KR100378746B1 - 체액내 활성 세포증식억제인자-베타1의 정량 방법 및 이를이용한 암 검사 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암시료에서 유의적으로 증가하는 인자로 확인된 세포증식억제인자-베타 1(Transforming Growth Factor-beta 1; TGF-β1)을 정량적으로 감도높게 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는, TGF-β1을 포함하는 검체를 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체에 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시키고 TGF-β1 특이적 항체를 이용하여 상기 TGF-β1-수용체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 TGF-β1의 정량 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람의 체액중의 TGF-β1을 정량하는 것을 포함하는 암의 검사 방법, TGF-β1에 대해 특이성이 높은 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 TGF-β1 정량방법에 의하면 TGF-β1을 감도높게 정량할 수 있을 뿐만 아니라, TGF-β1의 공급원으로서 사람의 체액을 사용하면 TGF-β1의 감도높은 정량에 의해 높은 정확도로 암을 검사할 수 있다.
Description
본 발명은 암시료에서 유의적으로 증가하는 인자로 확인된 세포증식억제인자-베타 1(Transforming Growth Factor-beta 1; TGF-β1)을 정량적으로 감도높게 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는, TGF-β1을 포함하는 검체를 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체에 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시키고 TGF-β1 특이적 항체를 이용하여 상기 TGF-β1-수용체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 TGF-β1의 정량 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람의 체액중의 TGF-β1을 정량하는 것을 포함하는 암의 검사 방법, TGF-β1에 대해 특이성이 높은 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
세포증식억제인자-베타(Transforming Growth Factor beta; TGF-β)는 여러 종류의 세포내에서 이들 세포의 증식과 분화를 조절하는 다양한 기능을 갖는 사이토카인이다(Sporn et al.,Science,233:532-534(1986); Roberts and Sporn,Adv. Cancer Res.,51:107-145(1988)). 즉, 세포의 형태와 다른 성장인자의 존재에 따라 세포의 성장과 분화를 촉진시키기도 하고 혹은 저해하기도 한다. 초기에는 간엽세포의 전환형태를 유도하는 특성 때문에 TGF라 불리웠으나 최근에는 배태발육 가운데 형태 형성에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라 의미가 대체되었다. TGF-β는 시험관내 실험에서 많은 세포의 증식을 강력하게 억제하는 인자로 알려져 있으며 특히 상피세포를 대상으로 수행한 실험에서는 강력한 세포증식억제인자로 작용한다(Masui et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,83:2438-2442(1986); Moses et al.,,Cancer Cells,3:65-71(1985); 및 Tucker et al.,Science,226:705-707(1984)).
TGF-β는 다섯 가지 형태가 알려져 있고 이들 상호간에는 64-82%의 상동성을 보이며 길이가 긴 전구체로부터 전환과정을 거쳐 활성을 갖는 성숙한 형태가 생성된다는 점과 이들 성숙형의 TGF-β는 9개의 보존적인 시스테인 잔기를 갖는 점등 구조적으로 필수적인 요소를 갖고 있다. 포유동물은 주로 β1, β2, β3에 해당하는 세 가지 형태의 TGF-β를 발현한다. 이 중에서 TGF-β1은 390개의 아미노산으로 이루어진 분비형의 전구체 폴리펩타이드로 합성된 다음, 각각 112개의 아미노산을 갖는 두 개의 폴리펩티드로 이루어진 분자량 25,000 달톤의 펩티드 형태로 생성되는데 자세한 전환 과정에 대해서는 알려져 있지 않다.
TGF-β가 생체 내에서 수행하는 역할이 다양하고 작용하는 세포의 종류도 많으므로 이 사이토카인은 많은 생리적인 기전과 질환 진행과정에서 중심점 역할을 할 것으로 예측된다. 다양한 TGF-β의 기능 중에서 성체의 조직이 재구성되거나 치료되는 과정에서 배형성과정과 동일한 기전이 반복되고 특히 암화과정과 같은 질환 유발과정에도 비정상적으로 관여하는 것이 밝혀짐에 따라 TGF-β의 감도 높은 정량 방법의 개발은 암의 검사 및 치료과정에 따른 예후의 관측지표로 유효성을 가질 것으로 판단된다.
표 1은 알려진 종양별 진단시약이다.
