JPH0742317B2

JPH0742317B2 - インタ−フエロン蛋白とその製造法

Info

Publication number: JPH0742317B2
Application number: JP55500974A
Authority: JP
Inventors: バ−グ・カ−ト・フリマン
Original assignee: テヒノビオチツクエルテイデイ．
Priority date: 1979-04-20
Filing date: 1980-04-18
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: IL59880A; IE800796L; EP0018218A1; AU5759980A; HK22792A; EP0018218B1; IL59880A0; NO801133L; CA1168151A; ES8103976A1; SG92591G; NZ193487A; FI77877B; WO1980002229A1; IE55791B1; ES490697A0; NO165961B; NO165961C; EP0091543A1; DE91543T1

Description

【発明の詳細な説明】この発明はヒトインターフエロンの精製、ヒトイン
ターフエロンとその抗体の精製品及びそれらに関する精
製ならびに調製法に関する。

ここで使用する用語は“蛋白”は“糖蛋白（グリコプロ
テイン）”を含むものである。

ヒトインターフエロンの精製については多くの試みが
なされてきた。この精製の試みの目的には、標準化を目
的としてインターフエロン種（インターフエロンスピ
シーズ）の特性を完全に決定することが含まれている。
今日まで、ヒトLe型インターフエロンを精製する試みは
完全に成功していない。

この発明は、不活性な且つさもなくば好ましくない不純
物が実質的に存在しないヒトLe型インターフエロン蛋白
の全成分を始めて製造しうる精製法を発見したことに基
づくものである。

インターフエロンのLe型はE.A.Havell,B.Berman,C.A.Og
burn,K.Berg,K.Paucker,and J.Vilcek,Proc.Nat.Acad.S
ci;USA,72,2185〜2187（1975）で定義されている。

この発明によつて、純粋なヒト白血球インターフエロン
蛋白が粗ヒト白血球インターフエロンから一連の特別な
精製工程を経て作られ、且つ純ヒト白血球インターフエ
ロンがSDS PAGE（ナトリウムドデシルスルフアート
ポリアクリルアミド傾斜電気泳動）における染色蛋白バ
ンドで特徴付けられた。

純ヒト白血球インターフエロン蛋白の製造及び特性決定
に用いられる特定の実験条件は下記の“原料と方法”お
よび“実験の部”の項で記載される。純白血球インター
フエロン蛋白類の製造と特性決定に含まれる製品と手法
のあるものは、それ自体新規であり、インターフエロン
技術に一般的に利用可能であつてこの発明の一つをなす
ものであり、広義には蛋白精製技術にも用いられる。今
この発明により入手可能にされ特性が決定された純ヒト
インターフエロン蛋白特に純ヒトLe型インターフエロ
ン蛋白はそれ自体この発明を構成するもので、かつこの
発明の他の１つであつてこの明細書で説明され例証され
る更に新しい発展の鍵を構成するものである。

数回のくり返し実験により、“原料と方法”の項で記載
されるSDS PAGEと染色条件下0.9×10⁶IFUの全インター
フエロン負荷で、純ヒト白血球インターフエロンは、1
8,400±200ダルトンと20,100±200ダルトンに本質的に
２つだけのシヤープな染色蛋白バンドと20,300±200と2
0,400±200ダルトンの間に次位の染色蛋白バンドを示す
ことが立証されたのである。下記の蛋白測定法によつて
測定されたように純ヒト白血球インターフエロンは蛋白
mg当り約10⁹IFUの比活性度（specific activity）を有
し、この比活性度は、使用する蛋白測定法によつてある
程度変るかも知れない。蛋白重量ベースでのこの比活性
度は蛋白mg当り２×10⁸〜２×10⁹IFUであると判断され
る。純インターフエロンが二つの主要な明白なバンドを
示す事実は、粗製または部分精製のインターフエロン調
製品を用いる先行技術の知見によると、ヒト白血球イン
ターフエロンが少なくとも２つの主要な種からなるもの
であることを意味する。例えば、3.8×10⁶IFUの高い全
インターフエロン負荷をすると上記のSDS PAGE系では６
つのインターフエロン蛋白バンドからなる更に分化した
蛋白パターンを示しうることが分つた。すなわち18,410
±200ダルトンと20,180±200ダルトンの２つの強い染色
バンド及び上記次位の染色バンドに対応する20,420±20
0ダルトンの中位に染色したバンド並びに19,500±200ダ
ルトン,21,130±200ダルトン及び23,440±200ダルトン
のやつと見える程度の蛋白バンドである。SDS PAGEアク
リルアミド傾斜ゲルの上記バンドの個々の成分はそれぞ
れ、生物学的インターフエロン活性：すなわち抗ウイル
ス活性、抗ヒト白血球インターフエロン〔抗ヒト線維芽
細胞（anti-human fibroblast）インターフエロンでは
ない〕だけを中和する能力および抗細胞活性に種々のい
わゆる非ウイルス活性が加わつた活性（これらの活性は
ナチユラルキラーセルやMIC-CMLの増強、HLA抗原の増加
等で例証される）を示すということを見出した。

