WO2005116208A1

WO2005116208A1 - Ｄｎａ増幅方法

Info

Publication number: WO2005116208A1
Application number: PCT/JP2005/009885
Authority: WO
Inventors: Takeshi Koizumi; Satoshi Yamamoto
Original assignee: Nichirei Foods Inc.
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2005-12-08
Also published as: EP1752535A4; JP4455168B2; JP2005341810A; US20080102494A1; EP1752535A1

Abstract

　本発明は、所望方向所望領域の１本鎖ＤＮＡを簡便かつ効率よく調製できるＤＮＡ増幅方法を提供することを目的とする。本発明は、ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ増幅方法であって、標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用い、前記第一プライマーの融解温度Ｔｍ１、前記第二プライマーの融解温度Ｔｍ２、前記第三プライマーの融解温度Ｔｍ３が下式に示す関係を有し、（式）Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３　アニール温度Ｔａ（但しＴａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程と、アニール温度Ｔｂ（但しＴｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とするＤＮＡ増幅方法を提供する。

Description

明細書

DNA増幅方法

技術分野

[0001] 本発明は、 DNAを増幅する方法に関する。

背景技術

[0002] 医療分野、環境衛生分野、食品衛生分野等における微生物の同定、臨床診断における遺伝子解析等においては、検体由来の 2本鎖 DNAから 1本鎖 DNAを調製し、これを塩基配列決定 (シークェンシング)などに用いている。また、ある特殊な配列を持つ DNAを検出するために、検体の微量 DNAを铸型として DNA増幅法を行つて得られた 1本鎖 DNAを用いる技術がある。

[0003] 1本鎖 DNAを調製する方法としては、非対称 PCR (ポリメレース 'チェイン'リアクシヨン)法が一般的である。

従来、非対称 PCR法として、例えば、フォワードのプライマー、リバースのプライマ一の濃度に、互いに偏りを持たせる方法 (例えば、非特許文献 1参照）、 RNAプライマーの増幅能力の方が DNAプライマーの増幅能力よりも弱いことを利用し、 DNA/ RNAノヽイブリツドプライマ一を用いて、プライマー間の増幅能力の差を利用する方法 (例えば、非特許文献 2参照）、プライマーの融解温度 (Tm)の差を利用する、いわゆるサーマルアシンメトリック法 (例えば、非特文献 3参照）、 DNA伸長反応に対するブロッカーを用い、铸型 2本鎖 DNAのうち一方の DNA1本鎖に対する伸長反応を阻害する方法 (例えば、特許文献 1、 2参照）が提案されている。

特許文献 1：米国特許第 5849497号明細書

特許文献 2 :米国特許第 5627054号明細書

非特許文献 1：「プロシーディングズ ·ォブ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイェンシズ (Proceedings of the National Academy of Sciencesノ」、 1988年、弟 85 卷、 p. 7652- 7656

非特許文献 2 :「ニュークレイック 'ァシッズ'リサーチ（Nucleic Acids Researech) 」、 2000年、第 28卷、第 8号、 e35 非特許文献 3 :「ニュークレイック 'ァシッズ'リサーチ（Nucleic Acids Researech) 」、 1990年、第 19卷、第 17号、 p. 4783

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] し力しながら、プライマーの濃度に偏りを持たせる方法では、プライマーの濃度比の設定など、実験条件の最適化が必要である。

プライマーの増幅能力の差を利用する方法では、 RNAプライマーの増幅能力が D NAプライマーのそれよりも弱いことを利用しているため、全体としての増幅効率を低下させてしまう。また、 DNAZRNAプライマーの合成が非常に高価である。

プライマーの Tmの差を利用する方法では、増幅したい配列に対応し、かつ必要な Tm差を有する配列が必ずしも存在するとは限らな、ので、所望の配列の増幅に適用できない場合がある。

ブロッカーを用い、一方の伸長反応を阻害する方法では、片方の伸長反応を阻害するため全体として PCRの効率を低下させてしまう。また、 PCRの開始後に、ブロッカーを別途添加する等の煩雑な操作が必要となる。さらに、ブロッカーとして使用する合成 PNA (ペプチド核酸）は非常に高価である。

[0005] 本発明は前記課題を解決するためになされたもので、所望の方向の、所望領域の 1本鎖 DNAを、簡便かつ効率よく調製できる DNA増幅方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明の DNA増幅方法は、 DNAを铸型として用いる DNA増幅方法であって、標的塩基配列の^末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の^ 末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの^末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を^末端側に有する第三プライマーとを用い、