이들 외에도 여러 종류의 종양을 선별(screening)하고 감시(monitoring)하는 CEA(carcinoembrionic antigen)등이 있으나 이들 시약들의 감도와 특이도는 아직 미흡하다. 그리고 아직 비뇨기, 구강 및 내분비계 암에 대한 시약은 개발되지 않았다. 암의 진단 연구는 일반적으로 특이성이 높은 종양 마커(tumor marker)를 찾아내서 이 마커에 친화력이 높은 단일클론항체나 DNA-탐침을 개발하는 것이 핵심이 된다. 암진단 시약에 의해 가장 잘 진단되는 분야가 백혈병 및 임파종양인데 세포분화항원(CD)을 마커로 사용하여 종양을 진단하며 예후를 예측할 수 있게 한다. 또한 B세포 면역글로불린의 변화를 보아 B세포 종양을, T세포 수용체의 유전자의 변화로부터 T세포 종양을 진단하는 등 혈액암을 판단할 수 있으나 아직 감도가 높지 않다. 고형암에서는 항체 패널을 사용하여 진단하는데 오르토사(Ortho Diagnostic Systems Inc., 미국)는 흑색종과 폐암에 대한 항체 패널을 가지고 있으며, 이와 같은 항체 패널의 개발이 진행되고 있다. 또 종양을 판별하기 위한 암유전자(oncogene) 단백 키트들이 아머샴사(Amersham), 온코사(Oncor), 트리톤사(Triton), 캠브리지 바이오사이언스사(Cambridge Bioscience) 등에서 개발되었으나 그 유효성은 확인되지 않았다.
치료전의 조기 발견과 치료중 및 치료 후의 암의 전이, 재발의 조기 발견 모두 암치료의 중요한 요인이 된다. 종래 암의 검사법은 통상 환부조직을 절제하여 세포의 형태를 직접 판단하는 방법이 이용되어 왔고 경우에 따라서는 수술시까지 양성 악성의 판정이 어려울 때도 있다. 한편, 암의 특이적 면역혈청학적 진단을 위해서 암특이적 당단백질을 암을 검색하는 마커로 사용하는 방법이 제안되고 있다. 종래 암의 검사에 사용되고 있는 종양 마커는 생체내에 다수 존재하는 생리활성 물질 등이고 그 함유량은 질병에 따라 어느 정도 상관관계가 있는 경우도 있지만 실제 정상세포에도 발견되며, 질적으로도 정상세포 유래인지 이상세포 유래인지 판별하기 어렵다. 특히 정량적, 정성적으로 유효한 암 마커는 현재 존재하지 않는 상태이다.
유럽 특허출원 공개 제 0 722 773 A1 호는 혈액에서 TGF-β1의 농도를 측정하므로써 암을 검색하는 방법으로서, TGF-β1을 흡착제에 흡착시킨 후 용출하여 농도를 측정하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 이 방법은 흡착제에 흡착 또는 용출하는 과정에서 측정오차를 유발할 수 있고, UV 검출기만으로 용출된 시료를 검색하는데는 감도의 한계가 있다는 문제점이 있다.
따라서, 암검색을 위한 TGF-β1의 효과적인 정량을 위해서는 측정감도의 향상이 요구된다.
본 발명자들은 TGF-β1을 감도높게 정량하기 위한 방법 및 이를 이용한 암검색 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, TGF-β1과 특이적으로 결합하는 III형의 수용체 및 항 TGF-β1 단일클론항체를 제조하고, 이들을 포함하는 조성물을 이용한 검색방법을 사용하여 암시료와 정상대조군에서의 TGF-β1의 농도 측정을 실시하여 암검색을 위한 유효성을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
TGF-β1과 결합하는 수용체는 각기 다른 결합상수를 가지는 I, II, III형이 알려져 있다. 이중 III형의 수용체는 베타글라이칸이라고도 불리워지며 I형과 II 형과는 다른 생물학적 활성을 가진다.
따라서, 본 발명의 목적은 TGF-β1의 농도를 감도높게 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 체액중의 TGF-β1을 정량함으로써 암을 검사하는 방법 및 암 검사용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TGF-β1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 세포주를 제공하는 것이다.
도 1은 III형 수용체에 의한 TGF-β1 표준시료의 검색감도를 나타낸 것이다.
도 2는 III형 수용체에 의한 TGF-β1 표준시료의 검색감도를 II형 수용체에 의한 것과 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 정상 대조군 및 위암, 간암 및 유방암 환자의 혈장 시료에서의 TGF-β1 농도의 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 정상 대조군 및 폐암, 직·대장암, 전립선암 및 자궁경부암 환자의 혈장 시료에서의 TGF-β1 농도의 분포를 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 TGF-β1을 포함하는 검체를 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체에 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시키고 TGF-β1특이적 항체를 이용하여 상기 TGF-β1-수용체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 TGF-β1의 정량 방법이 제공된다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 체액을 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체에 가하여 체액중에 포함된 TGF-β1와 수용체의 복합체를 형성시키고, TGF-β1 특이적 항체를 이용하여 TGF-β1-수용체 복합체를 검출함으로써 체액중의 TGF-β1 농도를 측정한 후 얻어진 측정치를 정상인의 것과 비교하는 것을 포함하는 암의 검사 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체 및 TGF-β1 특이적 항체를 포함하는 암 검사용 조성물이 제공된다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 TGF-β1에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 hTGF-46(기탁번호: KCTC 0460BP)을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 TGF-β1 정량 방법은, 바람직하게는, TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체를 고체 지지체에 부착시키고, 이 수용체에 TGF-β1을 포함하는 검체를 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시킨 후, 이 복합체에 표지된 TGF-β1 특이적 항체를 가하여 결합시키고, 상기 표지를 이용하여 상기 복합체를 검출하는 단계들을 포함한다.