インターフエロン蛋白を完全に精製すれば、単に純イン
ターフエロン調製物またはその一つ以上の成分で動物に
免疫性を与えることにより、活性スピシーズに対し厳に
特異性を有する抗インターフエロンを生産することがは
じめて可能になる。かような単一特異性（monospecifi
c）の強い抗インターフエロンは、簡便かつ経済的に粗
製または部分精製インターフエロンを精製し、多量の純
インターフエロンまたは高度精製のインターフエロン
（これら純又は精製インターフエロンは臨床用，標準
化、化学的研究およびシーケンス研究用として、並びに
単一特異性抗インターフエロンを繰返し製造するための
免疫抗原として用いられる）を得るために行う抗体アフ
イニテイクロマトグラフイ用に極めて有用である。こ
の発明には、純ヒト白血球インターフエロンに対して生
ずる単一特異性抗原を用いヒト白血球インターフエロン
を精製する方法だけではなく、その単一特異性抗インタ
ーフエロンと免疫学的に交叉反応する他のタイプのイン
ターフエロンの精製法も含まれる。この他のタイプのイ
ンターフエロンとしては、例えばナマルバ（Namalva）
インターフエロン〔ヒトリンホブラストイドインタ
ーフエロン（human lymphoblastoid interferon）；そ
のLe型インターフエロンは、ヒトリンホブラストイド
インターフエロンすなわちナマルバインターフエロンの
生物学的活性の約85％を占める,E.A.Havell,Y.K.Yip,J.
Vilcek,“Characterization of human lymphoblastoid
（Namalva）interferon,"J.gen.Virol.,38 51-59（197
7）参照〕およびインターフエロン蛋白（または重要な
生物学的インターフエロン活性決定因子を有する蛋白）
を生産するためのDNAコーデイング（coding）を運ぶ微
生物の培養によつて得られるそのLe型を含有するインタ
ーフエロンがある。

またこの単一特異性抗インターフエロンは、それ自体公
知法でインターフエロン蛋白の生産用の遺伝子工学のシ
ステムを確率するために有用である。すなわち、遺伝子
工学に属する知られた方法によれば、その第一段階はイ
ンターフエロン生産細胞から伝令RNAの単離であり、そ
こではインターフエロンの合成がインターフエロン誘発
因子（inducer）によつて開始され、インターフエロン
の免疫学的な決定因子（またはその一部）を保持したイ
ンターフエロン蛋白の合成を完了し、一方、そのときそ
のインターフエロンはまだリポゾームやメツセンジヤー
RNAに結合している。インターフエロン産生細胞として
は、通常の方法またはバツフイコート（buffy coats）
〔またはフイコル技法で単離されたリンパ球〕中で成育
された高度クローン産生ナマルバ細胞懸濁液が好ましい
ものである。メツセンジヤーRNAは、かような細胞をそ
れ自体公知の方法で溶解し、その溶解物を抗体アフイニ
テイカラム（そこで共有結合される抗体は単一特異性抗
インターフエロンである）中を通過させることによつて
単離される。この抗体カラムはインターフエロンを選択
的に保持するだけでなく、付着したメツセンジヤーRNA
も保持する。塩の溶離のごとき公知方法で、メツセンジ
ヤーRNAはカラムからの溶離液から単離され、また公知
方法でリバーストランスクリプターゼ（reverse tran
scriptase）と処理すると対応するDNAを与える。その代
わりに、公知の免疫沈降法（immunoprecipitation meth
ods）が用いられ、またこの方法は二重免疫沈降法とあ
わせて用いることもできる。遺伝子工学に属する公知方
法にしたがつて、かかるインターフエロンまたはその主
要部分に関するDNAコーデイングは、適当なクローニン
グベクター好ましくはミニプラスミドに組込まれ、微生
物に移送される。これの培養によりインターフエロンお
よび／またはインターフエロン誘導体が生産され、培養
媒体中に放出される。微生物の培養で得られるかような
インターフエロンを精製するには、粗製品を単一特異性
抗インターフエロンを用いた抗体アフイニテイカラム
を通過させるという前記と同一の方法に付すのが適切で
ある。放射性標識した単一特異性抗インターフエロン
は、微生物のクローンがDNAを受け取り、インターフエ
ロン、その一部または誘導体を生産しうるということを
評価するのに価値ある道具となりうる。