前記第一プライマーの融解温度 Tm、前記第二プライマーの融解温度 Tm、前記

1 2 第三プライマーの融解温度 Tmが下式に示す関係を有し、（式) Tm <Tmかつ T

3 1 3 m Tm ァニール温度 Ta (但し、 Ta≤Tmかつ Ta≤Tm )で PCRサイクルを行う第一過程

1 2

と、ァニール温度 Tb (但し、 Tmく Tbかつ Tmく Tbかつ Tb≤Tm )で PCRサイク

1 2 3

ルを行う第二過程とを有することを特徴とする。

[0007] 前記第三プライマーが、 5'末端側に、 LCRed705、アミノ基、リン酸基、ピオチン、 DIG, DNPゝ TAMRA、 Texas -Red, ROX、 XRITC、ローダミン、 LCRed640、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、 FITC、 6— FAM、 TET、 cy3、 cy5、 BOD IPY564/570, BODIPY500/510, BODIPY530/550, BODIPY581/59 1、 gと cの合計含有量が 50%以上のオリゴヌクレオチド、及び gと cの含有量が 15% 以上で 2塩基以上のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる化合物を有することが好ましい。

前記第一過程における PCRサイクル数を 10〜30、前記第二過程における PCRサイタル数を 10〜50とすることが好まし!/、。

発明の効果

[0008] 本発明の DNA増幅方法によれば、所望の方向の、所望領域の 1本鎖 DNAを、簡便かつ効率よく調製することができる。し力も、 DNA増幅産物において、従来になく高、含有率および絶対量をもって、 1本鎖 DNAを生成させることができる。

図面の簡単な説明

[0009] [図 1]本発明の一実施態様による増幅過程を示す概念図である。

[図 2]本発明の一実施態様による増幅過程を示す概念図である。

[図 3]実施例で得られた DNA増幅産物中の 1本鎖 DNA (ssDNA)および 2本鎖 DN A (dsDNA)に対応する蛍光強度を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 本発明の DNA増幅方法は、 DNAを铸型として用いる DNA増幅方法であって、標的塩基配列の^末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の^末端側に相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの^末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を^末端側に有する第三プライマーとを用いる。

標的塩基配列（以下、「標的配列」という）とは、本発明の方法により増幅しょうとする領域であって、 5,末端から^末端まで特定順に配列された塩基からなる塩基配列をいう。この増幅される領域は、例えばその機能等に着目した場合、センス鎖であってもよ、し、該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖であってもよ、。

以下、「塩基配列」を、単に「配列」と称する場合がある。

[0011] 本発明の DNA増幅方法における铸型は、 PCRにおいて 1本鎖 DNAを供給しうるものであれば、特に限定されず、 2本鎖 DNAであっても、 1本鎖 DNAであってもよい。このような铸型 (铸型 DNA)として、例えば、検体から調製された DNA画分、 DNA 画分から予め公知の PCR法により増幅された 2本鎖 DNAや、 RT— PCR (逆転写 P CR)の铸型として用いられる mRNA等カゝら得られた cDNA (相補 DNA)等が挙げられる。

後述の通り、铸型 DNA中に、標的配列及び Z又は標的配列に相補的な塩基配列が含まれると、本発明による標的配列の増幅が進行する。

[0012] 本発明にお、て、第一〜第三プライマーとしては、第一プライマーの融解温度 Tm 、第二プライマーの融解温度 Tm、第三プライマーの融解温度 Tm力下式（1)に

2 3

示す関係を有するようなものを用いる。

(式） Tm <Tmかつ Tm <Tm · · · (1)

1 3 2 3

融解温度とは、 2本鎖核酸が熱変性して 1本鎖になる温度である。プライマーの融解温度を求めるには、例えば下記 (a)〜（c)の測定方法が挙げられる。

(a)温度条件を変化させながら、プライマーの波長 260nmにおける吸光度を測定する。得られた温度条件-吸光度関数における変曲点を、そのプライマーの融解温度 Tmとする。

(b)計算値を測定値に代用する。例えば、中山広榭著、秀潤社、「別冊細胞工学バィォ実験イラストレイテッド 3+ 本当に増える PCR」、p. 25— 27に記載の計算式及び推定結果を用いることができる。

(c)プライマーを含む 1本鎖とその相補鎖力なる核酸 2本鎖を形成させた後、 2本鎖に入り込む物質 (いわゆるインターカレーター；例えば、臭化工チジゥム、「サイバーグリーン I」等)を加える操作を行う。この操作を各種温度条件下で行い、得られた温度条件蛍光強度度関数における変曲点を、そのプライマーの Tmとする。本発明においては、 Tmを求める方法は制限されず、第一〜第三プライマーについて共通の方法を適用して得られた Tm、Tm、Tmの値が上記式（1)を満たして

