JP2013507992A5 - - Google Patents

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開示のそれぞれの方法では、本明細書で開示されたように、逆方向プライマーがプライマーの組み合わせであるような態様が提供されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
前記標的ポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対するＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２）
前記標的ポリヌクレオチドの前記二次構造が、Ｆの不在下で、前記標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸張を阻害する、項目１に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目３）
前記Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含む、項目１又は２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４）
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１のポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目５）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ １ とＴ ２ の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ３ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目６）
Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端が重複する、項目５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目７）
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｐａの全長にわたってＰａに重複する配列を有する、項目６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目８）
前記Ｐの３’末端における前記ヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの前記５’末端におけるヌクレオチドが異なる、項目６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目９）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記ブロッカーポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、項目５、６、又は８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１０）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記プローブポリヌクレオチドが、Ｔ １ とＴ ２ の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ４ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１１）
前記プローブポリヌクレオチドが、標識とクエンチャーとを含む、項目１０に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目１２）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記プローブポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、項目１０又は１１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１３）
ブロッカーポリヌクレオチドを更に含み、前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ １ 及びＴ ２ の５’末端に存在し、かつＴ ４ の３’末端に存在する第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ３ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、項目１０、１１又は１２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１４）
前記ブロッカーが、修飾核酸を含む、項目１３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１５）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端における標識とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列、Ｐｃの５’ポリヌクレオチド配列とＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃの５’に対して十分に相補的である５’ポリヌクレオチド配列、及びＦｄの３’ポリヌクレオチド配列とユニバーサルクエンチャーが適切な条件下でハイブリダイズするように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的である３’ポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、クエンチャーと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとＦｄの３’ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするようにＦｄの３’ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列とを含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１６）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記ユニバーサルクエンチャーが、修飾核酸を含む、項目１５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１７）
上記項目のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーが、逆方向プライマーを更に含み、前記逆方向プライマーが、Ｔ １ に対してハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目１８）
Ｐが修飾核酸を含む、項目３、４、９、１２、１４又は１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１９）
Ｆが修飾核酸を更に含む、項目３、４、９、１２、１４又は１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２０）
前記修飾核酸がＰａ内にある、項目１８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２１）
前記修飾核酸がＦｂ内にある、項目１９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２２）
Ｐが、Ｐａ内に複数個の修飾核酸を含む、項目１〜２１のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２３）
Ｆが、Ｆｂ内に複数個の修飾核酸を含む、項目１〜２２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２４）
前記修飾核酸が、Ｐの３’末端におけるヌクレオチドである、項目２１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２５）
Ｆｄが、Ｐｃに対して少なくとも７０％相補的である、項目１〜２４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２６）
Ｐｃが、Ｆｄに対して少なくとも７０％相補的である、項目１〜２５のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２７）
ＰｃとＦｄが、前記鋳型ポリヌクレオチドの不在下で互いに対してハイブリダイズする、項目１〜２６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２８）
Ｐが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２７のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２９）
Ｆが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２８のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３０）
ＤＮＡポリメラーゼからの伸張をブロックする、Ｆにその３’末端において結合されているブロッキング基を更に含む、項目１〜２９のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３１）
前記ブロッキング基が、３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、及び逆位デオキシチミジン（ｄＴ）からなる群から選択される、項目３０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３２）
Ｐａが、長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約５塩基〜長さ約１０塩基、長さ約５塩基〜長さ約８塩基である、項目１〜３０のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３３）
Ｐｃが、長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である、項目１〜３２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３４）
Ｆｂが、長さ約１０塩基〜長さ約５０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５５塩基、長さ約１０塩基〜５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基である、項目１〜３３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３５）
Ｆｄが、長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である、項目１〜３４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３６）
Ｐが、標識を含む、項目１〜３５のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３７）
前記標識が、Ｐ内にその５’末端において存在する、項目３６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３８）
前記標識が、消光可能である、項目３６又は３７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３９）
Ｆがクエンチャーを含む、項目３６、３７又は３８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４０）
前記クエンチャーが、Ｆ内にその３’末端において存在する、項目３９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４１）
前記クエンチャーが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ２、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、及びＤａｂｃｙｌ．Ｇ−ｂａｓｅからなる群から選択される、項目３９又は４０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４２）
前記ブロッカーポリヌクレオチド内の前記修飾核酸が、前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドである、項目９、１４及び１８〜４１のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４３）
前記修飾核酸が、前記Ｐの３’末端におけるヌクレオチドである、項目３、４、９、１２、１３、１６又は１７〜４２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４４）
前記修飾核酸が、ロックド核酸である、項目３、４、９、１２、１４、１６、１８〜２４、４２又は４３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４５）
サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を、プライマーの組み合わせを使用して検出する方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップとを含む、方法。
（項目４６）
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
ＰがＴ １ に対して完全に相補的である第１のドメインを含み、Ｐａがサンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではない、項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載されたプライマーの組み合わせを使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
前記方法が、
標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
検出が前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すような、Ｐａからの前記配列を検出するステップとを含む、方法。
（項目４８）
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記検出するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目４５〜４８のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、Ｐａから伸張した配列に相補的な配列を有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、Ｐａから伸張した配列に相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする前記標的ポリヌクレオチドの鎖に相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
検出がリアルタイムで実行される、項目４５〜５１のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
プライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上でポリメラー伸張を開始させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ １ ）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない第１の領域内の配列（Ｔ １ ＊ ）を有する非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、ＰａがＴ １ に接触する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
（項目５４）
前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域（Ｔ １ ）内の前記配列が、前記非標的ポリヌクレオチド内の前記第１の領域（Ｔ １ ＊ ）内の前記配列と、１つの塩基で異なる、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップを更に含み、前記検出が、前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上で、ポリメラーゼ伸張を開始する方法であって、Ｐが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
（項目５７）
前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップを更に含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記検出するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目５５〜５７のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸張した配列に相補的である配列を有する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記Ｐａから伸張した配列に相補的である逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
検出がリアルタイムで行われる、項目５７〜６０のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ １ ）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない、１つまたはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含み、
Ｐａが前記Ｐａ内の前記配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
（項目６３）
項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に対して完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含む方法であり、
Ｔ １ が前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
（項目６４）
前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して完全に相補的である配列を有する、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６５）
前記逆方向プライマーが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、
前記第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第１の領域（ＴＴ １ ）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第２の領域（ＴＴ ２ ）に対して相補的である第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、ＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６６）
前記逆方向プライマーが、項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせである、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６７）
前記方法で増幅された生成物を検出するステップを更に含む、項目６２〜６６のうちのいずれか一項に記載された方法。
（項目６８）
検出が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
検出が、リアルタイムで実行される、項目６７又は６８に記載の方法。

