JP6496665B2 - ハイスループットｐｃｒシーケンシングのための方法及びプライマーのセット - Google Patents

Description

本発明は、ハイスループット（高処理能）ＰＣＲシーケンシングのための方法及びプライマーのセットに関する。

近年、１回のランにおいて膨大な数のシーケンシング（配列決定又は配列読み取り）を並行して行える、進歩的な技術が開発されている。この「次世代型」シーケンシング（ＮＧＳ）又は「ハイスループット（高処理能）」シーケンシング（ＨＴＳ）から得られる多次元データは、従来にはないデータの正確さと深さを有し、個人又はある人口における生物学的多様性の把握に用いることができる。しかし、この技術は非常に高い感度を有するため、多様な材料からの（クロス）コンタミネーション物生成のリスクが高い。そこで、ＮＧＳ又はＨＴＳデータの誤読を防ぐために、（i）コンタミネーション物があった場合その配列増幅を防止し、（ii）コンタミネーション物の配列の有無を検出することができる方法が求められている。高感度で信頼性のあるＮＧＳ診断のためには、コンタミネーションを防止するとともに、残留した可能性のあるコンタミネーション物の有無の識別を行うことが肝要である。

コンタミネーションを発生させる主な原因の１つとして、ＮＧＳシーケンシングに適したＰＣＲライブラリの作製に頻繁に使用される、２ステップＰＣＲによる増幅が挙げられる（非特許文献１）。２ステップＰＣＲでは、第１段階目の増幅反応において、尾部配列（tail sequence、本発明の文脈においてはｍ_ａと表記され、例えば尾部Ｍ１３又はＴ７と表記される）で挟まれた特異的プライマーを使用して標的核酸配列を増幅する。続いて、第２段階目のプライマー（アダプタープライマー）を用いて、第１段階目の増幅産物の増幅を行い、シーケンシングに使用する第２段階目の増幅産物を得るが、この第２段階目の増幅反応においては、第１段階目の増幅用プライマーの尾部配列と相補的な配列を３'末端部分に有するプライマーを用いることで、ＮＧＳシーケンシングに必要な核酸配列が導入される。この方法のコスト効率をより高めるために、第２段階目の増幅用プライマーの中間域又は５'末端近傍に、バーコード配列又は多重識別子と呼ばれる配列を導入することで、ＮＧＳシーケンシング用の複数の試料を多重に解析することができる（非特許文献１）。

次の表は、コンタミネーション発生源を概観するためのものである。本発明に最も関連があるのは、（Ｃ）及び（Ｄ）欄である。２ステップＰＣＲによる増幅においては、第１段階目の増幅で生成される増幅産物が多数であるために、第１段階目の増幅（ＰＣＲ）で生成された増幅産物が再増幅反応（Ｃ）へと持ち越されてしまうことで、クロスコンタミネーションが発生する可能性が高い。更に、第２段階目のＰＣＲ産物（増幅産物）が、他の第２段階目の増幅反応（Ｄ）にとってのコンタミネーション物となる可能性もある。ゲル抽出法又はＰＣＲ精製キットを使用して増幅産物を単離する場合、コンタミネーションのリスクは更に高くなる。
表１：クロスコンタミネーションの発生、及びＮＧＳライブラリ作成のための２ステップＰＣＲにおけるクロスコンタミネーションの防止。Ａ及びＢ：第１段階目の増幅における、他の第１段階目又は第２段階目の増幅に由来するＰＣＲ産物のコンタミネーションは、ＵＴＰやＵＮＧを用いることで防止可能であり、尾部又はアダプターに特異的なプライマーを用いて検出可能である。（ＵＳ５０３５９９６（又はＥＰ０４０１０３７、ＵＳ６８４４１５５Ｂ２、ＵＳ７９１４９８６Ｂ２）としても公開）を参照）。Ｃ及びＤ：第２段階目の増幅における、他の第１段階目又は第２段階目の増幅に由来するＰＣＲ産物のコンタミネーションは、本発明による「二重のコンタミネーション防止技術」によって防止及び検出が可能である。

Baetens et al., Human Mutation 32, 1053-1062 (2011)

本発明の課題は、大量並列シーケンシング（ＮＧＳ／ＨＴＳ）技術を利用した技術において、ＰＣＲに由来するコンタミネーションを（i）防止する及び／又は（ii）検出することである。

上記課題は、独立請求項に記載する特徴によって解決される。

本発明の方法に係る、プライマー、標的並びに第１段階目及び第２段階目の増幅産物を示す図である。配列断片ｍ_ａ−Ｋは配列要素ｋ_１を含み、配列断片ｍ_ａ−Ｋ'は配列要素ｋ'_１を含む。逆相補配列断片には下線が引かれている。 本発明の方法に係る、プライマー、標的並びに第１段階目及び第２段階目の増幅産物を示す図である。配列断片ｍ_ａ−Ｋは、配列要素ｋ_１に加え配列要素ｋ_２を更に含み、配列断片ｍ_ａ−Ｋ'は、配列要素ｋ'_１に加え配列要素ｋ'_１を更に含む。逆相補配列断片には下線が引かれている。 本発明の方法に係る、プライマー、標的並びに第１段階目及び第２段階目の増幅産物を示す図である。配列断片ｍ_ａ−Ｋは、配列要素ｋ_１及び配列要素ｋ_２に加え、配列要素ｓを更に含み、配列断片ｍ_ａ−Ｋ'は、配列要素ｋ'_１及び配列要素ｋ'_２に加え、配列要素ｓ'を更に含む。逆相補配列断片には下線が引かれている。 本発明の方法に係る、プライマー、標的並びに第１段階目及び第２段階目の増幅産物を示す図である。配列断片ｍ_ａ−Ｋは、配列要素ｋ_１に加え配列要素ｓを更に含み、配列断片ｍ_ａ−Ｋ'は、配列要素ｋ'_１に加え配列要素ｓ'を更に含む。逆相補配列断片には下線が引かれている。

用語と説明
核酸配列は５'末端から３'末端の方向で表記される。本明細書の文脈において、配列断片とは、ひとまとまりの連続した配列を意味する。配列断片は、下付き文字又は上付き文字を適宜伴う文字によって表される。ｋ_１、ｋ_１'、ｋ_２、ｋ_２'、ｓ及びｓ'は、配列断片の表記例である。配列がこれら配列表記で表される場合、そのような配列は、５'末端から３'末端の方向で記載されている。配列断片は、配列要素とも称される。

標的配列の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。増幅及びシーケンシングの標的がＲＮＡの場合、そのＲＮＡは、増幅に先立ってｃＤＮＡに転写される（逆転写酵素による）。

本明細書の文脈において、「プライマー」とは、ブロックオリゴマーを形成する一本鎖のＤＮＡ又は核酸類縁体であって、８から１００ヌクレオチド長を有するものである。

本発明の文脈において、「ハイブリッドを形成可能」とは、ＰＣＲ反応又はシーケンシング反応のための条件下（例えば、１０ ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）：１００ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ;１．５ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ_２；０．２ｍｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰを用いて、各プライマーのアニーリング温度が４０から６８℃であるという条件）で、標的配列と選択的に結合可能な配列に関する表現である。このようなハイブリッド形成可能な配列は、標的配列に対して連続的な逆相補配列であってもよく、ギャップ又はミスマッチを含んでもよい。又は、このようなハイブリッドを形成可能な配列は、マッチしないヌクレオチドが更に追加されてよい。ハイブリッド形成可能な配列の取り得る最短の長さは、Ｃ又はＧ塩基がＡ又はＴ／Ｕに比べ結合エネルギーが高いことから、その組成に依存する。又は、当該最短の長さは、ＬＮＡのような高い結合エネルギーをもたらす修飾によって、ＤＮＡの場合に比べハイブリッド形成可能な配列の取り得る最短の長さが短くなることから、配列骨格の化学的性質に依存する。

本発明の文脈において、「ヌクレオチド」とは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列と、塩基同士の塩基対形成によって選択的にハイブリッドを形成可能な纏まりとしてのオリゴマーを構成する核酸又は核酸類縁体を意味する。この文脈において、「ヌクレオチド」なる用語は、アデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）及びシチジンの纏まりを構成する従来知られたリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン、デオキシグアノジン、チミジン、デオキシウリジン及びデオキシシチジン等の従来知られたデオキシリボヌクレオチドを含む。「ヌクレオチド」なる用語は更に、ホスホロチオエート、２'Ｏ−メチルホスホロチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ペプチド結合によるＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットであり、グリシンのα炭素に核酸塩基が結合している）、又はロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＬＮＡ；２'Ｏと４'Ｃとのメチレン架橋によってブロックを形成するＲＮＡ）等の核酸類縁体も含む。本明細書の文脈において、「プライマー配列」とは、上記核酸のいずれか又はそれらの混合物で構成されてよい。いくつかの実施態様では、プライマー配列は、デオキシヌクレオチドで構成され、その最後の（３'末端から数えて）１、２、３又は４個のヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。また、いくつかの実施態様では、（３'末端から数えて）４、３、２又は１ヌクレオチドが核酸類縁体のＬＮＡである。また、いくつかの実施態様では、３'末端から数えて２番目３番目のヌクレオチドが核酸類縁体のＬＮＡである。また、いくつかの実施態様では、３'末端から数えて２番目及び３番目のヌクレオチドが核酸類縁体のＬＮＡである。

本明細書に記載の番号によって特定される全ての米国特許及び米国特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。

発明の概要
本発明は、相乗作用を有する３種のプライマー要素（まとめて大文字Ｋを用いてＫ−ボックスと表記され、フォワード（順方向）プライマーに含まれるｋ−ボックス（小文字のｋを用いる）及びリバース（逆方向）プライマーに含まれるｋ'−ボックスとに分類できる）であって、組み合わせて使用することで、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含むがこれに限定されない方法を用いて解析可能なＰＣＲライブラリの正確性を顕著に向上させるプライマー要素の、設計指針を提供するものである。

本発明に係る方法は、２つのプライマー対を使用する。第１又は第１段階目のプライマー対を用いて、標的配列を増幅し第１の増幅産物を生成する。次いで、入れ子である第２（アダプター）プライマー対を用いて、第１の増幅産物を増幅し、シーケンシングに使用される第２の増幅産物を生成する。

本発明は、複数の試料を並行して解析するにあたって、複数のプライマー対を含む相異なるプライマーのセットを第１段階目の増幅及び第２段階目の増幅に使用すること、すなわち試料ごとに異なるプライマーのセットを使用することで、クロスコンタミネーションを防止する。あるプライマーのセット特有の第１段階目の（第１の）プライマー対とのみ協働するように設計された、そのプライマーのセット特有の第２段階目の（第２の）プライマー対が含まれる。各プライマーのセットに含まれる第１のプライマー対及び第２のプライマー対は、Ｋ−ボックス（Ｋ）と名付けられた、特別に設計された配列断片を含む。各Ｋ−ボックスは、各プライマーのセットに特有のものである。第１段階目の増幅用の（第１の）プライマーに含まれるＫ−ボックスは、複数の要素ｋ_１、ｋ_１'、ｋ_２、ｋ_２'、ｓ及びｓ'を含んでよい。後に詳述するとおり、ｓ／ｓ'はＰＣＲバイアスを防止し、ｋ_２／ｋ_２'はコンタミネーション物の検出に使用され、第２段階目の増幅用プライマーのＫ−ボックスにも含まれるｋ_１／ｋ_１'は、コンタミネーションを防止する。重要なことは、ｋ_１／ｋ_１'の配列同士のマッチングを利用することで、マッチングするｋ_１／ｋ_１'配列が、第１の増幅産物生成に既に用いたセットに含まれる第１のプライマーに含まれている場合にのみ、当該セットに含まれる第２のプライマー対による第１の増幅産物の増幅が可能となるという点である。プライマーのセットには、対応する又はマッチするプライマー対が含まれる。複数のセット（例えばセット１からセット３００）によって、コレクションが構成される。Ｎ個のセットを含むコレクションは、第２段階目の増幅反応において、クロスコンタミネーションを発生させずにＮ個の相異なる試料の処理を可能にする。

