JPS61191620A - 細胞毒素及びその応用 - Google Patents

細胞毒素及びその応用

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JPS61191620A
JPS61191620A JP60286811A JP28681185A JPS61191620A JP S61191620 A JPS61191620 A JP S61191620A JP 60286811 A JP60286811 A JP 60286811A JP 28681185 A JP28681185 A JP 28681185A JP S61191620 A JPS61191620 A JP S61191620A
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cells
cytotoxins
monoclonal antibody
purified
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デビツド　ワラツク
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、ヒトの単核細胞に由来する細胞毒素、ＣＴ
、を精製した形で提供せんとするものである。この発明
は、本質的に均質な形で精製されたＣＴを調製する方法
を提供せんとするものである。また、この発明は、ＣＴ
結合能力を有する抗体の産出ハイプリに一マを選抜する
ためのスクリーニング用の免疫検定法を提供せんとする
ものである。更に、この発明によって、ＣＴに特異的な
モノクロナール抗体Ｃ’ｒ　−ｉを提供せんとするもの
である。更に、またこの発明は、ウイルス感染腫瘍標的
ヒト細胞の選択的な処理に有用であるＣＴ、その塩若し
くは誘導体と医薬用助剤とよりなる医薬品組成物を提供
せんとするものである。
〈従来の技術〉 細胞毒性を有する蛋白が、種々の単核細胞により、刺激
に反応して、分泌されることが知られている６Ｔ−細胞
、−恐らくヘルパー及びサプレッサーサブセットの両方
ともがそれらによって認識される抗体及びマイトジェン
レクチンに対して細胞毒を有する蛋白を分泌することに
より対応することができる（　Ｇ、　Ａ、　Ｇｒａｎｇ
ｅｒ及びＷ、　Ｐ、　Ｋｏｌｂ。
Ｊ、ｌｍｍ１ｎｏ１．１０１，（１８）−１２０（１９
６８）；　Ｎ、　Ｈ，Ｒｕｄｄｌｅ及びＢ、　Ｈ，Ｗａ
ｋｓｍａｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ。
Ｍｅｄ、　１２８．１２６７−１２７５（１９６８）；
Ｄ、　Ｄ、　ｇａｒｄｌｅｙ、　Ｆ、　Ｗ、　８ｈｅｎ
、　Ｒ，Ｋ、　Ｇｅｒｓｈｏｎ及びＮ、　Ｈ，Ｒｕｄｄ
ｌｅ、　Ｊ、　ｘｍｍｕｎｏｌ、　　１２４　ｖ　ｊ　
１９９−１２０２（１９８０））。天然キラー細胞は適
当な標的細胞と一緒にインキュベートすると細胞毒作用
を有する蛋白を分泌する（　８．　Ｃ，Ｗｒｉｇｈｔ及
びＢ、　Ｂｏｎａｖｉａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、
、　１２９．４６３−４３９、（１９８２））が、一方
ある種のＢす／パ球継代系は自然発生的に細胞毒作用を
有する層目を産出することが仰られている（　Ｗ、　Ｒ
ｏｓｅｎａｕ。
Ｄ、　５ｔｉｔｅｓ及び８．　Ｊｅｍｔｒｕｄ、　Ｃｅ
１ｌ　、　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。
４６．２３５−２４４、（１９７９））。リンパ球培養
物中で産出される蛋白は、通常リンフォトキシンと呼ば
れ、また、腫瘍壊死因子という用語はしばしば、単球又
はマクロファージの培養物中に産出された細胞毒作用を
有する蛋白に使用される。このような細唯障害性（＝細
胞毒作用を有する）蛋白は選択的に腫瘍細胞を破壊する
ことができるという事実は既に報告されている（　Ｊ、
　Ｏ。
Ｒｕｎｄｅｌ及びＣ，Ｈ，Ｅｖａｎｓ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　３゜９−１８、（１９８１））