1 2 3

いればよい。なお、上記に例示したうち（b)の方法が簡便であり、また (C)の方法が通常よく用いられる。また、第一過程及び第二過程で実際に用いる反応条件を再現した条件下で融解温度を求めることが好ま、。

[0013] 本発明に用いられる第一プライマーは、標的配列の^末端側に相補的である。すなわち、前記標的配列の^末端側に位置する特定塩基配列に対し相補的な塩基配列を、少なくとも一部に有する。第一プライマーは、前記標的配列に対し相補的な塩基配列のみ力なることが好まし、。

第二プライマーは、当該標的配列の^末端側に相同な塩基配列を有する。すなわち、当該標的配列の^末端側に位置する特定塩基配列と比較して、 5'から 3Ίこ向けて同一順序の塩基配列を、少なくとも一部に有する。

第三プライマーは、その^末端側に、前記第二プライマー又は前記第一プライマ一の^末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を有する。この第三プライマーとして、前記第二プライマーの一部塩基配列と相同な塩基配列を有するものを用いるか、前記第一プライマーの一部塩基配列と相同な塩基配列を有するものを用いるかによって、後述のように、増幅される核酸鎖の方向を任意に制御することが可能である。以下、第二プライマー又は第一プライマーの^末端側と、第三プライマーの^末端側とにそれぞれ位置する、第二プライマー又は第一プライマーと、第三プライマーとの互いに相同な配列を「共通配列」と称する。この共通配列は、標的配列、又は標的配列と相補的な配列に、ハイブリダィズし得る配列であっても、ハイブリダィズし得ない配列であってもよい。

このように、本発明においては、上記の共通配列が、標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダィズし得な、配列であってもよ!/、から、所望の標的配列の増幅に寄与し、かつ式（1)に示す関係を満たす第三プライマーの準備が容易である。

[0014] 本発明の DNA増幅方法は、前記第一〜第三プライマーを用い、ァニール温度 Ta

(但し、 Ta≤Tmかつ Ta≤Tm )で PCRサイクルを行う第一過程と、ァニール温度 T

1 2

b (但し、 Tmく Tbかつ Tmく Tbかつ Tb≤Tm )で PCRサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とする。

具体的には、 PCR反応液に、後に詳述する第一過程および第二過程を行うことで実施できる。 PCR反応液は、铸型 DNAと、 dNTP (デォキシヌクレオチド 3リン酸）と、 DNAポリメレースと、第一〜第三プライマーからなるプライマーセットを含有するものとして、公知の方法で調製することができる。 DNAポリメレースとしては、耐熱性ポリメレースが好ましぐ Taqポリメレースとして提供されているものが例示できる。

なお、不活性ィ匕された DNAポリメレースを使用する場合は、第一過程の前に、公知の条件で DNAポリメレースの活性化ステップを行っておく。

[0015] (第一過程）

まず、ァニール温度 Ta (但し、 Ta≤Tmかつ Ta≤Tm )で PCRサイクルを行う第

1 2

一過程を行う。

例えば、 PCR反応液に対し、下記（1)〜（3)のステップ力もなる PCRサイクル (I)を、所望の回数行う。

(1) 2本鎖 DNAの変性温度に制御する変性ステップ、（2)Ta≤Tmかつ Ta≤Tm

1 2 を満たすァニール温度 Taに温度制御するアニーリングステップ、（3) DNAポリメレースによる DNA伸長反応に適した条件に温度制御する伸長ステップ。

なお、上記ステップ（2)および（3)に適した温度条件を設定し、ステップ（2)および ( 3)を同時に行ってもよい。

[0016] (第二過程）

ついで、ァニール温度 Tb (但し、 Tmく Tbかつ Tm <Tbかつ Tb≤Tm )で PCR

1 2 3 サイクルを行う第二過程を行う。

例えば、下記 (4)〜（6)のステップ力もなる PCRサイクル (Π)を、所望の回数行う。 (4)所望の変性温度に制御する変性ステップ、（5)Tm <Tbかつ Tm <Tbかつ Tb

1 2

≤Tmを満たすァニール温度 Tbに温度制御するアニーリングステップ、（6) DNAポ

3

リメレースによる DNA伸長反応に適した条件に温度制御する伸長ステップ。

なお、上記ステップ（5)および (6)に適した温度条件を設定し、ステップ（5)および ( 6)を同時に行ってもよい。

[0017] 铸型 DNAに、標的配列及び Z又は標的配列に相補的な塩基配列が含まれるとき、 PCRサイクル (I)および (Π)を行うことにより、標的配列の増幅が進行する。