１個のコレクションに含まれる第１段階目の増幅用の第１のプライマーは全て、同じ標的配列の増幅に用いられる。相異なる標的配列を増幅する（つまりマルチプレックスＰＣＲ）ための相異なるコレクションは、組み合わせて１個のコレクション集合としてよい。

発明の詳細な説明
標的配列断片及びプライマー配列断片
プライマーの簡単な説明及び配列断片を表す略語

プライム記号又はアポストロフィー（'）は、その配列断片又は配列要素が、プライム記号又はアポストロフィーなしで表記される相似物と類似の機能的特徴を有し、かつ、その相似物に対し標的配列において反対側に位置して逆方向に作用することを示す。

増幅される標的核酸配列は、ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'と表記され、ｔ_Ｃ／ｔ'_Ｃは、それぞれフォワード（左側）プライマー及びリバース（右側）プライマーがハイブリッドを形成する配列断片である。ｔ_Ｖは、標的核酸配列中の、目的の配列領域（シーケンシングによって解明したい多様性を有する可能性のある配列部分）である。また、標的核酸配列の要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ'は、それぞれｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'の５'末端及び３'末端に連結されるものである。標的配列の構造は、ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'−ｔ_ｎ'とも表記される。

本発明に係る方法又はプライマーのコレクションに使用されるプライマーは、少なくとも２種の配列断片を含む。

第１段階目の増幅に使用される左側の第１又は第１段階目のプライマーは、（５'末端から３'末端のＯＨに向かって）配列断片ｍ_ａ−Ｋボックス（ｍ_ａ−Ｋとも表記される）及び配列断片ｐ_ｃを含む（図１）。配列断片ｐ_ｃは標的に対する特異性を有するものであり、ｍ_ａ−Ｋは標的特異性を有さない配列断片であって、その一部又は全体が、第２の「アダプター」プライマーとのハイブリダイゼーションに用いられ得る。ｍ_ａ−Ｋボックスにおいて、配列断片ｍ_ａは、シーケンシングに必要な配列を含んでもよく、Ｍ１３のような配列からなるものでもよい。Ｋ−ボックスは、Ｋ−ボックスの要素（ｋ_１／ｋ_１'、ｋ_２／ｋ_２'及びｓ／ｓ'）を含む。

左側のアダプター（第２の）プライマーは、第２段階目の増幅に使用される、ａ_L及びａ_Ｐ−ａ_Ｋと表記される複数の配列断片を含む。ａ_L及びａ_Ｐは、ハイスループットシーケンシングのための機能的特徴を与えるものであり、例えば、シーケンシングプライマーの鋳型配列となるもの、及び／又は、スライドガラスやビーズ等の固体表面に増幅産物を付着させるための機能的特徴を与えるものである。更に、ａ_Ｐは、Ｍ１３のような配列からなるものであってもよい。配列断片ａ_Ｋは、Ｋ−ボックスの要素であるｋ_１を含む。

右側の第１のプライマー又は右側のリバースプライマー、及び右側のアダプタープライマー又はアダプターリバースプライマーは、ｍ_ａ'−Ｋ'と表記され（ｍ_ａ−Ｋ'ボックスとも表記される）、右側の第１の（第１段階目の）プライマーのものと類似の性質を有する配列断片及びｐ_Ｃ'と表記される配列断片を含む。右側のアダプター（第２段階目の又は第２の）プライマーは、ａ_L'及びａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'と表記される配列断片を含む（図１）。

配列要素ａ_L及びａ_Ｐは、各種シーケンシングに使用される。各種シーケンシングの例として、プライマーとハイブリッドを形成する部位及び／又は固体支持体に付着部位のシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない。ハイスループットシーケンシング法は、本発明の技術分野において広く知られるものであり、特にＵＳ２０１１０４５５４１Ａ１、ＵＳ２００５１００９００Ａ１及びＵＳ２００２０５５１００Ａ１に記載される「イルミナ」架橋ＰＣＲシーケンシング法、特にＵＳ６，２７４，３２０、ＵＳ７，２４４，５６７、ＵＳ７，２６４，９２９、ＵＳ７，３２３,３０５及びＵＳ７，５７５，８６５に記載されるパイロシーケンシング法、及び「２塩基コーディング（２ Ｂａｓｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」技術（ＵＳ４８８３７５０、ＵＳ５７５０３４１）等を含む。ハイスループットシーケンシングと関連する更なる方法は、下記の文献に記載されている。

Robustness of Amplicon Deep Sequencing Underlines Its Utility in Clinical Applications. Grossmann et al. J Mol Diagn. 2013年5月14日 doi:pii: S1525-1578(13)00057-3. PMID:23680131；
Solid-State and Biological Nanopore for Real-Time Sensing of Single Chemical and Sequencing of DNA. Haque et al. Nano Today. 2013年2月;8(1):56-74. PMID:23504223；
Next-generation sequencing - feasibility and practicality in haematology. Kohlmann et al. Br J Haematol. 2013年3月;160(6):736-53. doi: 10.1111/bjh.12194. Epub 2013 Jan 7. PMID:23294427；
Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Merriman et al. Electrophoresis. 2012年12月;33(23):3397-417. doi: 10.1002/elps.201200424. Erratum in: Electrophoresis. 2013年2月;34(4):619. PMID:23208921；
Comparison of next-generation sequencing systems. Liu et al. J Biomed Biotechnol. 2012年;2012:251364. doi: 10.1155/2012/251364. PMID:22829749；
Current state-of-art of sequencing technologies for plant genomics research. Thudi M et al. Brief Funct Genomics. 2012年1月;11(1):3-11. doi: 10.1093/bfgp/elr045. PMID:22345601；及び
Integration of next-generation sequencing into clinical practice: are we there yet? Kohlmann A et al. Semin Oncol. 2012年2月;39(1):26-36. doi:10.1053/j.seminoncol. 2011.11.008. PMID:22289489

本発明のプライマーは、上述のようなコンタミネーションの発生を防止し、かつシーケンシング結果に含まれるコンタミネーションの有無の識別を可能にする、特有の配列要素（Ｋ−ボックス）を提供する。Ｋ−ボックスの要素は、ｋ_１、ｋ_１'、ｋ_２、ｋ_２'、ｓ及びｓ'と表記され、バイオインフォマティクス技術によってひと纏まりのＫ−ボックスとして選択されるものであり、この選択は、使用するプライマーの３'末端においてミスマッチが存在しないように行われる。これらの作用機序については、以下に、３種のＫ−ボックスの要素のそれぞれに分けて詳述する。

Ｋ−ボックスの要素ｋ_１及びｋ_１'の役割と作用機序
ｋ_１／ｋ_１'の配列は、既に行われた増幅に由来するコンタミネーションを防止するように設計されている。図１に示すように、第１段階目のＰＣＲに使用されるフォワードプライマーは、（i）標的特異的な部分ｐ_Ｃ、（ii）各プライマーのセットに特異的な、Ｋ−ボックスの要素ｋ_１、及び（iii）配列要素ｍ_ａを含む。第１段階目のＰＣＲに使用されるリバースプライマーは、これらと同じように、しかし逆相補配列となるように構成されている。

各ｋ_１及び／又はｋ_１'はある特定の増幅反応に使用されるものであり、増幅反応を複数回行う場合には多様な（多種類の）ｋ_１及び／又はｋ_１'が使用される。つまり、ルーチンの診断増幅反応（例えば、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の再構成分析又は癌関連遺伝子分析）を同一の研究室で複数回行うような場合には、全ての種類のｋ_１／ｋ_１'を使用するよう、相異なる要素ｋ_１／ｋ_１'を個々の試験に使用することができる。各第２の（アダプター）プライマーの３'末端部分は、それぞれｋ_１又はｋ_１'とハイブリッドを形成するように、ｋ_１（又はｋ_１'）の全長に沿って選択される。このようにして、第１段階目のプライマー対及び第２段階目のプライマー対が作成される。ここで、「左側」のアダプタープライマーは、「左側」の第１段階目のプライマーによって生成した配列断片ｋ_１とハイブリッドを形成し、「右側」のアダプタープライマーは、「右側」の第１段階目のプライマーによって生成した配列断片ｋ_１'とハイブリッドを形成する。完全なハイブリダイゼーションを叶えるためには、アダプタープライマーは、必ずしもｋ_１（又はｋ_１'）によって生成された断片のみとハイブリッドを形成する必要はなく、もしｋ_１（又はｋ_１'）が、選択されたハイブリダイゼーション温度においてハイブリダイゼーション断片として十分な長さを有さない場合には、ｋ_１（又はｋ_１'）の５'末端においてｋ_１（又はｋ_１'）と隣接する配列断片、つまりｍ_ａ及びｍ_ａ'とも、ハイブリッドを形成してよい。

例えば、それぞれ要素ｋ_１／ｋ_１'を含む第１の（第１段階目の）プライマー及び第２の（アダプター）プライマーを含む、５種の相異なるセットを、５つの試料それぞれに特異的に使用して、５種の試料を並行して処理する場合、試料２の第２段階目のＰＣＲにおいて、試料１の第１段階目のＰＣＲに由来するコンタミネーションがあっても、試料１のＰＣＲ産物に含まれるｋ_１及び／又はｋ_１'と、試料２用のプライマーに含まれるｋ_１及び／又はｋ_１'との間のミスマッチによって、コンタミネーション物の増幅が防止されることになる。

ｋ_１もｋ_１'も、１、２、３、４、５、６、７、８、９塩基長又はそれより長い塩基長を有してよい。後述する表４に記載の原理試験の実施例に示すように、ｋ_１／ｋ_１'の配列長さが１塩基長であったとしても、コンタミネーションを軽減することができるが、パーミテーションが小さいこと、また１塩基ミスマッチの識別力（コンタミネーション抑制有無についての識別力）はより長いミスマッチの識別力に比べて低いことから、要素ｋ_１及びｋ_１'がより長い塩基長、例えば２、３、４、５、６、７、８又は９塩基長を有する方が、適用可能範囲が広くなる（そういった例は表１６〜１９を参照のこと）。

Ｋ−ボックス要素ｋ_２及びｋ_２'の役割と作用機序
更なるＫ−ボックス要素ｋ_２及びｋ_２'は、それぞれ第１のプライマーの配列断片ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ'−Ｋ'に含まれるが、これら配列断片に対応する第２の（アダプター）プライマーの配列断片には含まれないものである（図２）。従ってｋ_２及びｋ_２'は、第１のプライマーのみに存在する特徴である。ｋ_２（又はｋ_２'）及びｋ_１（又はｋ_１'）が第１のプライマーに含まれる実施態様においては、要素ｋ_２（又はｋ_２'）は、要素ｋ_１（又はｋ_１'）の下流（３'末端側）に位置する。

ｋ_１及びｋ_１'がコンタミネーションを抑制するのに対し、ｋ_２及びｋ_２'は、既に行われた増幅反応からのコンタミネーション物を検出するように設計されている。

ｋ_１（又はｋ_１'）と同様に、同じルーチンの設定において複数回又は異なる試料に使用される複数のプライマーのセットが、多様なｋ_２（又はｋ_２'）（表２０に例示される）を含むことによって、コンタミネーション物を検出すること、及びｋ_１／ｋ_１'によるコンタミネーション抑制を相乗効果的に制御することができる。

Ｋ−ボックス要素ｓ及びｓ'の役割と作用機序
Ｋ−ボックス要素ｓ／ｓ'は、以下に概説するように、ｋ_１／ｋ_１'及びｋ_２／ｋ_２'の配列に依存して起こり得るＰＣＲバイアスを防止する。

ｓは、左側の第１段階目のプライマーに含まれる、標的特異的な配列ｐ_ｃと配列断片ｋ_２及び／又はｋ_１とを離隔するものであり、ｓ'は、右側の第１段階目のプライマーの標的特異的な配列ｐ_ｃ'と配列断片ｋ_２'及び／又はｋ_１'とを離隔するものである（図３、４）。連続して行うＰＣＲにおいては、ｋ_１／ｋ_１'及びｋ_２／ｋ_２'はプライマー間で異なるために、偶然に、いくつかのｋ_２／ｋ_２'及びｋ_１／ｋ_１'の３'末端部分の複数のヌクレオチドと、第１のプライマーに含まれるｐ_ｃ又はｐ_ｃ'がハイブリダイゼーションする標的領域に隣在する配列と、がマッチしてしまう可能性がある。ある第１段階目のプライマーにおいて、ある標的配列とマッチする長さは、他の標的配列とマッチする長さよりも長い可能性があり、このことが、アニーリング温度の上昇及びそれに起因するＰＣＲバイアスを引き起こす。