0.9×10⁶IFUのインターフエロン負荷において、純ヒト
白血球インターフエロン蛋白は、５〜６つの生物学的ピ
ークと共にSDS PAGEアクリルアミド傾斜ゲル中に上記の
３つの別々の蛋白バンドとして現われる。見出される生
物学的バンドの数が５つになるか６つになるかは、その
ゲルスライスが切り取られる正確な位置によつて左右さ
れる。第１図に、後記の“原料と方法”の項に記載した
のと同様にしてこの負荷で作製した染色SDS PAGE傾斜ゲ
ルスラブを示した。この蛋白バンドは各々明確なインタ
ーフエロン活性を有することを示した。第２図に、同一
のインターフエロン負荷での他の実験から得たSDSスラ
ブの図と後記“原料と方法”の項で説明される方法で測
定されたバンドに関するインターフエロン活性のプロフ
アイルとを示したが、５個の生物学的インターフエロン
のピークと３個の明確な染色バンドとが認められる。第
２図から、蛋白バンドがインターフエロン活性のピーク
と厳密に一致していることが、明らかに認められる。こ
のことはその蛋白がインターフエロン蛋白であるという
ことを証明している。インターフエロン活性プロフアイ
ルは、勿論ゲルの個々のスライシングの正確な位置に左
右されるということは注目すべき重要なことである。第
２図において、20,410±200ダルトンの位置の次位のバ
ンドの一つのインターフエロン活性はそれ程明白ではな
いが、同一のインターフエロン負荷の他の実験ではその
次位のバンド自体がインターフエロン活性を有すること
が示され、より高い負荷での実験では（以下参照）その
次位のバンドが明白なインターフエロンの亜種（subspe
cies）であることが見出された。対応するインターフエ
ロン蛋白切片中に見出されSDS PAGEから得られたインタ
ーフエロン活性の量は、蛋白バンドの染色強度から評価
される蛋白の量と直線的に対応する。従つて、二つの主
体をなすインターフエロン蛋白と次位のバンドが明確に
存在することが、第１図および第２図に示された実験で
実証された。系内へのインターフエロン負荷がより高い
実験では、第３図〔染色と脱色（destaining）を行つた
後、六つの生物学的ピークと共に六つのインターフエロ
ン蛋白が測定された〕に示したごとく、上記したバンド
のより詳細なバンドパターンが示された。SDSで処理さ
れたインターフエロンは、その免疫学的な決定因子（de
terminant）を保有し、SDSで処理されていないインター
フエロンに比較してより明白に抗原性を示す（又は保有
する）ということは知られているので〔Pauckerらの、
ヒト白血球インターフエロン製剤によるマウスの免疫に
よつて示されている。（Dalton,B.F.,Ogburn,C.A.,Pauc
ker,K.;Production of antibodies to human interfero
ns in mice,Infect.Immun.19（２）,570-574（1978）,P
P4;25〜30）〕、予備のSDS PAGEによつて、各成分を分
離された形態で得ることができるだけでなく、以下に詳
述するように分離した成分で免疫にすることもできる。

比活性度について述べれば、この発明は、約２×10⁸〜
２×10⁹IFU/mg蛋白の比活性度を有するヒトインター
フエロンまたはその種に関する。しかし、蛋白の定量方
法にはかなりの種類があるので、比活性度の実際の数値
は個々の種をSDS PAGEで明確に示すのに比べて重要では
ない。

そのため、この発明の純インターフエロン蛋白を下記の
ように表わすのがより適切である。すなわち、インター
フエロンの全負荷が0.9×10⁶IFUでかつここで定められ
たSDS PAGE及び染色条件下にて、18,400及び20,100ダル
トンにそれぞれ抗ウイルス性インターフエロン活性を有
する２つの主要なシヤープな染色蛋白バンド,20,300ダ
ルトンと20,400ダルトンの間に抗ウイルス性インターフ
エロン活性を有する次位の染色蛋白バンド並びに19,50
0,21,130,及び23,440ダルトンに抗ウイルス性インター
フエロン活性の小さなピークを示し（このダルトン分子
量の実験精度は±200ダルトンである）、またそのSDS P
AGEアクリルアミドグラジエントが特に他の染色蛋白
部分を示さないヒトLe型インターフエロン蛋白か；また
は、インターフエロンの全負荷が3.8×10⁶IFUでかつこ
こで定められたSDS PAGE及び染色条件下にて、抗ウイル
ス性インターフエロン活性を有する六つの染色蛋白バン
ド、すなわち18,410と20,180ダルトンの強いバンド、2
0,420ダルトンの中位の強度のバンド及び19,500、21,13
0と23,440ダルトンに見える程度のバンド（このダルト
ン分子量の実験精度は±200ダルトンである）を示し、
抗ウイルス性インターフエロン活性のピークが染色蛋白
バンドと正確に一致しかつそのSDS PAGEアクリルアミド
グラジエントが特に他の染色蛋白部分を示さないヒト
Le型インターフエロン蛋白として表わすのがより適切で
ある。

SDS PAGEゲルの上記バンドにおける個々の成分は、生物
学的なインターフエロン活性、抗ヒト白血球インターフ
エロンを中和する性能、抗細胞活性等を有することは重
要であり注目すべきである。またこの発明は、上記の各
SDS PAGEバンドで表わされる各成分、その各成分が有す
る有意の生物学的インターフエロン活性決定因子を有す
る蛋白及びその各成分が有する有意な免疫学的決定因子
を有する蛋白に関する。

原料に関して、この発明のヒトインターフエロン蛋白
は、前記したように、ヒト細胞を用いて作製されるヒト
白血球インターフエロン、培養されたヒトリンホブラ
ストイド（ナマルバ）細胞又はインターフエロンのDNA
コーデイングを有する微生物を培養して作製された蛋白
もしくはその主要部から誘導して得られる。しかし、他
の出発物から得られるヒトLe型インターフエロンであつ
ても、上記の特徴を有するものであればこの発明の範囲
内に含まれる。

ヒトLe型インターフエロンは、抗ウイルス活性及び抗腫
瘍活性を含めてヒトに対して多くの重要な治療効果を示
し、かつ純ヒトLe型インターフエロンを投与すればこれ
らの有用な性質が一層利用可能になることはよく知られ
ている。この発明には、ヒトもしくは動物に疾病予防、
治療または免疫効果を与えるため投与するのに適応させ
た一種又は複数種のヒトLe型インターフエロン蛋白から
なる製剤が含まれる。かような製剤は、例えば非経口、
鼻内又は局所投与に応用される。

