MXPA02003318A - Prueba de combinacion antigeno-anticuerpo para hepatitis c para una deteccion temprana de la infeccion. - Google Patents

Abstract

Un metodo para determinar la presencia de HCV en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con antigenos de HCV y anticuerpos nucleo anti-HCV unidos a una fase solida, anadir un eter de polioxietileno a dicha muestra, detectar antigenos capturados y anticuerpos al agregar anti IgG de humano marcada y anticuerpos nucleo anti-HCV marcados y detectar la senal como una indicacion de la presencia de la infeccion por HCV.

Description

PRUEBA DE COMBINACION ANTIGENO-ANTICtlERPO PARA HgPATITIS C PARA UNA DETECCION TEMPRANA DE LA INFECCION ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un estimado de 170 millones de personas en el mundo se han infectado por el virus de la hepatitis C (HCV). En los próximos años, el número de muertes en los Estados Unidos por enfermedades del hígado provocadas por HCV y cáncer pueden superar las muertes provocadas por el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Parece que la transmisión del HCV requiere contacto sangre con sangre. Al portar una sola cadena de ácido ribonucleico (ARN), el HCV que contiene un sólo gen, codifica para una poliproteína que se procesa subsecuentemente en al menos 10 proteínas funcionales. Claramente, la capacidad de analizar el suministro de sangre para HCV es de gran importancia. Además, mientas más rápido se pueda detectar la etapa de HCV, mejor. Por lo tanto, se ha desarrollado una prueba a base de ELISA para la detección de la infección por HCV. Esta nueva prueba puede detectar una infección por HCV de manera más temprana que las pruebas en la actualidad utilizadas para la selección de sangre para la infección por HCV. Las pruebas de la actualidad se basan en la detección de anticuerpos anti-HCV en sangre infectada al capturar estos anticuerpos mediante las ^secuencias de proteína de HCV representadas por las proteínas recombinantes o péptidos. Por ejemplo, ELISA Ortho HCV 3.0 utiliza antígenos múltiples para detectar anticuerpos anti-HCV de manera temprana en la seroconversión. Sin embargo, existe un período de ventana importante en individuos virémicos antes de que desarrollen los anticuerpos anti-HCV. Este período de ventana puede ser de 60 días. Durante este período el individuo, aunque muy infeccioso, pasará inadvertido por las pruebas de selección de HCV actuales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objeto de la invención es proveer una prueba de diagnóstico que pueda detectar la infección por HCV durante el período de ventana descrito anteriormente al capturar tanto el antígeno núcleo de HCV como anticuerpos. Se ha descrito en la presente un método para detectar una infección por HCV de manera más temprana que las pruebas de anticuerpos utilizadas en la actualidad. Esto se ha logrado al proveer una prueba que detecta el antígeno núcleo de HCV junto con los anticuerpos anti-HCV. Otro objeto de la invención es provee un método para determinar la presencia de HCV en una muestra, que comprende, poner en contacto la muestra con antígenos de HCV y anticuerpos núcleo anti-HCV unidos a una fase sólida, añadir un éter de polioxietilo a dicha muestra, detectar antígenos capturados y anticuerpos al añadir anti IgG de humano marcada y anticuerpos núcleo anti-HCV marcados y detectar la señal como una indicación de la presencia de la infección por HCV. Otro objeto de la invención es proveer ciertos detergentes que se necesitan para liberar el antígeno núcleo de HCV a partir del virus al romper la proteína de cubierta y/o la capa de lípido.