例えば、第三プライマーとして、前記第二プライマーとの共通配列を有するものを用いた場合、以下の反応が進行する。

铸型が 2本鎖 DNAであり、標的配列を含む場合、 PCRサイクル (I)を行うことにより、第一プライマーが、铸型 2本鎖 DNAのうち標的配列の存在する方の片側 1本鎖 D ΝΑにアニーリングする。また、第二プライマーのうち標的配列の^末端に相同な領域力他方の 1本鎖 DNAにアニーリングして、第一、第二プライマーをそれぞれ起点 (5,末端)とする DNA伸長反応が進行し、第二プライマーを起点（5,末端)とする伸長 DNA鎖と、第一プライマーを起点とする伸長 DNA鎖とがそれぞれ生成する。铸型が 1本鎖 DNAであり、標的配列を含む場合、 PCRサイクル (I)を行うことにより、まず第一プライマーが当該 1本鎖 DNAにアニーリングし、第一プライマーを起点とする伸長 DNA鎖が生成する。ついで、この伸長 DNA鎖に第二プライマーがァニーリングして、第二プライマーを起点とし、第一プライマーに相補的な配列を終点（3'末端)とする伸長 DNA鎖が生成する。

铸型が 1本鎖 DNAであり、標的配列に相補的な塩基配列を含む場合、 PCRサイクル (I)を行うことにより、まず第二プライマーが当該 1本鎖 DNAにアニーリングし、第二プライマーを起点とする伸長 DNA鎖が生成する。ついで、この伸長 DNA鎖に第一プライマーがアニーリングして、第一プライマーを起点とし、第二プライマーに相補的な配列を終点（3'末端)とする伸長 DNA鎖が生成する。

第二、第三プライマーの有する共通配列が標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダィズし得ない場合は、 PCRサイクル (I)開始時の PCR反応液には、第三プライマーがハイブリダィズしうる DNAが存在しない。一方、前記共通配列が標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダィズし得る場合は、 PCRサイクル (I )開始時の PCR反応液中に、第三プライマーがハイブリダィズしうる DNAは存在するいずれの場合も、 PCRサイクル (I)を繰り返すと、 5'末端に第一プライマーを有し、 3'末端に、共通配列に相補的な配列を有する伸長 DNA鎖 (I)を含んだ PCR産物が得られる。 [0018] この伸長 DNA鎖 (I)の^末端配列には、第二プライマー中の共通配列と、第三プライマー中の共通配列の双方がハイブリダィズしうる。したがって、伸長 DNA鎖 (I)が生成した後に、さらに変性、アニーリング、伸長ステップを含む PCRサイクル (I)が行われることで、第一〜第三プライマーが DNA伸長反応に貢献し、第一プライマーと相同な配列（5'末端側)から、上記共通配列に相補的な配列（3'末端側）にいたる増幅断片が多量に蓄積される。

[0019] PCRサイクル (Π)において、ァニール温度 Tbを上記範囲とすることにより、第一、第二プライマーはいずれも他のヌクレオチド鎖に対してアニーリングし得ない。一方、第三プライマーは、第一過程によって得られた第一プライマーと相同な配列力上記共通配列に相補的な配列にいたる増幅断片の^末端側にアニーリングし、ァニーリングした第三プライマーの^末端に dNTPが付加する DNA伸長反応が進行する。このような PCRサイクル (Π)を繰り返すことにより、第三プライマーを ^末端に有し、以下^末端まで標的配列と相同な配列力なる 1本鎖 DNAが蓄積される。

以上では、第三プライマーとして、前記第二プライマーとの共通配列を有するものを用いた場合の反応を例示した。一方、第三プライマーとして、前記第一プライマーとの共通配列を有するものを用いれば、上記で、う標的配列と相補的な核酸鎖を生成させることができる。

[0020] このように、第一過程によって、第三プライマーが相補的に結合しうる铸型が多量に蓄積され、さらに第二過程によって、プライマーのうち第三プライマーのみが DNA伸長反応に貢献するので、第三プライマーをフォワードプライマーとする 1本鎖 DNAの生成が非常に効率よく進み、標的配列が増幅されてなる 1本鎖 DNAが効率よく生成する。

[0021] 第一および第二過程を行った後、 PCR反応液を所望の温度に制御することができる。なお本発明によれば、このとき比較的低温に制御しても、増幅された 1本鎖 DNA 力 ^本鎖を形成するおそれは少な、。