상기 표지로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 바이오틴 및 형광물질이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체로는 I형, II형, III형 TGF-β1 수용체 등을 사용할 수 있으며, 특히 III형 TGF-β1 수용체가 바람직하다. 상기 TGF-β1 수용체들은 포유동물세포주 또는 곤충세포주에서 발현시켜 얻을 수 있다. 특히 III형 TGF-β1 수용체는 이를 발현하는 재조합 백큘로바이러스(baculovirus)에 감염된 곤충세포주에서 발현된 불용성 수용체 단백질을 우레아 또는 구아니딘 HCl로 가용화시킨 후 TGF-β1과의 결합능을 회복하기 위해 구아니딘 HCl 또는 우레아를 제거하여 리폴딩함으로써 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 TGF-β1 특이적 항체는 TGF-β1 전체 분자 또는 그의 일부를 동물에 면역화하여 제조될 수 있으며, 단일클론 항체 및 다클론 항체를 포함한다.
TGF-β1을 정량하기 위한 예시적인 방법으로서는, TGF-β1 수용체를 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰(well)과 같은 고체 지지체에 부착시킨 후 검체 시료를 적정농도로 희석하여 첨가하고 일정시간 반응시킨다. 반응 후 인산염 완충용액(PBS)으로 세척한 다음, 발색효소가 부착된 항 TGF-β1 항체를 첨가하여 반응시킨 후 세척한다. 마지막으로 발색기질을 첨가하여 발색시키고 흡광도를 측정한 후 표준정량곡선으로 정량화함으로써 검체 시료중의 TGF-β1의 양을 측정할 수 있다.
TGF-β1을 정량하기 위한 예시적인 다른 방법으로는, 고체 지지체에 부착시킨 TGF-β1 수용체 대신에 TGF-β1 수용체를 포함하는 액체를 사용할 수 있다. 이 방법에서는 검체 시료를 TGF-β1 수용체를 포함하는 액체에 가하고 표지된 TGF-β1특이적 항체를 가한 후 항체-TGF-β1-수용체 복합체를 침전시키고 발색시킨 후 흡광도를 측정함으로써 검체 시료중에 TGF-β1의 양을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 30 pg/ml 이하의 저농도 TGF-β1도 검출할 수 있다.
또한, 검체 시료로서 사람의 체액, 예를 들어, 혈장 또는 뇨액을 사용하여 상기 방법에 의해 혈액 또는 뇨액중의 TGF-β1의 양을 측정하고 이를 정상인의 것과 비교함으로써 암을 검사할 수 있다. 예를 들어, TGF-β1 수용체를 고체 지지체에 부착시키고, 체액을 첨가하여 체액중의 TGF-β1와 수용체의 복합체를 형성시키고, 효소와 결합된 TGF-β1 특이적 항체를 가하여 반응시킨 후 효소의 기질을 가하여 발색시킴으로써 체액중의 TGF-β1을 정량하고 이 측정치를 정상인의 것과 비교하여 암을 검사한다. 본 발명의 암 검사 방법은 특히 위암, 간암, 유방암, 폐암, 직·대장암, 전립선암 및 자궁경부암의 검사에 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 검사 방법에 사용하기 위한 본 발명의 암 검사 조성물은 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 수용체, 바람직하게는, III형 TGF-β1 수용체, 및 항 TGF-β1 항체를 포함하며, 검사 대상의 체액을 시료로 하여 상기 방법에 따라 암 검사에 사용할 수 있다.
본 발명에서는 더욱 감도 높은 검출을 위해, 세포융합법에 의해 TGF-β1 전체분자 또는 일부 항원결정기를 면역원으로 사용하여 TGF-β1 특이적인 단일클론항체를 분비하는 세포주를 제조하고 이로부터 생산된 단일클론항체를 분리하여 항 TGF-β1 항체로서 사용한다.