この発明の純インターフエロン蛋白のもつとも有用な製
剤は水溶液である。水溶液の純インターフエロン蛋白は
安定化させねばならないが、安定剤はその溶液の用途に
よつて選択される。この溶液を、ヒトに例えば非経口投
与して用いる場合、安定剤は生理学的に受容な安定剤で
なければならず、適切な安定剤はヒト血清蛋白及びその
フラクシヨン並びにヒトアルブミンのごときヒトに対し
非毒性かつ非免疫性の一つの蛋白又はその蛋白を組合わ
したものである。典型的な好ましい安定剤は１％のヒト
アルブミンである。ヒトに非経口投与する組成物中の純
インターフエロン蛋白の通常の濃度は、10⁶〜２×10⁷IF
U/mlに相当する範囲であり、通常の一日当りの投与量は
合計３×10⁶〜10⁷例えば５×10⁶〜10⁷IFUであり、一日
当り１〜２回筋肉注射して投与するのが好ましい。ヒト
投与用純インターフエロンの溶液を作製する際、確実に
滅菌しかつ発熱物質を存在させない予防策のごとき非経
口投与用組成物の製造時に通常行われている通常の製薬
上の予防策が行われる。

この発明の安定化された製剤が、単一特異性抗インター
フエロンを作るため動物類を免疫にするのに用いる純ヒ
トLe型インターフエロン蛋白類の水溶液の場合は、SDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）がインターフエロンの抗原
性及び／又は安定性を増大させるという前記事実からみ
て、SDSでヒトLe型インターフエロン蛋白のSDS錯体を形
成させて安定化させるのが好ましい安定化方法である。
次により詳細に説明されるように、純インターフエロン
とSDSとの結合物又はその錯体は、好ましくはpH7.2で溶
液換算にて約0.1重量％の濃度の水性純インターフエロ
ン蛋白に、SDSを添加することによつて簡単に形成され
る。一種又は複数種のヒトLe型インターフエロン蛋白の
SDS錯体は、それ自体安定なことから、この発明の価値
ある態様であり、かかる錯体の形態のものは貯蔵又は輸
送（下記のごとく固体で単離された際は、低温が適切で
あり、例えば約４℃、好ましいのは−20℃である）に好
適であり、最も興味深いものである。この目的のため
に、デタージエント型の他の安定剤を用いることもこの
発明に含まれる。純ヒトLe型インターフエロン蛋白のさ
らに好ましい形態は、シバクロンブルーF3GAと結合した
形態か又はシバクロンブルーF3GAが示す機序に従つてイ
ンターフエロン蛋白と結合しうる他のリガンドと結合し
た形態である。これらのことは以下に詳しく説明する。

単一特異性抗インターフエロンを作るために動物を免疫
にするのに用いる純インターフエロン蛋白溶液のpHは約
7.2が好ましく、適切な緩衝液はPBS（リン酸塩緩衝食塩
水）である。

動物の免疫用の安定化された純ヒトインターフエロン
蛋白製剤には、抗原性を一層増大させるためにアジユバ
ンドを添加してもよい。一つの適切なアジユバントとし
てはフロイントのアジユバント（Freund′s adjuvant）
がある。周知の原理に従つて〔一種の“ハプテン”（ha
pten）として一種又は複数種の純インターフエロン蛋白
を提供し〕、純Le型インターフエロン蛋白類又はその各
蛋白を免疫性担体にカツプリングさせることによつてそ
の抗原性を増加及び／又は安定化させることもこの発明
に含まれる。免疫性担体の例としてはPPD（Purified Pr
otein Derivative）及びBCG（Bacille Calmette Gueri
n）が挙げられる。しかし、かような免疫性担体の使用
は現在のところ好ましくない。

免疫処置用には、マウス、うさぎ、山羊及び羊が好まし
い動物であるが、他の動物類を用いることもこの発明に
含まれる。下記のごとく、豚IgG免疫グロブリンはある
種の目的には際立つた利点を示す。

原理的には、純インターフエロンに対する動物類の免疫
処置は、例えば、Acta Path.Microbiol.Scand.Section
B,83、443-460（1975）に記載のごとき抗インターフエ
ロンの公知の製造法に従つてなされる。しかし、この発
明のインターフエロン蛋白が純品であるので、免疫原の
濃度及び免疫処置時間やその間隔について若干変動す
る。免疫処置計画の例は“実験の部”で明らかにする。

動物の採血及び抗血清の単離は周知の方法に従つて行わ
れる。

上記のようにして作製された抗体は、免疫処理をされた
動物の生来の特徴を示すという当然の事実とは別に、上
記SDS PAGEバンドを特徴とするインターフエロン蛋白に
対して実質的な特異性を示す。インターフエロン蛋白と
共存し、そのSDS PAGEの染色バンドとして認められない
ごく少量の不純物は避けることはできない。純インター
フエロン蛋白製剤中の全蛋白含量の約１〜５％に相当す
る少量のかような蛋白類は、対応する不純物に対する抗
体類を誘発するかも知れない。この可能性を調べる一つ
の方法は、純インターフエロン（すなわち、SDS PAGEに
おいて、全体で１〜４×10⁶IFUの負荷で可視のインター
フエロン蛋白バンドを与える上記特徴を有するインター
フエロン）でうさぎを免疫にすることによつて得られる
関連抗血清の抗インターフエロンカラムを作製する方法
である。そのカラムは全く吸収剤なしで作製される。粗
ヒト白血球インターフエロンをこのカラムに充填し、通
常の抗体アフイニテイクロマトグラフイが行われる
（後記参照）。溶出液をSDS PAGEで分析され（後記参
照）、このときインターフエロンのバンドだけが認めら
れるべきであるが、１〜４の他の蛋白（不純物）が認め
られる場合がある。このことは、実際にうさぎの抗血清
について認められ（３つの蛋白）、２〜３×10⁶IFUの粗
ヒト白血球インターフエロンを負荷した場合に2mlカラ
ム中５×10⁵IFU-NU/mlの力価を有していた。