。今までのところＢリンパ球系細胞により自然発生的に
産出された単一タンパクのみが僅かにその特性が解明さ
れているにすぎない。均質な状部にまで精製したところ
その分子量は、お＼よそ２００００ダルトンであると推
定されている（　Ｂ、　Ｂ、　Ａ＠ｇａｒｗａｌ、　Ｂ
、Ｍｏｆｆａｔ及びＲ，Ｎ、　Ｈａｒｋｉｎｓ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．６８９−６９１　
（１９８４））。
〈発明の要約〉 この発明により、細胞毒素（＝細胞障害抗体＝ＣＴ　）
と呼ばれる精製された細胞障害性蛋白と、当該蛋白を効
率的に単球又はセンダイウイルスなどのウイルスを用い
て単球より誘導された細胞中に作出する方法を提出せん
とするものである。更に、この発明により、末梢［ｔｌ
液の単核細胞により天然に産出されるＣＴｔｌ−精製し
、本質的に均質なものとして調製する方法を提供せんと
するものである。当該精製ＣＴは、約１７０００ダルト
ンの分子量を有する。部分精製又は粗製のＣＴ　ｖ４製
物を注入したマウスから得られる当該ＣＴに対するモノ
クロナール抗体を用いて、当該ＣＴは単離できる。更に
、この発明により、か＼る抗−ＣＴ抗体を産出する細胞
系を定着させる技術を提供せんとするものである。この
細胞系（Ｃｅ１ｌ　−１ｘｎｅ）は、上記のようにして
免疫化したマクスの牌臓の単核食細胞から誘導された多
数のハイプリｒ−マからのスクリーニングにより好都合
に定着させうる。ＣＴに対して特異的なモノクロナール
抗体もまた本発明により提供せんとするものである。当
該モノクロナール抗体は、上記の方法により定着したハ
イブリドーマ細胞系により産出さ九ＣＴを実質的に均質
ｆｘ！Ｗ製された形で単離するために使用される。上記
のようにして得られた精製細胞障害抗体、すなわち、Ｃ
Ｔは、特異的な抗−ＣＴ抗体により識別される。分析用
ｌリアクリルア５ｐｓｒ＋ｓｙル電気泳動により、それ
はお＼よそ１７０００±５００ダルトンの分子量を有す
ると決定された。更にまた、この発明は、ＣＴ、その壇
若しくはその誘導体と、医薬品として使用可能な賦形剤
よりなる、ウイルス感染腫瘍標的ヒト細゛　　胞を選択
的に処理するための医薬品組成物を提供せんとするもの
でちる。
用語「塩」とは、ＣＴのカルぜキシル基又はアミノ基の
いずれか一方又は双方の塩を意味し、また用語「誘導体
」とは、当該ＣＴのポリペブチげ側鎖の共有結合修飾を
意味する。ＣＴ、その塩若しくはその誘導体用の賦形剤
は、その用法に従い適宜選択して使用する。即ち、局所
処理用としては、クリーム又はローション用のものが、
また注射用若しくは経口投与用としては、ＣＴ　、その
塩若しくはその誘導体を安定化できるヒト血清アルブミ
ンなどを加えつる液体用のものが使用可能でちる。当該
精製ＣＴは、１０ピコグラム／ｄの低い濃度で、腫瘍及
びウィルスに感染した細胞に対して効果的に細胞障害性
を示す。治療に際しては、ＣＴの用量は、標的組織中で
、上記の濃度またはそれ以上となるように調整する。
当該ＣＴは、代謝ブロッカ−１例えば、シクロヘキシミ
１５（ＣＨＩ）、アクチノマイシンＤ又はマイトマイシ
ンＣの存在下では細胞に効果的に障害性を示すが、これ
らの薬剤の不存在下では、多種類の細胞はその作用に対
して耐性を示す。ウィルス感染によって、細胞は、当該
ＣＴにより殺滅され易くなる。例えば、ＶＳＶ感染８Ｖ
　−Ｆ３　Ｑ細胞の殺滅は有効に増強さされるが、末感
染５ｖ−Ｂ□細砲には作用を示さない。ウイルス感染細
胞の殺滅作用は、ＩＦＮ（インターフェロン）類、主と
してＩＦＮ−ｒであるが、これらインターフェロンを実
質的な濃度で投与すると、相乗的に効果が高まる。それ
故に、当該ＣＴを治療に使用する際には、適当なＩＦＮ
を含有する医薬品組成物は大変有利であり、ま次、ＣＨ
Ｉ　、アクチノマイシンＤ又はマイトマイシンＣなどの
代謝ブロッカ−を含有する医薬品組成物も同様である。
ＣＴに対する抗体を産出するノ・イブリドーマ細胞は、