즉, 사람의 TGF-β1을 생쥐에 면역화시키고 이로부터 추출한 비장세포와 미엘로마세포를 종래의 세포융합법(Kohler and Milstein,Eur. J. Imunol.,6:511- (1975))에 의해 융합시킨다. 사람의 TGF-β1 항원에만 특이적으로 반응하는 융합세포군을 효소면역분석법(ELISA)으로 선별한다. 상기에서 선별된 융합세포군이 생산하는 단일클론항체의 소단위형(subclass)을 면역확산법으로 결정하고 그중 소단위형이 IgG1이고 항체 역가가 높은 하나의 하이브리도마 세포주를 hTGF-46이라 명명하여 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1998년 4월 20일자 기탁번호 제 KCTC 0460BP 호로서 기탁하였다.
본 발명에서 수립한 세포주는 베타-림포마(β-limphoma)로부터 유래한 것으로서, 계속 분열하면서 사람의 TGF-β1에 특이적인 면역글로불린 G1형(IgG1 type)의 항체를 생성하는 생쥐 하이브리도마 세포주이다. 이 하이브리도마 세포주는 배양 플라스크의 바닥에 붙지 않고 배양배지에 떠서 자라는 세포이며 크기는 직경이 15 ∼ 20 ㎛로 둥근 형태를 하고 있다. 배양조건은 10% 소태아혈청을 함유한 RPMI 1640 배지를 가하여 37℃에서 배양하고 5% CO2와 100% 습도를 유지할 수 있는 배양기를 사용한다. 세포의 숫자가 두배로 늘어나는 시간은 12 ∼ 14 시간이다.
상기 융합세포주로부터 사람의 TGF-β1에 대한 단일클론항체를 대량으로 생산하기 위해서는 상기 융합세포주를 생쥐에 주사하고 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 고농도의 융합세포를 함유하는 복수액을 취한 후 이로부터 본 발명의 단일클론항체를 얻는다.
본 발명의 단일클론항체는, 사람의 TGF-β1, β2 및 β3을 전기영동하고 본발명의 단일클론항체로 웨스턴 블랏을 수행할 때 TGF-β2나 β3은 인식하지 않고 TGF-β1만을 인지하는 특이적 항원 인식능력을 나타낸다. 또한, 사람 TGF-β1에 대하여 높은 결합 친화도를 보이며, 사람 TGF-β1의 5 내지 80번째 아미노산으로 이루어진 에피토프 부위에 결합한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: TGF-β1의 검색 감도 확인
(단계 1) TGF-β1 III형 수용체의 제조
플라스미드 pCEP4(Invitrogen사)에 클로닝된 인간 TGF-β1 III형 수용체의 전체 cDNA 서열로부터 서열번호: 1 및 2의 프라이머 RIII1 및 RIII2를 사용하여 PCR을 수행하여 세포외 도메인을 포함하는 부위(아미노산 1-400)의 서열을 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편을 재조합 백큘로바이러스(baculovirus) 벡터인 pCRBac(Invitrogen사)에 삽입시켜 제작된 플라스미드 pCRBac-TGFR로 대장균을 형질전환시키고 앰피실린을 포함하는 선별배지에서 재조합된 플라스미드를 포함하는 균주를 선별하였다.
벡터 pCRBac-TGFR과 Bac-N-Blue DNA(Invitrogen사)를 리포좀 형질감염(liposome transfection) 방법으로 곤충세포주 Sf-21(Invitrogen사)에 동시도입시켰다. 도입 3일 후에 얻어지는 전체 바이러스중 재조합 바이러스를 lacZ유전자의 발현을 선택 마커로 하여 플라크 분석 방법으로 선발하였다. 선발된 바이러스의 TGF-β1 수용체 유전자 삽입여부는 서열번호:3 및 4의 프라이머를 사용한 PCR 방법으로 확인하였다. 이때 야생 백큘로바이러스는 839 bp의 PCR 생성물을 보이는 반면 올바른 III형 수용체 유전자가 삽입된 재조합 바이러스의 경우에는 1.5 kbp의 생성물을 보이게 되므로 재조합 바이러스가 올바른 유전자를 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
확인된 재조합 바이러스를 다시 Sf21 세포주에 감염시키고 감염 5일 후에 원심분리하여 세포 부유물을 제거한 바이러스 상층액을 얻어 수확하였다.
바이러스 상층액을 다시 Sf21 세포주에 접종하고 10% FBS(fetal bovine serum)와 TC 이스톨레이트(yeastolate), 락토알부민 가수분해물이 포함된 그레이스 인섹트(Grace Insect) 배양액(Invitrogen사)에서 27℃로 배양하였다. 접종 후 72시간에 세포를 수거하여 PBS로 세척하고 단백질 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM β-머캅토에탄올, 1% Triton X-100 및 2 mM BMSF)을 가한 후 100℃에서 10분간 가열하여 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블랏팅 분석시료를 준비하였다. 전기영동은 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 수행하고 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하여 관찰하였으며, 웨스턴 블랏팅은 SDS-PAGE 젤을 나이트로셀룰로즈 필터에 전기적으로 옮기고 TGF-β1 수용체에 대한 항체(R&D Systems Inc.)를 붙인 후 HRP가 결합된 항-IgG 2차 항체(Chemicon)로 분석하여 III형 수용체 단백질의 발현을 확인하였다.