この問題は、本発明のいくつかの実施態様で示されるように、コレクション集合を用いる場合により顕著に現れる。コレクション集合に含まれる各セットは、マルチプレックスＰＣＲに使用するため相異なる標的配列のそれぞれに使用されるものであり、かつ、同じｋ_１（及びｋ_１'）、そして任意に同じｋ_２（及びｋ_２'）を含むものである。ここで、アニーリング温度が様々である場合、試験結果の定量的解析結果を顕著に歪める可能性のあるＰＣＲバイアスを起こすことがある。

従って、いくつかの実施態様では、短い（１、２、３又は４ヌクレオチド長の）離隔用配列ｓ（ｓ'）を、配列断片ｐ_ｃ／ｐ_ｃ'のすぐ上流、つまりｋ／ｋ'の３'末端側に導入する。このように、ｓ及びｓ'は、図３、４で概観するように、プライマーがハイブリッドを形成する配列断片ｔ_Ｃ／ｔ_Ｃ'に隣接する鋳型（標的）配列のｔ_ｎ／ｔ_ｎ'とのハイブリダイゼーションを防止するように設計されている。

ｋ_１、ｋ_２及びｓを組み合わせること、並びにｋ_１'、ｋ_２'、及びｓ'を組み合わせることの利点について
これら３種のＫ−ボックス要素は、相乗作用によって、ＮＧＳ／ＨＴＳ技術を使用した増幅におけるＰＣＲに起因するコンタミネーションを防止する効果を奏する。

ｋ_２／ｋ_２'は第１段階目の増幅用プライマーにしか含まれないので、第２の増幅産物を見れば、最終的にコンタミネーションが発生したかどうかを識別することができる。従って、要素ｋ_２／ｋ_２'は、ｋ_１／ｋ_１'によるコンタミネーション抑制効果がどの程度か決定することができ、従って当該抑制効果を制御することができる。

また、ｓ／ｓ'は、Ｋ−ボックスの要素の一つであって、ｋ_１／ｋ_１'及びｋ_２／ｋ_２'の配列に依存したＰＣＲバイアスの発生問題を解決するものである。

そして、これら３種のＫ−ボックス要素の設計は、３種を１個の纏まりとしてバイオインフォマティクスに基づいてまとめて行われ、かつ、使用するプライマーの配列、特に３'末端部分の配列以外とのミスプライミングを引き起こす可能性のあるハイブリッド（例えば１０ｂｐ以下６ｂｐ以上マッチする）を形成しないように行われなければならない。

本発明の様々な観点
本発明の第１の観点によると、配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'−ｔ_ｎ'に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'を増幅する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による複数の増幅反応を行う工程を含む方法が、提供される。換言すれば、本発明は、同じ標的配列（ただし、ｔ_Ｖと表記される目的の配列断片に多様性があってもよい）を繰り返し増幅又はシーケンシングする方法に関する。各増幅反応は、ＰＣＲによる２個の増幅工程を含む。第１段階目の増幅工程は、第１の（第１段階目の）プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅を行う工程であり、ＰＣＲ反応に必要な、ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、適切な緩衝液及びＴａｑポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ等の、当業者によく知られる反応用物質が必要に応じて使用される。この第１のプライマー対は、２個の配列要素ｍ_ａ−Ｋ及びｐ_ｃを５'末端から３'末端の方向で有する配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１の（第１段階目の）左側（フォワード）ＰＣＲプライマーと、同様に５'末端から３'末端の方向で配置される配列ｍ_ａ−Ｋ'−ｐ_ｃ'を含む第１の右側（リバース）ＰＣＲプライマーと、を含む。第１段階目の増幅産物を第１の増幅産物と称し、第１の増幅産物は、その配列断片ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ'が両側に隣在する、標的核酸配列を含む（図１）。

配列要素ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'は、標的において増幅される領域を構成する。短い配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ'は、フランキング（隣接）領域であり、プライマーのセットの配列要素ｓ及びｓ'をどのように設計するかを決定づける領域である。

本発明の方法は、更に第２段階目のＰＣＲ増幅工程を含み、この第２段階目の増幅工程では、配列要素ａ_Ｌ、ａ_Ｐ及びａ_Ｋを５'末端から３'末端の方向で有する配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む第２の（第２段階目の）左側（フォワード）ＰＣＲプライマーと、配列ａ_Ｌ'−ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'を含む第２の右側（リバース）（アダプター）ＰＣＲプライマーと、を含む第２の（アダプター）プライマー対を用いて、第１の増幅産物の増幅を行う。上述のとおり、ＰＣＲ反応に必要な、ヌクレオシド三リン酸、適切な緩衝液及びＴａｑポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ等の、当業者によく知られる反応用物質が使用される。第２段階目の増幅産物を、第２の増幅産物と称する（図１）。

第１のプライマー対において、ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対して相補的な配列を有し、ｐ_ｃ'はｔ_Ｃ'に対する逆相補配列を有する。つまりｐ_ｃ及びｐ_ｃ'は、標的特異的なプライマー配列であり、標的にハイブリッドを形成して増幅を可能にするものである。ｐ_ｃ及びｐ_ｃ'の長さは、それぞれ独立して、８から４０ヌクレオチド長である。

第１のプライマー対において、ｍ_ａ−Ｋは、配列要素ｋ_１を含むｋ−ボックスを含み、ｍ_ａ−Ｋ'は、配列要素ｋ_１'を含むｋ'−ボックスを含む。ｋ_１及びｋ_１'の長さは、それぞれ独立して、２、３、４、５、６、７、８又は９ヌクレオチド長である。ｋ_１及びｋ_１'は、標的配列とハイブリッドを形成するためのものではない。それぞれ独立したｋ_１及びｋ_１'を含む第１段階目のプライマー対及び第２段階目のプライマー対は、１個のセットを構成する。ｋ_１及びｋ_１'は、各プライマーのセットを他のプライマーのセットと区別可能にする配列要素といえる。１個のセットにおいて、第１の（第１段階目の）プライマー対のｋ_１及びｋ_１'は、及び第２の（アダプター）プライマー対のｋ_１及びｋ_１'とマッチする。換言すれば、第１のプライマー対のｋ_１及びｋ_１'は、それぞれ第２のプライマー対の配列要素ａ_Ｋ（ｋ_１）及びａ_Ｋ'（ｋ_１'）に対応するものである（図１）。

また、ｍ_ａ−Ｋは、その３'末端部分に配列要素ｓを含み、ｍ_ａ−Ｋ'は、その３'末端部分に配列要素ｓ'を含む。ｓ及びｓ'は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ'とハイブリッドしてしまうような連続的配列が存在しないように選択された、ミスマッチ配列である。ｓ及びｓ'の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長である。既に詳述したように、ｓ及びｓ'は、ｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'の配列に依存して発生する、ｐ_ｃ及びｐ_ｃ'と標的とのアニーリング温度の意図しない上昇を防止するためのものであり、ＰＣＲバイアスを防止することができる（図３、４）。

配列断片ａ_Ｐ−ａ_Ｋは、配列要素ｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、配列断片ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'は、配列要素ｍ_ａ−Ｋ'内の連続した配列とハイブリッドを形成する。つまり、ａ_Ｐ−ａ_Ｋ（及びその相似物といえるａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'）は、アダプタープライマーの３'末端部分にあり、かつ第１のプライマーを認識する配列断片である。

ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ'は、これらの使用目的が叶えられればどのような長さを有してもよいが、通常、プライマー標的配列の長さ以内の長さを有する。すなわち、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ'の長さは、通常、それぞれ独立して１０から４０ヌクレオチド長であり、いくつかの実施態様においては、１５から３０ヌクレオチド長であると想定される。

ａ_Ｌ及びａ_Ｌ'、並びにａ_Ｐ及びａ_Ｐ'は、これらの全般的な使用目的である、第２の増幅産物のシーケンシングに有用な配列の提供を叶えるものであれば、どのような配列を有していてもよい。例えば、プライマーをアニーリングさせるための配列でもよく、チップやビーズ等ＮＧＳ／ＨＴＳシーケンシングに有用と考えられる結合性の表面構造との結合のための配列であってもよい。

ｔ_Ｖは、標的核酸配列内の、多様性を有してよい領域である。

加えて、本発明の第１の観点によれば、複数の増幅反応のそれぞれに特異的に使用されるプライマーのセットが提供される。あるプライマーのセットのｋ_１及びｋ_１'の配列は、それぞれ他のプライマーのセットのｋ_１及びｋ_１'の配列と異なる。換言すれば、どのセットにおいても、ｋ_１及び／又はｋ_１'の配列は１回しか出現しない。

いくつかの実施態様において、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ'の長さは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様においては、ｐ_ｃ及びｐ_ｃ'の長さは、それぞれ独立して、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８又は４０ヌクレオチド長である。

ある実施態様においては、ｍ_ａ−Ｋは３'末端配列ｋ_１−ｓを含み、ｍ_ａ−Ｋ'は３'末端配列ｋ_１'−ｓ'を含む。

ある実施態様においては、ｍ_ａ−Ｋは配列要素ｋ_１の３'末端に連結する配列要素ｋ_２を含み、ｍ_ａ−Ｋ'は配列要素ｋ_１'の３'末端に連結する配列要素ｋ_２'を含む（図２）。ｋ_２及びｋ_２'の長さは、それぞれ独立して、２、３、４、５、６又は７ヌクレオチド長である。ｋ_２及びｋ_２'は、あるプライマーのセットの第１の（第１段階目の）プライマーと、他の第１の（第１段階目の）プライマーとを区別するものである。ｋ_２及びｋ_２'は、第２の（アダプター）プライマーの配列に対し相補的な配列は含まない。１個のセットにおいて、第２のプライマーのｋ_１及びｋ_１'は、第１のプライマーと相補的な配列を有する。

いくつかの実施態様において、プライマーのセットは、ｋ_１／ｋ_１'、ｋ_２／ｋ_２'及びｓ／ｓ'３個の要素全てを含む（図３）。この場合、ｍ_ａ−Ｋは３'末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、ｍ_ａ−Ｋ'は３'末端配列ｋ_１'−ｋ_２'−ｓ'を含む。いくつかの実施態様においては、ｍ_ａ−Ｋは３'末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、ｍ_ａ−Ｋ'は３'末端配列ｋ_１'−ｋ_２'−ｓ'を含み、かつ、第１のプライマー対及び／又は第２のプライマー対は、それらの３'末端から数えて１、２、３又は４個目のヌクレオチド間結合にホスホロチオエート部分を含む。

ある実施態様において、Ｋは３'末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、Ｋ'は３'末端配列ｋ_１'−ｋ_２'−ｓ'を含み、ここで、
ｋ_１及びｋ_１'の長さは、それぞれ独立して２から９ヌクレオチド長であり、
ｋ_２及びｋ_２'の長さは、それぞれ独立して２から７ヌクレオチド長であり、
ｓ及びｓ'は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ'の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同じであり、ａ_Ｋ'の配列は配列要素ｋ_１'の配列と同じであり、
ａ_Ｋ及びａ_Ｋ'は、それぞれｋ_２及びｋ_２'とハイブリッドを形成しないように設計され、
ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'はｍ_ａ−Ｋ'内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
ｐ_ｃ、ｐ_ｃ'、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ'の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ'はそれぞれ独立して任意の配列を有する。

ある実施態様において、ｋ_１及びｋ_１'の配列の長さは、それぞれ独立して５、６、７、８又は９ヌクレオチド長であり、ｓ及びｓ'の配列の長さは、それぞれ独立して２、３又は４ヌクレオチド長であり、ｋ_２及びｋ_２'の配列の長さは、それぞれ独立して２、３、４、５又は６ヌクレオチド長である。

ある実施態様においては、各プライマーのセットにおいて、
各ｋ_１が互いに異なり、かつ各ｋ_１'が互いに異なることで、各セットに特有のｋ_１及びｋ_１'の組み合わせが存在する、及び／又は
各ｋ_２が互いに異なり、かつ各ｋ_２'が互いに異なることで、各セットに特有のｋ_１及びｋ_１'の組み合わせが存在する。

