CN111074010A

CN111074010A - 一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111074010A
Application number: CN202010162069.XA
Authority: CN
Inventors: 许森; 谢书阳; 李有杰; 封建凯; 张帅; 吕长俊; 邹志强; 王萍玉; 刘文英; 张兴晓
Original assignee: Binzhou Medical College
Current assignee: Binzhou Medical College
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111074010B

Abstract

本发明公开了一种新的快速检测2019‑nCoV核酸试剂盒及应用，选择2019‑nCoV三个位点进行检测，检测准确性大大提高。其中包括一个2019‑nCoV特异性位点，大大提高了检测的精确性，特异性高；本试剂盒采用实时荧光PCR技术和水解探针技术在同一反应管中实现一种或多种病原体在核酸水平上的定性检测，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断，能较好对该病毒进行定性分析，检测结果可用于病程进展分析及临床辅助诊断，具有重要的应用价值。

Description

一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用。

背景技术

新型的冠状病毒感染患者临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，该病毒引发的肺炎可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、多器官功能衰竭、严重酸碱代谢紊乱等，甚至危及生命。2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）。

目前，实验室检测方法目前主要有病毒分离、核酸检测等。在本发明之前，有关病毒检测试剂主要对病毒进行定性的分析，检测时间较长；难以诊断处于潜在复制的病毒，且难以开展病程进展分析。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供了一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用。本试剂盒采用实时荧光PCR技术和水解探针技术在同一反应管中实现一种或多种病原体在核酸水平上的定性检测，操作简单，全程不开盖减少污染，检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断，能较好对该病毒进行定性分析，且应用三对特异性引物检测提高精确度，节省检测的时间，检测结果可用于病程进展分析及临床辅助诊断，具有重要的应用价值。

具体技术方案如下：

本发明的目的之一是提供一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒。

包括三对引物：引物1、引物2与引物3；

其中，引物1为针对2019-nCoV特异性位点的引物；

所述的引物1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为ATGGCAGACGGGCGATTT；

所述的引物1的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为TTTTGGGGTAAGTAACCACAAGTAGT；

所述的引物2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为AAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGG；

所述的引物2的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，具体为AACGACAGTAATTAGTTATTAATTATACTGCGT；

所述的引物3的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，具体为TACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTA；

所述的引物3的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，具体为AAAACACCTAAAGCAGCGGTTGAGT。

以上方向均为5’-3’。

引物1的目的基因如SEQ ID NO. 7所示，其相应的DNA基因片段为2019-nCoV的特异性逆转录片段；

引物2的目的基因如SEQ ID NO. 8所示，在已知基因中，其相应的通过逆转录获得的DNA基因片段仅存在于2019-nCoV与下述基因组：

蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13（Select seq MN996532.1 Bat coronavirus isolateRaTG13, complete genome）；

严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株（Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2 isolate BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-02/2019, complete genome）；

引物3的目的基因如SEQ ID NO. 9所示，在已知基因中，其相应的通过逆转录获得的DNA基因片段仅存在于2019-nCoV与下述基因组：

严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株（WIV05 Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2 isolate WIV05, complete genome）；

蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13 （Bat coronavirus isolate RaTG13, completegenome）；

蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZXC21（Select seq MG772934.1 Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZXC21, complete genome）；

急性呼吸综合征冠状病毒2分离株BetaCoV/huanzhou/IPBCAMS-WH- （Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2 isolate BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-）；

蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZC45（Select seq MG772933.1 Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45, complete genome）。

进一步，试剂盒还包括基因的逆转录反应体系、PCR反应体系、阳性对照与阴性对照。

其中，所述的逆转录反应体系包括M-MLV逆转录酶、dNTP、缓冲液与RNase抑制剂；

所述的PCR反应体系包括SYBR水解荧光探针、DNA聚合酶与DNA聚合酶缓冲液；

所述的阳性对照包括所述的三对引物（引物1、引物2与引物3）分别针对的三段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8与SEQ ID NO. 9所示；即为引物1、引物2、引物3的目的基因；

所述的阴性对照为人cDNA。

本发明的另一个目的是公开上述试剂盒在2019-nCoV检测中的应用。

进一步，采用qRT-PCR扩增检测。

以AB Applied Biosystems，StepOne Real-Time PCR System为例，选择2-△△CT法；荧光染料设置，选择SYBR（或none，根据机器选择）；