DESCRIPCION DETALLA DE LA INVENCION Se prefiere en una prueba de combinación para los detergentes, liberar el antígeno núcleo del virus y no tener un impacto negativo en la capacidad de las proteínas recombinantes de HCV para capturar anticuerpos anti-HCV. En una modalidad preferida de la invención, los detergentes a partir de la clase de éteres de polioxietileno se utilizan para este propósito. Los detergentes comúnmente disponibles en esta clase son: BRIJ 30, BRIJ 35, 56, 58, 92, 96, 98, 700 y MYRJ 52, 59, 53, 45. Estos detergentes ayudan a liberar el antígeno núcleo de HCV del virus sin embargo la presencia de estos detergentes no impactan de manera negativa la prueba anti-HCV. Ciertos detergentes pueden efectuar la detección del anticuerpo al afectar los antígenos recombinantes revestidos en la fase sólida o al inactivar los anticuerpos anti-HCV en la muestra. Algunos de los detergentes como N-lauril sarcosina utilizados en la detección de la prueba núcleo de HCV destruyen la capacidad de las proteínas eeombinantes de HCV c22-3, c200 y NS5 para detectar anticuerpos anti-HCV en ELISA Ortho HCV 3.0. Como se utiliza en la presente, una "muestra", se refiere a cualquier sustancia que pueda contener el analito de interés. Una muestra puede ser fluido biológico, tal como toda la sangre o los componentes de la sangre incluyendo las células de eritrocitos, células de leucocitos, plaquetas, suero y plasma, ascitis, orina, fluido cerebroespinal, y otros constituyentes del cuerpo que pueden contener el analito de interés.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos demuestran las ventajas y utilidad de la invención al describir una lista de detergentes evaluados y los resultados obtenidos al utilizar la prueba antes descrita. Los expertos en la técnica reconocerán que la detección del anticuerpo de HCV y el antígeno puede realizarse de manera separada o simultánea. Estos ejemplos ilustran pero no limitan el espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Una prueba de combinación de antíqeno-anticuerpo Los antígenos de HCV c200-3, NS-5 y un antígeno núcleo modificado C22KSÑ 47, 48 o C22KSR47L junto con dos anticuerpos monoclonales anti-núcleo (monoclonales anti-núcleo de murino Pep10, 12) se revistieron en micropozos en amortiguador de fosfato. Los antígenos se modificaron al modificar las clonas de ADN que codifican para las proteínas c22-3 recombinantes que contienen la secuencia de HCV1. Estos procedimientos implican una mutagénesis sitio-dirigida utilizando oligonucleótidos sintéticos (Sambrook, Fritsh and Maniatis ¡n Molecular ' Cloning, A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, Chapter 15, 1989). Después de una incubación durante la noche, el amortiguador que contiene las proteínas de revestimiento se removió y los micropozos se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato que contiene un detergente Tween 20. Los micropozos revestidos con antígeno/anticuerpo entonces se trataron con una solución de BSA/sacarosa para bloquear todos los sitios de unión a proteína en los micropozos. Después de 2-24 horas, la solución de BSA/sacarosa se removió y los micropozos se secaron con aire y se almacenaron bajo un desecante.

EJEMPLO 2 100 mi de la muestra a analizar se diluyeron en 100 mi de solución de PBS que contenía albúmina de suero de bovino, dismutasa de superóxido, extracto de levadura y 1 % de Brij 58 o Brij 35 o una mezcla de ambos. Los especímenes diluidos se pipetearon en micropozos revestidos con anticuerpos monoclonales/de antígeno de HCV (como se describió en el ejemplo 1 ). Estos micropozos se incubaron a 37°C durante 90 minutos. Los micropozos se lavaron 5 veces con PBS que contiene 0.5% de Tween 20. Una solución de 200 mi de anti IgG de humano de murino marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y anticuerpo monoclonal núcleo anti-HCV (Anti Pep4) marcado con HRP se añadieron. Después de una incubación de 30 minutos, los micropozos se lavaron 5 veces con PBS Tween 20. Una solución de ortofenilend ¡amina y peróxido de hidrógeno se añadió a cada pozo. Después de la incubación en la obscuridad durante 30 minutos, la reacción se detuvo al añadir 50 microlitros de ácido sulfúrico al 4N. Las placas se leyeron a 495 nM. Un color naranja en cualquier pozo indica que el espécimen que se analiza está infectado con HCV.

EJEMPLO 3 Efectos de los éteres de polioxietileno en anticuerpos de HCV o pruebas de antígeno.

El efecto de la adición de varios éteres de polioxietileno en la prueba anti-HCV HCV 3.0 o en la prueba ELISA de antígeno núcleo de HCV se muestra abajo en los cuadros 1A y 1 B. En la prueba ELISA de antígeno núcleo de HCV la N-lauril sarcosina de la utilizada en el antígeno núcleo de HCV comercial se reemplazó mediante diferentes concentraciones de detergentes en la columna uno. En la prueba anti-HCV HCV 3.0 se añadieron los detergentes al diluyente del espécimen utilizado en la prueba de HCV 3.0.