[0022] 図 1、 2を参照して、本発明の一実施態様による標的配列の増幅過程を例示する。

この態様は、铸型が標的配列を含む 2本鎖 DNAであり、標的塩基配列の^末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の^末端側と相同な塩基配列からなる第二プライマーと、この第二プライマーの全域と相同な共通配列を^末端側に有する第三プライマーとを用いた例である。図 1、 2において、矢印の矩形端は DNA の^末端を示し、尖端は ^末端を示す。

図 1中の（a)に示す铸型 10は、その片側 1本鎖 DNAに標的配列 12を含む。

PCRサイクル (I)の実施により、図 1中の（b)に示すように、第一プライマー 14が、铸型 2本鎖 DNAのうち標的配列 12の存在する方の片側 1本鎖 DNAにアニーリングする。また、第二プライマー 16が、他方の 1本鎖 DNAにアニーリングする。

そして、図 1中の (c)に示すように、第一、第二プライマーをそれぞれ起点（5'末端）とする DNA伸長反応が進行し、第二プライマー 16を起点（5,末端)とする伸長 DNA 鎖 17と、第一プライマー 14を起点とする伸長 DNA鎖 18とがそれぞれ生成する。

PCRサイクル (I)を繰り返すと、図 1中の（d)、及び (e)に示されるように、 5'末端に第一プライマー 14を有し、 3'末端に、第二プライマーに相補的な配列 160を有する伸長 DNA鎖 120が生成する。

[0023] PCRサイクル (Π)の実施により、図 2に示すように、この例では第二プライマーの全域と相同な共通配列 16を^末端側に有する第三プライマー 20が、伸長 DNA鎖 12 0の^末端側にアニーリングし、 PCRサイクル (Π)を繰り返すことにより、第三プライマー 20を^末端に有し、以下^末端まで標的配列 12からなる 1本鎖 DNAが蓄積される。

[0024] (DNA増幅産物）

第一および第二過程を経て得られる DNA増幅産物は、標的配列を含む 2本鎖 DN Aを铸型として用いた場合、標的配列を含む 1本鎖 DNAを铸型として用いた場合、及び標的配列に相補的な配列を含む 1本鎖 DNAを铸型として用いた場合の、ずれにおいても、第一、第二、及び第三プライマーの組み合わせに対応した標的配列が増幅されてなる 1本鎖 DNAを、多量に含む。

DNA増幅産物において、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNAの生成比は、例えば DNA増幅産物に蛍光標識操作を行った後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたバンドの蛍光強度を測定することで評価できる。なお、予め第三プライマーに蛍光標識物質を結合させておけば、上記標識操作が必要なぐまた、所望の^末端側配列を有する 1本鎖 DNAが実際に生成されたことを、容易に確認できる。

[0025] (第一プライマー）

第一プライマーの融解温度 Tmと、第二プライマーの融解温度 Tmの関係は、公

1 2

知の PCR法で用いられるプライマーセットにおけるのと同様であり、特に限定されないが、 Tm =Tmを満たすことが好ましい。ここで、 Tm =Tmとは、ある特定のァ-

1 2 1 2

一リング温度で PCR反応を行ったときに、第一のプライマーおよび第二のプライマーが双方ともプライマーとして有効に機能する程度に、 Tmが近似していることを示す。

[0026] (第二プライマー）

第二プライマーは、前記標的配列の^末端側に相同な塩基配列を、少なくとも一部に有する。

また、上述の通り、第二プライマー又は前記第一プライマーの^末端側には、第三プライマーの^末端側と相同な共通配列が存在する。

第二、第三プライマーの融解温度 Tm、 Tmは、 Tm <Tmの関係を満たす。この

2 3 2 3

ような関係を満たす第二プライマーを得るために、例えば、第二プライマーの GC含量を増減させる、第二プライマーの全長を増減させる、これらの方式を組み合わせる等により、 Tmを調整することができる。

2

[0027] (第三プライマー）

第三プライマーは、第二プライマー又は前記第一プライマー 5'末端側の一部塩基配列に相同な共通配列を^末端側に有する。

第三プライマーは、第一、第二プライマーに対して、 Tm <Tmかつ Tm <Tmの

1 3 2 3 関係を満たす。

このように第一、第二プライマーに対して高い融解温度を有し、かつ、これらに対して適度な融解温度差を示す第三プライマーを得るために、例えば、下記の方式で τ

3 を調整することができる。

第三プライマーの GC含量を増減させる方式。

第三プライマーの全長を増減させる方式。

また、第三プライマーの^末端側に、後述の特定化合物群、特定塩基から選択される化合物を結合させることで Tmを制御する方式も可能である。また、これらの方式を組み合わせてもよい。