ある実施態様において、プライマーのセットは、以下を含む：
配列番号００１から０４５から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０４６から０５８から選択されるｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１８９から２３２から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号２３３から２４６から選択されるｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号０５９から０８５から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０８６から１１７から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１１８から１４９から選択されるａ_Ｌ−ａ_Ｐを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号１５０から１８２から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー

いくつかの実施態様において、ｋ_１及びｋ_１'並びに／又はｋ_２及びｋ_２'（ｋ_２及びｋ_２'が配列中に含まれていれば）は、増幅する配列断片に隣接するｔ_ｎ及びｔ_ｎ'とはハイブリッドを形成しないように設計される。つまり、ｋ_１及びｋ_１'並びに／又はｋ_２及びｋ_２'（ｋ_２及びｋ_２'が配列中に含まれていれば）の配列は、プライマーに含まれる、標的の増幅に関与する配列と離隔して存在し、かつ標的の増幅に関与する配列とは異なるものである。ｋ−ボックスの全ての要素はそれぞれ、各プライマーのセットを互いに区別する目的で使用され、そのことによって、上述のとおり、増幅産物中のコンタミネーション物の増幅を防止する。

いくつかの実施態様において、左側の第１段階目のプライマー、右側の第１段階目のプライマー、左側のアダプタープライマー及び右側のアダプタープライマーは、これらプライマーの３'末端又はその近傍（３'末端から数えて１、２、３及び／又は４番目）に存在する、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド又はヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合によって特徴づけられる。換言すれば、このような各プライマーの３'末端にエキソヌクレアーゼ活性を阻害する又は当該活性に耐性を有する結合を配置することで、３'末端からのエキソヌクレアーゼによる分解から保護する。

いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合は、２−Ｏ−メチル化リボヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチドは、ブロックを形成しているＬＮＡ（２'Ｏと４'Ｃとがメチレン架橋されてブロックを形成するＲＮＡ）である。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチドは、２−Ｆ−デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチドは、２−プロピン−デオキシリボヌクレオチドである。

いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド又はヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合は、上記プライマーのちょうど３'末端に存在する。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド又はヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合は、上記プライマーの３'末端から−１、−２、−３及び／又は−４番目の位置に存在し、いくつかの実施態様では、上記プライマーの３'末端から−１番目及び−２番目に存在し、いくつかの実施態様では、上記プライマーの３'末端から−１番目、−２番目及び−３番目に存在し、いくつかの実施態様では、上記プライマーの３'末端から−１番目、−２番目、−３番目及び−４番目に存在する。

誤解を防ぐために説明すると、配列５'ＧｐＡｐＴｘＧｙＣ３'において、ｙは３'末端から−１番目のヌクレオシド間結合を、ｘは３'末端から−２番目のヌクレオシド間結合を、ｐは３'末端から−３番目及び−４番目のヌクレオシド間結合を示し、Ｃは３'末端から−１番目のヌクレオチド、Ｇは３'末端から−２番目のヌクレオチドである。

本発明の第１の観点の他の態様によると、配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'−ｔ_ｎ'に含まれる標的配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ'をシーケンシングする方法であって、以下の工程を含む方法が提供される。
ａ． 上述の観点のいずれかにおいて説明した方法を用いて上記標的配列を増幅する工程、及び
ｂ． 配列要素ｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'を含む第２の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列で構成される配列のセットを生成する工程

シーケンシングを行う方法は、当業者に公知であり、上述の公知文献に記載の方法も含まれる（ただしそれらには限定されない）。

いくつかの実施態様において、標的配列をシーケンシングする方法は、更に以下の工程を含む。
ｃ． 上記配列のセットに含まれる各配列を、第１段階目のプライマーに含まれるｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'とアライメントする工程、及び
ｄ． コンタミネーションの指標として、上記配列のセットに含まれる各配列に対し０又は１の値を割り当てる工程、ここで、上記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）がｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'と完全にアライメントした場合は値０が割り当てられ（この特定の配列を有するコンタミネーション物が存在しないことを意味する）、上記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）とｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'とのアライメントが不完全だった場合は値１が割り当てられ（この特定の配列を有するコンタミネーション物の配列が読み取られたことすることを意味する）、ここで、
（i）工程ｄ）で割り当てられた値を全て加算し、読み取った全配列数で当該加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び／又は
（ii）上記配列のセットから、値１が割り当てられた配列を削除する

配列のセットに含まれる読み取った配列が１０，０００個であって、ｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ'に対応する３２個の配列断片が、あるランにおいてアライメントすると予期された（選択された）配列とアライメントしなかった場合、コンタミネーション物の百分率は、３２／１０，０００を計算して得られた０．００３２から、０．３２％となる。

換言すれば、標的配列をシーケンシングする方法は、妥当性検証（バリデーション）又は品質管理（quality control）を行う工程を含む。ここで、得られた全ての配列は、上記識別力を有する配列であるｋ_２及びｋ_２'、並びに／又はｋ_１及びｋ_１'の有無によって検証される（実施例の原理試験で詳述するように、第２段階目の増幅用プライマーに含まれるｋ_１及びｋ_１'が、第２段階目の増幅において、校正活性を有するポリメラーゼによって部分的に分解され得ることから、ｋ_１及びｋ_１'は、第１段階目の増幅に関する識別子となり得る）。想定外の識別子配列やこれらの組み合わせは、コンタミネーション物が存在することを意味する。

各増幅反応において、ｋ_１、ｋ_１'、ｋ_２及びｋ_２'又はこれらの組み合わせの相違によって区別可能な、相異なるプライマーで構成されるプライマーのセットが使用される。換言すれば、この方法は、複数のサンプルそれぞれに対し１個のプライマーのセットを使用する工程を含み、ここで、各プライマーのセットは、配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍ_ａ−Ｋ'−ｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対と、配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ'−ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対と、を含む。

本発明の他の観点によれば、本発明に係る、標的核酸配列を増幅又はシーケンシングするための方法に用いるプライマーのセットが提供され、ここで、前述のコレクションに含まれる各プライマーのセットは、以下を含む：
i． 配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列ｍ_ａ−Ｋ'−ｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側（リバース）プライマーと、を含む第１のプライマーのセット、及び
ii． 配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ'−ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'を含む右側のアダプタープライマーと、を含むアダプターＰＣＲプライマー対
ここで、配列の各表記は前述のとおりの意味を持つ。具体的には以下のとおりである。
ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対し相補的な配列を有し、ｐ_ｃ'はｔ_Ｃ'に対する逆相補配列を有する。
Ｋは配列要素ｋ_１及び３'末端の配列要素ｓを含み、Ｋ'は配列要素ｋ_１'及び３'末端の配列要素ｓ'を含み、ここで、
ｋ_１及びｋ_１'の長さは、それぞれ独立して２から９ヌクレオチド長であり、
ｓ及びｓ'は配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように設計されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ'の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列に対して相補的であり、ａ_Ｋ'の配列は配列要素ｋ_１'の配列に対して相補的であり、
ａ_Ｋ及びａ_Ｋ'は、それぞれｋ_２及びｋ_２'とハイブリッドを形成しないように設計され、
ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'はｍ_ａ−Ｋ'内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
ｐ_ｃ、ｐ_ｃ'、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ'の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ'はそれぞれ独立して任意の配列を有する。

いくつかの実施態様において、Ｋは３'末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、Ｋ'は３'末端配列ｋ_１'−ｋ_２'−ｓ'を含み、ここで、ｋ_２及びｋ_２'の長さは、それぞれ独立して２から７ヌクレオチド長であり、ａ_Ｋ及びａ_Ｋ'は、それぞれｋ_２及びｋ_２'とハイブリッドを形成しないように設計される。

ある実施態様において、１個のコレクションにおいて、配列要素ａ_Ｐの配列は全て同じであり、配列要素ａ_Ｐ'の配列は全て同じである。

１つの実施態様において、本発明に係る（そして本発明に係る方法に使用される）プライマーのセットは、以下を含む。
配列番号００１から０４５から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０４６から０５８から選択されるｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１８９から２３２から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号２３３から２４６から選択されるｐ_ｃ'を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号０５９から０８５から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０８６から１１７から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１１８から１４９から選択されるａ_Ｌ−ａ_Ｐを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号１５０から１８２から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー

本発明の他の観点によれば、これまで述べた観点又は実施態様のいずれかに係る、標的核酸配列を増幅又はシーケンシングするための方法に使用するためのプライマーのセットのコレクションが提供される。ここで、当該プライマーのセットは、これまで述べた本発明の観点によって定義されるもの（本発明に係るプライマーのセット）である。そして、コレクションに含まれるプライマーのセット全てにおいて、配列要素ｐ_ｃの配列は全て同じであり、配列要素ｐ_ｃ'の配列は全て同じである。また、各プライマーのセットは、ｋ_１及びｋ_１'の組み合わせによって、他のプライマーのセットと区別される。

換言すれば、プライマーのセット間で、ｋ_１は互いに異なる、及び／又はｋ_１'は互いに異なる。つまり、プライマーのセットの各々は、特有のｋ_１／ｋ_１'の組み合わせを有する。

本発明に係るこの観点におけるいくつかの実施態様では、ｋ_２及びｋ_２'が存在する場合、プライマーのセット間で、ｋ_２は互いに異なり、ｋ_２'は互いに異なる。換言すれば、各プライマーのセットは、ｋ_１、ｋ_１'、ｋ_２及びｋ_２'の組み合わせの違いによって、他のプライマーのセットと区別される。

いくつかの実施態様において、本発明に係るプライマーのセットのコレクションは、４、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、１６０、２００、２５６又は１０２４個の相異なるプライマーのセットを含む。

本発明の更に他の観点によれば、本発明に係るプライマーのセットのコレクションを複数含む、コレクション集合（プライマーライブラリ）が提供される。ここで、各コレクションは、ｐ_ｃ及びｐ_ｃ'の組み合わせによって区別される。

コレクション集合において、セット集合は、コレクション集合の構成要素と定義される。つまり、１個のセット集合とは、本発明の方法に使用される複数のプライマーのセットの集合１個を指し、ここで、プライマーのセットが複数あるということは、各セット間でｐ_ｃ及びｐ_ｃ'の組み合わせが異なり、かつ全てのセットにおいてｋ_１及びｋ_１'が同じ（ｋ_２及びｋ_２'も存在すればこれらも同じ）である、ということを意味する。従って、コレクション集合の構成要素は、同じマルチプレックスＰＣＲにおいて併用することができ、コレクション集合に含まれる相異なる構成要素（相異なるＫ−ボックスによって区別される）は、各ＰＣＲ／各シーケンシングにおいて繰り返し使用されることになる。

本発明の効果を示すため、ＰＣＲを用いた、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）遺伝子再構成の分析を行った。

通常、ＴＣＲの分析には２ステップＰＣＲが有用である。それは、ＴＣＲに特異的なプライマーを用いた第１段階目の増幅でたった数回のＰＣＲサイクルを行えばよく、ＰＣＲバイアスが最小化され、次の増幅工程において、アダプタープライマーによって第１の増幅産物が均等に増幅されるためである。また、第２段階目の増幅では、様々なＮＧＳプラットフォームのそれぞれに適した相異なるアダプターを使用することができる。

１つの実施態様において、第１の左側プライマーに含まれる、標的にハイブリッドを形成する断片（ｐ_ｃ）の配列は、配列番号００１から０４５で表され、第１の右側プライマーに含まれる、標的にハイブリッドを形成する断片（ｐ_ｃ'）の配列は、配列番号０４６から０５８で表される。他の実施態様においては、第１の左側プライマーに含まれる、標的にハイブリッドを形成する断片（ｐ_ｃ）の配列は、配列番号１８９から２３２で表され、第１の右側プライマーに含まれる、標的にハイブリッドを形成する断片（ｐ_ｃ'）の配列は、配列番号２３３から２４６で表される。配列番号００１から０５８及び配列番号１８９から２４６で表されるプライマーは、１）アニーリング温度を近接させる、及び２）自己プライミングを最小限にする、という観点から最適化されたものである。

ここに記載される方法、プライマーのセット、コレクション及びコレクション集合は、ヒト患者におけるＴＣＲβのレパトア（repertoire）をin vitroで分析するにあたって使用される。