フランス国パリ市パスツール研究所の国際呵株保存セン
ター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）に１９８５年７月１６日に寄託
し、その番号は、第１−４７２番であり、発明者等ら′
は細胞系ＣＴ　（Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅ　ＣＴ　）と称呼
している。
この発明を、以下に例を挙げて説明する。第１図には、
ＣＴの単離方法を模式的に示す。図に示した如く、この
発明による方法は、適当な実験動物（例えばマウスなど
）をクロマトグラフ的手段を用いて精製したＣＴ調製物
で免疫化し、次いで、第２図ａ及び同すに示した技術を
用いて、ＣＴ　−中和性及びＣＴ−結合抗体の血清力価
をモニターすることを含む工程よりなる。当該免疫化し
たマウスの牌懺の単核食細胞から誘導されたノ・イブリ
げ一マについて、第３図に示した手順によりＣＴ−結合
抗体の産出に関しスクリーニングした。上記抗体を産出
すると判明したノ・イブリドーマをクローン化し、産出
されたモノクロナール抗体を免疫吸着剤カラムに適用し
た。当該カラムにより、ＰＢＭＣ中にコンカナバリンＡ
　（Ｃｏｎ　Ａ　）及びホルボール−１２−〇−ミリス
テート１６アセテート（ＴＰ−Ａ）に誘導されたリンフ
ォカイン類の調製物から、ＣＴの親和力純化を行ない、
次いで、制御された細孔を有するプラス上のクロマトグ
ラフィーにより部分精製した。緊要な工程は、大量のハ
イブリｒ−マ培養物をＣＴに対する抗体の僅かな産出に
ついて検出するためのスクリーニングであった。そのた
めに開発された技術（第３図）は、固相ＣＴ−結合検定
法を含み、それは、か＼る量の抗体の存在に関しハイプ
リｒ−マ培養物を迅速スクリーニングを可能とするもの
であり、次いで、ＣＴの細胞障害性作用にたいして、シ
クロへキシミンを用いて感作した細胞を用いる生物検定
法によって、当該固相に結合したＣＴを高感度で検出す
ることができるものである。
第４図は、モノクロナール抗体（Ａ）より構築された免
疫吸着剤と、他の無関係な二種類のモノクロナール抗体
（Ｂ及びＣ）によるインターフエロン−γの結合に対す
るＣＴ−結合能を比較することにより、上述の如く分離
したモノクロナール抗体（すなわ’＆Ａ）の結合力の選
択性を示す。図から明らかな如く、ＣＴに対するもの（
第４図Ａ中ＯＣＴ　−１）のみが三種類のうちでＣＴと
結合することを示している。また、この図は、細胞毒素
調製物−ＩＦＮ−γ中の検出可能な量の他の蛋白とは結
合せずにＣＴとのこの結合は発生することを示している
。後者に対するモノクロナール抗体は、同一の実験条件
下で、同Ｂに示した如く、Ｃ’Ｔとは全く結合せずに、
ＩＮＦ−ｒと効率的に結合する。
第５図のＣ欄には、当該モノクロナール抗体から構築し
た免疫吸着剤上で精製したＣＴを、８Ｄ８の存在下でア
クリルアミケテル上で電気泳動させたのち、クーマシー
デルー染色により検出したものを示す。（また゛、Ａ欄
には、当該ＣＴ金精製して得＆　ＩＪンフオカイ／の粗
製調製物中の蛋白のパターンを、Ｂ欄には、無関係の抗
体（ＤＮＰに対するもの）から構築した免疫吸着剤上に
上記の粗製調製物を適用したときの蛋白結合の不存在を
、Ｄ欄には、分子量標準物質を示す。）第３図には、第
５図りに示した分子量標準物質の、アルリルアミｒゲル
上の、移動性との比較において、とＯＣＴの推定分子量
を示す。当該ＣＴの選択的細胞障害性と、そのＩＰ’Ｎ
による増幅については第７図に示す。尚、図中の・印は
、ｖＳ■感染５ｖ−ｓ。
細胞に対する種々な濃度での効果を、０印は感染１６時
間前に１０単位／　ｍｌのＩＦＮ−１で、Δ印は同１０
０単位／ｄのＩＦＮ−ｒでこれらの細胞を処理した時の
増強作用を、１印で示される未感染細抱によるＣＴへの
耐性又は０印で示されるＩＦＮ−１を１００単位／ｄで
それら（未感染細＠）を処理した場合ＯＣＴへの耐性と
の比較において示す。
〈実施例〉 次の実楕例は、この発明の説明の為のみに記載するもの
であり、勿論これＫこの発明が限定されるものでないこ
とは云うまでもない。
