
て、フォワード側を配列番号１で表される塩基配列、リ
バース側を配列番号２で表される塩基配列を用いた。該
フォワード側プライマー及び該リバース側プライマーの
５’末端に、表１に示す各特定化合物群を結合させた。
これとは別に、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦ
Ｏ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型と
し、ｒｐｏＤ遺伝子増幅用ユニバーサルプライマー（特
開平８−２５６７９８号公報：配列番号３、４）を用い
てＰＣＲを行い、増幅産物を調製した。次いで、該増幅
産物を鋳型とし、上記各特定化合物群結合プライマーを
用いて複数アニール温度条件のＰＣＲを行った。
物群より選ばれる化合物を結合させたものを用い、Ｇｒ
ａｄｉｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ Ｍｏｄｕｌｅを装着したＨ
ＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓを用い、下記条
件でＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上限
温度を測定した。腸炎ビブリオ検出用プライマーとし
て、フォワード側を配列番号１で表される塩基配列、リ
バース側を配列番号２で表される塩基配列を用いた。該
フォワード側プライマー及び該リバース側プライマーの
５’末端に、表１に示す各特定化合物群を結合させた。
これとは別に、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦ
Ｏ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型と
し、ｒｐｏＤ遺伝子増幅用ユニバーサルプライマー（特
開平８−２５６７９８号公報：配列番号３、４）を用い
てＰＣＲを行い、増幅産物を調製した。次いで、該増幅
産物を鋳型とし、上記各特定化合物群結合プライマーを
用いて複数アニール温度条件のＰＣＲを行った。
【００３０】ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
Ｔａｑポリメレース（Applied Biosystems社製AmpliT
aqGold）の活性化：９５℃で１０分 変性：９４℃で１分 アニール：５５．１℃、５５．５℃、５６．３℃、５
７．７℃、５９．４℃、６１．４℃、６３．３℃、６
５．３℃、６７．６℃、６９．０℃、６９．７℃及び７
０．２℃で３０秒 伸長反応：７２℃で１分 上記〜を４０サイクル繰り返す。 伸長反応：７２℃で１０分 冷却：４℃まで冷却 次いで、得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動に
より解析し、アニール上限温度を決定した。なお、プラ
イマーに特定化合物群を結合させないものをコントロー
ルとした。アニール上限温度及びアニール上限温度のコ
ントロールに対する上昇温度を表１に示す。
aqGold）の活性化：９５℃で１０分 変性：９４℃で１分 アニール：５５．１℃、５５．５℃、５６．３℃、５
７．７℃、５９．４℃、６１．４℃、６３．３℃、６
５．３℃、６７．６℃、６９．０℃、６９．７℃及び７
０．２℃で３０秒 伸長反応：７２℃で１分 上記〜を４０サイクル繰り返す。 伸長反応：７２℃で１０分 冷却：４℃まで冷却 次いで、得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動に
より解析し、アニール上限温度を決定した。なお、プラ
イマーに特定化合物群を結合させないものをコントロー
ルとした。アニール上限温度及びアニール上限温度のコ
ントロールに対する上昇温度を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】特定化合物群を結合させたプライマーは、
アニール上限温度が上昇し、増幅効率が向上したことが
確認された。
アニール上限温度が上昇し、増幅効率が向上したことが
確認された。
【００３３】実施例２
増幅可能なアニール上限温度の比較
プライマーとして、フォワード側を配列番号３で表され
る塩基配列、リバース側を配列番号４で表される塩基配
列を用いた。該プライマーの５’末端に、表２に示す塩
基配列を繰り返し単位とした４ｍｅｒ〜２０ｍｅｒを結
合させたものを用い、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ
Ｍｏｄｕｌｅを装着したＨＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓを用い、腸炎ビブリオのタイプストレイン
（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳
型とし、アニール時間を１分として、実施例１と同様の
条件でＰＣＲを行い、増幅可能なアニール上限温度を測
定した。なお、プライマーに塩基を結合させないものを
コントロールとした。また、ｇｃ含量が０％であるａａ
ａｔを繰り返し単位とした４ｍｅｒ〜２０ｍｅｒを結合
させたものを比較例とした。アニール上限温度及びアニ
ール上限温度のコントロールに対する上昇温度（かっこ
内）を表２に示す。
る塩基配列、リバース側を配列番号４で表される塩基配
列を用いた。該プライマーの５’末端に、表２に示す塩
基配列を繰り返し単位とした４ｍｅｒ〜２０ｍｅｒを結
合させたものを用い、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ
Ｍｏｄｕｌｅを装着したＨＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓを用い、腸炎ビブリオのタイプストレイン
（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳
型とし、アニール時間を１分として、実施例１と同様の