なお、ここに「実施態様」として開示された各特徴の代替となり得るいかなる事物も、他の実施態様を構成するために任意に組み合わせることができる。

以下の実施例及び図面によって、本発明の実施態様及び利点が更に例示されるが、これらの実施例は、本発明を例示するものであって本発明の範囲を限定するものではない。

実施例に記載する原理試験において、配列断片ｋ_１／ｋ_１'（小文字のｋで表記される）は大文字を用いてＫ_１とも表記され、配列断片ｋ_２／ｋ_２'（小文字のｋで表記される）は大文字を用いてＫ_２とも表記される。また、以降、配列断片ｓ_１／ｓ_１'は、大文字を用いてＳとも表記される。プライム記号又はアポストロフィー（'）は、それを含んで表記される配列断片又は配列要素が、プライム記号又はアポストロフィーなしで表記される対応物と類似の機能的特徴を有し、かつ標的配列において反対側に位置して逆方向に作用することを示す。

実施例１：Ｋ _１ の機能の原理試験
コンタミネーションの抑制効果を確認するための原理試験の設計の概要は、下記のとおりである。
１）第１段階目の増幅のＰＣＲ産物を、その１００％がコンタミネーション物であると見なして第２段階目の増幅の鋳型として使用した。配列断片Ｋ_１の、このコンタミネーション物の増幅抑制機能及び効果を確認するため、プライマー並びに第１の増幅産物及び第２の増幅産物における、Ｋ_１間の様々な長さ（Ｎ＝１、２、３、４、６ｂｐ）のミスマッチを確認した。更に、コンタミネーション抑制効果を確認するため、（i）校正活性を有するポリメラーゼ及び校正活性を有さないポリメラーゼ、並びに（ii）ホスホロチオエート結合又はＬＮＡを含むプライマー及びホスホロチオエート結合もＬＮＡも含まないプライマーを使用した。
２）コンタミネーション抑制をしない場合との比較、及びコンタミネーション抑制をしない場合のシミュレーションを行うため、完全にマッチする配列を有するＫ_１を含むプライマーを用いたＰＣＲも同時に行った。
３）１）及び２）に記載の増幅によって得られたＰＣＲ産物の量を、後に詳述するように定量及び標準化した。統計的な信頼度を確保するため、各実験について反復実験を行い、ＰＣＲ産物量の平均及び標準偏差を算出した。

第１段階目の増幅用プライマーに含まれる配列断片Ｋ_１と第２段階目の増幅用プライマーに含まれる配列断片Ｋ_１との間にミスマッチがある場合は、第２段階目の増幅によってＰＣＲ産物が得られなければ、第１段階目の増幅からのコンタミネーションが完全に抑制されたことになる。

第１段階目の増幅用プライマーに含まれる配列断片Ｋ_１と第２段階目の増幅用プライマーに含まれる配列断片Ｋ_１との間にミスマッチがある場合にＰＣＲ産物が得られたならば、第１段階目の増幅からのコンタミネーションが完全には抑制されなかったことになる。

この方法の詳細は以下のとおりである。

ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥ９７００、パーキンエルマー社製、ロートガウ、ドイツ）を用いてＰＣＲを行った。第１段階目の増幅反応の鋳型として、Ｖ−４及びＪ−２．１断片によるＴＣＲβ再構成が生じていることが知られる、Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＰｅｅｒのＤＮＡ１００ｎｇを用いた。

第１段階目の増幅に、５'末端から３'末端の方向で、配列断片ｍ_ａ−Ｋ及びｐ_ｃを含む第１段階目のプライマーを用いた（図１）。配列断片ｐ_ｃは標的特異性を有する部分であり、一方で配列断片ｍ_ａ−Ｋは、その配列全体で第２のアダプタープライマーとハイブリダイゼーションするものであり、標的特異性を有さない。第１段階目の左側プライマーは、配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含み、ここでｐ_ｃの配列（配列番号１８３；ＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣ）はＶ−４断片とマッチする配列である。第１段階目の右側プライマーは、配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃ'を含み、ここでｐ_ｃ'の配列（配列番号１８６；ＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）はＪ−２．１断片とマッチする配列である。

ここで、第１のフォワードプライマーは、そのｋ−ボックスの３'末端部分に、２個のヌクレオチドＧＧからなる配列要素ｓを含む。第１のリバースプライマーは、そのｋ'−ボックスの３'末端部分に、２個のヌクレオチドＴＡからなる配列要素ｓ'を含む。

また、第１のフォワードプライマーのｋ−ボックスは、その５'末端部分に配列要素ｍ_ａ（配列番号１８５；ＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を更に含み、第１のリバースプライマーのｋ'−ボックスは、その５'末端部分に配列要素ｍ_ａ'（配列番号１８６；ＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を含む（これら配列要素は図３で概観できる）。

表２に記載されるように、第１のフォワードプライマーに含まれる各ｋ−ボックスは、様々なｋ_１及びｋ_２配列を含み、第１のリバースプライマーに含まれる各ｋ'−ボックスも、様々なｋ_１'及びｋ_２'配列を含む。
表２：フォワードプライマーまたはリバースプライマーの５’末端から３’末端の方向で記載した、ｋ−ボックス及びｋ’−ボックスの要素の配列

第１段階目の増幅は、最終濃度３ｍＭのＭｇＣｌ_２、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１．０μＭのフォワードプライマー、１．０μＭのリバースプライマー及び１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を含む１×ＰＣＲバッファーを５０μｌ使用して行った。増幅反応条件は、１５分間９５℃とするサイクルを１サイクル行い、次いで９５℃を３０秒、６５℃を４５秒、７２℃を４５秒のサイクルを３４サイクル繰り返した後、最後に７２℃で１０分間伸長反応を行うこととした。そして、第１の増幅産物の精製を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製、ヒルデン、ドイツ）を用い、製造者によるマニュアルに従って行った。次に、ＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）１．０フルオロメーター（インビトロジェン、ダルムシュダット、ドイツ）を使用して測定した。第２段階目の増幅の鋳型として、精製した第１の増幅産物５００ｐｇを使用した。

第２の増幅には、配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマーと、配列ａ_Ｌ'−ａ_Ｐ'−ａ_Ｋ'を含む右側のアダプタープライマーと、を含むアダプターＰＣＲプライマー対を使用した。

ここで、左側のアダプタープライマーは配列要素ａ_Ｌ−ａ_Ｐ（配列番号１８７）を含み、右側のアダプタープライマーは、配列要素ａ_Ｌ'−ａ_Ｐ'（配列番号１８８）を含む。

また、フォワードアダプタープライマーに含まれるｋ−ボックスは、様々なｋ_１配列を含み、リバースアダプタープライマーに含まれるｋ'−ボックスも、様々なｋ_１'配列を含む（表２に記載）。

第２段階目の増幅中には、３'末端から５'末端の方向にエキソヌクレアーゼ活性を有する、校正活性を有するポリメラーゼによって、第２段階目の増幅用プライマーの有するＫ_１のミスマッチが、プライマーの３'末端において除去され得る。そこで、第２段階目の増幅用の左側（フォワード）プライマー及び右側（リバース）プライマーそれぞれの、３'末端から数えて（i）１番目、（ii）１番目及び２番目、並びに（iii）１番目から３番目にホスホロチオエートを配置して、その保護効果を、このホスホロチオエート結合による保護が施されていないプライマーの場合と比較することによって確認した。

第２段階目の増幅は、（i）校正活性を有するポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ―Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製、エスポー、フィンランド））、又は（ii）校正活性を有さないポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）を用いて行った。

校正活性を有するポリメラーゼを用いたＰＣＲにおいては、第２段階目の増幅反応を、最終濃度１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、各０．０５ｍＭのｄＮＴＰ、１．０μＭのフォワードプライマー、１．０μＭのリバースプライマー及び１ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ―Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ製、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を含む１×ＰｈｕｓｉｏｎＨＦバッファーを５０μｌ使用して行った。第２段階目の増幅の反応条件は、３０秒間９８℃とするサイクルを１サイクル行い、次いで９８℃を１０秒間、５８℃を３０秒間、７２℃を３０秒間のサイクルを１２サイクル繰り返した後、最後に７２℃で５分間伸長反応を行うこととした。

ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを用いたＰＣＲにおいては、第２段階目の増幅反応を、最終濃度３ｍＭのＭｇＣｌ₂、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１．０μＭのフォワードプライマー、１．０μＭのリバースプライマー及び１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含む１×ＰＣＲバッファーを５０μｌ使用して行った。第２段階目の増幅の反応条件は、１５分間９８℃とするサイクルを１サイクル行い、次いで９５℃を１５分間、５４℃を３０秒間、７２℃を３０秒間のサイクルを２３サイクル繰り返した後、最後に７２℃で５分間伸長反応を行うこととした。

ＰＣＲ産物の分析には、６％アクリルアミドゲルを使用し、バイオラッド社のＧｅｌｄｏｃ ２０００（ミュンヘン、ドイツ）を用い、初期設定条件（default condition）でＴｉｆファイルを得た。ＰＣＲ産物のバンドを、Ｆｕｓｉｏｎ−Ｃａｐｔアドバンスソフトウェア（ヴィルバー・ルーマット（Vilber Lourmat）社製、エバーハルツェル、ドイツ）を用いて定量した。ＰＣＲ産物の定量には、（i）各分析においてコンタミネーション１００％と定義される、ゲルを用いた定量用スタンダード（つまりＰｅｅｒのＰＣＲ産物、８μｌ）、（ii）ＰＣＲ産物、（iii）ネガティブコントロール（no template control、ＮＴＣ）及び（iv）バックグラウンド部分から、同じ面積のゲルを供した。各バックグラウンドバンドのゲルの中央部分に対し、Ｆｕｓｉｏｎ−Ｃａｐｔアドバンスソフトウェアのパラメータによるバックグラウンドの線形減法を行った。ここでは、「転がるボール」（rolling ball）アルゴリズムによるバックグラウンド減法（サイズ＝１１）を採用した。マイクロソフトエクセルを用いて、反復実験の平均値及び標準偏差（ＳＤＮ）を求めた。

結果
表３は、ホスホロチオエート結合の数の影響を含むＫ−ボックスのミスマッチによる、Ｋ_１によるコンタミネーション抑制に関する実験の結果を単一値で表したものである。表４は、表３の簡易統計である。上記試験において、第２段階目の増幅反応用プライマーは、０から３個のホスホロチオエート結合を含むものであった。コンタミネーション物（ＰｅｅｒのＤＮＡを鋳型として、Ｐｅｅｒに特異的な第１段階目の増幅用プライマーを用いて得たＰＣＲ産物）が１００％存在するという状況を、第１段階目の増幅で得られたＰＣＲ産物を第２段階目の増幅に供することで模擬的に作り出した。第２段階目の増幅は、マッチする第２段階目の増幅用プライマー（つまりＫ_１のミスマッチが０（ゼロ）である）、及び１ｂｐ又は２ｂｐ（フォワードプライマーのＫ_１間のミスマッチとリバースプライマーのＫ_１間のミスマッチとの合計）のミスマッチを含むＫ_１を含む２番目の増幅用プライマーを用いた。

Ｋ−ボックスがミスマッチを含むことで増幅が顕著に抑制され、ミスマッチが２塩基の場合の方が、ミスマッチが１塩基の場合よりも増幅が抑制された。この結果は、我々の技術的思想の妥当性を支持するものである（表３及び４）。
表３：３、２、１又は０個のホスホロチオエート結合を３'末端部分に含む第２段階目の増幅用プライマー及び校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合の、Ｋ_１間のミスマッチ（１ｂｐ又は２ｂｐ）の数がコンタミネーション抑制度合に与える影響。ＰＣＲ産物の量を標準化するために、ゲルを用いた定量用スタンダード（ゲル定量スタンダード）として、各ゲルに同じＰｅｅｒのＴＣＲのＰＣＲ産物を使用し、このＰＣＲ産物量を１００％とした。よって、Ｖｏｌ．％が１００％を超える場合もある。コンタミネーション抑制効果は簡易統計として表４に示される。（ＦＡ＝第１段階目の増幅、ＳＡ＝第２段階目の増幅、ＮＴＣ＝ネガティブコントロール、ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ．％＝Ｆｕｓｉｏｎ−Ｃａｐｔアドバンスソフトウェアを用いて求めた容量パーセント、ＰＴ＝ホスホロチオエート結合）
表４：表３の簡易統計（ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ.％＝容量パーセント（百分率）、ＳＤＮ＝標準偏差、ＰＴ＝ホスホロチオエート結合）。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。

