CN111413496B - 一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒 - Google Patents
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒，包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM/IgG单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM/IgG单克隆抗体。本发明所述的试剂盒，与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便，速度快，成本低，对实验室要求低等特点。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析检测技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒。
背景技术
冠状病毒属于单股正链RNA病毒，既往已知感染人的冠状病毒有 6种，即HCoV-229E、HCoV-OC43、SARSr-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERSr-CoV。新型冠状病毒（2019-nCoV）属于第7种。
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型冠状病毒（2019-nCoV）。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。患者初始症状多为发热，乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。
目前临床实验室的检测方法主要依靠核酸检测，但核酸检测要在有条件和资质的实验室进行，存在检测时间长、样本采集要求高、步骤多、场地和设备要求高等不足，难以大规模开展。而用免疫测定进行抗体检测则可用于对高危人群的筛检，IgM以及IgG可用于新型冠状病毒感染肺炎原发感染或继发感染急性期的临床辅助诊断，如何实现这一临床辅助诊断，成为亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒，与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便，速度快，成本低，对实验室要求低等特点。
为达到上述目的，本发明的方案是这样实现的：
一种新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体；其中，FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括如表1所示的4种合成多肽，
表1合成多肽的氨基酸序列
FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原可以为具有如表2所示氨基酸序列：
表2重组抗原的氨基酸系列信息
优选的，还包括稀释液，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体时，稀释液包括如下组分Tris 4-8g/L；NaCl 5-20g/L；BSA 5-20g/L；CaseinNa 1-5g/L；Tween-20 0.5-5mL/L； ProClinTM300 2-5mL/L，且pH为8.0±0.20；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体时，稀释液包括如下组分：Tris 4-8g/L；ZnCl2 1-5g/L； MgCl2 5-20g/L；BSA 5-20g/L； ProClinTM300 1-5mL/L，且pH为8.0±0.20。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01~0.5μg/mL。
优选的，辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶（HRP）活化
1）配制5-10mg/mL HRP溶液；
2）配制10-20 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：（1-2）混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3）配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1 M pH 8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:（1-3）进行混合，之后用0.02-0.1 M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3）配制浓度为2-5mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0.01-0.05M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
优选的，碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下：
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下：
A、碱性磷酸酶（ALP）活化
1）配制5-20mg/mL ALP溶液；
2）配制10-20 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的ALP按质量比1:（1-3）进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3）配制浓度为2-5mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01-0.05M PBS 于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
本发明还提供一种新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体，其中，FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
优选的，还包括稀释液；
当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，稀释液包括如下组分，Tris 4-15g/L；NaCl 5-20g/L；BSA 5-20g/L；海藻糖 5-20g/L；Tween-20 0.5-5mL/L；ProClinTM300 0.5-2mL/L；硫酸庆大霉素 1-5 mL/L，且pH为8.0±0.20；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，稀释液包括如下组分：Tris 4-8g/L； NaCl5-20g/L； CaseinNa 0.5-2g/L；MgCl2 0.05-0.2g/L； ProClinTM300 1-5mL/L，且pH为7.4±0.2。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的工作浓度均为0.01~0.5μg/mL。
优选的，辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下，
A、辣根过氧化物酶活化：
1）配置5-10mg/mL HRP溶液；
2）配置10-20 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：(1-2)混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3）配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体：
1）将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1 M pH8.5-10 的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1 M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3）配置浓度为2-5mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01-0.05M PBS 于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下，
A、碱性磷酸酶活化：
1）配置5-20mg/mL ALP溶液；
2）配置10-20 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将上述步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述步骤3）配制溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体：
1）将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1 M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的ALP按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1 M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
3）配置浓度为2-5mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01-0.05M PBS 于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原制备包括以下步骤：
1）将新型冠状病毒抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH 8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h，当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；
2）当新型冠状病毒抗原为重组抗原时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比4:1进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比1：1进行混合，避光37℃反应8-12h。