발현된 수용체 단백질은 불용성이므로 8M 구아니딘 HCl(pH 8.0)을 가하고 1시간 동안 교반한 다음 7,000 rpm에서 40 분 동안 원심분리하고 상층액을 취해 2 mg/ml의 농도로 맞추었다. 여기에 리폴딩 완충액(100 mM Tris, 0.5M arginin, 0.2M EDTA pH 8.0)에 가용화시킨 시료를 첨가하여 최종 농도가 150 ㎍/㎖가 되게 하고 10 ℃에서 40 시간 동안 반응시켰다. 이 용액을 20 mM Tris 용액(pH 8.0)으로 4 시간씩 2회, 하룻밤, 2 시간씩 2회 단계적으로 투석하여 수용체를 효과적으로 리폴딩시켰다.
(단계 2) TGF-β1 III형 수용체에 의한 TGF-β1의 검색 감도 확인
리폴딩한 TGF-β1 III형 수용체 2μg씩을 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 가하고 상온에서 24시간동안 부착시켰다. 2 ng의 정제된 TGF-β1(R & D systems Inc.)을 PBS에 녹이고 단계별 농도로 희석액을 제조하였다. 각 희석액을 100 ㎕의 양으로 웰에 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켜 수용체와 TGF-β1을 결합시켰다. 각 웰을 인산염 완충용액(PBS)-트윈(Tween) 20(0.05%)(PBST 용액)으로 세척한 후 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; HRP)가 부착된 항 TGF-β1 항체(R & D systems Inc.)를 가하고 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. PBST로 웰을 세척한 후 HRP 효소의 기질인 TMB-ELISA(Gibco-BRL)를 100 ㎕의 양으로 가하고 상온에서 20분 동안 반응시켜 발색시킨 후 25 ㎕의 2N 황산을 넣어 반응을 정지시켰다. 측정파장 450 nm, 보정파장 570 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
도 1은 III형 수용체에 의한 표준시료의 검색감도를 나타낸 것으로서, 본 발명의 정량 방법은 기존의 검색감도보다 높은 10 pg까지의 TGF-β1을 검색할 수 있어 pg단위의 탁월한 검색감도를 나타낸다. 또한 표준곡선의 직선성은 0.999를 나타낸다.
한편, II형 수용체(R & D systems Inc.)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 TGF-β1의 검색감도를 조사하고, 그 결과를 III형 수용체를 이용한 경우와 비교하여 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 동일한 TGF-β1의 농도에서 III형 수용체를 이용할 경우 II형 수용체를 이용한 경우에 비하여 높은 검색 감도를 나타낸다. 또한, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, III형 수용체를 이용한 경우에는 II형 수용체를 이용한 경우에 비하여 검색 감도가 높고 표준곡선의 기울기가 커서 더 높은 감도를 나타내므로 미량의 TGF-β1 존재상태에서 검색이 용이하다.
실시예 2: III형의 TGF-β1 수용체의 결합특이도
TGF-β1 대신에 2,000 pg/㎖ TGF-β1, 2,000 pg/㎖ TGF-β2 및 2,000 pg/㎖ TGF-β3의 혼합물을 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 단계 2와 동일하게 실시하여 TGF-β1의 검색감도를 조사하였다. 그 결과는 하기 표 3과 같고, 시험군의 검색감도는 2,000 pg/㎖ TGF-β1을 사용한 경우(대조군)의 검색 감도에 대한 백분율로 나타내었다.
TGF-β1 | TGF-β1+TGF-β2+TGF-β3 | |
TGF-β1 III형 수용체 | 100% | 91.5% |
표 3에서 보듯이, III형의 수용체가 다른 TGF-β 군(family)에 대한 교차반응 없이 TGF-β1에 대해 결합 특이도를 가진다.
