JPH01175945A - 抗ビリルビンモノクローナル抗体固定担体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、抗体固定担体、その製造方法およびその用
途に関するものであり、更に詳細には、血液または血清
から有害物質を選択的に除去することができるモノクロ
ーナル抗体を固定化した抗体固定担体、その製造方法お
よびそれを１ｆｌｌ流循環経路に配置して血液または血
清からそのイＩ害物質を選択的に除去するための用途に
関するものである。

健常人は、体内の老廃物質を静脈流により循環２させ、
その循環経路にある腎臓により吸収して、腎臓から体外
に排泄されるシステムが有効に作用している。しかし、
何らかの障害によりこの排泄システムが正常に作用しな
い患者は、かかる体内の老廃物質を人為的に除去してや
る必要がある。

かかるシステムとして腎臓透析が行なわれている。しか
し、このような腎ｌ１）′ｄ１析システムによっても容
易には除去できない有害物質があり、かかる有害物質を
簡便にかつ有効に除去できるシステムが未だに１３１発
されていないのが現状である。また、肝臓切除や肝臓移
植後、肝臓の解毒・排泄機能が回復するまでの人工肝臓
においても、ビリルビンを始めとするｆＴ￥！Ｆ物質の
除去は非常に困難でかつ厄介な問題である。

かかる現状に鑑みて、この発明者らは、１ｕｌｌ液また
はその血清内の有害物質に対して特異性を有する抗体、
殊にモノクローナル抗体を使用すればかかる有害物質を
有効にかつ簡便に除去できるシステムが開発できるので
はないかと鋭意努力した結果、かかるモノクローナル抗
体を抗体固定１）Ｈ１体に固定化して得られた抗体固定
担体な利用すれば、そのような有害物質を（ｉ効に除去
することができ、患者にとってその占痛を除去もしくは
著しく軽減できる換めて有効な排泄システムが開発でき
ることが判明して、この発明を完成した。

以ド、この発明の詳細な説明する。なお、この発明に係
る抗体固定担体を利１）１シた排泄システムを使用する
ことができる血液または１）１）清中の有害物質として
は、ビリルビン類、胆汁酸、トキシン等の毒素、または
薬剤等があるが、以下において具体的に説明する場合に
は、とリルビンな例に挙げて説明するが、特記ない限り
その他の有１！Ｆ物質にも同様に適用できるものと理解
すべきである。

また、単に「ビリルビン」という用語を使用した場合に
は、特記ない限り、遊離のビリルビンを始め、その各種
異性体、グルクロン、酸等とのモノ、ジ抱合体、分解代
謝物等をも包含するものと理解すべきである。

この発明に係る抗体固定担体は、モノクローナル抗体を
抗体固定用担体に固定化させて得ることができる。この
発明に使用できるモノクローナル抗体は、血液または１
ｆｌｌ清中の所望するイ１害物質を選択特異的に認識で
き、か９つ、抗体固定用担体に固定化されて血流循環経
路に配置された場合に、血液または血清等に対し如何な
る悪影響をも及ぼすことなく、その有’ｉ！ｆ￥Ｍ質を
除去できるモノクローナル抗体を固定化することができ
ると共に、固定化された抗体固定用担体に対しても何等
悪影臂を及ぼすものでなければいずれも使用することが
できる。

かかるモノクローナル抗体としては、例えば、ビリルビ
ンを特異的に認識できるものが挙げられる。かかるモノ
クローナル抗体は、例えば、とリルビンな牛血清アルブ
ミンと酸無水物法により共有結合させて得たアルブミン
結合ビリルビンを抗原とし、それでマウスを免疫し、そ
の牌ｍｓｍ胞とマウス骨髄細胞とをポリエチレングリコ
ール法にて細胞融合しＩＩＡＴ選択培地で培養して作成
した。

かかるモノクローナル抗体は、当然のことながら、血清
成分であって、人体に必要なヘムタンパク、つまりビリ
ルビンはヘムタンパクの代謝産物、に対しては反応しな
い特性を有している。