（ＢＰＭＣ）ｆｔ新鮮な献血血液のいわゆる°バツフイ
コート”から゛ファイコールーハイバーク。
（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　；ファルマシャ社製
、スエー２７国アゾサラ市）上で単離し、分画遠心によ
り血小板を除去する。当該細胞を１０７細胞／ｄの中で
インキュベートする。ＣＴは、これらの細胞中に下記の
うちのいずれか一つの方法で誘導する：Ａ、マクスの免
疫化するのに使用する調製物の植物凝集素（ＰＨＡ）を
用いてＰＢＭＣを賦活すること罠より誘導する方法。
細胞の賦活前に、リンフォカイン（０，２μｇ／ｍ）の
粗製調製物の存在下でまず１２時間インキュベートする
。この処理によってＣＴの産出は起らないが、引き続い
ての賦活（刺激）に対する細胞の応答性を著るしく増大
させる。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｊ；２イフコ社製、デトロ
イト市）を加えて、当該ＰＢＭＣを更に２４時間インキ
ュベートする。培養物を収集し、２５０　Ｏｒｐｍで１
５分間遠心分離し、細胞残渣を除去し、以下に記載する
如（ＣＴ’を濃縮し、富化させるために処理をする。
Ｂ、免疫吸着剤上によるＣＴ精製に使用するリンフオカ
イ／調製物のＣｏｎ　Ａを用いての有利に誘導化する方
法。
痕跡量のＰＨＡを精製によって充分に除去することは困
難であることが知られている。従って、以下の方法を用
いても良い。当該細胞をまず０．２５μｇ／ｍｌのＣｏ
ｎ　Ａで１２時間処理をする。この濃度では、Ｃｏｎ　
Ａは、ＣＴの有意な分泌は誘導しないが、引き続いての
Ｃａｎ　Ａの高濃度による細胞の賦活への応答性が増加
する。
ホルぜ一ルー１２−０−ミリステート１６アセテート（
ＴＰＡ）を５印ｇ／−の濃度となるまで加え、６時間後
にＣｏｎ　Ａを１０μｇ／ｍｌの濃度となるまで加える
。当該細胞を２４時間インキュベートし、更に５μｇ／
ｍｊのＣｏｎ　Ａを含む新しい培地に移しかえ、更に２
４時間インキュベートする。培養物をあわせ、遠心分離
し、メチル−α−Ｄマンノシー（シグマ社製、ミズリー
州セントルイス市）を５０ｍＭの濃度まで加え、当該培
地を更に次に記載する方法で免疫吸着剤上での精製のた
めに処理する。
Ｃ１ヒトの末梢血液単核細抱等中に効率的にＣ’ｒを誘
導する方法。
上聞の単核細（１８）ＩＫ変えて、単核細胞群より分離
した単球又はセンダイウィルス（２００ＨＡ単位／−）
をこれらの細胞に処理した単球に似た性質を有するＵｇ
　３７などの培養細胞も使用出来る。
これらの細胞を１２時間インキュベートしてＣＴを産出
せしめる。細胞培養物を遠心分離し、以下に記載する方
法で精製するために処理をする。
２゜ＣＴの定量： ＣＴの定量は、生物検定法（Ｄ、　Ｗａｌｌａｃｈ、　
Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏ　１−１３２　、２４６４−２４６９（１
９８４））を用いて、その細胞障害性作用を定量する。
検査すべき試料を、一連の希釈濃度で、シクロヘキシミ
Ｉ−’（ＣＨＩ５Ｑμｇ／ｍｊ）と同時にＳＶ　−８Ｑ
細胞の融合性培養物を含有するミクロ−フェルへと適用
する。細胞の殺滅程度は、細胞による中性赤色（色素）
の摂取量の測定による分析で、２０時間後に、マイクロ
ＥＬＩＳＡ自動読取り装置（ダイナチック社製、バージ
ニア州アレキサン（Ｉ　リア市）を用いて定量化する。
３、　０Ｔのクロマトグラフを用いた富化：ＣＴの粗製
の調製物はまず制御された細孔を有するガラＸ（ＣＰ（
）；ＰＧ−３５０−２００シグマ社製、ミ・戸り一州セ
ントルイス市）に吸着させて濃縮し、次いで０．５Ｍの
テトラメチルアンモニウムクロライｌ／（ＴＭＡＣ）で
脱着させ、更にアミコンＰＭ−１０１１（アミコン社製
、マサチューセッツ州ヂンバー市）で限外濾過して濃縮
する。
マクスの免疫のために適用するＣＴ調製物は、更に次ぎ
二方法のうちのいずれか一方の手順で精製する： （Ａ）ＣＰＧ−濃縮ＣＴ調製物を、非変性条件下で７．