表３において、全ＮＴＣの平均は９．７（標準偏差１．９）であり、バックグラウンドの平均は９．４（標準偏差２．３）であった。

表３及び４を要約すると、第２段階目の増幅において校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合、再増幅（第２段階目の増幅）に使用したｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの３'末端部分に含まれるホスホロチオエート結合によって、コンタミネーション抑制効果が高まった。更に、Ｋ_１間のミスマッチの数が多いほど、コンタミネーション抑制効果が高かった。例えば、Ｋ_１間のミスマッチが２ｂｐであり、２個のホスホロチオエート結合があった場合のコンタミネーションの値（平均１１．８、標準偏差０．９）は、ＮＴＣ又はバックグラウンドと同程度であった。

更に、Ｋ_１がより長いミスマッチを含むことでコンタミネーションが完全に抑制されることを示す実験を行った。Ｋ_１間のミスマッチの全長が２、３、４及び６ｂｐであることで、コンタミネーションがどれほど抑制されるか、ミスマッチを含まないＫ_１をコントロールとして、比較試験を行った。この試験においては、３個のホスホロチオエート結合を含む第２段階目の増幅用プライマーを用いた。結果を表５に示す。表５の結果の平均及び標準偏差を含む簡易統計は、表６に示される。
表５：３個のホスホロチオエート結合を３'末端部分に含む第２段階目の増幅用プライマー及び校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合の、Ｋ_１間のミスマッチ（全長２、３、４又は６ｂｐ）の数がコンタミネーション抑制度合に与える影響。ＰＣＲ産物の量を標準化するために、ゲルを用いた定量用スタンダード（ゲル定量スタンダード）として、各ゲルに同じＰｅｅｒのＴＣＲのＰＣＲ産物を使用し、このＰＣＲ産物量を１００％とした。よって、Ｖｏｌ．％が１００％を超える場合もある。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（ＦＡ＝第１段階目の増幅、ＳＡ＝第２段階目の増幅、ＮＴＣ＝ネガティブコントロール、ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ．％＝容量パーセント、ＰＴ＝ホスホロチオエート結合）
表６：表５の簡易統計。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ.％＝容量パーセント（百分率）、ＳＤＮ＝標準偏差）

表５において、全ＮＴＣの平均は１０．０（標準偏差３．７）であり、バックグラウンドの平均は９．１（標準偏差１．０）であった。

表５及び６を要約すると、第２の増幅において校正活性を有するポリメラーゼを使用し、第２の増幅用プライマーのｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの３'末端部分に３個のホスホロチオエート結合があり、Ｋ_１間のミスマッチが４ｂｐ（平均９．６、標準偏差１．３）及び６ｂｐ（平均９．１、標準偏差２．３）である場合、ＮＴＣ及びバックグラウンドに匹敵する値を取り、コンタミネーションが完全に抑制されていた。

また、ホスホロチオエート結合を用いず、かつ校正活性のないポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ）を用いた試験によって、Ｋ_１間のミスマッチの数（１及び２ｂｐ）がコンタミネーション抑制に及ぼす影響を確認した（表７）。表７の結果の簡易統計は表８に示される。
表７：３個のホスホロチオエート結合含まない第２段階目の増幅用プライマー及び校正活性を有さないポリメラーゼを使用した場合の、Ｋ_１間のミスマッチ（全長１又は２ｂｐ）の数がコンタミネーション抑制度合に与える影響。ＰＣＲ産物の量を標準化するために、ゲルを用いた定量用スタンダード（ゲル定量スタンダード）として、各ゲルに同じＰｅｅｒのＴＣＲのＰＣＲ産物を使用し、このＰＣＲ産物量を１００％とした。よって、Ｖｏｌ．％が１００％を超える場合もある。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（ＦＡ＝第１段階目の増幅、ＳＡ＝第２段階目の増幅、ＮＴＣ＝ネガティブコントロール、ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ．％＝容量パーセント）
表８：表７の簡易統計。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（ｂｐ＝塩基対、Ｖｏｌ.％＝容量パーセント（百分率）、ＳＤＮ＝標準偏差）

表７において、全ＮＴＣの平均は１６．９（標準偏差８．０）であり、バックグラウンドの平均は１２．２（標準偏差１．８）であった。

表７及び表８を要約すると、校正活性を有さないポリメラーゼを使用し、かつ第２の増幅用プライマーのｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの３'末端部分にホスホロチオエート結合が存在しない場合においても、Ｋ_１間のミスマッチの数が増えるほど、コンタミネーションの抑制効果は高まった。

ＴＣＲβコレクション集合を用いた場合におけるＫ _１ のコンタミネーション抑制
Ｋ_１がコンタミネーションを抑制できることを示すため、コレクション集合（ＴＣＲβコレクション集合と称する）を用いた試験を行った。ここで、このＴＣＲβコレクション集合は、ＴＣＲβのＶ断片に特異的な４４個のプライマー（ｐ_Ｃは配列番号１８９から２３２で表されるものである）と、ＴＣＲβのＪ断片に特異的な１４個のプライマー（ｐ_Ｃ'は配列番号２３３から２４６で表されるものである）とを含む。これらプライマーのそれぞれは、５'末端部分に２ヌクレオチド長の配列Ｓを含む（Ｓの配列が「ＧＧ」のものは配列番号１８９から１９３、１９５、１９７、１９８、２０１から２１１、２１３から２２１、２２３から２２９、２３１、２３３から２４１及び２４３から２４６で表され、Ｓの配列が「ＴＧ」のものは配列番号１９４、２００及び２３０で表され、Ｓの配列が「ＧＴ」のものは配列番号１９６、１９９、２１２、２２２及び２４２で表され、Ｓの配列が「ＴＴ」のものは配列番号２３２で表され、ここで、Ｓの配列は５'末端から３'末端に向かって表記されている。）。

また、このＴＣＲβコレクション集合において、第１段階目のフォワードプライマーのｋ−ボックスは、その５'末端部分に尾配列（tail sequence）要素ｍ_ａ（配列番号２４７、ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を含み、第１段階目のリバースプライマーのｋ'−ボックスは、その５'末端部分に配列要素ｍ_ａ'（配列番号２４７、ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を含む。

（i）３'末端部分に２個のホスホロチオエート結合を含む第２の増幅用プライマーを用いた試験と、（ii）３'末端から数えて２番目にＬＮＡを含む第２の増幅用プライマーを用いた試験と、を行った。表９に記載される、特有のＫ_１及びＫ_２配列を含む３個のプライマーのセット（セット１〜３）を使用した。
表９：フォワードプライマーまたはリバースプライマーの５'末端から３'末端の方向で記載した、ｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの要素の配列

１００ｎｇの扁桃由来ＤＮＡを鋳型として、上述したとおりに、第１段階目の増幅（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いた）及び第２段階目の増幅（校正活性を有するＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いた）を行った。増幅で得られたものは、前述のとおりに、Ｆｕｓｉｏｎ−Ｃａｐｔアドバンスソフトウェアを用いて定量した。

行った増幅反応（セット１〜３で可能な、全９個の、Ｋ_１のマッチ及びミスマッチの組み合わせ）及びその結果を表１０に示す。
表１０：ＴＣＲβコレクション集合を用いた場合の、Ｋ_１によるコンタミネーション抑制効果。ＰＣＲ産物の量を標準化するために、ゲルを用いた定量用スタンダード（ゲル定量スタンダード）として、各ゲルに同じＰｅｅｒのＴＣＲのＰＣＲ産物を使用し、このＰＣＲ産物量を１００％とした。よって、Ｖｏｌ．％が１００％を超える場合もある。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（ＦＡ＝第１段階目の増幅、ＳＡ＝第２段階目の増幅、Ｖｏｌ．％＝容量パーセント、ＰＴ＝ホスホロチオエート結合、ＬＮＡ＝ロックド核酸）

表１０の結果の簡易統計を表１１に示す。これらの結果から、Ｋ_１同士がマッチするものである場合にはコンタミネーション物が増幅され、Ｋ_１間にミスマッチがある場合にはコンタミネーション物は増幅されなかった（ＳＤＮを鑑みると、バックグラウンドと同等の値であった）。
表１１：表１０の簡易統計。１００付近のＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こらなかったことを意味する。小さいＶｏｌ．％の値は、コンタミネーションの抑制が起こったことを意味する。（Ｖｏｌ.％＝容量パーセント（百分率）、ＳＤＮ＝標準偏差、ＰＴ＝ホスホロチオエート結合、ＬＮＡ＝ロックド核酸）

実施例２：ｋ _２ 及びｋ _２ 'の機能の原理試験
短い配列要素として、ｋ_２は配列要素ｋ_１の３'末端に連結され、ｋ_２'は配列要素ｋ_１'の３'末端に連結される（図２、３）。Ｋ_２は、セットにおいて第１のプライマー対を特定する機能を有し、第２の（アダプター）プライマーの配列要素と相補的な配列は有さないものである。Ｋ_２の配列は、これまでの増幅反応に由来するコンタミネーション物を検出するよう設計されており、従ってＫ_１の、上述の抑制効率を制御するものである。

本実施例においては、５個のＰＣＲチューブからなるストライプＰＣＲチューブを用いて、第１段階目の増幅反応を５種の試料に対し並行して行い、第２段階目の増幅反応を、５個のＰＣＲチューブからなる他のストライプＰＣＲチューブ及び５種の相異なるプライマーのセットを用いて行った。本実施例において、「チューブ１」とは、特有のｋ_２及び／又はｋ_２'が第１段階目の増幅用プライマーに使用され、かつ第１段階目の増幅用プライマー及び第２段階目の増幅用プライマーとマッチする配列を有するｋ_１及びｋ_１'を使用したものである。ここで、「チューブ２」中の第２の増幅産物に、「チューブ１」中の増幅産物の要素ｋ_２／ｋ_２'が含まれ、かつ「チューブ２」中の第２の増幅産物の配列ｋ_１及びｋ_１'が含まれない場合、要素ｋ_２（又はｋ_２'）間のミスマッチによって、コンタミネーション物があるかないかを明確に識別することができる。この場合、コンタミネーション物は、「チューブ２」中の第２段階目の増幅用プライマーに含まれる要素ｋ_１及びｋ_１'が、「チューブ１」中の第１の増幅産物に含まれる要素ｋ_１及びｋ_１'にミスプライミングすることで生じる。また、コンタミネーション物の増幅は、校正活性を有するポリメラーゼによって「チューブ２」中の要素ｋ_１及びｋ_１'が一部又は完全に分解されることによっても生じ得る。それでも、要素ｋ_２／ｋ_２'は第１段階目の増幅用プライマーにしか存在しないため、第２の増幅産物中にコンタミネーション物があるかないかの識別が可能である。従って、要素ｋ_２／ｋ_２'は、上述のようなコンタミネーションを抑制に対するｋ_１／ｋ_１'の効果を補完する、コンタミネーション物の検出のための有用な安全鍵の機能を果たすといえる。ｋ_２／ｋ_２'は、ｋ_１／ｋ_１'に対し、ｋ_１／ｋ_１'のコンタミネーション抑制効果を１００％にする相乗効果を奏するものである。

配列断片ｋ_２／ｋ_２'の機能及び効果を実証するために、上述したＰｅｅｒのＴＣＲに特異的な、第１段階目の増幅用プライマー及び第２段階目の増幅用プライマーを用いた。ここで、第１段階目の増幅用フォワードプライマーのｋ−ボックス及びｋ'−ボックスは、表２に記載されるものである。
「チューブ１」（セット１）の第１段階目の増幅：フォワードプライマー１ｂｐＶ１及びリバースプライマー１ｂｐＪ１
「チューブ２」（セット２）の第２段階目の増幅：フォワードプライマー１ｂｐＶ２及びリバースプライマー１ｂｐＪ１

つまり、「チューブ１」の第１段階目の増幅用プライマー（ｋ_１＝Ｇ）と、「チューブ２」の第２段階目の増幅用プライマー（ｋ_１＝Ａ）との間に、１ｂｐのｋ_１間ミスマッチが存在する。また、「チューブ１」の第１段階目の増幅用プライマーは、Ｇであるｋ_２も含むものである。