数据分析：引物1、引物2与引物3扩增的体系的Ct值区间应同时≤30，可判断为阳性；检测精度：至少可低至100拷贝。

溶解曲线：最高峰均应在75℃-85℃，如果其他位置出现峰值且高于75℃-85℃处峰值，可判断为阴性。

本发明的有益效果如下：

（1）操作简单，所用到的试剂种类少，减少了交叉污染的可能。

（2）大大缩短了检测时长，全程2h，快速读取低至1-1.5h。

（3）特异性高。选择2019-nCoV三个位点进行检测，检测准确性大大提高。其中包括一个2019-nCoV特异性位点，大大提高了检测的精确性；特异性高，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体(冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKUI型、冠状病毒NL63型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌)以及人类白细胞的总核酸无交叉反应。

（4）检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。

（5）经相关医院检测验证，效果好。

附图说明

图1为程序设置界面；

图2为实施例1中检测1的阳性结果扩增曲线；

图3为实施例1中检测1的阳性结果熔解曲线；

图4为实施例1中检测2的阳性结果扩增曲线；

图5为实施例1中检测2的阳性结果熔解曲线；

图6为实施例1中检测3的阳性结果扩增曲线；

图7为实施例1中检测3的阳性结果熔解曲线。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例中使用的RNA提取试剂盒为MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNAIsolation Kit。

实施例1

一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒，其组成成分如下表所示：

其中，溶液E含400 U/μL DNA聚合酶、200U/μL M-MLV逆转录酶；

qRT-PCR反应液

的成分包括：引物1的正、反向引物各250 pmol（各25μL），以及：

1×SYBR水解荧光探针（索莱宝SYBRGreenI核酸染料），RNase-Free water、1×DNA聚合酶缓冲液[含0.01mol/L Tris-Cl（pH8.0）和MgCl₂ （25mmol/L）]、TaqDNA多聚酶(1.5 U/μL)、dNTP（10 mmol /L）、1×M-MLV缓冲液（pH 8.3的250 mM Tris-HCl，375 mM KCl，15 mMMgCl₂， 50 mM DTT）、5 U/μL Rnase抑制剂（5 U/μL）、；

其中，引物1的正向引物RT1F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为ATGGCAGACGGGCGATTT；引物1的反向引物RT1R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具体为TTTTGGGGTAAGTAACCACAAGTAGT(方向均为5’-3’)；

qRT-PCR反应液II包含引物2的正、反向引物各250 pmol（各25μL）,除引物外的其他成分与qRT-PCR反应液

相同；

其中，引物2的正向引物RT2F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为AAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGG；引物2的反向引物RT2R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，具体为AACGACAGTAATTAGTTATTAATTATACTGCGT(方向均为5’-3’);

qRT-PCR反应液III包含引物3的正、反向引物各250 pmol（各25μL），,除引物外的其他成分与qRT-PCR反应液

相同；；

其中，引物3的正向引物RT3F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，具体为TACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTA；所述的引物3的反向引物RT3R的核苷酸序列如SEQ IDNO. 6所示，具体为AAAACACCTAAAGCAGCGGTTGAGT(方向均为5’-3’)

阳性对照包括所述的三对引物（引物1、引物2、引物3）分别针对的三段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8与SEQ ID NO. 9所示；

阴性对照为人cDNA。

本实施例中的试剂盒的检测原理如下：

本试剂盒采用实时荧光PCR技术和水解探针技术在同一反应管中实现一种或多种病原体在核酸水平上的定性检测，操作简单，全程不开盖减少污染，检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断。本试剂盒内设置有阳性对照。

上述试剂盒的储存条件及有效期如下：

溶液E,-20℃储存，若三天内用完可置于冰浴保存；

qRT-PCR反应液：-20℃贮存，反复冻融5次对效期没有影响，若三天内用完可置于冰浴避光保存；

试剂盒的有效期为12个月；

上述试剂盒的适用仪器为AB Applied Biosystems、StepOne Real-Time PCR System、ABI7500、QuantStudio、Roche LightCyeler*480、Bio-RadCFX96、上海宏石SLAN-96P/S等荧光定量PCR仪。