Claims (21)

  1. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    前記標的ポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対するＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  2. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１のポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  3. 第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ１とＴ２の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  4. Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端が重複する、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  5. 前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｐａの全長にわたってＰａに重複する配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  6. 前記Ｐの３’末端における前記ヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの前記５’末端におけるヌクレオチドが異なる、請求項４に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  7. 第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記プローブポリヌクレオチドが、Ｔ１とＴ２の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ４）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  8. ブロッカーポリヌクレオチドを更に含み、前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ１及びＴ２の５’末端に存在し、かつＴ４の３’末端に存在する第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  9. 第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端における標識とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列、Ｐｃの５’ポリヌクレオチド配列とＦｄがＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にハイブリダイズするようにＰｃの５’に対して十分に相補的である５’ポリヌクレオチド配列、及びＦｄの３’ポリヌクレオチド配列とユニバーサルクエンチャーがＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にハイブリダイズするように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的である３’ポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、クエンチャーと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとＦｄの３’ポリヌクレオチド配列がＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にハイブリダイズするようにＦｄの３’ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列とを含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  10. 請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーが、逆方向プライマーを更に含み、前記逆方向プライマーが、Ｔ１に対してハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマー。
  11. ＤＮＡポリメラーゼからの伸張をブロックする、Ｆにその３’末端において結合されているブロッキング基を更に含む、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  12. サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を、プライマーの組み合わせを使用して検出する方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記方法が、
    前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップとを含む、方法。
  13. ＰがＴ１に対して完全に相補的である第１のドメインを含み、Ｐａがサンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではない、請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載されたプライマーの組み合わせを使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
    前記方法が、
    標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    検出が前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すような、Ｐａからの前記配列を検出するステップとを含む、方法。
  14. プライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上でポリメラー伸張を開始させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
    前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ１）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない第１の領域内の配列（Ｔ１ ＊）を有する非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
    前記方法が、ＰａがＴ１に接触する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
  15. 請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上で、ポリメラーゼ伸張を開始する方法であって、Ｐが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
    前記方法が、
    前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
  16. ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
    前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ１）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない、１つまたはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
    前記方法が、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
    （ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含み、
    Ｐａが前記Ｐａ内の前記配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
  17. 請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
    前記方法が、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
    （ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含む方法であり、
    Ｔ１が前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
  18. 前記逆方向プライマーが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、
    前記第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第１の領域（ＴＴ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第２の領域（ＴＴ２）に対して相補的である第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、ＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと、前記ブロッカーポリヌクレオチド内のヌクレオチドとが異なるものである、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  20. 前記ブロッカーポリヌクレオチドが非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であり、かつ前記標的ポリヌクレオチドに対するミスマッチを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  21. ＤＮＡポリメラーゼからの伸長を妨害する、その３’末端で前記ブロッカーに結合したブロッキング基をさらに含む、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。

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