실시예 3: 단일클론 항체를 사용한 정상인 및 암환자의 혈장에서 TGF-β1 농도 측정방법
정상인(101명) 및 암환자(위암 111명, 간암 100명, 유방암 151명)로부터 채취한 혈액에 항응고제로서 EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)를 가하고 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장 0.1 ㎖에 2.5 N 아세트산/10M 우레아 용액 0.1 ㎖를 넣고 잘 섞은 후 상온에서 10분간 방치하였다. 여기에 2.7 N NaOH/1M HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic aicd) 용액 0.1 ㎖를 넣어 중화하였다. 이렇게 활성화된 혈장을 PBST 용액으로 4배 희석하여 TGF-β1 농도 측정에 사용하였다. 위와 같이 준비한 혈장시료와 TGF-β1 표준물질(0, 100, 1000, 2000 pg/㎖) 각각 0.1 ㎖을 TGF-β1 수용체가 고정된 96 웰 플레이트에 넣고 상온에서 3시간 정치시킨 후, PBST 용액으로 세 번 세척하였다. 여기에 순수 정제된 항 TGF-β1 단일항체-HRP 결합체(Sigma)를 넣고 상온에서 1시간 30분 정치시킨 후 PBST 용액으로 세 번 세척하였다. HRP의 기질인 TMB-ELISA(Gibco-BRL) 0.1 ㎖을 넣고 상온에서 20분간 반응시켜 발색시킨 후 25 ㎕의 2N 황산을 넣어 반응을 정지시켰다. ELISA 리더(reader)에서 측정파장 450 nm, 보정파장 570 nm로 하고 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그리고, 이로부터 TGF-β1 농도를 측정하였다.
각 종양 환자 시료에서의 TGF-β1 농도를 표 4에 나타내었으며, 각 시료별 TGF-β1 농도의 분포를 도 3에 나타내었다.
상기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 혈장내 TGF-β1의 평균 농도는 정상대조군의 경우 1.03 ng/㎖, 위암 환자의 경우 6.53 ng/㎖, 간암 환자의 경우 5.89 ng/㎖, 유방암 환자의 경우에는 수술전과 후에 각각 5.49 ng/㎖와 2.15 ng/㎖로 측정되었다. 또한, 도 3에서 보이는 바와 같이, TGF-β1 농도의 분포는 정상대조군과 암시료에서 존재양상이 뚜렷이 대별된다. 이러한 결과는 본 발명의 방법에 의해 체액중 TGF-β1의 농도를 측정함으로써 효과적으로 상기 암들을 검사할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: 단일클론 항체를 사용한 정상인 및 암환자의 혈장에서 TGF-β1 농도 측정방법
정상인(288명) 및 암환자(폐암 29명, 직·대장암 48명, 전립선암 50명 및 자궁경부암 88명)로부터 채취한 혈액을 이용하여 실시예 3과 동일한 방법으로 TGF-β1 농도를 측정하였다. 각 종양 환자 시료에서의 TGF-β1 농도를 표 5에 나타내었으며, 각 시료별 TGF-β1 농도의 분포를 도 4에 나타내었다.
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 혈장내 TGF-β1의 평균 농도는 정상대조군의 경우 1.17±0.05 ng/㎖, 폐암 환자의 경우 8.48±1.27 ng/㎖, 직·대장암 환자의 경우 5.19±0.87 ng/㎖, 전립선암 환자의 경우 4.12±0.53 ng/㎖, 그리고 자궁경부암 환자의 경우에는 8.55±0.92 ng/㎖로 측정되었다. 또한, 도 4에서 보이는 바와 같이, TGF-β1 농도의 분포는 정상대조군과 암시료에서 존재양상이 뚜렷이 대별된다. 이러한 결과는 본 발명의 방법에 의해 체액중 TGF-β1의 농도를 측정함으로써 효과적으로 상기 암들을 검사할 수 있음을 입증한다.
실시예 5: 다클론항체를 사용한 정상인과 암환자 혈장에서 TGF-β1 농도 측정방법
정상인(50명) 및 암환자(간암 50명 및 유방암 50명)로부터 채취한 혈액을 이용하여 실시예 3과 동일한 방법으로 TGF-β1 농도를 측정하였다. 각 종양 환자 시료에서의 TGF-β1 농도를 표 6에 나타내었다.
간암 | 유방암 | 정상 | |
평균 | 5.14±0.57 | 5.31±0.46 | 1.19±0.08 |
표준편자 | 2.92 | 1.67 | 0.29 |
측정범위(ng/ml) | 1.44-16.96 | 2.07-10.27 | 0.70-1.9 |
p<0.05 |
표 6에서 보듯이, TGF-β1 농도의 분포는 정상대조군과 암시료에서 존재양상이 뚜렷이 대별된다. 이러한 결과는 본 발명의 방법에 의해 체액중 TGF-β1의 농도를 측정함으로써 효과적으로 상기 암들을 검사할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: TGF-β1에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 제조
(단계 1) 생쥐의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, TGF-β1과 동량의 프로인트 완전 보조액(Complete Freund Adjuvant)을 유상화가 될 때까지 잘 혼합하여 생후 6-8주된 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥내에 100㎕의 양으로 주사하였다. 2주 후에 1차 주사와 같은 양을 프로인트 불완전 보조액(Freund's incomplete adjuvant)에 혼합하여 동일 부위에 주사하였다. 그 후 4∼5일 후에 생쥐 꼬리 부위의 혈관에서 소량의 혈액을 채혈하여 ELISA 방법으로 항체의 역가를 확인한 후 세포융합 실험 3∼4일 전에 0.85% 생리식염수에 녹인 30 ㎍의 사람 TGF-β1의 단백질을 정맥 내에 주사하였다.