「チューブ１」における第１段階目の増幅は、「チューブ２」における第２段階目の増幅にとって、「コンタミネーション物が１００％（チューブ１中の第１の増幅産物）」である、と定義されるものである。従って、第２段階目の増幅は、「チューブ２」中の第２段階目の増幅用プライマー、及び鋳型としての「チューブ１」中の第１の増幅産物を用いて行われた。ｋ_１間のミスマッチの長さがたった１ｂｐだったために、最終的に得られた第２の増幅産物のゲル分析において増幅産物が検出された。つまり、この「チューブ１」のコンタミネーションは、第２段階目の増幅（「チューブ２」の第２段階目の増幅用プライマーを用いた）において完全には抑制されなかったことを意味する。

増幅産物のサンガー法によるシーケンシングによって、増幅産物に、「チューブ１」の第１段階目の増幅用フォワードプライマーの識別子であるｋ_２（ｋ_２＝Ｇ）が含まれていたことが検出された。よって、「チューブ１」に特有のｋ_２'の配列（ｋ_２＝Ｇ）によって、「チューブ２」における第２段階目の増幅において「チューブ１」中の第１の増幅産物由来のコンタミネーション物が存在することが識別されたことになる（「チューブ２」中のｋ_２の配列は、「チューブ２」のｋ−ボックスが表２に記載する１ｂｐＶ２であることから、Ｃであるはずであった）。

このコンタミネーション検出及び防止システムをより理解するために、この第２段階目の増幅試験を、上述のＰＣＲ条件に従って、校正活性を有するポリメラーゼを使用した試験と、校正活性を有さないポリメラーゼを使用した試験とに分けて行った。そして、サンガー法によるシーケンシングの結果、どちらの試験においても、コンタミネーション発生を示すｋ_２の配列（ｋ_２＝Ｇ）が存在し、よってコンタミネーション物（「チューブ１」の試料）が存在することを識別することができた。

このシーケンシング結果から、校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合には、コンタミネーションした試料（「チューブ１」）のｋ_１の配列が検出された一方で、校正活性を有さないポリメラーゼを使用した第２段階目の増幅においては、第２段階目の増幅用プライマーのｋ_１の配列（「チューブ２」における増幅）が存在したことが確認された。これは、第１の増幅用リバースプライマーと第２の増幅用リバースプライマーとの間にｋ_１のミスマッチがあったこと、及び、第２段階目の増幅用プライマーが２個のホスホロチオエート結合を含んでいたにも関わらず、第２段階目の増幅中に、校正活性を有するポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって、第２段階目の増幅用プライマーの３'末端が除去（分解）されたことによるものである。一方で、第２段階目の増幅用プライマーの要素ｋ_１は、校正活性を有さないポリメラーゼを使用したため、除去されなかった。

従って、上記サンガー法によるシーケンシングによって、ｋ_２／ｋ_２'のコンタミネーション物検出機能が確認された。また、校正活性を有する又は有さないポリメラーゼを第２段階目の増幅に用いることができる。重要なのは、要素ｋ_２／ｋ_２'が要素ｋ_１／ｋ_１'の上記機能を評価及び制御することが可能だということである。この実施例試験において同様に重要なのは、校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合、バイオインフォマティクスに基づく方法によってシーケンシングすると想定外のｋ_１／ｋ_１'ハイブリッドを含む配列が検出され、このような配列はコンタミネーションとして除去することが可能ということである。

実施例３：Ｓの機能の原理試験
上記ｋ_１（及びｋ_１'）並びにｋ_２（及びｋ_２'）の機能を向上させるのが、短い離隔用配列を有するｓ及びｓ'である（図３、４）。ｓは第１段階目のプライマー間で不変の配列断片ｐ_Ｃと配列断片ｋ_１及びｋ_２とを離隔し、ｓ'は第１段階目のプライマー間で不変の配列断片ｐ_Ｃ'と配列断片ｋ_１'及びｋ_２'とを離隔するものである。ここで、連続する増幅反応において、ｋ_１／ｋ_１'及びｋ_２／ｋ_２'はプライマー間で異なるので、いくつかのｋ_１／ｋ_１'及びｋ_２／ｋ_２'においては、その３'末端部分が、標的配列において第１段階目のプライマーがハイブリッドを形成する領域であるｐ_Ｃ及びｐ_Ｃ'に隣接する配列と、偶然にマッチする可能性がある。従って、第１段階目のプライマー内の標的配列にマッチする断片が長くなる可能性があり、アニーリング温度の上昇や、ＰＣＲバイアスを引き起こす可能性がある。

ＳがＰＣＲバイアスを軽減することを確認する原理試験として、ｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの６ｂｐが標的配列とマッチするよう設計した第１段階目の増幅用プライマーであって、１、２及び３ｂｐの長さを有するＳを含む、及び比較例としてＳを含まない第１段階目の増幅用プライマーを用いた試験を行った。

第１段階目の増幅には、Ｔ細胞リンパ腫細胞株であるＰｅｅｒ由来のＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として使用した。増幅反応条件は、１５分間９５℃とするサイクルを１サイクル行い、次いで９５℃を３０秒、６８℃を４５秒、７２℃を４５秒のサイクルを２９サイクル繰り返した後、最後に７２℃で１０分間伸長反応を行った。

第１段階目の増幅用左側プライマーは、配列要素ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含み、ここでｐ_Ｃ（配列番号２４８；ＡＣＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣ）はＶ−４断片とマッチするものである。また、第１段階目の増幅用右側プライマーは、配列要素ｍ_ａ '−Ｋ'−ｐ_ｃ'を含み、ここでｐ_Ｃ'（配列番号２４９；ＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧ）はＪ−２．１断片とマッチするものである。また、第１段階目の増幅用左側プライマーに含まれるｋ−ボックスは、その５'末端部分に配列要素ｍ_ａ（配列番号２５０；ＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を有し、第１段階目の増幅用右側プライマーに含まれるｋ'−ボックスは、その５'末端部分に配列要素ｍ_ａ '（配列番号２５１；ＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ）を有するものとした。

Ｋ−ボックスにおける、Ｖ−４断片又はＪ−２．１断片とマッチする６ｂｐの配列、及び様々な長さを有するｓの配列を、表１２に示す。
表１２：Ｓの配列及び６塩基長を有するｋ−ボックスの配列。ｋ−ボックスの配列のいくつかは、鋳型配列とマッチするＫ−ボックスを使用する試験のために、Ｖ−４断片又はＪ−２．１断片と完全にマッチするものである。最初の列（「プライマー」の列）の記載において、最初の文字「Ｖ」及び「Ｊ」はそれぞれ、各Ｋ−ボックスが含まれるＴＣＲのＶ−４断片用プライマー及びＴＣＲのＪ−２．１断片用プライマーを意味し、「ＫＭ」はＫ−ボックスが鋳型とマッチするものであることを意味する。また、「ＫＭＭ」はＫ−ボックスが鋳型に対しミスマッチを有することを意味する。Ｓ１、Ｓ２及びＳ３は、離隔用要素Ｓの配列の長さを意味する（つまり１から３ヌクレオチド長）。
表１３：試験番号、及び、各番号の試験において、Ｓが、鋳型に対してＫ−ボックスがマッチすることを防ぐことで、プライマーのアニーリング温度が多様になること及増幅速度が多様になることを防止して、ＰＣＲバイアスを軽減することを示す原理試験。Gel-St.は、ゲル定量用スタンダードを意味し、各ゲルに同じＰｅｅｒのＴＣＲのＰＣＲ産物を使用し、このＰＣＲ産物量を１００％とした。Ｖｏｌ．％は容量パーセント（百分率）を意味する。Ｅ１からＥ５は、試験１から５（反復試験）をそれぞれ意味する。ＳＤＮは、標準偏差を意味する。第３番目の列（「プライマー」列）は、ＰＣＲに用いたプライマー対を記載するものである。また、最初の文字「Ｖ」及び「Ｊ」はそれぞれ、各Ｋ−ボックスが含まれるＴＣＲのＶ−４断片用プライマー及びＴＣＲのＪ−２．１断片用プライマーを意味し、「ＫＭ」はＫ−ボックスが鋳型とマッチするものであることを意味する。また、「ＫＭＭ」はＫ−ボックスが鋳型に対しミスマッチを有することを意味する。Ｓ１、Ｓ２及びＳ３は、離隔用要素Ｓの配列の長さを意味する（つまり１から３ヌクレオチド長）。

表１３は、Ｓの有する配列によって、偶然に標的とマッチするｋ−ボックス及びｋ'−ボックスの配列の存在に関わらず、似た増幅を引き起こすことを示すものである。つまり、例えば表１３の６行目に記載の、３ｂｐの長さの配列を有するＳ並びに標的とマッチする配列を有するｋ−ボックス及びｋ'−ボックスを使用した増幅の値（Ｖｏｌ．％）の平均は１８．４（標準偏差４．５）であったが、これは、同表の３行目に記載の、標的とマッチする配列を有さないｋ−ボックス及びｋ'−ボックスを使用した増幅の値の平均１７．６（標準偏差５．１）に匹敵するものである。

よって、この実施例は、Ｋ−ボックスの配列が鋳型と偶然にマッチしアニーリング温度が変化する場合であっても、Ｓが相乗効果的にＰＣＲバイアスを軽減することを確認した原理試験であるといえる。

実施例４：ＴＣＲβコレクション集合及びＮＧＳ分析における、Ｋ _１ によるコンタミネーション抑制及びＫ _２ によるコンタミネーション検出
Ｋ_１によるコンタミネーション抑制効果及びＫ_２によるコンタミネーション物検出効果を分析するため、前述のとおりこれら効果に関連する配列を有するＳを含む、ＴＣＲβコレクション集合（配列番号１８９から２４６）を用いた試験を行った。セット１から３に使用した要素Ｋ_１及びＫ_２は、表９に記載したものである。

表１４に記載される２種類の分析を２連（duplicate）で行った。これらの分析試験においては、扁桃由来ＤＮＡ及び２種類のＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ及びＫａｒｐａｓ２９９）由来のＤＮＡを、第１段階目の増幅の鋳型として使用した。第２段階目の増幅の鋳型としては、第１の増幅における増幅産物の混合物として、精製した５００ｐｇの第１の増幅産物を使用した。

２連のうちの１つ（試料１及び２、表１４）においては、第２段階目の増幅の鋳型として使用した第１の増幅産物混合物は、５０％の扁桃ＤＮＡ増幅産物（セット１）、２５％のＪｕｒｋａｔＤＮＡ増幅産物（セット１）、及び２５％のＫａｒｐａｓ２９９ＤＮＡ増幅産物（セット１）を含んでいた。第２段階目の増幅用プライマーは、セット１のものを用いた。

２連のうちのもう１つ（試料３及び４、表１４）においては、第２段階目の増幅の鋳型として使用した第１の増幅産物混合物は、５０％の扁桃ＤＮＡ増幅産物（セット１）、２５％のＪｕｒｋａｒＤＮＡ増幅産物（セット２）、及び２５％のＫａｒｐａｓ２９９ＤＮＡ増幅産物（セット３）を含んでいた。第２段階目の増幅用プライマーは、セット１のものを用いた。

つまり、２連のうち一方においては、ＴＣＲはコンタミネーション抑制なし、かつスパイクした２種類のコンタミネーション物（ＪｕｒｋａｔのＴＣＲ及びＫａｒｐａｓ２９９のＴＣＲ）の存在下で増幅を行い、２連のうちのもう一方においては、ＴＣＲは、コンタミネーションを抑制したうえで、スパイクした同じ２種類のコンタミネーション物（ＪｕｒｋａｔのＴＣＲ及びＫａｒｐａｓ２９９のＴＣＲ）の存在下で増幅を行った。
表１４：ＴＣＲβコレクション集合及びＮＧＳ解析を用いた場合の、Ｋ_１によるコンタミネーション抑制、及びにＫ_２による検出を分析するための試験設計。ＮＧＳ多重解析を可能にするために、４個の試料のそれぞれには、第２段階目の増幅用プライマーによって、イルミナの相異なるバーコードが増幅産物に導入された。