また、その“異質の”蛋白類は、偶然生起する単一の自
然発生交差反応で現われるのかもしれない。

特定の抗体が単一特異的であるか否かを検査する上記方
法は、それ自体新規であると信ずるものであり、この発
明のもう一つの態様を構成するものである。この態様
は、特定の抗体製剤（例えば抗血清）がその特定の抗原
に対し単一特異的であるか否かを検査する方法であり、
すなわち検査対象の抗体製剤によつて抗体アフイニテイ
クロマトグラフイカラムを作り、そのカラムに抗体と
不純物を含有する溶液を負荷し、カラムからの溶出液を
分析してその抗体と異なる蛋白が存在するか否か確認す
ることからなる方法である。後者の分析は、当面用いら
れる、抗インターフエロンの単一特異性測定法に関連し
て討論されたのと同様の方法でSDS PAGE傾斜法で行うの
が好ましい。そして溶出液中の不純物蛋白類に対応して
発生するバンドが多くとも４つならば、一般にその抗体
製剤を実用に供するには充分な単一特異性を示している
と考えられる。

SDS PAGE中の染色インターフエロン蛋白バンドが、それ
らの抗原性を完全又はかなりの程度に保持した際は、う
さぎのような免疫にされうる動物類を免疫にするための
抗原製剤として、その染色インターフエロン蛋白類を、
SDS PAGEから直接切り取つて使用できる。SDS PAGEから
切り取つた染色バンドを免疫（下記製造の後）に用いる
時、前に討論した交叉反応（又はごく少量の不純物によ
る汚染）が、（５つのインターフエロン種を示す全溶出
液に比較して）起こる可能性は少ない。かくして、最適
の特異性を有するインターフエロンの個々の種（主とし
て、約18,400ダルトンと20,100ダルトンの二つの主要な
種）に対する抗体は下記方法にしたがつて生産すること
ができる。

1.4〜５×10⁶IFUのヒト白血球インターフエロン（CIFと
して）が、（下記の“タンデム”アフイニテイクロマ
トグラフイによつて）完全に精製され、次いでSDS PAGE
に付される。

2.そのゲルは、室温で10〜15分間だけ染色され、次いで
10分間部分的に脱色され、次いで蒸留水中で３回、０℃
の蒸留水で１〜２分間洗浄される。蛋白のバンドの正確
な位置を（例えばポラロイド写真で）記録しておき、そ
の二つの主要なインターフエロン蛋白種は、鋭利なナイ
フで切取つて特別に採取される。各切取片は、1mlの0.0
1％ SDS（PBS中,pH7.2）中でテフロンのロツドで細切
し、その後うさぎに皮下注射される。この操作を２週間
毎に行い、ヒト白血球インターフエロン蛋白類に対して
低い力価の抗体類を２〜４ケ月間発育させる。インター
フエロンに対する力価の低いことが検出されたならば直
ちに、フロイントのアジユバンドをその免疫性の混合物
に対し添加する。そしてその力価の発育状態によるが４
回目毎（４〜６週間毎）に添加される。この操作は３〜
12ケ月間続行され、インターフエロン種に対する抗イン
ターフエロンが発育する（10,000〜1,000,000IFU-NU/m
l）。このように、“単一特異性抗インターフエロン”
という用語は、SDS PAGEから切り取るステツプなしで上
記の如き純インターフエロン蛋白によつて生産される抗
インターフエロン、及びSDS PAGEから切り取られた染色
インターフエロンの一つ又は複数のバンドに対して産生
された抗体類について用いられる。

インターフエロン類に対して単一特異性の抗体類を生産
するもう一つの方法としていわゆるハイブリドマ（hybr
idoma）手法がある。このハイブリドマ手法は抗体の公
知の製造法であり、単一分枝系（monoclonal）の抗体産
生リンパ細胞／骨髄腫雑種（例えば、Current topics i
n Microbiology and Immunology,Vol.81,lymphocyte Hy
bridomas,Eds.F.Melchors,M.Potter,and N.L.Warner,Sp
ringer Verlag.1978参照）を確立したことからなるもの
である。しかし、この発明がなされるまでは、抗インタ
ーフエロン産生ハイブリドマ細胞クローンを得ることが
可能であるか知られておらずまた自明なことではなかつ
た。ハイブリドマ手法において、例えば免疫にされた動
物としてヒトLe型インターフエロンで免疫にされたマウ
スを用い、この免疫にされたマウスから得た脾臓の細胞
を骨髄腫細胞に融合させた後、この融合させたハリブリ
ドマを無性生殖させ、抗体産生クローンを選別して培養
し、抗体はその培養媒体から得られる。

マウス系でハイブリドマ手法で作られた抗体は、厳密に
単一特異性であり、それ故に、放射線免疫検定法（radi
oimmunoassay）又は他の類似の試験法に特に有利であ
る。

ハイブリドマ手法において、その抗体を得る一つの特別
な方法は、脾臓細胞が取り出された動物種の生体内で、
選別したクローンを培養し、その動物の腹水液から抗体
を得る方法である。そしてかような態様はこの発明の範
囲内に含まれる。