3）将上述步骤2）完成的标记液用0 .01-0.05M PBS 于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
需要说明的是，当新型冠状病毒抗原为合成多肽，FITC可以分别与4种合成多肽的端部连接，连接方式不限，可以通过现有的方式，只要实现连接均可以用于本申请试剂盒，用于病毒抗体的检测。
优选的，还包括化学发光底物，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，化学发光底物包括A液和B液；
A液为0.5-1.5g/L鲁米诺，0.05-0.2g/L对碘酚，缓冲液为pH 7.5-9的2-10mmol/LTris-HCl，避光保存；
B液为0.5-1g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，化学发光底物包括如下组分，0.1-0.5g/L AMPPD，0.05-0.1g/L Na2SO3，2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，5-10g/L Tris；0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mLProclinTM300，pH值为9.0±0.50。
优选的，抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M 磷酸盐缓冲液稀释至1~5μg/mL，同时加入到白色不透明塑料微孔板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH 7-8 PBS 缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.2-1％ BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。
抗FITC抗体包被板，功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoVIgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2~8℃。
FITC标记新型冠状病毒抗原，需满足（1）外观：澄清，呈橙黄色，无混浊沉淀。（2）功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoVIgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2~8℃。
辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体，需满足（1）外观：澄清透明，无混浊沉淀。（2）功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoVIgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2~8℃。
可以根据需要提供参考品，包括阴性参考品，阳性参考品，最低检出限参考品，精密度参考品。
阴性参考品，对20份阴性参考品（N1-N20）进行检测，不得出现假阳性，阴性参考品符合率20/20。制备，选取20份新型冠状病毒IgM抗体阴性血清样本，其中包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体等阳性干扰样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
阳性参考品，对10份阳性参考品（P1-P10）进行检测，不得出现假阴性，阳性参考品符合率10/10。制备，选取10份不同发病时间、发病程度及抗体不同反应强度的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
最低检出限参考品，对检出限参考品L1-L4进行检测，L1和L2应检为阳性，L3可检为阳性或阴性，L4应检出阴性。制备，选取5份不同发病时间的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后混合，按照一定比例稀释，分别得到L1-L4，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
精密度参考品，检测应满足以下精密度，（1）批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据阳性质控品测定结果（S/CO）的平均值与标准差（SD），根据公式（1）计算变异系数（CV），结果应符合以下要求阴性质控品：阴性检出率应为100%（n=20）；弱阳性质控品：阳性检出率应≥90%（n=20）；阳性质控品：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。
变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（1）
（2）批间精密度：计算，用三批试剂盒检测参考品中精密度阳性质控品，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（1）计算变异系数（CV），结果应符合以下要求：检测参考品中精密度阳性质控品，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。
试剂盒中还应包括阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入体积浓度1%的ProClin TM 300。分装，贴标签，储存于2~8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/LBSA，0.01-0.02mol/L PBS（PH值：7-8，有效期：14个月）
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至适合的工作浓度，加入ProClinTM 300，分装，贴标签，储存于2~8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/LBSA，0.01-0.02mol/L PBS（PH值：7-8，有效期：14个月）。
本发明一种新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM./IgG抗体检测试剂盒（化学发光法）采用的是化学发光免疫分析（CLIA）测定系统，该系统由免疫反应系统和化学发光系统组成，用免疫反应后的产物所产生化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。CLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好、无污染等优点。
本发明采用间接法原理检测人血清中的新型冠状病毒IgM抗体或IgG抗体。将FITC标记新型冠状病毒抗原（重组抗原或合成多肽）和样本加入到包被板反应孔中，若样本中含有新型冠状病毒IgM抗体或IgG抗体，则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物，同时结合到包被板上，洗掉游离成分。将辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或 或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体加入反应孔中，辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记的抗体作为二抗，与样本中的IgM抗体或IgG抗体结合，并形成辣根过氧化物酶标记或碱性磷酸酶标记抗体-IgM抗体或IgG抗体-复合物，洗掉游离成分。加入化学发光底物液，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化相对应的化学发光底物发光，测定各样本的发光值（RLU）。样本的发光值与其中的新型冠状病毒IgM 抗体或IgG抗体浓度呈正相关，从而检测人血清中的新型冠状病毒IgM抗体或IgG抗体。
相对于现有技术，本发明所述的一种新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，具有以下优势：
表3 IgM抗体检测试剂盒优势
本发明所述的一种新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，具有以下优势：
表4 IgG抗体检测试剂盒优势
附图说明
图1为实施例一的ROC曲线分析图；
图2为实施例二的ROC曲线分析图；
图3为实施例三的ROC曲线分析图；
图4为实施例四的ROC曲线分析图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
以下实施例均使用如下试剂：
FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1）将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比4:1进行混合，避光37℃反应12h；
2）将步骤1）完成的标记液用0 .01M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
其中，新型冠状病毒抗原为4种合成多肽按相同质量比混合；4种合成多肽的氨基酸序列如表1所示。
20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和质量浓度2% Proclin300。
阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入1%体积浓度的ProClin TM 300。分装，贴标签，储存于2~8℃。其中缓冲液的配方为：10g/LBSA，0.02mol/L PBS（pH值：7-8，有效期：14个月）
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至工作浓度，加入ProClinTM 300，分装，贴标签，储存于2~8℃。其中缓冲液的配方为：10g/LBSA，0.02mol/L PBS（pH值：7-8，有效期：14个月）。
实施例一以及实施例二使用的抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，同时加入到96 孔白色不透明塑料微孔板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4 PBS 缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5％BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24 小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。