CUADRO 1A ELISA HCV 3.0 AD Matriz base Reactivo de anticuerpo de Detergente analizado HCV 0.25% 0.125% 0.06% 0.25% 0.125% 0.06% SYN. 0.125% 0.06% 0.03% 0.125% 0.06% 0.03% éter oleílico de polioxietileno 2 Brij 92 0.056 0.035 0.041 1.543 1.432 1.405 estearato de polioxietileno 8 Myrj 45 0.019 0.024 0.025 1.208 1.286 1.313 éter laurílico de polioxietileno 5 0.033 0.046 0.058 1.168 1.274 1.351 estearato de polioxietileno 50 yrj 53 0.044 0.069 0.083 1.368 1.361 1.262 éter laurílico de polioxietileno 8 0.064 0.070 0.059 1.223 1.219 1.277 éter laurílico de polioxietileno 9 0.057 0.055 0.061 1.312 1.260 1.225 éter laurílico de polioxietileno 10 0.049 0.059 0.064 1.192 1.069 1.161 éter cetílico de polioxietileno 10 Brij 56 0.053 0.093 0.059 0.994 1.212 1.209 éter oleílico de polioxietileno 10 Brij 97 0.031 0.056 0.072 1.316 1.341 1.534 estearato de polioxietileno 100 Myrj 59 0.047 0.050 0.045 1.751 1.615 1.418 éter cetílico de polioxietileno 20 Brij 58 0.058 0.046 0.062 1.568 1.507 1.488 estearato de polioxietileno 40 Myrj 52 0.048 0.063 0.067 1.502 1.308 1.194 éter estearíllco de polioxietileno 100 Myrj 700 0.043 0.045 0.052 1.600 1.482 1.503 éter oleílico de polioxietileno 20 Brij 98 0.053 0.044 0.050 1.632 1.542 1.493 éter laurílico de polioxietileno 23 Brij 35 0.067 0.055 0.065 1.492 1.415 1.473 éter laurílico de polioxietileno 7 0.065 0.105 0.100 1.151 1.458 1.497 éter laurílico de polioxietileno 4 Brij 30 0.093 0.058 0.185 0.867 1.135 1.190 éter laurílico de polioxietileno 3 0.035 0.042 0.075 0.995 0.927 1.156 Pluronic F-127 0.025 0.030 0.035 1.521 1.327 1.271 Control 0.075 1.358 (3.0 SD) (3.0 SD) CUADRO 1AB ELISA HCV 3.0 Ab Matriz base Reactivo de anticuerpo de Detergente analizado HCV 0.25% 0.125% 0.06% 0.25% 0.125% 0.06% SYN. 0.125% 0.06% 0.03% 0.125% 0.06% 0.03% éter oleílico de polioxietileno 2 Brij 92 0.010 0.010 0.032 0.609 0.847 0.502 Estearato de polioxietileno 8 Myrj 45 0.028 0.021 0.022 0.880 0.509 0.433 éter laurílico de polioxietileno 5 0.002 0.004 0.007 0.195 0.243 0.265 Estearato de polioxietileno 50 Myrj 53 0.014 0.040 0.006 0.573 0.536 0.659 éter laurílico de polioxietileno 8 0.009 0.010 0.014 0.326 0.364 0.343 éter laurílico de polioxietileno 9 0.008 0.008 0.005 0.360 0.379 0.212 éter laurílico de polioxietileno 10 0.010 0.013 0.020 0.495 0.556 0.344 éter cetilico de polioxietileno 10 Brij 56 0.004 0.001 0.016 0.445 0.298 0.390 éter oleílico de polioxietileno 10 Brij 97 0.004 0.006 0.021 0.371 0.419 0.479 Estearato de polioxietileno 100 Myrj 59 0.019 0.021 0.023 0.429 0.320 0.369 éter cetilico de polioxietileno 20 Brij 58 0.008 0.011 0.028 0.546 0.898 0.564 Estearato de polioxietileno 40 Myrj 52 0.009 0.005 0.006 0.579 0.412 0.661 éter estearílico de polioxietileno 100 Myrj 700 0.016 0.023 0.019 0.294 0.307 0.319 éter oleílico de polioxietileno 20 Brij 98 0.008 0.011 0.032 0.557 0.718 0.539 éter laurílico de polioxietileno 23 Brij 35 0.022 0.028 0.029 0.722 0.494 0.309 éter laurílico de polioxietileno 7 0.009 0.009 0.016 0.228 0.289 0.309 éter laurílico de polioxietileno 4 Brij 30 -0.001 0.001 0.008 0.194 0.158 0.212 éter laurílico de polioxietileno 3 0.004 0.005 0.013 0.106 0.168 0. 62 Pluronic F-127 0.013 0.013 0.012 0.324 0.285 0.268 Control 0.001 1.109 (nUs) (nLe) EJEMPLO 4 Detección del antígeno núcleo HCV v/o anticuerpos anti-HCV Detección del antígeno de HCV o anticuerpo anti-HCV en placas revestidas con anticuerpos c11-3 y c11-7 monoclonales anti-núcleo y antígenos c200-3, NS5 de HCV y un antígeno núcleo modificado. (Proteína fusionada con SOD que contiene secuencias núcleo Aa10-99 con Aa 47 y 48 (C22KS (V47-48). Los especímenes utilizados fueron 4 sangrados consecutivos a partir de un panel de seroconversión comercialmente disponible. El antígeno núcleo se detectó utilizando anticuerpo monoclonal c11-4 marcado con HRP, se detectaron anticuerpos anti-HCV mediante anti IgG de humano marcada con HRP. Al utilizar los dos anticuerpos juntos, se produjo una señal cumulativa, como se muestra en la columna combo marcada en el cuadro 2. .i...í 1 CUADRO 2 * la señal obtenida al utilizar las muestras negativas de HCV EJEMPLO 5 Detección del antígeno núcleo de HCV v/o anticuerpos anti-HCV Detección del antígeno núcleo de HCV y/o anticuerpos anti-HCV en placas revestidas con anticuerpos c11 -3 y c11 -7 monoclonales anti-núcleos y antígenos c200-3, NS5 de HCV y un antígeno núcleo modificado. (Proteína fusionada con SOD que contiene secuencias núcleo aa10-99 con arginina en posición 47 reemplazada con leucina (c22KS (R47L)). Los especímenes utilizados fueron 4 sangrados consecutivos a partir de un panel de seroconversión comercialmente disponible. El antígeno núcleo se detectó utilizando anticuerpo monoclonal c11-4 marcado con HRP, anticuerpos anti-HCV se detectaron mediante anti IgG de humano marcada con HRP. En la prueba combo los dos anticuerpos detectados, anticuerpo monoclonal antinúcleo y anticuerpo monoclonal anti IgG de humano marcada con HRP se utilizaron como una mezcla.

