CZ305181B6 - Způsob určení přítomnosti viru hepatitis C (HCV) ve vzorku - Google Patents

Abstract

Způsob určení přítomnosti viru hepatitis C (HCV) ve vzorku, který zahrnuje kontaktování vzorku s HCV antigeny a anti-HCV jádrovými protilátkami připojenými k pevné fázi, přidání specifického polyoxyethylen-etheru nebo -esteru ke vzorku, stanovení zachycených antigenů a protilátek přidáním značeného anti-lidského IgG a značených anti-HCV jádrových protilátek a detekci signálu jakožto indikaci přítomnosti HCV infekce.

Description

Vynález se týká způsobu určení přítomnosti viru hepatitis C (HCV) ve vzorku, který zahrnuje kontaktování vzorku s HCV antigeny a anti-HCV jádrovými protilátkami připojenými k pevné fázi, přidání specifického polyoxyethylen-etheru nebo -esteru ke vzorku, stanovení zachycených antigenů a protilátek přidáním značeného anti-lidského IgG a značených anti-HCV jádrových protilátek a detekci signálů jakožto indikaci přítomnosti HCV infekce.

Dosavadní stav techniky

Odhaduje se, že na celém světě bylo 170 milionů lidí infikováno virem hepatitis C (HCV). Během několika příštích let počet úmrtí Američanů na jatemí choroby a rakovinu způsobených HCV může překonat počet úmrtí způsobených syndromem získaného imunodeficience (AIDS).

Zdá se, že přenos HCV vyžaduje kontakt krev-krev. HCV, nesoucí jednořetězcovou ribonukleovou kyselinu (RNA), obsahuje pouze jeden gen, kódující polyprotein, který je následně posttranskripčně upraven sestřihem na nejméně 10 funkčních proteinů.

Je zřejmé, že schopnost testovat krevní materiál na HCV má značný význam. Navíc, čím dříve může být stav HCV zjištěn, tím lépe.

Proto jsme vyvinuli test pro stanovení HCV infekce, který je založen na ELISA testu. Tento nový test může stanovit HCV infekci dříve než běžně užívané testy pro vyšetření krve na HCV infekci.

Běžné testy jsou založeny na stanovení anti-HCV protilátek v infikované krvi zachycováním těchto protilátek HCV proteinovými sekvencemi, které jsou zastoupeny rekombinantními proteiny nebo peptidy. Tak například Ortho HCV 3.0 ELISA používá mnohočetné antigeny k brzkému stanovení anti-HCV protilátek při serokonverzi.

Avšak u viremických jedinců existuje charakteristické bezpříznakové období (window period) před tím, než si vytvoří protilátky proti HCV. Toto období může být dlouhé až 60 dnů. Během tohoto období jedinec, ačkoliv vysoce nakažlivý, zůstane neobjeven běžnými HCV kontrolními testy.

Použití určitých neiontových detergentů při stanovení přítomnosti viru hepatitis C ve vzorku bylo popsáno v EP 1 020 727. Mezi detergenty, které jsou popsány v EP 1 020 727 jako výhodné pro stanovení HCV, je kyselina dodecyl-N-sarkosinová (také známá jako N-lauryl sarkosin). Tento detergent i jiné zde popsané detergenty však mají negativní vliv na možnost detekce HCV antigenů a/nebo anti-HCV protilátek tím, že ovlivňují stanovení protilátek buď působením na rekombinantní antigeny natažené na pevné fázi nebo inaktivaci anti-HCV protilátek ve vzorku. Při stanovení u HCV jádrového testu Ortho HCV 3.0 ELISA ničí tyto detergenty schopnost HCV rekombinantních proteinů c22-3, c200 a NS5 stanovovat anti-HCV protilátky. Předložený vynález se týká použití určité skupiny specifických polyoxyethylen-etherů nebo -esterů, které nejsou uvedeny v dokumentu EP 1 020 727 a ani nejsou s detergenty uvedenými v tomto dokumentu zaměnitelné. Na rozdíl od detergentů podle EP 1 020 727 detergenty podle vynálezu s překvapením nesnižují možnost detekce HCV antigenů a/nebo anti-HCV protilátek.