なお、この発明に使用するモノクローナル抗体は、遊離
ビリルビンばかりでなく、ビリルビンの各種異性体、抱
合体、分解代謝物等に共通の部位を認識できるものがよ
い、これにより、１種のモノクローナル抗体を使用する
だけで３種ビリルビンを除去できることができ、礪めて
効率よくビリルビンを除去できることになる。しかし、
各種ビリルビンに対して選択特異性を有するモノクロー
ナル抗体をも使用できるのは当然である。

この発明において使用される抗体固定用担体としては、
モノクローナル抗体を固定化することができ、そのモノ
クローナル抗体に対して何ら悪い作用を及ぼさず、かつ
、血流循環経路に配置された場合に、血液やｔｉｌｌ清
に対して、特に血液内のＩｒｕ球等の有用成分に対して
何等悪影響を及ぼさないものであればいずれもこの発明
の目的に適したものである。かかる担体としては、マト
リックス構造を有するものが好ましい０例えば、セルロ
ース、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド
なと、特にアフィニティークロマトグラフィー川の担体
として使用されているものが好ましいが、高速液体クロ
マトグラフィー川樹脂等も使用することができる。

かかる担体にリガンドとしてのモノクローナル抗体を固
定化するには、常法に従って行なうことができる。この
リガンドと担体とは、例えば、アミド基、暁黄結合、ト
レシル結合等を介してカップリングしていることが好ま
しい。

例えば、その固定化法を、アガロースを例にして、その
概略を説明すると次のようになる。アガロースを抗体固
定用担体として使用するには、アガロースは先ず活性化
されなければならない、この活性化法にしても、従来の
方法を使用することができ、例えば、縮合剤、ハロゲン
化シアン、過ヨウ素酸、架橋試薬、エポキシド等を使用
して、アガロースを活性化することができる０例えば、
Ａｌｌ型アガロース、Ｃ１ｌ型アガロース等のようにア
ミノ基、カルボキシル基を何するマトリックスの場合に
は、カルボジイミド等の縮合剤などを使用してリガンド
としてのモノクローナル抗体なアミド基を介して固定化
することができる。またエポキシ活性化アガロース等の
ようにエポキシ基を有するマトリックスの場合には、Ｓ
結合を介してリガンドとしてのモノクローナル抗体がカ
ップリングされる。更に、スクシンイミド基等を有する
活性化ＣＨアガロースのようなマトリックスの場合には
、アミド基を介してリガンドとしてのモノクローナル抗
体が固定化されることができる。更にまた、トレシル活
性化型マトリックスの場合には、例えば、そのトリフル
オロメチル基と、リガンドとしてのモノクローナル抗体
のアミノ基とがカップリングして固定化をすることもで
きる。

（効果） 上記のようにして１）られたこの発明による抗体固定担
体は、例えば、既仔の腎臓透析システムの１部としてそ
のシステム内に組み込んで配置することもでき、また腎
臓透析が必要でない患者に対しては、例えば腎臓透析シ
ステムのような透析システムとしても利用できる。また
肝臓切除や肝臓移植などによって肝臓の機能が弱ってい
る患者に対して、肝臓の機能が回復するまで取り付けら
れる人工肝臓などにも組み込んで使用でき、治療上から
も纒めて有用である。

以上説明したように、この発明にかかる抗体固定担体は
、血液または狸清中からイｉ害物質だけを選択特異的に
排除でき、患者の苦痛を簡単にかつ効率的に排除または
緩和できる礪めて有用なものである。

（実施例） 以下、実施例によってこの発明を説明する。

実施例１ （抗原の調製） ウシ血清アルブミンＩＯＢをジオキサン２．　Ｏｗｌに
溶解してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を得た。

これとは別に、ビリルビンｌｈｇをジメチルスルホキシ
ド１．　Ｏｗｌに溶解し、トリーｎ−ブチルアミン３．
０μｌとイソブチルクロロホルメート２６口μｌによっ
て活性化した。これに８．１Ｎ水酸化チトリウム５０μ
ｍを添加した後、この溶液を、ｆｌＱ述したようにして
得たウシ血清アルブミン溶液に滴加した。この溶液のｐ
ＨをＩＮ塩酸または水酸化ナトリウムで約９．５に調整
した後、この混合液を４℃で１２時間撹拌してカップリ
ングを終ｒした。この反応液からセファデックスＧ−２
５を使用したゲル濾過により結合ビリルビン−ＢＳＡ　
（ビリルビン８モル／タンパク１モル）・を得た。