(단계 2) 세포 융합
세포융합의 모세포로는 마이엘로마(myeloma) 세포 SP2/0ㆍAg14(ATCC CRL 1581)를 사용하였다. 이 모세포는 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 최대밀도 5×105/㎖ 정도로 항상 유지시켰다.
(단계 1)에서 면역화된 생쥐를 에테르로 마취하고 비장조직을 꺼내서 조직분쇄기로 곱게 간 후 HBSS에 현탁시켰다. 제조된 비장세포 현탁액을 15 ㎖ 원심분리관에 넣어서 원심분리하고, 이 방법을 2회 반복하여 비장세포를 충분히 세척하였다. 한편 모세포인 SP2/0ㆍAg14도 HBSS를 사용하여 2회 원심분리하였다. 비장세포와 SP2/0ㆍAg14을 각각 10 ㎖의 HBSS에 재현탁시킨 후 각자의 세포 수를 세어서 비장세포와 SP2/0ㆍAg14의 비율이 10 : 1이 되도록 면역화된 생쥐의 비장세포 108개와 SP2/0ㆍAg14 107개를 50㎖의 원심분리관에서 섞어 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 37℃에서 1분간 유지시켰다. 여기에, HBSS에 들어있는 45% PEG(w/v)-5% DMSO(w/v)의 혼합액 1 ㎖을 1분간에 걸쳐 넣고 또 다시 1분간 약간 흔들어 주었다. 그 후 RPMI 9 ㎖을 3분간 걸쳐 첨가하고, 원심분리관을 흔들어 주면서 50 ㎖이 될 때까지 RPMI를 서서히 첨가하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포 펠릿(pellet)을 HAT 배지에1∼2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 0.2 ㎖씩 넣은 후 37℃, 5% CO2, 100%습도의 배양기 안에서 수일 동안 배양하였다.
(단계 3) 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
(단계 2)에서 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 사람의 TGF-β1 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 사람의 TGF-β1을 이용한 ELISA 분석방법으로 다음과 같이 선별하였다.
마이크로타이터 플레이트에 사람의 TGF-β1 항원을 각 웰당 50 ㎕(2 ㎍/㎖)씩 가하고 상온에서 12시간동안 반응시켜 플레이트 표면에 부착시킨 후, 반응하지 않은 항원은 PBST 용액으로 세척하여 제거하였다.
하이브리도마 세포의 배양액을 각 웰에 50 ㎕씩 가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP; Sigma)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후, 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 100㎕의 양으로 넣어 상온에서 20분 동안 반응시키고, ELISA 리더로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 반응정도를 확인하였다.
그 결과, 사람의 TGF-β1 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 먼저 선별하였고, 사람의 TGF-β1, β2 및 β3를 이용하여 사람의 TGF-β1 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 선별된 세포주를 단일클론이 되게 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주들을 선별하여 7개의 클론을 얻었다. 이들 클론을 동결보존하였고 배양 상등액을 이용하여 효소면역측정법으로 항체 역가를 측정한 후 이중면역확산법에 의해 서브타입(subclass type)을 확인한 결과, 7 개의 클론 모두 IgG1으로 판명되었다(표 7).
IgG1으로 판명된 클론을 재선별하여 가장 높은 역가를 보이는 1개의 클론을 선별하여 이 클론을 생쥐의 복강에 주사하여 복수액을 만들었다. 그 결과, 선별된 세포주가 사람의 TGF-β1에 대한 특이성이 높은 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포주임이 확인되었다.
실시예 7: 단일클론항체의 대량 생산
실시예 6에서 제조된, TGF-β1에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주로부터 단일클론항체를 대량 생산하기 위하여, Balb/c 생쥐에 0.5 ㎖의 프리스탄(pristane)을 복강내로 주사하였다. 1주일 후에 각 하이브리도마들을 생쥐 1마리당 5×106개씩 주사하고, 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액에는 하이브리도마 세포가 고농도로 자라기 때문에 이를 10,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상층액만을 취하고 이 상층액은 -20℃에서 보관하였다.
프로틴 G 비드를 컬럼에 충진하고 4배량의 1X PBS로 세척하였다. 상기 상층액 2 ㎖을 분당 5방울로 흘려 수지에 결합시키고 0.1 M 글라이신-HCl을 10초당 1방울의 유속으로 흘려 용출시킴으로써 IgG를 순수분리하였다.