５％アクリルアミＶデルを用いた電気泳動により分画す
る（　８．　Ｍ、　Ｗａｌｋｅｒ及びＺ、　Ｊ、　Ｌｕ
ｃａｓ。
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１３　、８１３−８２３．
（１９７４）。
Ｊ、　Ｅ、、　Ｌｅｗｉｓ、　Ｃ，Ｅ、　Ｃａｒｍａｃ
ｋ、　Ｒ，Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｇ。
Ａ、Ｇｒａｎｇｅｒ、Ｊ。Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、
１　４　　ｅ　　１　６　３　−１７＋５（１９７７）
）。ゲルのスライスから溶出されたフラクションで、細
胞障害性を示すものをゾールし、ＰＭ−１０１１Ｅで限
外濾過して濃縮しマウスへ注入する。
（Ｂ）ＣＰＧ−濃縮Ｃ’ｒ調製物をＩＭＮａ（Ｊ、　３
０％のエチレングリコール、１０ｍＭの橿酸ソーダ及び
肌１ｍＭＥＤＴＡで平衡状櫂として、二回連続してウル
トロｒルＡｃＡ　４４上で分画する。各分画後、細胞障
害性を示すフラクションをゾールし、ＰＭ−１０嘆上で
１縮する。ウルトロゲルカラムカラ二度目に回収された
細胞障害性蛋白を、ＬＫＢ８１００−１カラムを用いて
蔗糖溶液中に構築された１％アムフオリン勾配（ｐ）１
３．５〜１０）に、分離用等電点電気泳動による高次精
製のために適用する。最大細＠障害性活性を示すフラク
ションで、約ｐｈｉ　６．４でピークを示すものをゾー
ルし、濃縮し、ＰＢ８で平衡化し、次いでマクスに注入
する。
４ケ月齢のｃｓ　６系雌マウスにＣＴ調製物１０μｇの
試料を注射する。−手順Ａにより富化したＣＴで５回注
射し、手順ＢＫより富化したＣＴで５回注射し、手順Ｂ
により富化したＣＴで更に２回注射する。第１回の免疫
化では、蛋白を完全７０インドアジユバントに乳化させ
、マウスの肉跡Ｋ　（０，５１ｒＬｌ／マクス）注射す
る。第２回の注射は、６週間後に行ない、残りの注射は
１〜２週間間隔で行ない、すべてアルミナデルをアジュ
バントとして皮下に（０，３μｇ１０．２５ゴ／マウス
）注入する。免疫化を１ケ月間中止し、ＣＴに対する血
清抗体がもつとも高い力価を示したマウスに対して２回
腹腔内に１日間間隔て、手順Ｂで富化した１０μｇのＣ
Ｔを注入する。第２回の免疫化の１日後に、マウスを層
殺し、その牌臓の食細胞をミエローマ細胞と融合させる
。当該融合細胞をマイクロタイター（ｍ１ｃｒｏｔｉｔ
ｅｒ　）プレート上の多数のウェル（孔）に分配し、Ｈ
ＡＴ含有含有組織培養用土地上イブリｒ−マを選抜する
。Ｃ’Ｔに対する抗体を産出することが明らかとなった
ハイプリｒ−マは、軟寒天培地中でクローン化する。マ
ウスの腹水中でこれらの細胞を成育させるために、マウ
ス１匹あたり１０７細抱の濃度で腹腔内に、０．５−の
プリスタｙ　（Ｐｒ１Ｓｔａｎ　）の腹腔内注入２〜４
週間後にこれらの細胞を接種する。
マウス血清及びハイデＩＪ　ｌ’−マ成育培地中のＣＴ
に対する抗体の定量： 成育培地： マウスの血清中ＯＣＴに対する抗体の水準は、これら（
抗体）の中和及び結合能（活性）の測定により決定され
る。
ＣＴＴ和能：（第２図ａ） ＣＴ試料（５０μｅのダルベコ−修正イーグル培地で２
％のＦｅ２を含有するもの（ＤＭＥＭ−２％ＦＣ８）中
に１０単位を含む）をマクス血清（５０μｇ）のサンプ
ルと共に３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−
２％ＦＣ’８中に段階的に希釈する。更に４℃で１２−
１（Ｓ時間インキュベートし、次いでＣＴ活性を２倍希
釈液を８連制で測定する。
ＣＴＴ合能：（第２図ｂ） 粗製濃縮ＣＴ　（３０μ４，１０４単位／　Ｗｌｌ　）
の試料を、マウスの血清のサンプルと共に円すい形の底
を持つマイクロ−タイターフェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ　社
製）中で６７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−