- 1 CZ 305181 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob určení přítomnosti viru hepatitis C (HCV) ve vzorku. Způsob podle vynálezu zahrnuje kontaktování vzorku s HCV antigeny a anti-HCV jádrovými protilátkami připojenými k pevné fázi, přidání polyoxyethylen-etheru nebo -esteru ke vzorku, stanovení zachycených antigenů a protilátek přidáním značeného anti-lidského IgG a značených anti-HCV jádrových protilátek a detekci signálu jakožto indikaci přítomnosti HCV infekce, přičemž polyoxyethylen-ether nebo -ester je vybrán ze souboru sestávajícího z polyoxyethylen-2-oleyletheru, polyoxyethylen-8-stearátu, polyoxyethylen-50-stearátu, polyoxyethylen-3-lauryletheru, polyoxyethylen-4-lauryletheru, polyoxyethylen-5-lauryletheru, polyoxyethylen-7-lauryletheru, polyoxyethylen-8-lauryletheru, polyoxyethylen-9-lauryletheru, polyoxyethylen-10lauryletheru, polyoxyethylen-10-cetyletheru, polyoxyethylen-10-oleyletheru, polyoxyethylen100-stearátu, polyoxyethylen-20-cetyletheru, polyoxyethylen-40-stearátu, polyoxyethylen100-stearyletheru, polyoxyethylen-20-oleyletheru, polyoxyethylen-23-lauryletheru a jejich kombinací.

Vynález poskytuje diagnostický test, který může stanovit HCV infekci během shora popsaného bezpříznakového období zachycením jak HCV jádrového antigenu, tak i protilátek.

V kombinovaném testu je pro detergenty vhodnější uvolnit jádrový antigen z viru a současně negativně neovlivňovat schopnost HCV rekombinantních proteinů zachycovat anti-HCV protilátky.

Ve výhodném provedení vynálezu, jsou pro tento účel používány detergenty z třídy polyoxyethylen-etherů a -esterů, jako jsou například běžně dostupné detergenty BRIJ 30, BRIJ 35, 56, 58, 92, 98, 700 a MYRJ 52, 59, 53, 45.

Tyto detergenty pomáhají při uvolňování HCV jádrových antigenů z viru, ale přítomnost těchto detergentů nemá negativní vliv na anti-HCV test.

Výraz „vzorek“ zde označuje jakýkoliv materiál, který může obsahovat analyzovanou složku.

Vzorkem může být biologická tekutina, jako celá krev nebo celé krevní složky zahrnující červené krvinky, bílé krvinky, destičky, sérum a plazmu, ascites, moč, mozkomíšní mok a další součásti těla, které mohou obsahovat analyzovanou složku.

Příklady uskutečnění vynálezu

Následující příklady ukazují výhody a užitečnost vynálezu. V příkladech jsou uvedeny a výsledky dosažené za použití detergentů uvedených v seznamu při výše popsaném testu. Odborníkům je zřejmé, že stanovení HCV protilátky a antigenu může být provedeno odděleně nebo současně. Příklady mají výhradně ilustrativní charakter a nikterak neomezují podstatu a rozsah vynálezu.

Příklad 1

Kombinovaný test antigen-protilátka

HCV antigeny c200-3, NS-5 a modifikovaný jádrový antigen C22KSN 47,48 nebo c22KSR47L spolu se dvěma anti-jádrový monoklonálními protilátkami (anti-jádrové myší monoklony Pepl0,12) byly ve fosfátovém pufru povlečeny na jamky mikrotitrační destičky.

-2CZ 305181 B6

Antigeny byly upraveny modifikací kódování DNA klonů pro rekombinantní proteiny c22-3, které obsahují HCV1 sekvenci.

Tyto postupy zahrnují místně řízenou mutagenezi, která využívá syntetické oligonukleotidy (Sambrook, Fritsh and Maniatis in Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, Chapter 15, 1989).

Po celonoční inkubaci byl pufr obsahující potažené proteiny odstraněn a jamky mikrotitrační destičky byly promyty fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím detergent Tween 20.

Jamky mikrotitrační destičky potažené antigenem a protilátkou pak byly ošetřeny BSA/sacharózovým roztokem pro blokování všech vazebných míst proteinů na jamkách mikrotitrační destičky.

Po 4 až 24 hodinách byl BSA/sacharózový roztok odstraněn a mikrotitrační destička byla vysušena vzduchem a uskladněna pod vysoušecím prostředkem.