实施例三以及实施例四使用的抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，同时加入到96 孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS 缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5％ BSA 的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4 小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。
实施例一
一种新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，包括以上所述的抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、20倍浓缩洗液、稀释液、化学发光底物、阴性对照以及阳性对照等试剂。
辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶（HRP）活化
1）配制10mg/mL HRP溶液；
2）配制12 .8 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配制浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3）配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0 .05 M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:3进行混合，之后用0 .05M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3）配制浓度为2mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
化学发光底物包括A液和B液：
A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；
B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合。
稀释液通过如下步骤配制，在1.98L工艺用水中，加入12.08g Tris、11.255gNaCl，搅拌至完全溶解；再加入20g BSA、5g CaseinNa搅拌过夜至完全溶解；再加入2.0mLTween-20、4.0 mL ProClinTM300，搅拌30分钟。用纯化水定容至2L，用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.20范围内的要求。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温（18～25℃）下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将20倍浓缩洗液按1:20稀释（475mL纯化水加25mL浓缩洗液）得到洗液。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
将FITC标记新型冠状病毒重组抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体用稀释液进行稀释，稀释到工作浓度0.2μg/mL；也可以在制备相关试剂后，直接稀释至工作浓度，在操作时，直接使用，不需要稀释。
样本检测分析过程如下：
1、样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，混匀，用漩涡混匀仪混匀5秒，静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μL稀释到工作浓度的 FITC标记新型冠状病毒抗原，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应30分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL 稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
8、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、化学发光底物A液与化学发光底物B液等体积混合，现用现配，每孔加入发光液100μL。
11、室温（18~25℃）暗置5分钟后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。
12、在软件支持下将各孔位按实验需要定义。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
实验设备：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I；产品注册号-津械注准20182400046。
1、稳定性
1.1 设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2 试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。
1.3 试验结果
表5 实施例一中稳定性检测结果
表6 实施例一中稳定性具体检测结果
2. 精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。
2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。
变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。
2.3精密度参考品测定结果
表7 实施例一中精密度检测结果
3、灵敏度与特异性
表8 实施例一中排除2019-nCoV感染的部分检测结果
表9 实施例一中确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图1所示。
表10 曲线下的面积
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
样本S/CO ≥ 1，检测结果判为阳性；样本S/CO < 1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.976，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
实施例二
一种新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，包括以上所述的抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、20倍浓缩洗液、阴性对照以及阳性对照等试剂。
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下：
A、碱性磷酸酶（ALP）活化
1）配制10mg/mL ALP溶液；
2）配制12 .8 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将上述步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配制浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液，与上述步骤3）配制溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0 .05 M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的ALP按质量比1:3进行混合，之后用0 .05M碳酸盐缓冲液于透析24h（期间换液2-3次）；
3）配制浓度为2mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
化学发光底物包括如下组分，0.25g/L AMPPD，0.05g/L Na2SO3，5g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，6g/L Tris；0.05mL/L Tween-20和1mL ProclinTM300，pH值为9.0。
稀释液通过如下步骤配制：在1L工艺用水中，加入6g Tris、1.36gZnCl2，9.6gMgCl2搅拌至完全溶解；再加入2.1g 聚合BSA搅拌至完全溶解；再加入1.1mL ProClinTM300，搅拌30分钟。用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温（18～25℃）下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将浓缩洗液按1:20稀释（475mL纯化水加25mL浓缩洗液）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
将FITC标记新型冠状病毒重组抗原、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体用稀释液进行稀释，稀释到工作浓度0.2μg/mL；也可以在制备相关试剂后，直接稀释至工作浓度，在操作时，直接使用，不需要稀释。
样本检测分析过程如下：
1、样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，用漩涡混匀仪混匀5秒，静置15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μLFITC标记的新型冠状病毒重组抗原或合成多肽，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL 碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
8、用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、每孔加入化学发光底物100μL。
11、室温（18~25℃）暗置5秒后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。
12、在软件支持下将各孔位按实验需要定义。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
实验设备：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I；产品注册号-津械注准20182400046。