２％ＦＣ’Ｓ中で段階的に希釈する。正常なマウスの血
清（ＰＢ８に１＝４０の割合で希釈したものを２０μＩ
ｌ）を加え、次いでマウスのＦ　（ａｂ　）’２に対す
る山羊の抗血清６０μσを加える。更に、３７℃で３０
分間、４°Ｃで一晩インキユベートし、１２００．９で
４℃で５分間遠心分離する。当該免疫沈澱物は、冷ＰＢ
Ｓで二回す＼ぎ、末緩衝貴塩水で−回す＼ぎ、５０μｇ
のＮＨ４ＯＨを加えて可溶化し、ＣＴ活性を８連制で、
２倍希釈液について測定する。
ＣＴ結結合モノクチナール検出のため固相検定法： （第３図に示した如く、ハイブリドーマ取前培養物０Ｃ
Ｔ−結合抗体のスクリーニングに適用される）。
ＰＶＣマイクロタイター　プレート（ダイナチック、バ
ージニア州アレ中サンげリア市）を、マウスのＦ（ａｂ
）２に対する親和性純化山羊抗体（ｐＢｓｃｐｌｃ８０
μｇ／ｍ／、８０μｅ／ウエル）で、次いで・・イブＩ
Ｊ　）＋１−マ成育培地（５０μｇ／クエル）で、最後
に粗製の濃縮ＣＴＴ製物（１０４単位／ｄ、５０μｌ／
クエル）の試料でインキュベートする。各インキュベー
ション期間は、（４℃で）１２〜１４時間で、次いで各
プレートをＰＢ８を用いて３回す＼ぐ。プレートは更に
一回末緩衝食塩水です＼ぎ、結合しているＣＴ　ｔ−Ｎ
Ｈ，ＯＩ（（７５嘘を含む０．１％ＦＣ８２０μｌ／ク
エル）を適用して溶解させる。ＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８
中のＱ、Ｑ　４　ＭＮａ　−Ｈｅｐｅｓ　ｐ）（７，４
，１００μｅ加え、溶出した細胞障害活性を４連制で、
２倍希釈のＣＨＩ−感作５ｖ８０細抱を用いて定量する
。
ＣＴの免疫吸着剤による精製： モノクロナール抗体を、腹水から硫酸アンモニア（５０
％）を用い、沈澱させ精製する。ＩｇＭインタイプを更
に水に対して透析して精製し、次いでＰＢＳ中に沈澱し
たＩｇＭを溶解させる。当該免疫グロブリン、各１０ｍ
９ずつを、予じめアミノカプロン酸で誘導化し、Ｎ−ヒ
１０キシ　サクシニミげで活性化したトリスアクリル　
ＧＦ　２０００（ＬＫＢ）Ｉｇとカップリングさせる。
末かツブリングの抗体は、５ＱｍＭのクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ２，８’）で、次いで０．１５　ＭＮＨ４ＯＨ
で当該樹脂を洗浄することにより除去する。
ＣＴの免疫吸着剤での精製の為に、当該樹脂試料０．５
４を０．５ＭのＴＭＡＣの存在下でＣＴＴ製物６Ｍと４
°Ｃで２時間混合する。次いで、当該樹脂を小さなカラ
ムに充填し、未結合の蛋白ヲ０．５ＭのＴＭＡＣ溶液で
更に洗浄する。当該カラムを次いでＱ、５Ｍ　　ＴＭＡ
Ｃ中の０．５％ＮＰ　−４Ｑで洗浄し、更に１０ｍＭの
燐酸ソーダ緩＠液ｐ８７．４を含むＩ　Ｍ　Ｎａ（Ｊで
、更に、末緩衝の食塩水で洗浄し、結合しりＣＴ　ｔ？
　０．２　Ｍ　＋７）　ＮＨ４ＯＨを適用して溶出させ
、１０分間以内の溶出物を１Ｍの酢酸で中和する。免疫
親和性の精製手順はすべて４°Ｃで実権する。
５Ｄ８）ｆルミ気泳動による精製Ｃ’ｒの分析第５図は
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル（１５％）上で分析
した細胞毒素の粗製調製物中の蛋白のパターンを示す。
抗体０１３−６（Ｄ　Ｎ　Ｐ　Ｋ対するもの）から構築
された免疫吸着剤で、それに粗製ＣＴｔ−適用したもの
からのアンモニア溶出フラクションはＢ欄に、ＣＴ　−
１免疫吸着剤カラムによる粗製調製物から精製したＣＴ
はＣ欄に、分子量標準物質（フォスフォリラーゼ９４に
、牛血清アルブミン６７Ｋ、オボアルデミン４３Ｋ。
炭酸デヒドラターゼ３０に、大豆トリプシンインヒビタ
ー２０．１　Ｋ及びり・ｔチーム１４．４にダルトン）
はＤ４１ｉｌＩに示す。尚、オざアルブミンから大豆ト
リプシンインヒビターについては第３図にその相対的位
置関係をＣＴの推定分子量との関係において示す。第５
図Ｃ欄は、精製ＣＴが、単一のポリベデチｒから構成さ
れ、その推定分子量即ち第３図に示す如く既仰分子量の
他の蛋白の当該アクリルアミドゲル上の移動度からの推