[0028] 本発明にお、て用いる第二プライマー又は前記第一プライマーと第三プライマーは共通配列を有するから、この共通配列の長さを増減させることで、第二又は第一プライマーと第三プライマーとの双方の全長が増減する。したがって、本発明においては、共通配列の長さを増減させることで、任意の標的配列に対応する第二又は第一プライマーと、この第二又は第一プライマーと所望の Tm差を有する第三プライマーと V、う組み合わせを容易に得て、反応に供することができる。

[0029] 第三プライマーは、 5,末端側に、 LCRed705、アミノ基、リン酸基、ピオチン、 DIG 、 DNPゝ TAMRA、 Texas -Red, ROX、 XRITC、ローダミン、 LCRed640、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、 FITC、 6— FAM、 TET、 cy3、 cy5、 BODIPY 564/570, BODIPY500/510, BODIPY530/550,及び BODIPY581Z59 1 (以下、「特定ィ匕合物群」という）、並びに、 gと cの合計含有量が 50%以上のオリゴヌクレオチド、及び gと cの含有量が 15%以上で 2塩基以上のオリゴヌクレオチド（以下、「特定塩基」、う）力もなる群より選ばれる化合物を有することが好ま U、。

特定化合物群、特定塩基から選択される化合物を有することにより、第三プライマ一の Tmをさらに容易に調整することができる。なお、特定塩基は、標的配列に対し

3

て非特異的な配列であることが好まし、。

[0030] 特定化合物群の表示において、 DIGとはジゴキシゲニンであり、 DNPとはジニトロフエ-ルであり、 TAMRAとはカルボキシテトラメチルローダミンであり、 Texas -Red とは 1H, 5H, 11H, 15H-Xantheno [2, 3, 4— ij : 5, 6, 7-i'j']diquinolizin 18— ium, 9— [2 (or4)— [ [ [6— (2, 5― dioxo— 1— pyrrolidinyl) oxy]— 6— oxohexyl]amino」sulfonyl]— 4、or2) sulfophenyl]— 2, 3, 6, 7, 12, 13, 16, 17-octahydro- , innersaltであり、 ROXとはローダミン Xであり、 XRITCとはローダミン Xイソチオシァネートであり、 FITCとはフルォレセインイソチオシァネートであり、 6— FAMとは 6—カルボキシフルォレセインであり、 TETとはテトラクロ口フルォレセインであり、 BODIPY564/570とは 4, 4 - dif luoro - 5 - styryl - 4 - bora - 3a, 4a― diaza— s— maacene— d— propionicacid, succinimidylesterで &)り、 BOD IPY500Z510とは 4, 4― dif luoro— 4— bora— 3a , 4a― diaza— s— indacene― 3, 5 -dipropionicacid, succinimidylesterであり、 BODIPY530/550とは 4, 4 — difluoro— 5, 7― diphenyl— 4— bora— 3a, 4a― diaza— s— indacene— 3— p ropionicacid, succinimidylesterであり、 BODIPY581Z591とは 4, 4— difluor o— 5— (,4— phenyl— 1, 3— butadienyl)— 4— bora— 3a, 4a― diaza— s— inda cene— 3— propionicacid, succinimidylesterである。

[0031] 特定塩基の第一の態様は、 gと cの合計含有量 (GC含量）が 50%以上のオリゴヌクレオチドである。 GC含量は高い方力 DNA増幅反応の効率が高くなる傾向があり、 60%以上、 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上、そして 100%とすることが可能である。 GC含量をこれらの何れの割合で選択するかは、特定塩基自体の長さ、特定塩基自体と増幅する配列やプライマーとの間に相補性が生じないようにすること等を考慮することにより、当業者が適宜選択することができるものである。特定塩基が長くなりすぎると、 DNA増幅反応の効率は低下する場合もあるため、特定塩基は 40塩基以下であることが好ましい。また、ブライマ一ダイマーを形成させに《するため、 gと cの一方の塩基の含有量が 50%以上の割合、 aと tの一方の塩基の含有量が 50%以上の割合で含まれることが好まし、。

[0032] 特定塩基の第二の態様は、 GC含量が 15%以上で、かつ 2塩基以上の塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドである。 GC含量が 15%未満のオリゴヌクレオチドを結合させると、 DNA増幅反応の効率が低下することもある。また、 gと cの合計の含有量に対する gと cのうち多、方の塩基の含有量が 70%以上、 aと tの合計の含有量に対する a と tのうち多、方の塩基の含有量が 70%以上であることが好まし、。