条件でＰＣＲを行い、増幅可能なアニール上限温度を測
定した。なお、プライマーに塩基を結合させないものを
コントロールとした。また、ｇｃ含量が０％であるａａ
ａｔを繰り返し単位とした４ｍｅｒ〜２０ｍｅｒを結合
させたものを比較例とした。アニール上限温度及びアニ
ール上限温度のコントロールに対する上昇温度（かっこ
内）を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】ｇｃ含量が１５％以上で２塩基以上のオリ
ゴヌクレオチドを結合させたプライマーは、増幅効率が
向上し、特にｇｃ含量が高い塩基を結合させたプライマ
ーにおいてその効果が著しかった。
ゴヌクレオチドを結合させたプライマーは、増幅効率が
向上し、特にｇｃ含量が高い塩基を結合させたプライマ
ーにおいてその効果が著しかった。
【００３６】実施例３
プライマーの５’末端に特定化合物群、特定塩基より選
ばれる化合物を結合させたことによる増幅効率の検討 プライマーとして、フォワード側を配列番号１で表され
る塩基配列、リバース側を配列番号２で表される塩基配
列を用いた。該フォワード側プライマー及び該リバース
側プライマーの５’末端に、ｃｙ３、ｃｙ５、ビオチ
ン、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒ又はａａ
ｇｔを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合させたもの
を用い、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ロ
シュ・ダイアグノスティック（株）製）を用い、腸炎ビ
ブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から
抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の条件でリアル
タイムＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上
限温度を測定した。
ばれる化合物を結合させたことによる増幅効率の検討 プライマーとして、フォワード側を配列番号１で表され
る塩基配列、リバース側を配列番号２で表される塩基配
列を用いた。該フォワード側プライマー及び該リバース
側プライマーの５’末端に、ｃｙ３、ｃｙ５、ビオチ
ン、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒ又はａａ
ｇｔを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合させたもの
を用い、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ロ
シュ・ダイアグノスティック（株）製）を用い、腸炎ビ
ブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から
抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の条件でリアル
タイムＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上
限温度を測定した。
【００３７】ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
変性：９５℃で１．５分
変性：９５℃で０秒
アニール：６０℃で０秒、５秒もしくは１０秒又は６
４℃で５秒 伸長反応：７２℃で１５秒 上記〜を４０サイクル繰り返す。次いで、各サイク
ルで得られた増幅断片の蛍光強度を測定した。なお、プ
ライマーに特定塩基より選ばれる化合物を結合させない
ものをコントロールとした。結果を図１〜４に示す。な
お、この蛍光強度は、プライマーに付加した特定化合物
群に由来するものではなく、２本鎖に結合したサイバー
グリーンに由来するものであり、増幅ＤＮＡ量を示す。
４℃で５秒 伸長反応：７２℃で１５秒 上記〜を４０サイクル繰り返す。次いで、各サイク
ルで得られた増幅断片の蛍光強度を測定した。なお、プ
ライマーに特定塩基より選ばれる化合物を結合させない
ものをコントロールとした。結果を図１〜４に示す。な
お、この蛍光強度は、プライマーに付加した特定化合物
群に由来するものではなく、２本鎖に結合したサイバー
グリーンに由来するものであり、増幅ＤＮＡ量を示す。
【００３８】図１は、アニール条件６０℃で０秒におけ
るＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したもので
ある。図２は、アニール条件６０℃で５秒におけるＰＣ
Ｒサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
図３は、アニール条件６０℃で１０秒におけるＰＣＲサ
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。図４
は、アニール条件６４℃で５秒におけるＰＣＲサイクル
数と蛍光強度との関係を示したものである。
るＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したもので
ある。図２は、アニール条件６０℃で５秒におけるＰＣ
Ｒサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
図３は、アニール条件６０℃で１０秒におけるＰＣＲサ
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。図４
は、アニール条件６４℃で５秒におけるＰＣＲサイクル
数と蛍光強度との関係を示したものである。
【００３９】特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合
物を結合させたプライマー（修飾プライマー）は、すべ
ての増幅条件で特定化合物群、特定塩基より選ばれる化
合物を結合させていないプライマー（非修飾プライマ