定分子量は、約１７．５Ｋｄ（ダルトン）の精製蛋白で
あることを示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は、　ＣＴの製造工程を、第２図は、ＣＴに対す
る抗体の検出方法の手順を、第３図は、ＣＴ結合モノク
ロナール抗体の固相検定法の手順を、第４図は、この発
明によるモノクロナール抗体の結合能についての他のモ
ノクロナール抗体の比較結果を、第５図は、ＣＴ粗製物
、精製ＣＴなどのぼりアクリルアミドゲル上の電気泳動
による蛋白のパターンを、第３図は、この発明ＯＣＴの
推定分子量を第５図り欄の分子量標準物質との比較にお
いて示す。また第７図は、この発明によるＣ′ｒの細胞
死滅能を示す。

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）細胞毒素の精製方法において、 （イ）細胞毒素を含む調製物を用意し、 （ロ）当該調整物から当該細胞毒素を制御された細孔を
    有するガラス製装置に吸着させ、 （ハ）当該制御された細孔を有するガラス製装置から純
    度を高めた状態で当該細胞毒素を脱着させ、次いで、 （ニ）当該細胞毒素のモノクロナール抗体よりなる免疫
    吸着剤に脱着した細胞毒素を接触させることを特徴とす
    る方法。
  2. （２）当該細胞毒素を工程（ハ）において脱着するのに
    際し、０．５Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドを
    含む脱着緩衝液を用いることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  3. （３）当該細胞毒素を緩やかな分離条件下で免疫吸着剤
    から溶出させることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
  4. （４）当該細胞毒素を０．２ＭＮＨ＿４ＯＨを用いて当
    該免疫吸着剤から溶出させることを特徴とする特許請求
    の範囲第３項記載の方法。
  5. （５）当該モノクロナール抗体がＣＴ−１であることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  6. （６）当該細胞毒素がヒト細胞毒素であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  7. （７）工程（イ）の調製物が賦活化した末梢血液の単核
    細胞からの調製物であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  8. （８）当該細胞がリンフォカインとインキュベートした
    後、植物凝集素を用いて賦活することを特徴とする特許
    請求の範囲第７項記載の方法。
  9. （９）コンカナバリン−Ａそれ自体では、細胞毒素の有
    意な分泌を誘導しない量を用いて、当該細胞をインキュ
    ベートした後、コンカナバリン−Ａで賦活することを特
    徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。
  10. （１０）当該細胞をサンダイウイルスで賦活することを
    特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。
  11. （１１）細胞毒素と結合できる抗体の産出に関する多数
    のハイブリドーマ培養物のスクリーニング用の固相免疫
    検定法において、 （イ）マウスの免疫グロブリンの抗体であって親和性を
    純化させたもので、蛋白結合支持手段を被膜し、 （ロ）被験ハイブリドーマの成長培養体を当該被膜支持
    手段中でインキュベートし、次いで洗浄し、 （ハ）細胞毒素の試料を当該支持手段中でインキュベー
    トし、次いで洗浄し、 （ニ）当該支持手段に結合している細胞を分離し、その
    量を生物検定法により測定する ことを特徴とする方法。