陽性のハイブリドマクローンの選別は、通常のインタ
ーフエロン中和試験によつて行なつてもよい。しかし、
通常のインターフエロン中和試験は、一つの必須要件と
して、そのインターフエロンの抗原決定子が生物学的活
性中心に極めて近接した位置（約1IgG分子長の距離以
内）にあることを要するので、一つ又は複数の生物学的
活性中心からはるかに離れて位置する抗原決定子はこの
試験法では検出されないであろうし、またこのことから
“陽性”のハイブリドマクローン（生物学的中心から
1IgG分子長以上の距離ではなれて位置するインターフエ
ロン蛋白上で抗原決定子に対する抗体を産生する）は、
この試験では検出されないであろう。それ故に、陽性ハ
イブリドマクローンを試験するのにより有利な手法はこ
の発明の放射性標識純ヒトLeインターフエロンを用いて
放射性免疫分析を行なう方法である。放射性標識純ヒト
Leインターフエロン蛋白は、ヒトLeインターフエロンに
放射性標識を行なうことによつて作られる。例えば下記
のゲル過手法でゲル液を作製し、ラクトバーオキシ
ダーゼ（lactoperoxidase）とヨー素135とを用いるとい
うような標準方法で放射性標識を行ない、次いでそのイ
ンターフエロン蛋白を本願記載の方法で精製し、その精
製インターフエロン蛋白をSDS PAGEに付し、そのSDS PA
GEゲルから放射性標識された純インターフエロン蛋白を
溶離する。通常のインターフエロン中和試験では、検出
されないようなクローンを検出する陽性ハイブリドマ
クローンを選別するもう一つの方法は次のとおりであ
る。すなわち各クローンの培養物の上澄液の例えば500
μｌをマトリツクス上に固定化し、例えば“原料及び方
法”の項に記載の方法に従つてCNBr−活性化セフアロー
ス（CNBr-activated Sepharose）上に固定する；得られ
た処理マトリツクスにヒトLe型インターフエロン例え
ば、粗ヒト白血球インターフエロンを加え、例えば各ク
ローンに対応する得られたマトリツクスゲル懸濁液をそ
のインターフエロンと混合し；その混合物を例えば１時
間37℃で放置し；次いで例えば遠心分離しPBSで洗浄し
て未結合のインターフエロンをマトリツクス物質から有
効に分離し；次いで各マトリツクスゲルを溶離し、例え
ば溶離緩衝液（pH2.4）と混合し遠心分離して結合イン
ターフエロンを脱離させ；この溶離によつてインターフ
エロンが得られるということは陽性のクローンの指標な
ので、そのマトリツクスゲルから得られた溶離緩衝液
（特に最後の溶離緩衝液）がインターフエロンを含有し
ている該マトリツクスゲルに対応するクローンを選別す
る方法である。陽性ハイブリドマクローンを検出する上
記二つの有利な方法は、抗インターフエロン産生ハイブ
リドマクローンに適用されるだけでなく、明確な修正を
行い、他の蛋白に対して指向される陽性ハイブリドマク
ローン産生抗体の検出にも用いられる。

この発明の精製されたインターフエロン蛋白類の一つに
対して生じた抗原類は、この発明の他の精製された蛋白
類を中和しうるということが見出されたのは興味深いこ
とである。かくして、この発明の単一特異性抗体類は、
この発明の単一の精製インターフエロン蛋白に対して生
成したものまたはこの発明の精製されたインターフエロ
ン蛋白類を組合わせたものに対して生成したもののいず
れもヒトLe型インターフエロン含有溶液の精製に等しく
有効であることが明らかになつたのである。

公知の原理に従つて、この発明の単一特異性抗インター
フエロンは、放射性免疫検定法又はその関連手法によつ
て生物学的流体中の対応するインターフエロン又はイン
ターフエロン成分の測定に用いることができる。しかし
上記したように、単一特異性抗体類の興味ある重要な効
用は、インターフエロン含有溶液の抗体アフイニテイ
クロマトグラフイ精製法に有用なことである。この目的
のために、抗体はそれ自体公知の方法でマトリツクスに
固定化される。すなわち、フアーマシア社製セフアロー
ス4Bのごとき架橋アガロースのような適切な抗体アフイ
ニテイクロマトグラフイマトリツクスに共有結合的に
適切に結合される。インターフエロン含有溶液の抗体ア
フイニテイクロマトグラフイ精製は、公知の方法で行つ
てもよいが、バツチ式か好ましくはカラム中に配置され
たマトリツクスに固定化された抗体を用いて行われる。

単一特異性抗インターフエロンを用いる抗体アフイニテ
イカラムの作製及びかようなカラムの操作は、本来公知
の方法で行われる。かかるカラムに用いられるインター
フエロン含有溶液は未濃縮の粗インターフエロン製剤で
もよく、又は濃縮インターフエロン製剤もしくは一部精
製されたインターフエロン製剤でもよい。カラムに用い
られるインターフエロン製剤は、ヒトLe型インターフエ
ロン含有のいずれのインターフエロン製剤でもよい。す
なわち、ヒト白血球インターフエロン、ヒトリンホブラ
ストイドインターフエロン（ナマルバインターフエロ
ン:Namalva interferons）又は上記のごときインターフ
エロンのDNAコーデイングを含有する微生物の培養によ
つて産生されるインターフエロン（もしはその主要部
分）が挙げられる。ナマルバインターフエロンや白血球
インターフエロンを精製するため、抗体アフイニテイク
ロマトグラフイに一部精製されたヒト白血球インターフ
エロンに対する抗体を用いることはすでに記載されてい
る〔例えば、Scand.J.Immunol.,８,429-436（1978）参
照〕。しかし、重要な改良点は、単一特異性抗インター
フエロンが実質的にヒトLe型インターフエロン蛋白だけ
を残し、製剤の残りの蛋白類はカラムを通過するという
ことである。自然に起る交差反応によるごく少量の不純
物は避けることができない。またこの交差反応は別とし
て、用いられる抗体がたとえ純インターフエロン蛋白だ
けを“産生する”（と反応する）と期待されているハイ
ブリドマ手法で生産された抗体であつても避けることは
できない。

