KR100844169B1 - Ｈｃｖ 감염 초기 진단을 위한 ｃ형 간염 항원-항체 조합분석 - Google Patents

Ｈｃｖ 감염 초기 진단을 위한 ｃ형 간염 항원-항체 조합분석 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플을 HCV 항원 및 고체상에 결합된 항-HCV 코어 항체와 접촉시키는 단계, 상기 샘플에 폴리옥시에틸렌 에테르를 가하는 단계, 표지된 항-휴먼 IgG 및 표지된 항-HCV 코어 항체를 가하여 포획된 항원 및 항체를 검출하는 단계 및 HCV 감염 지시로서의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 HCV의 존재를 측정하는 방법에 관한다.
Ｃ형 간염

Description

ＨＣＶ 감염 초기 진단을 위한 Ｃ형 간염 항원-항체 조합 분석{A Hepatitis C Antigen-Antibody Combination Assay for the Early Detection of HCV Infection}
전세계적으로 1억 7천만으로 추정되는 사람들이 C형 간염 바이러스(HCV)에 감염되어 있다. 몇년안에, HCV-원인의 간질환 및 암으로 인한 미국인 사망 통계가 후천성면역결핍증(AIDS)으로 인한 사망을 넘어설 수 있을 것이다.
HCV는 혈액 접촉으로 감염되는 것으로 사료되어진다. 단일 가닥의 리보핵산(RNA)을 함유하면서, HCV는 차후 10개 이상의 관능 단백질로 스플라이싱되는 폴리단백질을 코드하는 하나의 유전자만을 함유한다. 공급된 혈액에 대하여 HCV 테스트를 할 수 있는 것은 매우 중요하다. 또한, HCV의 검출이 초기 단계일수록 더 바람직하다.
따라서, 우리는 HCV 감염 검출을 위한 ELISA 기재 분석방법을 개발하였다. 이 신규한 분석방법은 최근 사용되는 HCV 감염에 대하여 혈액을 스크리닝하는 분석방법 보다 더욱 초기에 HCV 감염 검출을 할 수 있다. 최근 분석방법은 재조합 단백질 또는 펩티드로 나타낸 HCV 단백질 서열에 의해 상기 항체를 포획함으로써 감염된 혈액내 항-HCV 항체의 검출에 기초한다.
예를들어, Ortho HCV 3.0 ELISA는 복수 항원을 사용하여 혈청전환에 있어 매우 초기의 항-HCV 항체를 검출한다. 그러나, 바이러스 혈증의 사람이 항-HCV 항체를 발달시키기 전의 항체미형성 기간이 상당히 길다. 이러한 항체미형성 기간은 60일이나 될 수 있다. 이 기간 중, 매우 감염되어 있음에도 불구하고 개인은 현재 HCV 스크리닝 분석에 의하여는 검출되지 않을 것이다.
본 발명의 목적은 HCV 코어 항원 및 항체 모두를 포획하여 상기한 항체미형성 기간 동안 HCV 감염을 검출할 수 있는 진단 테스트 방법을 제공하는 것이다. 우리는 본원에서 현재 사용되는 항체 분석방법 보다 초기에 HCV 감염을 검출하는 방법을 기술한다. 이것은 항-HCV 항체 외에 HCV 코어 항원을 검출하는 테스트 방법을 제공함으로써 달성하였다.
본 발명의 또다른 목적은 샘플을 HCV 항원 및 고체상에 결합된 항-HCV 코어 항체와 접촉시키는 단계, 상기 샘플에 폴리옥시에틸렌 에테르를 첨가하는 단계, 표지된 항-인간 IgG 및 표지된 항-HCV 코어 항체를 첨가하여 포획된 항원 및 항체를 검출하는 단계 및 HCV 감염의 존재의 표시로서 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 HCV의 존재를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 외피 단백질 및/또는 지질층을 파괴시켜 바이러스로부터 HCV 코어 항원을 방출시키는데 필요한 혹종의 세정제를 제공하는 것이다.
조합 분석방법에서, 세정제는 바이러스로부터 코어 항원을 방출시키면서 HCV 재조합 단백질의 항-HCV 항체 포획력에 부정적 영향을 주지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 폴리옥시에틸렌 에테르 류에서 유래하는 세정제를 이 목적에 사용한다. 통상 이용되는 이 부류의 세정제는 BRIJ 30, BRIJ 35, 56, 58, 92, 96, 98, 700 및 MYRJ 52, 59, 53, 45이다. 이들 세정제는 바이러스로부터 HCV 코어 항원을 방출하는 것을 도우나 이들 세정제의 존재는 항-HCV 분석방법에 부정적 영향을 주지 않는다. 혹종의 세정제는 고체상에 피복된 재조합 항원에 영향을 미치거나 샘플내 항-HCV 항체를 비활성화시킴으로써 항체 검출에 영향을 줄 수 있다. HCV 코어 검출 분석에 사용되는 N-라우릴 사코신과 같은 몇몇 세정제는 Ortho HCV 3.0 ELISA에서 HCV 재조합 단백질 c22-3, c200 및 NS5의 항 HCV 항체 검출력을 파괴한다.