1、 稳定性
1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2 试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。
1.3 试验结果
表11 实施例二中稳定性检测结果
表12 实施例二中稳定性检测结果
2、精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。
2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。
变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。
2.3精密度参考品测定结果
表13 实施例二中精密度检测结果
3、灵敏度与特异性
表14 实施例二中排除2019-nCoV感染的部分检测结果
表15 实施例二中确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图1所示。
表16 实施例二中曲线下的面积
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
样本S/CO ≥ 1，检测结果判为阳性；样本S/CO < 1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.976，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
实施例三
一种新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，包括以上所述的抗FITC抗体包被板、以上所述的FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体、20倍浓缩洗液、稀释液、化学发光底物、阴性对照以及阳性对照等试剂。
辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶（HRP）活化
1）配置10mg/mL HRP溶液；
2）配置12 .8 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3）配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0 .05 M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:2进行混合，之后用0 .05M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h（期间换液2-3次）；
3）配置浓度为2mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
化学发光底物包括A液和B液：
A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；
B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合。
稀释液通过如下步骤配制而成，在1.9L工艺用水中，加入24.1g Tris、11.6gNaCl，搅拌至完全溶解；再加入20g BSA、20g 海藻糖搅拌过夜至完全溶解；再加入2.0mLTween-20、1.5 mL ProClinTM300、5mL硫酸庆大霉素，搅拌30分钟。用纯化水定容至2L，用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.20范围内的要求。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温（18～25℃）下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将20倍浓缩洗液按1:20稀释（475mL纯化水加25mL浓缩洗液）得到洗液。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
将FITC标记新型冠状病毒重组抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体用稀释液进行稀释，稀释到工作浓度0.2μg/mL；也可以在制备相关试剂后，直接稀释至工作浓度，在操作时，直接使用，不需要稀释。
样本检测分析过程如下：
1、样本处理：取1mL样本生理盐水，加入20μL样本，混匀，用漩涡混匀仪混匀5秒，静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μL稀释到工作浓度的 FITC标记新型冠状病毒抗原，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应30分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL 稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
8、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、化学发光底物A液与化学发光底物B液等体积混合，现用现配，每孔加入发光液100μL。
11、室温（18~25℃）暗置5分钟后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。
12、在软件支持下将各孔位按实验需要定义。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
以下检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I ；产品注册号-津械注准20182400046；
1、稳定性
1.1 设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2 试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。
1.3 试验结果
表17 实施例三中稳定性检测结果
表18 实施例三中稳定性具体检测数据
2、精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。
2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。
变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。
2.3精密度参考品测定结果
表19 实施例三中精密度检测结果
3、灵敏度与特异性
表20 实施例三中排除2019-nCoV感染的部分检测结果
表21 实施例三中确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图3所示。
表22 实施例三中的曲线下的面积
样本S/CO ≥ 1，检测结果判为阳性；样本S/CO < 1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.996，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
实施例四
一种新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，包括以上所述的抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体、20倍浓缩洗液、阴性对照以及阳性对照等试剂。
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下：
A、碱性磷酸酶（ALP）活化
1）配置10mg/mL ALP溶液；
2）配置12 .8 mg/mL 过碘酸钠NaIO4溶液；
3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4）配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体
1）将待标记原料装入透析袋中，用0 .05 M pH9 .6 的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2）将标记原料与活化的ALP按质量比1:2进行混合，之后用0 .05M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h（期间换液2-3次）；
3）配置浓度为2mg/mL的 NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4）将上述步骤3）完成的标记液用0 .01M PBS 于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
化学发光底物包括如下组分，0.25g/L AMPPD，0.05g/L Na2SO3，5g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，6g/L Tris；0.05mL/L Tween-20和1mL ProclinTM300，pH值为9.0。
稀释液通过如下步骤配制，在1.6L工艺用水中，加入12.684g Tris、18.396gNaCl，搅拌至完全溶解；再加入2.1g CaseinNa搅拌至完全溶解；再加入0.2331g MgCl2搅拌至完全溶解；再加入2.1mL ProClinTM300，搅拌30分钟。用纯化水定容至2L，用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在7.4±0.2范围内的要求。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温（18～25℃）下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将浓缩洗液按1:20稀释（475mL纯化水加25mL浓缩洗液）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
将FITC标记新型冠状病毒重组抗原、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体用稀释液进行稀释，稀释到工作浓度0.2 μg/mL；也可以在制备相关试剂后，直接稀释至工作浓度，在操作时，直接使用，不需要稀释。
样品检测分析过程：
1、样本处理：取1mL样本生理盐水，加入20μL样本，混匀，用漩涡混匀仪混匀5秒，静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μL稀释到工作浓度的 FITC标记新型冠状病毒抗原，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应30分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL 稀释到工作浓度的碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