適切な寸法のかような抗体カラムは（抗体アフイニテイ
クロマトグラフイカラムの公知の原理に従つて設計しう
るが）、このカラムは、粗インターフエロン製剤からイ
ンターフエロンの大規模な工業的精製を行い、カラム溶
出液中に純粋な（又は高度に精製された）インターフエ
ロン蛋白を得るのに用いられる。この方法で製造される
純（又は高度に精製された）インターフエロン蛋白は、
上記のごとく、その意図する用途によつて適切な安定剤
で安定化される。

単一特異性抗インターフエロンカラムに用いられるイン
ターフエロン製剤のインターフエロンは、重量基準で通
常非常に低濃度で存在し、かつ高価なインターフエロン
はできるだけ大量に単離すべきであるから、インターフ
エロンが接触する生物学的物質中に蛋白分解活性が存在
することから起るインターフエロン蛋白の劣化を最小に
することが大切である。そして精製されるべきインター
フエロンが接触するいずれの生物学的物質からも蛋白分
解活性を除去することはこの発明の一つの態様である。

この態様の重要な一つの効用は、この発明の抗インター
フエロン抗体（免疫グロブリン）から蛋白分解活性を除
去することである。この発明の除去法は、抗体をマトリ
ツクスに結合させる前に、免疫グロブリン（又はその重
要なフラグメント）に対して有害でないマトリツクス固
定化酵素阻害剤又は酵素分解剤で処理することによつて
適切に行なわれる。例えば、抗体は、マトリツクス固定
化ポリ−Ｌ−リジン及び／又はマトリツクス固定化ソヤ
ビーントリブシン阻害剤及び／又はマトリツクス固定化
カリクライン（Kallikrein）不活性化剤のカラムを通過
させることができる。抗体の適切な処理の例としては、
セフアロース4Bのごとき架橋アガロースに共有結合的に
結合したポリ−Ｌ−リジンのカラムを通過させ次いで同
じマトリツクスに共有結合的に結合したソヤビーントリ
ブシン阻害剤のカラムを通過させる方法が挙げられる。
このように蛋白分解活性を除去するとインターフエロン
含有溶液の抗体アフイニテイクロマトグラフイ精製時の
インターフエロン活性の回収率を増大させることが見出
されたのである。

単一特異性抗インターフエロンが架橋アガロースのごと
きマトリツクスに共有結合的に結合している際は、マト
リツクスに共有結合的に結合した抗体の全量は、この発
明の発明者がScand・J.Immunolog.,６,77-86（1977）に
記載したごとく、その共有結合段階で用いられる免疫グ
ロブリンのせいぜい85％に相当するような程度に結合さ
せるのが好ましい。その結果、このカラムからは、最高
の回収率でインターフエロンが得られる。

単一特異性抗インターフエロンアフイニテイクロマトグ
ラフイからの溶離液をヒトに投与する際は、その溶離液
がヒトに免疫を起こさせるいずれの成分も含有しないこ
とが重要である。抗体アフイニテイクロマトグラフイに
随伴するかもしれない一つのリスクは、免疫グロブリン
フラグメントがカラムから遊離し、所望の単一又は複数
の蛋白と共に溶出されるようになることである。

この発明によれば、ヒトに免疫を起こさせるような免疫
グロブリン又はそのフラグメントは、その溶離液を、そ
の抗体が抗インターフエロン免疫グロブリンに対して指
向されており、かつヒトに非経口投与しても免疫を起こ
させない種類のものである抗体アフイニテイカラムを通
過させることによつて除かれる（溶離液は、該カラムを
通過させる前にpHを中性、例えば、PBSに対して透析しp
H7.2に調整しなければならない）。

ヒトへ非経口投与した際、免疫を起こさせない免疫グロ
ブリンは霊長類の免疫グロブリンであるが、単一特異性
抗インターフエロンの製造に用いられる動物の免疫グロ
ブリンに対して指向される霊長類の免疫グロブリンへの
門戸は、法律的論理的理由から制限されるか完全に閉ざ
されている。それ故に、豚IgG免疫グロブリンが、米国
特許第4,132,769号に記載のようにヒトに免疫を起こさ
せないことが見出されたことは注目すべき重要なことで
ある。ヒトハイブリドマ系で生産される抗体が得られれ
ば興味深い代替物となるであろう。

かくして、この発明に従つて、抗インターフエロンアフ
イニテイクロマトグラフイの溶離液からの抗インターフ
エロン免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラクシヨン
の除去は、溶離液を（pHを中性に調整後）、抗インター
フエロン免疫グロブリンに対して指向されるマトリツク
ス固定化豚IgGのカラムを通過させて行うのが好まし
い。