Příklad 2 lOOml vzorek, který byl testován, byl rozředěn ve 100 ml PBS roztoku obsahujícím hovězí sérový albumin, superoxid dismutázu, kvasinkový extrakt a 1% Brij 58 nebo Brij 35 nebo jejich směsi.

Naředěné vzorky byly pipetovány do jamek mikrotitrační destičky potažených HCV antigen/monoklonálními protilátkami (jak je popsáno v Příkladě 1).

Mikrotitrační destička byla inkubována 90 minut při 37 °C. Pak byly jamky pětkrát promyty PBS obsahujícím 0,5% Tween 20.

Bylo přidáno 200 ml roztoku myšího anti-lidského IgG značeného křenovou peroxidázou (HRP) a anti-HCV jádrové monoklonální protilátky (Anti Pep4) značené HRP.

Po 30minutové inkubaci byly jamky pětkrát promyty PBS s Tween 20. Do každé jamky byl přidán roztok ortofenyldiaminu a peroxidu vodíku.

Po 30minutové inkubaci ve tmě byla reakce zastavena přidáním 50 mikrolitrů 4N kyseliny sírové.

Plotny byly odečteny při vlnové délce 495 nm. Oranžová barva v každé jamce signalizuje, že testovaný vzorek byl infikován HCV.

Příklad 3

Účinek polyoxyethylenetherů na HCV protilátkový nebo antigenový test

Účinek přidání různých polyoxyethylenetherů na HCV 3.0 anti-HCV test nebo HCV jádrový antigenový EFISA test je ukázán dále v Tabulkách 1A a IB.

V HCV jádrovém antigenovém EFISA testu byl N-lauryl sarkosin, užívaný u komerčního HCV jádrového antigenu, nahrazen rozdílnými koncentracemi detergentů uvedených v prvním sloupci.

V HCV 3.0 anti-HCV testu byly detergenty přidány do vzorkového ředidla používaného v HCV 3.0 testu.

-3CZ 305181 B6

Tabulka 1A

testovaný detergent	Syn.	HCV 3.0 Ab ELISA
základní hmota	reagující HCV protilátka
0,25%	0,125%	0,06%	0,25%	0,125%	0,06%
0,125%	0,06%	0,03%	0,125%	0,06%	0,03%
polyoxyethylen-2-oleylether	Brij 92	0,056	0,035	0,041	1,543	1,432	1,405
polyoxyethylen-8-stearát	Myrj 45	0,019	0,024	0,025	1,208	1,286	1,313
polyoxyeťhylen-5-laurylether		0,033	0,046	0,058	1,168	1,274	1,351
polyoxyethylen-50-stearát	Myij 53	0,044	0,069	0,083	1,368	1,361	1,262
polyoxyethylen-8-laurylether		0,064	0,070	0,059	1,223	1,219	1,277
polyoxyethylen-9-laurylether		0,057	0,055	0,061	1,312	1,260	1,225
polyoxyethylen-10-laurylether		0,049	0,059	0,064	1,192	1,069	1,161
polyoxyethylen-10-cetylether	Brij 56	0,053	0,093	0,059	0,994	1,212	1,209
polyoxyethylen-10-oleylether	Brij 97	0,031	0,056	0,072	1,316	1,341	1,534
polyoxyethylen-1 OO-stearát	Myrj 59	0,047	0,050	0,045	1,751	1,615	1,418
polyoxyethylen-20-cetylether	Brij 58	0,058	0,046	0,062	1,568	1,507	1,488
polyoxyethylen-40-stearát	Myrj 52	0,048	0,063	0,067	1,502	1,308	1,194
polyoxyethylen-1 OO-stearylether	Brij 700	0,043	0,045	0,052	1,600	1,482	1,503
polyoxyethylen-20-oleylether	Brij 98	0,053	0,044	0,050	1,632	1,542	1,493
polyoxyethylen-23-laurylether	Brij 35	0,067	0,055	0,065	1,492	1,415	1,473
polyoxyethylen-7-laurylether		0,065	0,105	0,100	1,151	1,458	1,497
polyoxyethylen-4-laurylether	Brij 30	0,093	0,058	0,185	0,867	1,135	1,190
polyoxyethylen-3 -laurylether		0,035	0,042	0,075	0,995	0,927	1,156
Pluronic F-127		0,025	0,030	0,035	1,521	1,327	1,271
Kontrola	0,075 (3,0 SD)	1,358 (3,0 SD)