（モノクローナル抗体のＸＲ製） １−で（すた結合ビリルビン−ＵＳＡを同量のフロイン
ト・アジュバントで乳化した乳化液１００μ１（５０μ
ｇ）をＢＡＬＩＩ／ｃマウスに腹腔内注射をして免疫し
た。細胞融合する４日前から、マウスに１日当たり　２
００μｌ、　４００μ！、４００μ＋、　４００μｌを
それぞれ追加注射した。この免疫したマウスのｌｌ１）
！臓細胞とマウス骨髄細胞（Ｐ３−Ｘ６３八ｇ−旧）と
をポリエチレフグリコール法にて細胞融合を行なった。

細胞融合した細胞をＨＡ　Ｔ培地で培養して選択した後
、ビリルビンに特異的なモノクローナル抗体を産生した
バイプリドーマを常法により処理して所望のモノクロー
ナル抗体を得た。

（固定化処理） 前述のようにして得たモノクローナル抗体のうちビリル
ビンと高い結合特性（Ｋｏ　＝１．３３　ｘ　１０−’
藺）を示したクローンを用いてイムノグロブリン［Ｉｇ
Ｇ）を大川精製し、活性化したＣ　Ｎ　ｌｌ　ｒ−セフ
ァ℃】−スに固定化した（なお、固定化量は、乾燥セフ
ァロース１ｇ当たり　２０−ｇであった）。

なお、この固定化は次のようにして行なった。

Ｉｇ乾燥ｍｍのＣＮＢｒ−セファロースをガラスフィル
ター上で洗浄と膨潤とを繰り返した。このようにして膨
潤させたゲルを、カップリングする抗体３＋Ｈを溶解し
たカップリングバッファー（０，５１４ＮａＣ１を含む
０．１Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ＊　（ｐＨ８，３）溶液）で洗
浄した。この溶液をゲル懸濁液と混合し、４℃で１夜撹
拌した。このようにして得たゲルを１Ｍエタノールアミ
ン（ｐＨ８，（１）に移し、残りの活性基をブロックし
た０次いで、カップリングバッファー、ＮａＣ１（０，
５Ｍ１を含む０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，Ｏ）で
洗浄し、更にカップリングバッファーで洗浄して、過剰
の吸着抗体を洗い流した０次いで、このカップリングバ
ッファーを洗い流して固定化処理を完了した。なお、対
照として、ヒト血清アルブミン（ＩＩＳＡＩ　とマウス
γ−グロブリン　（Ｍ（ｉＧ）を同川づつ固定化したセ
ファロースをそれぞれへへ婦した。

この３種のタンパク固定化セファロースと、未処理のセ
ファロースをそれぞれ２１づつカラムに充填し、これに
ビリルビン値５　＋Ｈ／ｄｉに調整したヒトｔｉ１）清
くトレーサーとして約５　ｘ　ｌＯ’ｄｐｍの”ＩＩ−
とリルビンな添加）を各１＋ｍｌ添加しリン酸媛術液で
流出させた。その結果、ＩｇＧ−セファロースのカラム
には添加ｍの６１．３％に当たる　１７．５μｇ（セフ
ァロースＩｇ当たり）のビリルビンが吸着された。この
主は、Ｉ　Ｓ　Ａ−セファロースのカラムの３．５倍、
その他のカラムの数十倍であった。

更に、モニターした中で、総タンパクｒｔ、ＧＯＴ（１
＾、ＧＰＴ値、フィブリノーゲン値は全てのカラムにお
いてその通過ｎｊＩ後での変化は認められなかった。

実施例２ （ビリルビン抗原の製造） 未抱合ビリルビンｔｕｃｎ）　ｔｘαＩｈｇをジメチル
スルホキサイド１．０鵬ｌに溶解し、この溶液に、結晶
が生じないことが確実になった後、ト’）−ｎ−ブチル
アミン　３．０μｌおよびイソブチルクロロホルメート
２．（１μｍを添加した。