8、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、每孔加入化学发光液100μL。
11、室温（18~25℃）暗置5秒后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。
12、在软件支持下将各孔位按实验需要定义。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
以下检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I；产品注册号-津械注准20182400046。
1、 稳定性
1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。
1.3 试验结果
表23 实施例四中稳定性检测结果
表24 实施例四中稳定性具体检测结果
2、精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。
2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。
变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。
2.3精密度参考品测定结果
表25 实施例四中精密度检测结果
3、灵敏度与特异性
表26 实施例四中排除2019-nCoV感染的部分检测结果
表27 实施例四中确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图4所示。
表28 实施例四中曲线下的面积
样本S/CO ≥ 1，检测结果判为阳性；样本S/CO < 1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.969，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原以及酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体；其中，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释液，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体时，稀释液包括如下组分Tris 4-8g/L；NaCl 5-20g/L；BSA 5-20g/L；CaseinNa 1-5g/L；Tween-20 0.5-5mL/L；ProClinTM300 2-5mL/L，且pH为8.0±0.20；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体时，稀释液包括如下组分：Tris4-8g/L；ZnCl2 1-5g/L；MgCl2 5-20g/L；BSA 5-20g/L；ProClinTM300 1-5mL/L，且pH为8.0±0.20。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：
FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A、辣根过氧化物酶活化：
1)配制5-10mg/mL辣根过氧化物酶溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：(1-2)混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体：
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH 8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2)将标记原料与活化的辣根过氧化物酶按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mg辣根过氧化物酶加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A、碱性磷酸酶活化：
1)配制5-20mg/mL碱性磷酸酶溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体：
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mg碱性磷酸酶加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
5.一种新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原以及酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体；其中，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释液；
当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，稀释液包括如下组分，Tris4-15g/L；NaCl 5-20g/L；BSA 5-20g/L；海藻糖5-20g/L；Tween-20 0.5-5mL/L；
ProClinTM300 0.5-2mL/L；硫酸庆大霉素1-5mL/L，且pH为8.0±0.20；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，稀释液包括如下组分：Tris4-8g/L；NaCl5-20g/L；CaseinNa 0.5-2g/L；MgCl2 0.05-0.2g/L；ProClinTM300 1-5mL/L，且pH为7.4±0.2。
7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下，
A、辣根过氧化物酶活化：
1)配制5-10mg/mL辣根过氧化物酶溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：(1-2)混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体：
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2)将标记原料与活化的辣根过氧化物酶按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mg辣根过氧化物酶加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体的制备方法如下，
A、碱性磷酸酶活化：
1)配制5-20mg/mL碱性磷酸酶溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述步骤3)配制溶液以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存；
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体：
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-3)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mg碱性磷酸酶加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒或根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原制备包括以下步骤：
1)将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比1:1进行混合，避光37℃反应8-12h；
2)将上述步骤1)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析12-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
10.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒或根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：还包括化学发光底物，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，化学发光底物包括A液和B液；
A液为0.5-1.5g/L鲁米诺，0.05-0.2g/L对碘酚，缓冲液为pH 7.5-9的2-10mmol/LTris-HCl，避光保存；
B液为0.5-1g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合；
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体时，化学发光底物包括如下组分，0.1-0.5g/L AMPPD，0.05-0.1g/L Na2SO3，2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，5-10g/L Tris；0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mL
ProclinTM300，pH值为9.0±0.50。
11.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体化学发光法检测试剂盒或根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgG抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，抗FITC抗体包被板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到白色不透明塑料微孔板中，2-8℃包被16-24小时或；弃去孔内液体，用pH7-8PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.2-1％
BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃；或37℃包被1-4小时，37℃封闭1-4小时，其余步骤不变。
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