ＭＩＳＥＱ（イルミナ社製）のペアエンドモジュール（paired end modulus）（２×１５０ｂｐ）によって、得られた４個のＮＧＳライブラリのシーケンシングを行った。目的に応じて設計したバイオインフォマティクスのアルゴリズムを用いて、使用したＫ−ボックスの要素及び鋳型に着目して、読み取った配列に対しクラスタリング及び分類を行った。扁桃及び各細胞株、並びに各プライマー（セット１から３）に由来する読み取り配列の出現頻度を計算し、表にまとめた（表１５）。

表１５に示されるように、コンタミネーションを抑制しない場合（試料１及び２）、２種類の細胞株由来のコンタミネーションが、想定どおりである約２５％の百分率で検出された。一方で、驚くべきことに、Ｋ_１によるコンタミネーション抑制を行った試料３及び４においては、２種類の細胞株由来のコンタミネーションは、完全に抑制されたか（細胞株１）、又は０．０１％にまで抑制された（細胞株２）。細胞株２において残存したコンタミネーションは、Ｋ_２によって検出することができたものである。
表１５：表１４に記載のコンタミネーション抑制分析における、ＮＧＳの結果。セットに関する情報は、上記のように３連で記載した（扁桃／細胞株１／細胞株２）。

ｋ _１ ／ｋ _１ '及びｋ _２ ／ｋ _２ 'の好適な配列の設計
ｋ_１及びｋ_１'の配列の好適な例を示す。それら好適な配列は、（ａ）後述の表１６から１９のいずれかに記載される全てのｋ_１及びｋ_１'の配列間でクロスハイブリダイゼーションしないように、（ｂ）ｋ_１及びｋ_１'の配列のアニーリング温度幅を小さくするように、及び（ｃ）塩基の多様性が低くならないように全塩基の３分の２超の塩基が同じヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）にならないように、設計された。

表１６から１９はそれぞれ、フォワードプライマー及びリバースプライマーの、ある特定の同じ長さ（４、５、６、７又は８ヌクレオチド長）を有するｋ_１及びｋ_１'を列挙している。

詳述すると、上述の特徴（ａ）から（ｃ）は、特定の長さ（４、５、６、７又は８ｂｐ）を有するｋ_１及びｋ_１'が有し得る全ての配列を互いに比較し、これら特定の長さを有するｋ_１及びｋ_１'のある配列に対する逆相補配列を除くことによって得られたものである。更に好適なｋ_１及びｋ_１'の配列を得るために、設計用アルゴリズムを用いて、ある長さ（４、５、６、７又は８ｂｐ）を有するｋ_１及びｋ_１'が取り得る全ての配列と、それら配列に対する逆相補配列であり、かつ同じ長さを有するｋ_１及びｋ_１'の全ての配列と、を比較して、３'末端部分において他のｋ_１若しくはｋ_１'の配列と共通する塩基を２個を超える個数有するもの、又は、他のｋ_１若しくはｋ_１'の配列と共通する塩基を配列全体の６０％超含むものを除いた。

このように最終的に得られたｋ_１及びｋ_１'の好適配列が、表１６から１９に記載されている。ここで、これらの好適配列は例であって、他のクライテリアに従って選択された好適配列を有するＫ_１−ボックスを用いてもよい。

また、好適なｋ_２／ｋ_２'の配列例も列挙する（表２０）。これらの配列は、ｋ_２／ｋ_２'の配列集合から、互いに逆相補配列である全ての配列を除くことで得た。例えば要素ｋ_２の配列がＡＴＣである場合、ｋ_２'の配列集合から、ＧＡＴは自動的に除かれる。

また、プライマーの設計は、使用するプライマーの３'末端部分におけるクロスハイブリダイゼーションを出来るだけ起こさないように、Ｋ−ボックス全体をまとめて行う。
表１６：最適化された、４塩基長のｋ_１の配列及びｋ_１'の配列。例えば、「プライマー位置」で「Ａ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ｂ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能である。また、「Ｂ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ａ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能でもある。
表１７：最適化された、５塩基長のｋ_１の配列及びｋ_１'の配列。例えば、「プライマー位置」で「Ａ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ｂ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能である。また、「Ｂ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ａ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能でもある。
表１８：最適化された、６塩基長のｋ_１の配列及びｋ_１'の配列。例えば、「プライマー位置」で「Ａ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ｂ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能である。また、「Ｂ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ａ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能でもある。
表１９：最適化された７又は８塩基長のｋ_１の配列及びｋ_１'の配列。例えば、「Ａ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ｂ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能である。また、「Ｂ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ａ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能でもある。
表２０：３塩基長のｋ_２の配列及びｋ_２'の配列。例えば、「Ａ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ｂ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能である。また、「Ｂ」と記されたものは右側のプライマーに使用可能であり、「Ａ」と記されたものは左側のプライマーに使用可能でもある。

Claims (15)

1. 配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’を増幅するための、複数の増幅反応を含む方法であって、
   前記増幅反応の各々は、
   i． 配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む、左側の（フォワード）第１段階目のプライマーと、
   ii． 配列ｍ_ａ’−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む、右側の（リバース）第１段階目のプライマーと、
   を用いて前記標的核酸配列を増幅して、第１の増幅産物を生成する第１段階目の増幅反
   応、及び
   iii． 配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む、左側の（フォワード）アダプタープライマーと、
   iv． 配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む、右側の（リバース）アダプタープライマーと、
   を用いて前記第１の増幅産物を増幅して、第２の増幅産物を生成する第２段階目の増幅反応を含み、
   ここで、
   ｔ_Ｖは、前記標的核酸配列における可変領域であり、
   ｐ_ｃは配列要素ｔ_Ｃと同一の配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
   Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
   ここで、
   ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
   ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同一の配列であり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同一の配列であり、
   ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ’−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
   ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ’−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
   ここで、
   前記複数の増幅反応の各々には、特有のプライマーのセットを用い、該プライマーのセットの各々において、
   ｋ_１は、他のプライマーセットのｋ_１と異なるものである、
   及び／又は
   ｋ_１’は、他のプライマーセットのｋ_１’と異なるものであり、
   ａ_Ｐ配列とｍ_ａ配列が同一であり、及びａ_ｐ’配列とｍ_ａ’配列が同一であり、
   第１段階目の増幅反応に使用するプライマーと、第２段階目の増幅反応に使用するプライマーの間で、ｋ_１は、他のプライマーセットのｋ_１と異なるものである場合、及び／又はｋ_１’は、他のプライマーセットのｋ_１’と異なるものである場合、第２の増幅産物の生成が抑制される。
2. Ｋは３’末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ_１’−ｋ_２’−ｓ’を含み、
   ここで、ｋ_２の長さ及びｋ_２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
   前記プライマーのセットの各々の間で、ｋ_２及びｋ_２’はそれぞれ、他のｋ_２及びｋ_２’とは異なるものである、及び
   ｋ_１、ｋ_１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記プライマーのセットは、
   配列番号００１から０４５から選択されるｐｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０４６から０５８から選択されるｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号１８９から２３２から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号２３３から２４６から選択されるｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号０５９から０８５から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０８６から１１７から選択されるｍ_ａ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号１１８から１４９から選択されるａ_Ｌ−ａ_Ｐを含む左側（フォワード）アダプタープライマーと、配列番号１５０から１８２から選択されるａ _Ｌ ’−ａ _Ｐ ’を含む右側（リバース）アダプタープライマーを含む、
   請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記第１段階目の増幅及び／又は前記第２段階目の増幅において、３’末端から５’末端方向のエキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’をシーケンシングする方法であって、
   ａ）請求項１、３又は４のいずれか１項に記載の方法を用いて前記標的核酸配列を増幅する工程、及び
   ｂ）配列要素ｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ’−Ｋ’を含む前記第２の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列のセットを生成する工程
   を含む、方法。
6. 更に、
   ｃ） 前記配列のセットに含まれる各配列を、第１段階目のプライマーに含まれるｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ’−Ｋ’とアライメントする工程、及び
   ｄ） コンタミネーションの指標として、前記配列のセットに含まれる各配列に対し０又は１の値を割り当てる工程であって、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）がｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ’−Ｋ’と完全にアライメントした場合は値０を割り当て、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）とｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ’−Ｋ’とのアライメントが不完全だった場合は値１を割り当てる工程
   を含み、
   ここで、
   （i）工程ｄ）で割り当てた値を全て加算し、読み取った全配列数で前記加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び／又は
   （ii）前記配列のセットから、値１を割り当てた配列を削除する、
   請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するためのプライマーのセットのコレクションであって、
   前記プライマーのセットの各々において、
   i．配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍ_ａ’−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
   ii．配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
   を含み、
   ここで、
   ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対し相補的な配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
   Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
   ここで、
   ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
   ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同じあり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同じであり、
   ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ’−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
   ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ’−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
   ここで、
   前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、全てのｐ_ｃは同じ配列を有し、かつ全てのｐ_ｃ’は同じ配列を有し、
   前記プライマーのセットの各々において、
   ｋ_１は、他のプライマーのセットのｋ_１と異なるものである、及び／又は
   ｋ_１’は、他のプライマーのセットのｋ_１’と異なるものである、
   プライマーのセットのコレクション。
8. 前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐ_ｃは配列番号００１から０４５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐ_ｃ’は配列番号０４６から０５８から選択され、及び／又は
   前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐ_ｃは配列番号１８９から２３２から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐ_ｃ’は配列番号２３３から２４６から選択され、及び／又は
   前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｍ_ａは配列番号０５９から０８５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｍ_ａ’は配列番号０８６から１１７から選択され、及び／又は
   前記左側（フォワード）アダプタープライマーであるａ_Ｌ−ａ_Ｐは配列番号１１８から１４９から選択され、かつ前記右側（リバース）アダプタープライマーであるａ _Ｌ ’−ａ _Ｐ ’は配列番号１５０から１８２から選択される、
   請求項７に記載のプライマーのセットのコレクション。
9. Ｋは３’末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ_１’−ｋ_２’−ｓ’を含み、
   ここで、ｋ_２の長さ及びｋ_２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものであり、
   前記プライマーのセットの各々において、
   ｋ_２は、他のプライマーのセットのｋ_２と異なるものである、及び／又は
   ｋ_２’は、他のプライマーのセットのｋ_２’と異なるものであって、
   ｋ_１、ｋ_１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
   請求項８に記載のセットのコレクション。
10. ４、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、１６０、２００、２５６又は１０２４個の相異なるプライマーのセットを含む、
    請求項７〜９のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
11. ｋ_１及びｋ_１’並びに／又はｋ_２及びｋ_２’は、ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とはハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
    配列要素ａ_Ｐの配列は全て同じであり、配列要素ａ_Ｐ’の配列は全て同じである、及び／又は
    ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
    請求項７〜１０のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
12. 請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを複数含む、コレクション集合であって、前記コレクションの各々は、相異なるｐ_ｃ及びｐ_ｃ’の組み合わせによって特徴付けられる、コレクション集合。
13. 各ｐ_ｃは、配列番号００１から０４５から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃの配列は配列番号００１から０４５から選択される配列であり、かつ、各ｐ_ｃ’は配列番号０４６から０５８から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃ’の配列は配列番号０４６から０５８から選択される配列である、又は、
    各ｐ_ｃは、配列番号１８９から２３２から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃの配列は配列番号１８９から２３２から選択される配列であり、かつ、各ｐ_ｃ’は配列番号２３３から２４６から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃ’の配列は配列番号２３３から２４６から選択される配列である、
    請求項１２に記載のコレクション集合。
14. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するための、複数のプライマーのセットのコレクションであって、ここでプライマーのセットの各々は、
    i．配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍ_ａ’−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
    ii．配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
    を含み、
    ここで、
    ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対し相補的な配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
    Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
    ここで、
    ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
    ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
    ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同じあり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同じであり、
    ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ’−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
    ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ’−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
    ここで、
    前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、配列要素Ｋ及びＫ’は全て同じであり、
    前記プライマーのセットの各々において、
    ｐ_ｃは他のプライマーのセットのｐ_ｃと異なる、及び／又は
    ｐ_ｃ’は他のプライマーのセットのｐ_ｃ’と異なる、
    複数のプライマーのセットのコレクション。
15. 患者のＴ細胞受容体β鎖のレパトアをｅｘ ｖｉｖｏで分析する方法であって、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法、又は請求項７〜１４のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを使用する、方法。