HRP를 1.25% 글루타르알데히드가 첨가된 0.1 M 인산 나트륨 완충액(pH 6.5)에서 활성화시키고, 활성화된 HRP를 탄산염 완충액(pH 9.2)로 투석시킨 다음 순수분리된 IgG와 결합시켰다. 반응이 완결된 후 RZ값(A403/A280) 측정을 위해 280 nm와 403 nm에서 흡광도를 측정하고, 효소접합항체의 활성을 측정하기 위해 TGF-β1(0.1 ㎍/웰)을 마이크로타이터 플레이트에 코팅한 후 제조된 hTGF-46-HRP를 반응시켜 활성도를 조사하였고, 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
실시예 8: 웨스턴 블랏팅에 의한 항체 특이성 확인
사람의 TGF-β1에 특이적으로 반응하는 본 발명의 단일클론항체가 사람의 TGF-β2 및 β3에 대해 반응하는지를 확인하기 위하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 웨스턴 블랏팅 방법을 사용하였다.
사람의 TGF-β1, β2 및 β3 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 다음 나이트로셀룰로즈 필터막에 전기적인 방법으로 옮겼다. 막에 옮긴 단백질의 비특이적인 반응을 줄이기 위해 3% 소혈청 알부민 용액으로 상온에서 12-14시간 동안 막을 차단시켰다. 탐침 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 확인하기 위하여, 1차 항체로 실시예 6에서 얻은 단일클론항체를 사용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 막을 0.5% 트윈이 포함된 인산염 완충액으로 3회 세척한 다음 2차 항체로는 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 항-생쥐 IgG(Sigma)를 사용하여 상온에서 반응시켰다. 필터막을 다시 0.5% 트윈이 포함된 인산염 완충액으로 세척한 후 0.018%(v/v) 4-클로로-1-나프톨과 0.045%(v/v) H2O2가 인산 완충용액과 메탄올에 녹아 있는 기질을 막에 가하여 발색반응을 시켰다.
그 결과, 본 발명의 단일클론항체는 사람의 TGF-β1과 반응하는 결과만을 나타낼 뿐 사람의 TGF-β2나 사람의 TGF-β3과는 반응하지 않으므로 본 발명에서 생산한 단일클론항체가 사람의 TGF-β1에 특이적으로 반응하는 항체임을 확인하였다.
TGF-β1 수용체 및 TGF-β1에 특이적으로 반응하는 항체를 이용한 본 발명의 TGF-β1 정량방법에 의하면 TGF-β1을 감도높게 정량할 수 있을 뿐만 아니라, TGF-β1의 공급원으로서 사람의 체액을 사용하면 TGF-β1의 감도높은 정량에 의해 높은 정확도로 암을 검사할 수 있다.
Claims (23)
- TGF-β1을 포함하는 검체를 TGF-β1과 특이적으로 결합하는 TGF-β1 Ⅲ형 수용체에 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시키고 TGF-β1 특이적 항체를 이용하여 상기 TGF-β1-수용체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 TGF-β1의 정량 방법.
- 제1항에 있어서,(a) TGF-β1과 특이적으로 결합하는 TGF-β1 Ⅲ형 수용체를 고체 지지체에 부착시키고,(b) 상기 TGF-β1 Ⅲ형 수용체에 TGF-β1을 포함하는 검체를 가하여 TGF-β1-수용체 복합체를 형성시키고,(c) 상기 복합체에 표지된 TGF-β1 특이적 항체를 가하여 결합시키고,(d) 상기 표지를 이용하여 상기 복합체를 검출함으로써 검체중의 TGF-β1 농도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 TGF-β1 특이적 항체가 TGF-β1 전체 분자 또는 그의 일부를 동물에 면역화하여 제조된 항체임을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서,상기 항체가 단일클론 항체 또는 다클론 항체임을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서,상기 단일클론 항체가 하이브리도마 세포주 hTGF-46(기탁번호: KCTC 0460BP)에 의해 생산된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 TGF-β1의 검출한계가 30 pg/ml 또는 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서,상기 표지가 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 바이오틴 또는 형광물질인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 검체가 혈장 또는 뇨액임을 특징으로 하는 방법.
- TGF-β1과 특이적으로 결합하는 TGF-β1 Ⅲ형 수용체 및 TGF-β1 특이적 항체를 포함하는 암 검사용 조성물.
- 삭제
- 사람 TGF-β1 특이적 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 hTGF-46(기탁번호: KCTC 0460BP).
- 하이브리도마 세포주 hTGF-46(기탁번호: KCTC 0460BP)에 의하여 생산되는, 사람 TGF-β1 특이적 단일클론항체.
- 제19항에 있어서,상기 암이 위암, 간암, 유방암, 폐암, 직·대장암, 전립선암 또는 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 조성물.
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