ー）よりも増幅反応の立ち上がりが早くなる。すなわ
ち、一定の蛍光強度となるためのサイクルが短くなる
（図２、図３）。
物を結合させたプライマー（修飾プライマー）は、すべ
ての増幅条件で特定化合物群、特定塩基より選ばれる化
合物を結合させていないプライマー（非修飾プライマ
ー）よりも増幅反応の立ち上がりが早くなる。すなわ
ち、一定の蛍光強度となるためのサイクルが短くなる
（図２、図３）。
【００４０】同じアニール温度でアニール時間を短くし
ていくと（１０秒（図３）→５秒（図２）→０秒（図
１））、非修飾プライマーでは増幅が始まるサイクルが
顕著に遅くなる（すなわち、増幅が弱くなる。）。例え
ば、蛍光強度が１０を超えるのに、アニール時間１０秒
（図３）では１４サイクル目であったが、アニール時間
５秒（図２）では２０サイクル目となり、アニール時間
０秒では４０サイクルでも蛍光強度が１０を超えない。
これに対し、修飾プライマーでは、アニール時間の減少
による増幅開始サイクルの遅れは、非修飾プライマーの
場合より緩やかである。すなわち、検出系に使用された
場合は、感度の向上もたらす。この修飾の効果は、アニ
ール時間が０秒の場合に非常に顕著であり、修飾プライ
マーの中でも、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅ
ｒを結合した場合の効果が特に高い。
ていくと（１０秒（図３）→５秒（図２）→０秒（図
１））、非修飾プライマーでは増幅が始まるサイクルが
顕著に遅くなる（すなわち、増幅が弱くなる。）。例え
ば、蛍光強度が１０を超えるのに、アニール時間１０秒
（図３）では１４サイクル目であったが、アニール時間
５秒（図２）では２０サイクル目となり、アニール時間
０秒では４０サイクルでも蛍光強度が１０を超えない。
これに対し、修飾プライマーでは、アニール時間の減少
による増幅開始サイクルの遅れは、非修飾プライマーの
場合より緩やかである。すなわち、検出系に使用された
場合は、感度の向上もたらす。この修飾の効果は、アニ
ール時間が０秒の場合に非常に顕著であり、修飾プライ
マーの中でも、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅ
ｒを結合した場合の効果が特に高い。
【００４１】非修飾プライマーでは増幅が起こらないア
ニール温度、アニール時間であっても、修飾プライマー
では実用となり得るレベルの増幅が起こる（図４）。こ
の場合もｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結
合した場合の効果が特に高い。
ニール温度、アニール時間であっても、修飾プライマー
では実用となり得るレベルの増幅が起こる（図４）。こ
の場合もｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結
合した場合の効果が特に高い。
【００４２】４０サイクル目の最終増幅産物の量は、修
飾プライマーの方が非修飾プライマーよりも顕著に多い
（図１〜４）。通常のＰＣＲでは、４０サイクル以上の
増幅反応は行わないため、修飾プライマーは、実用範囲
で明らかな優位性を有する。
飾プライマーの方が非修飾プライマーよりも顕著に多い
（図１〜４）。通常のＰＣＲでは、４０サイクル以上の
増幅反応は行わないため、修飾プライマーは、実用範囲
で明らかな優位性を有する。
【００４３】以上より、温度上昇とアニール時間短縮の
両者で修飾の効果が認められたため、かかる効果は、プ
ライマーと鋳型ＤＮＡ間の結合の熱的安定性の向上、す
なわち結合力の増大に由来すると考えられる。
両者で修飾の効果が認められたため、かかる効果は、プ
ライマーと鋳型ＤＮＡ間の結合の熱的安定性の向上、す
なわち結合力の増大に由来すると考えられる。
【００４４】
【発明の効果】本発明の第一の発明を用いれば、アニー
リング条件の検討等の予備実験を大幅に簡略化すること
ができるとともに、ＰＣＲの増幅効率を向上させること
ができる。かかる効果は、ＰＣＲが、非対称ＰＣＲ又は
デジェネレートＰＣＲである場合に特に著しい。また、
本発明の第二の発明を用いれば、オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡへの特異的結合性を向上させることができる。
リング条件の検討等の予備実験を大幅に簡略化すること
ができるとともに、ＰＣＲの増幅効率を向上させること
ができる。かかる効果は、ＰＣＲが、非対称ＰＣＲ又は
デジェネレートＰＣＲである場合に特に著しい。また、
本発明の第二の発明を用いれば、オリゴヌクレオチドの
ＤＮＡへの特異的結合性を向上させることができる。
【配列表】SEQUENCE LISTING
<110> NICHIREI CORPORATION
<120> The method of increasing specific hybridizat
ion of oligonucleotideto DNA <130> J92068A1 <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 合成配列 <400> 1 aagaagacct agaagatgat 20 <210> 2 <211>18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 2 gttaccagta atagggca 18 <210> 3 <211>21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 3 yatgmgngar atgggnacng t 21 <210> 4 <211>21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 4 ngcytcnacc atytcyttyt t 21