[0033] 特定塩基として、具体的な好ましい塩基配列としては、例えば以下の 2〜8塩基のものを例示することができる。また、 9塩基以上の配列については、以下の 2〜8塩基のものを適宜組み合わせればよい。なお、 Sとは c又は gを表し、 Wとは a又は tを表す ss、 sw、 ws、 sss、 ssw、 sws、 wss、 ssss、 sssw、 ssws、 swss、 w sss、 sssss, ssssw, sssws, sswss, swsss, wssss, ssssss, ss sssw、 ssssws, ssswss, sswsss, swssss, wsssss, sssssss, ssssssw, sssssws, sssswss, ssswsss, sswssss, swsssss, wssssss, ssssssss, sssssssw, ssssssws, ssssswss, ssss wsss、 ssswssss, sswsssss, swssssss, wsssssss, ssssssw w、 ssssswsw, sssswssw, ssswsssw, sswssssw, swsssssw 、 wssssssw, ssssswws, sssswsws, ssswssws, sswsssws, swssssws, wsssssws, sssswwss, ssswswss, sswsswss, s wssswss, wsssswss, ssswwsss, sswswsss, swsswsss, ws sswsss, sswwssss, swswssss, wsswssss, swwsssss, wsw sssss, wwssssss。

また、具体的には、 agtc、 aagt、 ggac又は gggcの繰り返し単位からなる 20塩基までのオリゴヌクレオチドを例示することができる。

[0034] また、特定塩基は 2次構造を形成して増幅反応を阻害しな、ような配列を有することが好ましいが、より具体的には配列間で塩基対形成が低いことが好ましぐ塩基対形成がないことが特に好ましい。少なくとも、連続して塩基対が形成されないことが好ましい。さらに、第三プライマー中の他の配列に対しても、塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形成が無、ことが特に好まし、。

[0035] 第三プライマーに含有される化合物が前記特定塩基である場合、第三プライマーの^末端 (すなわち特定塩基の^末端）には、標識物質として公知の放射性同位体、蛍光物質等が結合されていてもよい。

[0036] 本発明では、第三プライマーの^末端側と相同な領域をもつ第二プライマー又は第一プライマーと第三プライマーを併用することで、増幅したい標的配列に対応し、しかも、第一、第二プライマーよりも高い Tmを有するプライマー (第三プライマー）が

、第二プライマーの^末端側に対して相同な共通配列を有したヌクレオチドとして、容易に準備できる。すなわち、上式（1)を満たす Tmを有して第二過程において優

3

先的に機能し、かつ所望の方向（5 則から 3 則への配列順)を有する標的配列の増幅に貢献する第三プライマーが容易に提供される。よって、従来のいわゆるサーマルァシンメトリック法では困難であった、所望配列に対応し、かつ必要な Tmを有するプライマーの提供が、容易に行える。さらには、第三プライマーの 5'末端側に、任意の化合物、例えば上記特定ィ匕合物あるいは特定塩基を含有させうることから、所望の特性を有する第三プライマーの準備を特に容易に行える。

[0037] 以上説明したように、本発明の DNA増幅方法によれば、全体としての PCR効率を低下させる要因が必要とされず、第一過程、第二過程が、一方向の 1本鎖 DNAの増幅に貢献する。そして、铸型が 2本鎖 DNAである場合、铸型が 1本鎖 DNAである場合のいずれにおいても、第一、第二、及び第三プライマーの設定に対応して、铸型 D NAの方向に関らず所望の方向を有し、所望の領域に対応するような 1本鎖 DNAを効率よく得ることができる。

さら〖こは、 RNAプライマー、 PNA等の高価な試薬や、特別の装置を用いる必要がない。また、ブロッカーを別途添加する操作を必要とせずワンステップ操作で増幅産物を得ることができ、またプライマーの濃度比の検討などが不要であるため、簡便に全工程を終えることができる。したがって、本発明の DNA増幅方法は、簡便かつ安価に実施することができる。

[0038] より効率よく所望の 1本鎖 DNAを得るためには、 PCRサイクル (I)のサイクル数を 1 0〜30、 PCRサイクル（Π)のサイクル数を 10〜50とすることが好まし!/、。

[0039] 本発明の方法で得られた DNA増幅産物は、 1本鎖 DNAを用いて遺伝子の 1塩基多型 (SNPs)を解析するため等に好適である。したがって、医療分野、環境衛生分野、食品衛生分野等における微生物の同定、臨床診断における遺伝子解析等に有利に用いられる。