CUADRO 3 EJEMPLO 6 Comparación anti-lgG Una comparación de la reactividad anti-HCV del panel de seroconversion en micropozos revestidos con dos proteínas núcleo de HCV diferentes se muestra en el cuadro 4.

CUADRO 4 EJEMPLO 7 La comparación de la detección del antígeno núcleo del panel de seroconversión en micropozos revestidos con dos antígenos núcleo diferentes se muestra en el cuadro 5.

CUADRO 5 Comparación del núcleo anti-HCV MUESTRA SOD/C22KS (?47-48) SOD/C22KS (R47L) NEG MEAN 0.036 0.047 BCP 6215 1 0. 35 0.224 BCP 62152 0.157 0.189 BCP 6215 3 0.231 0.304 BCP 62 54 0.197 0.189 EJEMPLO 8 La comparación de la reactividad de combo del panel de seroconversión en micropozos revestidos con dos antígenos núcleo diferentes se muestra en el cuadro 6.

CUADRO 6 Comparación del combo de HCV MUESTRA SOD/C22KS (?47-48) SOD/C22KS (R47L) NEG MEAN 0.094 0.144 BCP 6215 1 0.193 0.247 BCP 6215 2 • 0.191 0.226 BCP 6215 3 0.270 0.328 BCP 6215 4 0.614 0.658

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar la presencia de HCV en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con antígenos de HCV y anticuerpos núcleo anti-HCV unidos a una fase sólida, añadir un éter de polioxietileno a dicha muestra, detectar antígenos capturados y anticuerpos al agregar anti IgG de humano marcada y anticuerpos núcleo anti-HCV marcados y detectar la señal como una indicación de la presencia de la infección por HCV.