別に、ウシ１ｆｌｌ清アルブミンｌ１０５ｅをｕ、　０
２４Ｍ　Ｎａ０Ｉｌに溶解し、この溶液にジオキサン２
．０＋＊ｌを添加し、この混合液を１０．０ＯＯＧで５
分間遠心分離して、不溶物質を除去した。

次いで、上で得たビリルビン溶液にＮａ０１）５０ＪＡ
１を添加した後、別に作成したアルブミン溶液に直に°
滴加した。この混合液をＮ　ａ　ＯｌｌまたはｌｌＣｌ
でｐＨが９．５になるように調整し、次いでこの溶液を
４℃で一夜撹拌した。

得られた結合物は、セファデックスＧ−２５にょるゲル
濾過によって精製した。

未結合ビリルビンを４５０ｎｍによる吸収、アルブミン
をプロテインアッセーは調べた結果、得られた結合物に
は、アルブミン１モルに対して、ビリルビン８モルが結
合していることを確認した。

（モノクローナル抗体の製造） このようにして得たビリルビン抗原を開用のフロイント
完全アジュバントで乳化した乳化液１００μｍ　（６０
μｇ）をＢＡＬＩＩ／　ｃマウスに腹腔内注射をして免
疫した。細胞融合する４日前から、マウスに１日当たり
　２００μＩ、４００μｍ、４００μｍ、　４００μｌ
をそれぞれ追加注射した。

この免疫したマウスのＹＲ臓細胞とマウス骨髄細胞ｔｌ
）３−Ｘ６３−八ｇ８−０１）　とをｌＯＯ１２（Ｉｆ
ｆ臓細胞対骨髄細胞）の割合で混合して、４５％ポリエ
チレングリコール６０００を用いて３７℃で８分間処理
して細胞融合を行なった。このように処理した細胞をヒ
ボキサンチンーチミヂン（ＩＩＴ）培地に懸濁し、組織
培養プレートウェルに注入した後、５％ＣＯｔインキュ
ベーター中において３７℃で培養した。２４時間後、ハ
イブリドーマを選択するために、この培地を１）　Ａ　
’ｒ培地に変えると、２〜３Ｍ！間後にコロニーの発生
が目視できた。このようにして得られたコロニーの上澄
液を除去してＥＬＩＳＡ法で所望のモノクローナル抗体
が産生しているかを調べた。

次に、この方法でモノクローナル抗体産生が陽性であっ
た：】ロニーをマウス牌臓細ｎと共に更に培養した。

（スクリーニング） ＵＣＩＩ−１ｔｓ八　（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）　１００μｍ中１μｍ）の抗原溶液をポリスチレンプ
レートウェルに入れて、４℃で一夜放置した後、そのウ
ェルをＰＢＳで３回洗浄して吸着していない抗原を除去
し、次いで１％ゼラチン（ＰＢＳ）溶液を注入して室温
で１時間放置した。続いて、０．０５％ツイーン２０を
含有するＰＢＳで３回洗浄して未結合タンパクを除去し
た０次に、抗体を含有する上清液をｌＯ倍川用１％ＩＩ
　Ｓ　Ａ　−Ｐ　８　Ｓで希釈し、アリコートｌＯμｍ
をウェルに添加した。このウェルを３７℃で３０分間培
養して、０．０５％ツイーン２０を含有するＩ）　Ｂ　
Ｓで３回洗浄した後、ウサギ抗マウス　ＩｇＧ（Ｆａｂ
’）＊−ウレアーゼ・コンジュゲート（予め０゜２５％
ＵＳＡ−ＰＢＳで１００倍に希釈したもの）を添加した
。このウェルを３７℃で３０分間培養して、０．０５％
ツイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、基質
溶液！００μｌを各ウェルに添加して、室温で：３０分
間放１αして、Ｅｌ、ｌＳ八へ−ダー（東洋囲器製）を
使用して５９００鴎の吸収を測定した。この測定の結果
、６４個のクローンが、キャリヤータンパクには結合し
てなく、ｖ　ｃ　ｔｓに結合した特異的な抗体を産生じ
ていることが判明した。