-4CZ 305181 B6

Tabulka 1B

testované detergenty	Syn.	HCV antigenový model
základní hmota	reagující HCV antigen
0,25%	0,125%	0,06%	0,25%	0,125%	0,06%
0,125%	0,06%	0,03%	0,125%	0,06%	0,03%
polyoxyethylen-2-oleylether	Brij 92	0,010	0,010	0,032	0,609	0,847	0,502
polyoxyethylen-8-stearát	Myrj 45	0,028	0,021	0,022	0,880	0,509	0,433
polyoxyethylen-5 -laurylether		0,002	0,004	0,007	0,195	0,243	0,265
polyoxyethylen-5 0-stearát	Myrj 53	0,014	0,040	0,006	0,573	0,536	0,659
polyoxyethylen-8-laurylether		0,009	0,010	0,014	0,326	0,384	0,343
polyoxyethylen-9-laurylether		0,008	0,008	0,005	0,360	0,379	0,212
polyoxyethylen-10-laurylether		0,010	0,013	0,020	0,495	0,556	0,344
polyoxyethylen-10-cetylether	Brij 56	0,004	0,001	0,016	0,445	0,298	0,390
polyoxyethylen-10-oleylether	Brij 97	0,004	0,006	0,021	0,371	0,419	0,479
polyoxyethylen-100-stearát	Myrj 59	0,019	0,021	0,023	0,429	0,320	0,369
polyoxyethylen-20-cetylether	Brij 58	0,008	0,011	0,028	0,546	0,898	0,564
polyoxyethylen-40-stearát	Myrj 52	0,009	0,005	0,006	0,579	0,412	0,661
polyoxyethylen-1 OO-stearylether	Brij 700	0,016	0,023	0,019	0,294	0,307	0,319
polyoxyethylen-20-oleylether	Brij 98	0,008	0,011	0,032	0,557	0,718	0,539
polyoxyethylen-23-laurylether	Brij 35	0,022	0,028	0,029	0,722	0,494	0,309
polyoxyethylen-7-laurylether		0,009	0,009	0,016	0,228	0,289	0,309
polyoxyethylen-4-laurylether	Brij 30	-0,001	0,001	0,008	0,194	0,158	0,212
polyoxyethylen-3 -laurylether		0,004	0,005	0,013	0,106	0,168	0,162
Pluronic F-127		0,013	0,013	0,012	0,324	0,285	0,268
Kontrola	0,001 (nLs)	1,109 (nLs)

Příklad 4

Stanovení HCV jádrových antigenů a nebo anti-HCV protilátek

Stanovení HCV jádrového antigenů nebo anti-HCV protilátek na destičkách potažených antijádrovými monoklonálními protilátkami cl 1-3 a cl 1-7 a HCV antigeny c200-3, NS5 a modifi

-5CZ 305181 B6 kovaným jádrovým antigenem (SOD fúzovaný protein obsahující jádrové sekvence aalO-99 s odstraněnými aa 47 a 48 (c22KS(V47-48))).

Použitými vzorky byly čtyři sekvenční odběry z komerčně dostupného serokonverzního panelu. Jádrový antigen byl stanoven použitím cl 1^4 monoklonální protilátky značené HRP, anti-HCV protilátky byly stanoveny anti-lidským IgG značeným HRP. Současným použitím dvou protilátek byl vytvořen úhrnný signál, jak je ukázáno ve sloupci označeném „kombinace“ v Tabulce 2.

Tabulka 2

vzorek	anti IgG	jádrové anti HCV	kombinace
neg. průměr*	0,045	0,036	0,094
BCP 6215 1	0,007	0,135	0,193
BCP 6215 2	0,009	0,157	0,191
BCP 6215 3	0,014	0,231	0,270
BCP 6215 4	0,494	0,197	0,614

* signál získaný použitím vzorku negativního na HCV

Příklad 5

Stanovení HCV jádrového antigenů a nebo anti-HCV protilátek

Stanovení HCV jádrového antigenů nebo anti-HCV protilátek na destičkách potažených antijádrovými monoklonálními protilátkami cl 1-3 a cl 1-7 a HCV antigeny c200-3, NS5 a modifikovaným jádrovým antigenem (SOD fúzovaný protein obsahující jádrové sekvence aalO-99 s argininem nahrazeným v pozici 47 leucinem (c22KS(R47L))).