实施例2

使用实施例1中的试剂盒进行2019-nCoV检测，具体方法如下：

（1）样本处理：

采集咽拭子、鼻咽抽取物、痰液、支气管灌洗液或肺泡灌洗液，按照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》进行采集；

保存方式:用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存)；标本采集后应尽快送往实验室；如果需要长途运输标本，建议采用干冰等制冷方式进行保藏)。

（2）核酸提取：使用市售普通RNA提取试剂盒提取待测样本RNA，参考说明书进行；

（3）加样：总体系20μL，同一样本三种检测（试剂差异在于qRT-PCR反应液不同）：自提RNA-2μL，溶液E-1μL，qRT-PCR反应液

-17μL（其它两管分别加qRT-PCR反应液

I-17μL和qRT-PCR反应液II

-17μL）；

qRT-PCR反应液

、qRT-PCR反应液

I、qRT-PCR反应液II

分别对应检测1、检测2、检测3。

（3）qRT-PCR扩增检测：以AB Applied Biosystems，StepOne Real-Time PCRSystem为例，选择2-△△CT法；

荧光染料设置，选择SYBR（或none，根据机器选择）；

时间设置，设置程序时，机器提供2h或40min，请选择2h（注意：不同机器可能不存在此选项）；

程序设置：50℃-10min，1个循环；95℃-5min，1个循环；95℃-15s，60℃-1min，35个循环；95℃-60℃进行溶解曲线分析。

程序设置界面见图1。

（4）数据分析：

Ct值：检测1（qRT-PCR反应液

）、检测2（qRT-PCR反应液

I）与检测3 （qRT-PCR反应液II

）的Ct值区间应同时≤30，可判断为阳性；检测精度：至少低至100拷贝。

熔解曲线：最高峰均应在75℃-85℃，如果其他位置出现峰值且高于75℃-85℃处峰值，可判断为阴性。

检测1的阳性检测结果见图2-3；图2为检测1的扩增曲线，图3为检测1的溶解曲线；

检测2阳性检测结果见图4-5；图4为检测2的扩增曲线，图5为检测2的溶解曲线

检测3阳性检测结果见图6-7；图6为检测3的扩增曲线，图7为检测3的溶解曲线。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 滨州医学院

<120> 一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用

<141> 2020-03-10

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcagacg ggcgattt 18

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttttggggta agtaaccaca agtagt 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaaatctgtg tggctgtcac tcgg 24

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aacgacagta attagttatt aattatactg cgt 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tactattaag tgtttgccta ggttcttta 29

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaaacaccta aagcagcggt tgagt 25

<210> 7

<211> 101

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

catggcagac gggcgatttt gttaaagcca cttgcgaatt ttgtggcact gagaatttga 60

ctaaagaagg tgccactact tgtggttact taccccaaaa t 101

<210> 8

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

taaaatctgt gtggctgtca ctcggctgca tgcttagtgc actcacgcag tataattaat 60

aactaattac tgtcgttgac a 81

<210> 9

<211> 94

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

attataattt ggtttttact attaagtgtt tgcctaggtt ctttaatcta ctcaaccgct 60

gctttaggtg ttttaatgtc taatttaggc atgc 94

Claims

1.一种新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒及应用，其特征在于，包括三对引物：引物1、引物2与引物3；

所述的引物1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；

所述的引物1的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；

所述的引物2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；

所述的引物2的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；

所述的引物3的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；

所述的引物3的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

2.根据权利要求1所述的新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒，其特征在于，还包括基因的逆转录反应体系、PCR反应体系、阳性对照与阴性对照。

3.根据权利要求2所述的新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒，其特征在于，所述的逆转录反应体系包括M-MLV逆转录酶、dNTP、缓冲液与RNase抑制剂。

4.根据权利要求2所述的新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应体系包括SYBR水解荧光探针、DNA聚合酶与DNA聚合酶缓冲液。

5.根据权利要求2所述的新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒，其特征在于，

所述的阳性对照包括所述的三对引物分别针对的三段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8与SEQ ID NO. 9所示；

所述的阴性对照为人cDNA。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的新的快速检测2019-nCoV核酸试剂盒在2019-nCoV检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用qRT-PCR检测，当引物1、引物2与引物3的扩增的体系的Ct值区间同时≤30，且溶解曲线的最高峰均位于75℃-85℃时，判断为2019-nCoV阳性。