このようにして得たクローンのうち、ＣｏｍｐｅＬｉ−
ｔｉｖｅ　５ａＬｕｒａＬｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓに
よって、ＵＣＢ抗原に対して最も高い反応性を示した１
６個のクローンを選択した。これらのクローンのサブク
ラスを常法により調べた結果、ＩｇＧ１が７個、ＩｇＧ
２ａが３個、ＩｇＧ２ｂが４個、１ｇＧ３がＨＬｒｇＧ
＆Ｉが１個であることを確認した。

（固定化処理） Ｌで得たモノクローナル抗体を、実施例１と実ττ的に
同様に処理して、アガロースマトリックスにカップリン
グさせた。

このマトリックスを用いて、実施例１と同様に処理した
ところ、実施例１のマトリックス同様血清中のビリルビ
ン類を同様に除去すると共に、その他の値には悪影響を
及ぼさないことが確認された。

実施例３ （抗原の製造法） ビリルビンを５％ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドを含
有するクロロホルム（ｔａｎｇ／ｍｌ）に溶解し、この
溶液にｐ−トルエンスルホン酸の結晶数個を添加した。

この混合液を暗所で約８時間ｒＪ！装置したところ、ビ
リルビンのエキソ−ビニル基にホルミルフェノキシ基が
結合したビリルビン誘導体が得られた。

得られたビリルビン誘導体は、次いで子牛＋０１清アル
ブミンと、水酸化カリウムでｐＨ９に調整した０、　３
３Ｍリン酸水素二カリウムの存在下で反応させて、ビリ
ルビン誘導体とアルブミンとが結合したシッフ塩基を生
成した。

次いで、このシッフ塩基を水素化はう素ナトリウムを用
いて室温で撹拌した後、還元して対応したシッフ塩が還
元された化合物が得られた。

この抗原を使用して上記と同様に処理して、モノクロー
ナル抗体を製造した。

このようにして得られた抗体を下記のように処理して、
アガロースマトリックスにカップリングさせた。つまり
、この抗体を水に溶解してｐＨを４．５に調整して、リ
ガンド溶液を調製した。他方、ω−カルボキシルへキシ
ルアミノ−アガロースゲル乾燥用爪１ｇを０．５ＭＮａ
Ｃ１２００＋ｍｌで洗浄して、アガロースマトリックス
をＪＡＩ製した。更に、ｌ−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１０ｇを水に
溶解してｐＨ４，５に７Ａ整し、この溶液を」二足のリ
ガンド溶液と混合した後、室温で１夜撹拌した０反応終
了後、過剰のリガンド、未反屋カルボジイミドならびに
副生物を水で洗い流した。

このようにしてカップリングさせたモノクローナル抗体
を使用して血清中のとクルビン類の除去効果を調べた結
果、上記の実施例と同様に良好な結果が得られた。

特許出願人　有限会社バイチクリサーチ（ほか１名）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液または血清から有害物質を選択的に除去する
   ことができるモノクローナル抗体を抗体固定用担体に固
   定化したことを特徴とする抗体固定担体。
2. （２）前記モノクローナル抗体が血液または血清中の有
   害物質を特異的に認識できるものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１）項に記載の抗体固定担体。
3. （３）前記有害物質がビリルビン、胆汁酸類、毒素また
   は薬剤であることを特徴とする特許請求の範囲第（２）
   項に記載の抗体固定担体。
4. （４）前記モノクローナル抗体がビリルビンに対して特
   異性を有することを特徴とする特許請求の範囲第（１）
   項に記載の抗体固定担体。
5. （５）前記抗体固定用担体がモノクローナル抗体を固定
   することができるものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）項に記載の抗体固定担体。
6. （６）モノクローナル抗体を活性化した抗体固定用担体
   に固定化して抗体固定担体を得ることを特徴とする抗体
   固定担体の製造方法。
7. （７）血液または血清から有害物質を選択的に除去する
   ことができるモノクローナル抗体を抗体固定用担体に固
   定化した抗体固定担体を血流循環経路に配置して、血液
   または血清から前記有害物質を選択的に除去することを
   特徴とする抗体固定担体の用途。