  12. （１２）当該生物検定方法が代謝ブロッカーを用いて細
    胞毒素の細胞毒作用に感作させた細胞を用意し、当該細
    胞毒素を加え、感作した細胞の死亡程度を測定すること
    よりなることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載
    の方法。
  13. （１３）当該代謝ブロッカーがシクロヘキシミドである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の方法。
  14. （１４）当該代謝ブロッカーがアクチノマイシンＤであ
    る特許請求の範囲第１２項記載の方法。
  15. （１５）当該代謝ブロッカーがマイトマイシンＣである
    特許請求の範囲第１２項記載の方法。
  16. （１６）細胞毒素の精製又は末精製調製物のいずれか一
    つでマウスを免疫化し、特許請求の範囲第１１項記載の
    免疫検定法を用いて当該細胞毒素に対するモノクロナー
    ル抗体を産出するハイブリドーマを検出し、そのハイブ
    リドーマを培養し、所望の抗体を得ることを特徴とする
    細胞毒素に対するモノクロナール抗体の調製方法。
  17. （１７）当該生物検定法が、代謝ブロッカーを用いて細
    胞毒素の細胞毒作用に感作した細胞を用意し、当該細胞
    を細胞毒素に暴露させ、細胞の死亡の程度測定すること
    を特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の方法。
  18. （１８）当該生物検定法で使用する細胞がシクロヘキシ
    ミドで感作したＳＶ８０細胞であることを特徴とする特
    許請求の範囲第１７項記載の方法。
  19. （１９）細胞毒素に対して特異的なモノクロナール抗体
    。
  20. （２０）ヒト細胞毒素を特異的に認識し、結合するモノ
    クロナール抗体ＣＴ−１で、かつ当該細胞毒素が末梢血
    液単核細胞により産出されるものであることを特徴とす
    る抗体。
  21. （２１）細胞毒素の単離方法において、 （イ）細胞毒素のモノクロナール抗体を産出させ、次い
    でこれらの細胞毒素の末精製調製物で免疫化させ、 （ロ）これらの抗体から免疫吸着剤を構築させ、当該吸
    着剤を細胞毒素の粗製調製物からの細胞毒素の精製に使
    用する ことを特徴とする方法。
  22. （２２）少なくとも１つの細胞毒素、その塩若しくは誘
    導体を、本質的に均質な形か又はインターフェロン及び
    ／又は通常細胞は感作せず、ウイルス感染腫瘍標的ヒト
    細胞を感作するのに充分な量の代謝ブロッカーとの組合
    せで、治療するのに充分な量を含有するウイルス感染標
    的ヒト細胞を選択的に処理するための医薬品組成物。
  23. （２３）当該ブロッカーがシクロヘキシミドである特許
    請求の範囲第２２項記載の組成物。
  24. （２４）当該ブロッカーがマイトマイシンＣである特許
    請求の範囲第２２項記載の組成物。
  25. （２５）当該ブロッカーがアクチノマイシンＤである特
    許請求の範囲第２２項記載の組成物。
  26. （２６）細胞毒素に対するモノクロナール抗体を発現す
    るハイブリドーマ細胞系。
  27. （２７）細胞系ＣＴ、ＣＮＣＭＩ−４７２の同定特徴を
    有する特許請求の範囲第２６項記載のハイブリドーマ細
    胞系。
  28. （２８）特許請求の範囲第１６項記載の方法により得た
    細胞毒素に特異的なモノクロナール抗体。
  29. （２９）特許請求の範囲第１７項記載の方法により得た
    細胞毒素に特異的なモノクロナール抗体。
  30. （３０）細胞毒素を含有する調製物を当該細胞毒素に対
    するモノクロナール抗体よりなる免疫吸着剤に接触させ
    ることよりなることを特徴とする細胞毒素を精製する方
    法。
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