実施例

[0040] (合成例 1)铸型 DNA

腸炎ビブリオのストレイン (整理番号; V89— 056、株式会社ニチレイ)力も抽出した染色体 DNAを、実施例における铸型として用いた。

[0041] (合成例 2)プライマー

配列番号 1で示される塩基配列を有する腸炎ビブリオ毒素遺伝子（150塩基対)を標的配列とし、その増幅用として、以下のプライマーを合成した。

第一プライマー:塩基配列を配列番号 2に示す。融解温度 Tm = 50°C 第二プライマー:塩基配列を配列番号 3に示す。融解温度 Tm = 50°C

2

第三プライマー：配列番号 4に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドに、 Cy3を結合させたプライマー。融解温度 Tm =62°C

3

[0042] (PCR装置）

PCR装置として、 GradientBlockModule (グラジェントブロックモジュール）を装着した HYBAID社製 PCRExpressを用いた。

[0043] (実施例 1)

合成例 1で得た铸型 DNAと、合成例 2で得た第一〜第三プライマーと、 Taqポリメレース（Applied Biosystems社製「AmpliTaqGold」）と、この Taqポリメレースに付属の dNTP (「Amp dNTP MIX」）とを、付属の PCRバッファ（「Gene Amp 10x PCR Buffer」）に溶解して PCR反応液を調製した。

この PCR反応液に、 95°C、 10分のポリメレース活性化ステップに引き続き、下記条件の PCRサイクルを行った。

(1)変性： 95°C、40秒（2)アニーリング: 45°C、 30秒（3)伸長： 72°C、 1分上記（1) 〜（3)を 20サイクル繰り返した。

(4)変性： 94°C、 40秒（5)アニーリング: 45°C〜60°Cの 6段階グラジェント（グラジェントブロックモジュールのレーン番号 1〜6)、 30秒（6)伸長： 72°C、 1分上記（4)〜（6 )を 40サイクル繰り返した。

その後、 72°Cで 10分間保持の後、 4°Cまで冷却し、 DNA増幅産物を回収した。

[0044] (評価方法）

得られた増幅産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。解析条件は以下の通りとした。

泳動条件ゲル濃度： 5%、泳動条件： lxTBE、 100V、 30分解析条件使用機器:フルォ口'イメージアナライザー（「FLA— 8000」、富士写真フィルム社製）、検出波長： 532nm

ssDNA(l本鎖 DNA)、 dsDNA(2本鎖 DNA)の各々に対応する、検出波長 532 nmにおける蛍光強度を、図 3に示す。

実施例 1では、多量の 1本鎖 DNAが得られた。その中でも、ァニール温度 45°Cで 20サイクルの後、ァニール温度を約 10°C以上上昇させて 40サイクル PCRを行った条件（レーン番号 5〜6)において、特に 2本鎖 DNAよりも多い 1本鎖 DNA(2本鎖 D NAに対する量比； 1. 5〜3程度）が得られた。

[0045] (比較例 1)

第三プライマーを用いない以外は、実施例 1と同様に行い、 DNA増幅産物を解析した。

増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染色を行ったところ、 2 本鎖 DNAのサイズに相当するバンドは検出されたが、 1本鎖 DNAに相当するバンドは、、ずれのァニール温度条件でも検出されなかった。

産業上の利用可能性

[0046] 本発明の DNA増幅方法によれば、所望の方向の、所望領域の 1本鎖 DNAを、簡便かつ効率よく調製することができる。し力も、 DNA増幅産物において、従来になく高、含有率および絶対量をもって、 1本鎖 DNAを生成させることができる。

Claims

請求の範囲

[1] DNAを铸型として用いる DNA増幅方法であって、

標的塩基配列の^末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の^ 末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの^末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を^末端側に有する第三プライマーとを用い、

3 1 3 m Tm

2 3

ァニール温度 Ta (但し、 Ta≤Tmかつ Ta≤Tm )で PCRサイクルを行う第一過程

1 2

1 2 3

ルを行う第二過程とを有することを特徴とする DNA増幅方法。

[2] 前記第三プライマーが、 5,末端側に、 LCRed705、アミノ基、リン酸基、ピオチン、 DIG, DNPゝ TAMRA、 Texas -Red, ROX、 XRITC、ローダミン、 LCRed640、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、 FITC、 6— FAM、 TET、 cy3、 cy5、 BOD IPY564/570, BODIPY500/510, BODIPY530/550, BODIPY581/59 1、 gと cの合計含有量が 50%以上のオリゴヌクレオチド、及び gと cの含有量が 15% 以上で 2塩基以上のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる化合物を有する請求項 1に記載の DNA増幅方法。

[3] 前記第一過程における PCRサイクル数を 10〜30、前記第二過程における PCRサイタル数を 10〜50とする請求項 1または 2に記載の DNA増幅方法。