본원에서 사용될때, "샘플"은 목적 분석물을 함유할 수 있는 혹종의 물질을 말한다. 샘플은 생물학적 유체, 예를 들면, 적혈구 세포, 백혈구 세포, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액, 및 목적 분석물을 포함할 수 있는 신체의 기타 성분을 포함하는 전혈 또는 전혈 성분일 수 있다.
실시예:
다음 실시예들은 평가한 세정제 리스트 및 상기 기술한 분석방법을 사용하여 얻은 결과를 기술함으로써, 본 발명의 이점 및 유용성을 증명한다. 당업자는 HCV 항체 및 항원의 검출을 별도로 또는 동시에 할 수 있음을 인지할 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 사상 및 범위를 예시하고자 함이며 제한의 의도가 아니다.
실시예 1: 항원-항체 복합 분석.
HCV 항원 c200-3, NS5 및 개질된 코어 항원 C22KSN 47, 48 또는 c22KSR47L과 더불어 두가지 항-코어 단클론 항체(항 코어 뮤린 모노클론 Pep10,12)를 포스페이트 완충액내 마이크로웰 상에 피복하였다. 항원은 HCV1 서열을 포함하는 재조합 단백질 c22-3을 코드하는 DNA 클론을 개질시킴으로써 개질하였다. 이들 절차는 합성 올리고누클레오티드를 사용하는 자리지정 돌연변이유발을 포함한다(Sambrook, Fritsh 및 Maniatis의 Molecular Cloning, A laboratary manual, 2판, Cold Spring Harbor Press, 15장, 1989). 밤새 인큐베이팅한 후 피복 단백질을 함유하는 완충액을 제거하여, 세정제 Tween 20을 함유하는 포스페이트 완충된 염수로 마이크로웰을 세척하였다. 항원/항체 피복된 마이크로웰을 이후 BSA/수크로스 용액으로 처리하여 마이크로웰 상의 단백질 결합 부위를 모두 블록킹하였다. 2-24시간후, BSA/수크로스 용액을 제거하고 마이크로웰을 자연 건조시켜 건조제하에 보관하였다.
실시예 2: 테스트할 100mL의 샘플을 소 혈청 알부민, 수퍼옥사이드 디스무타제, 효모 추출물 및 1%의 Brij 58 또는 Brij 35 또는 이 둘의 혼합물을 함유하는 100mL의 PBS 용액에 희석시켰다. 희석된 검편을 피펫으로 (실시예 1에 기술한 바와 같은) HCV 항원/단클론 항체 피복된 마이크로웰 내에 넣었다. 이들 마이크로웰을 37℃에서 90분간 인큐베이팅하였다. 이후 마이크로웰을 0.5%의 Tween 20을 함유하는 PBS로 5회 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 표지된 뮤린 항-인간 IgG 및 HRP로 표지된 항-HCV 코어 단클론 항체(Anti Per4)의 용액 200mL를 첨가하였다. 30분간 인큐베이팅시킨 다음 PBS Tween 20으로 마이크로웰을 5회 세척하였다. 오르토페닐렌디아민 및 과산화수소의 용액을 각 웰에 첨가하였다. 암실에서 30분간 인큐베이팅한 다음 50 마이크로리터의 4N 황산을 첨가하여 반응을 멈추었다. 플레이트 읽음은 495mM였다. 각 웰의 오렌지색은 테스트 검편이 HCV로 감염되었음을 나타낸다.
실시예 3: HCV 항체 또는 항원 분석에 미치는 폴리옥시에틸렌 에테르의 효과
HCV 3.0 항-HCV 분석 또는 HCV 코어 항원 ELISA 분석에 미치는 여러가지 폴리옥시에틸렌 에테르의 부가 효과를 아래 표1A 및 1B에 나타내었다. HCV 코어 항원 ELISA 분석에서는, 시판 HCV 코어 항원에 사용된 N-라우릴 사코신을 여러가지 농도의 칼럼 1에 나타낸 세정제로 대체하였다. HCV 3.0 항-HCV 분석에서는, HCV 3.0 분석에 사용되는 검편 희석제에 세정제를 첨가하였다.
Figure 112002008955788-pat00001
Figure 112002008955788-pat00002
실시예 4: HCV 코어 항원 및/또는 항-HCV 항체의 검출