Použitými vzorky byly čtyři sekvenční odběry z komerčně dostupného serokonverzního panelu. Jádrový antigen byl stanoven použitím cl 1—4 monoklonální protilátky značené HRP, anti-HCV protilátky byly stanoveny anti-lidským IgG značeným HRP.

V kombinovaném testu byla použita směs dvou stanovovaných protilátek, anti-jádrové monoklonální a anti-lidské IgG monoklonální protilátky, obě značené pomocí HRP.

Tabulka 3

vzorek	anti IgG	jádrové anti HCV	kombinace
neg. průměr	0,045	0,036	0,094
BCP 6215 1	0,007	0,135	0,193
BCP 6215 2	0,009	0,157	0,191
BCP 6215 3	0,014	0,231	0,270
BCP 6215 4	0,494	0,197	0,614

-6CZ 305181 B6

Příklad 6

Anti-IgG srovnání

Srovnání reaktivity anti-HCV ze serokonverzního panelu v jamkách mikrotitrační destičky, které jsou potaženy dvěma různými HCV jádrovými proteiny, je ukázáno v Tabulce 4.

Tabulka 4

vzorek	SOD/c22KS (Δ47-48)	SOD/c22KS (R47L)
neg. průměr	0,045	0,076
BCP 6215 1	0,007	0,015
BCP 6215 2	0,009	0,021
BCP 6215 3	0,014	0,028
BCP 6215 4	0,494	0,498

Příklad 7

Srovnání stanovení jádrového antigenu ze serokonverzního panelu v jamkách mikrotitrační destičky, které jsou potaženy dvěma různými jádrovými antigeny, je ukázáno v Tabulce 5.

Tabulka 5

Anti-HCV jádrové srovnání

vzorek	SOD/C22KS (Δ47-48)	SOD/c22KS (R47L)
neg. průměr	0,036	0,047
BCP 6215 1	0,135	0,224
BCP 6215 2	0,157	0,189
BCP 6215 3	0,231	0,304
BCP 6215 4	0,197	0,189

Příklad 8

Srovnání reaktivity kombinace ze serokonverzního panelu v jamkách mikrotitrační destičky, které jsou potaženy dvěma různými jádrovými antigeny, je ukázáno v Tabulce 6.

-7CZ 305181 B6

Tabulka 6

HCV kombinační srovnání

vzorek	SOD/C22KS (Δ47-48)	SOD/c22KS (R47L)
neg. průměr	0,094	0,144
BCP 6215 1	0,193	0,247
BCP 6215 2	0,191	0,226
BCP 6215 3	0,270	0,328
BCP 6215 4	0,614	0,658

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. Způsob určení přítomnosti viru hepatitis C (HCV) ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování vzorku s HCV antigeny a anti-HCV jádrovými protilátkami připojenými k pevné fázi, přidání polyoxyethylen-etheru nebo -esteru ke vzorku, stanovení zachycených antigenů a protilátek přidáním značeného anti-lidského IgG a značených anti-HCV jádrových protilátek a detekci signálu jakožto indikaci přítomnosti HCV infekce, přičemž polyoxyethylenether nebo -ester je vybrán ze souboru sestávajícího z polyoxyethylen-2-oleyletheru, polyoxyethylen-8-stearátu, polyoxyethylen-50-stearátu, polyoxyethylen-3-lauiyletheru, polyoxyethylen—4-lauryletheru, polyoxyethylen-5-lauryletheru, polyoxyethylen-7-lauryletheru, polyoxyethylen-8-lauryletheru, polyoxyethylen-9-lauryletheru, polyoxyethylen-10-lauryletheru, polyoxy ethy len-10-cetyletheru, polyoxyethylen-10-oleyletheru, polyoxyethylen-100-stearátu, polyoxyethylen-20-cetyletheru, polyoxyethylen-40-stearátu, polyoxyethylen-100-stearyletheru, polyoxyethylen-20-oleyletheru, polyoxyethylen-23-lauryletheru a jejich kombinací.