ion of oligonucleotideto DNA <130> J92068A1 <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 合成配列 <400> 1 aagaagacct agaagatgat 20 <210> 2 <211>18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 2 gttaccagta atagggca 18 <210> 3 <211>21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 3 yatgmgngar atgggnacng t 21 <210> 4 <211>21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>合成配列 <400> 4 ngcytcnacc atytcyttyt t 21
【図１】 アニール条件６０℃で０秒におけるＰＣＲサ
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図２】 アニール条件６０℃で５秒におけるＰＣＲサ
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図３】 アニール条件６０℃で１０秒におけるＰＣＲ
サイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
サイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図４】 アニール条件６４℃で５秒におけるＰＣＲサ
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
イクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 山本 敏
千葉県千葉市花見川区幕張本郷三丁目19−
５ 204号
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA05 HA14
4B063 QA11 QQ42 QR08 QR62 QS25
QS34
Claims (5)
- 【請求項１】 ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であっ
て、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミ
ノ基、ＰＯ4 3-、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲ
Ａ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダ
ミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、
コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ
３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰ
Ｙ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯ
ＤＩＰＹ５８１／５９１及びｇとｃの合計の含有量が１
５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチドからなる群
より選ばれる化合物を結合したものをプライマーとして
用いることを特徴とするＤＮＡ増幅反応の効率向上方
法。 - 【請求項２】 ｇとｃの合計の含有量が１５％以上で２
塩基以上のオリゴヌクレオチドが、ｇとｃの合計の含有
量が５０％以上で４０塩基以下であり、かつｇとｃの合
計の含有量に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量
が７０％以上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔの
うち多い方の塩基の含有量が７０％以上である請求項１
に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。 - 【請求項３】 ＰＣＲ増幅効率向上方法である請求項１
又は２に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。 - 【請求項４】 ＰＣＲが、非対称ＰＣＲ又はデジェネレ
ートＰＣＲである請求項３に記載のＤＮＡ増幅反応の効
率向上方法。 - 【請求項５】 オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的
結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイズさせ
るものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端に、ＬＣ
Ｒｅｄ７０５、アミノ基、ＰＯ4 3-、ビオチン、ＤＩ
Ｇ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯ
Ｘ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メル
カプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６
−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６
４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰ
Ｙ５３０／５５０及びＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１から
なる群より選ばれる化合物を結合したものを使用するこ
とを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異
的結合性向上方法。
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