항-코어 단클론 항체 c11-3 및 c11-7 및 HCV 항원 c200-3, NS5 및 개질된 코어 항원으로 피복시킨 플레이트 상에서 HCV 코어 항원 또는 항-HCV 항체의 검출. (코어 서열 aa10-99를 포함하고 aa47 및 48이 결실되어 있는(c22KS(▽47-48) SOD 융합된 단백질). 사용된 검편은 시판되는 혈청전환 패널에서 4회 연속 출혈시킨 것이었다. HRP로 표지된 c11-4 단클론 항체를 사용하여 코어 항원을 검출하고 HRP로 표지된 항-인간 IgG로 항-HCV 항체를 검출하였다. 두 항체를 함께 사용하여, 표2의 콤보로 표시된 칼럼에 도시한 바와 같이 누적 신호를 얻었다.
Figure 112002008955788-pat00003
*HCV 네가티브 샘플을 사용하여 얻은 신호
실시예 5: HCV 코어 항원 및/또는 항-HCV 항체의 검출
항-코어 단클론 항체 c11-3 및 c11-7 및 HCV 항원 c200-3, NS5 및 개질된 코어 항원으로 피복시킨 플레이트 상에서 HCV 코어 항원 및/또는 항-HCV 항체의 검출. (코어 서열 aa10-99를 포함하고 위치 47에서 아르기닌이 류신으로 대체된(c22KS(R47L) SOD 융합된 단백질). 사용된 검편은 시판되는 혈청전환 패널에서 4회 연속 출혈시킨 것이었다. HRP로 표지된 c11-4 단클론 항체를 사용하여 코어 항원을 검출하고 HRP로 표지된 항-인간 IgG로 항-HCV 항체를 검출하였다. 콤보 분석에서, 두 검출 항체, HRP로 표지된 항-인간 IgG 단클론 항체 및 항 코어 단클론 항체는 혼합물로서 사용하였다.
Figure 112002008955788-pat00004
실시예 6: 항-IgG 비교
두가지 상이한 HCV 코어 단백질로 피복시킨 마이크로웰내에서 혈청전환기(seroconverter) 패널의 항-HCV 반응성을 비교한 것을 표4에 나타내었다.
Figure 112002008955788-pat00005
실시예 7: 두가지 상이한 코어 항원으로 피복시킨 마이크로웰내에서 혈청전환기 패널의 코어 항원 검출을 비교한 것을 표5에 나타내었다.
Figure 112002008955788-pat00006
실시예 8: 두가지 상이한 코어 항원으로 피복시킨 마이크로웰내에서 혈청전환기 패널의 콤보 반응성을 비교한 것을 표6에 나타내었다.
Figure 112002008955788-pat00007
우리는 현재 사용되는 항체 분석방법 보다 초기에 HCV 감염을 검출하는 방법을 기술한다. 이것은 항-HCV 항체 외에 HCV 코어 항원을 검출하는 테스트 방법을 제공함으로써 달성하였다.
본 발명의 또다른 목적은 샘플을 HCV 항원 및 고체상에 결합된 항-HCV 코어 항체와 접촉시키는 단계, 상기 샘플에 폴리옥시에틸렌 에테르를 가하는 단계, 표지된 항-인간 IgG 및 표지된 항-HCV 코어 항체를 가하여 포획된 항원 및 항체를 검출하는 단계 및 HCV 감염 지시로서의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 HCV의 존재를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 외포 단백질 및/또는 지질층을 파괴시켜 바이러스로부터 HCV 코어 항원을 방출시키는데 필요한 혹종의 세정제를 제공하는 것이다.

Claims (1)

  1. 샘플을 HCV 항원 및 고체상에 결합된 항-HCV 코어 항체와 접촉시키는 단계, 상기 샘플에 폴리옥시에틸렌 에테르를 첨가하는 단계, 표지된 항-인간 IgG 및 표지된 항-HCV 코어 항체를 첨가하여 포획된 항원 및 항체를 검출하는 단계 및 HCV 감염의 존재의 표시로서 신호를 검출하는 단계로 필수적으로 이루어지는, 샘플 내 HCV의 존재를 측정하는 방법으로서,
    상기 폴리옥시에틸렌 에테르는 2 올레일 에테르, 8 스테아레이트, 50 스테아레이트, 3 라우릴 에테르, 4 라우릴 에테르, 5 라우릴 에테르, 7 라우릴 에테르, 8 라우릴 에테르, 9 라우릴 에테르, 10 라우릴 에테르, 10 세틸 에테르, 10 올레일 에테르, 100 스테아레이트, 20 세틸 에테르, 40 스테아레이트, 100 스테아릴 에테르, 20 올레일 에테르, 23 라우릴 에테르, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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