抗インターフエロン免疫グロブリンに対して指向される
豚IgG免疫グロブリンは、本来公知の方法、すなわち、
豚を、抗インターフエロン免疫グロブリン産生動物種か
らの免疫グロブリンで免疫にしておいて、上記米国特許
第4,132,769号に開示の方法に従つて豚から得られる抗
血清からIgG免疫グロブリンフラクシヨンを単離する方
法で製造される。

一般的に、この発明の寄与するところを示せば、この発
明はヒトに投与される蛋白溶液からヒトに免疫を起こさ
せる蛋白を除去する方法であるといえる。すなわち、そ
の蛋白溶液を、抗体が免疫を起こさせる蛋白に対して指
向する免疫グロブリンであり、該免疫グロブリンがヒト
に非経口投与しても免疫を起こさせない種類のものであ
る抗体アフイニテイクロマトグラフイ処理に付すことか
らなる方法である。上記説明から明らかなごとく、免疫
を起こさせない好ましい免疫グロブリンは霊長類の免疫
グロブリン又は豚のIgG免疫グロブリンである。

この発明の上記の寄与に関連した別の態様としては、マ
トリツクス固定化抗体を用いる抗体アフイニテイクロマ
トグラフイで免疫グロブリンとして豚IgG免疫グロブリ
ンを用いる方法；抗体アフイニテイクロマトグラフイに
マトリツクス固定化豚IgG免疫グロブリンを用いる方
法；及びマトリツクス固定化豚IgG免疫グロブリンを用
いる抗体アフイニテイクロマトグラフイによつて、ヒト
に非経口投与する蛋白含有溶液を精製する方法が挙げら
れる。これらの一般的な態様、効用及び実施態様は上記
説明から明らかである。

粗ヒト白血球インターフエロンから純ヒト白血球インタ
ーフエロン蛋白（ヒトLe型インターフエロン蛋白）を製
造するためにこの発明にしたがつて行われる精製工程
は、KSCNでの蛋白の沈澱による濃縮、ゲル過、リガン
ドアフイニテイクロマトグラフイ及び抗体アフイニテイ
クロマトグラフイからなるものである。かような工程
はインターフエロン技術分野では本来公知であるが、そ
の特定の組合わせ及びいくつかの操作に適用される特定
の条件は新規な特徴であり、その中のいくつかのものは
それ自体この発明に含まれる。この工程を実施するとき
の特定の仕方や操作の特定の組合わせによつて、インタ
ーフエロンに最適の精製法や濃縮法が得られ、かつ工程
中でのインターフエロンの損失が最小になつたのであ
る。

KSCN沈澱法は、0.5M濃度のKSCN含有粗インターフエロン
のpHを、通常の3.5に低下させる代りに4.5に低下させて
行うのが好ましい。かようにすると、沈澱中の蛋白の量
はごく少量になり、その後の精製工程が容易になる。

ゲル過法は、25容量％のエチレングリコール、１モル
濃度のNaCl及びPBS（pH7.2）を含有する緩衝溶液で行わ
れる。その結果PBSを用いて低いpH（2.4）にするだけか
又は尿素を用いかつPBSでpH7.2とした場合よりも良好に
溶解することができた。特に10,000〜20,000ダルトンの
範囲の蛋白だけを含有する溶離液フラクシヨンが集めら
れる。

リガンドアフイニテイクロマトグラフイは新規で極めて
有利な方法で行われ、この発明の一つの重要な態様を構
成するものである。

該リガンドアフイニテイクロマトグラフイは、リガンド
として固定化シバクロンブルーF3GAを用い、少なくとも
50,000〜100,000IFU/mg蛋白の特異性活性を有するイン
ターフエロンについて、特定の条件下で行われる。イン
ターフエロンのアフイニテイクロマトグラフイ用のリガ
ンドとしてシバクロンブルーF3GAを用いることは当然技
術分野では公知であつたが、この発明によつて、条件の
特定の組合わせを用いるとこのリガンドの選択度が著し
く増大することが見出されたのである。すなわち用いら
れるインターフエロンは、このタイプのリガンドを通常
用いる場合（このとき約３〜５×10³IFU/mg蛋白の比活
性度の粗ヒト白血球インターフエロンが用いられる）よ
りもはるかに高い比活性度すなわち少なくとも50,000〜
100,000IFU/mg蛋白の比活性度を有していなければなら
ない。そしてインターフエロンをカラムに入れるときの
溶液は、pHが6.5〜８の範囲になければならずイオン強
度は特に10〜100の範囲を超えてはならず、特にpHが7.2
の20mMリン酸塩緩衝液が用いられる。このような比較的
高い比活性度のインターフエロンが用いられる際は、リ
ガンドの特異性が変化し、インターフエロン蛋白がリガ
ンドと選択的に結合する度合がより高くなる。シバクロ
ンF3GAは、インターフエロン蛋白と“ジヌクレオチドホ
ウルド（dinucleotide fold）”の存在を示すインター
フエロン蛋白とある程度相互作用するものと信じられ、
この相互作用において、ポリリボヌクレオチドと同じ結
合部位を有するようである。上記で討論されたごとき特
別の臨界条件下でシバクロンF3GAが示した特別の有利な
性質は、このリガンドが属する部類の他のリガンドも示
すものと信じられる。それ故に、この発明の一つの態様
として、少なくとも50,000〜100,000IFU/mg蛋白の比活
性度を有するヒトLe型インターフエロン蛋白含有水溶
液、すなわちpHが6.5〜８に緩衝されイオン強度は実質
的に10〜100を超えず特に20mMのリン酸塩緩衝液が用い
られpH7.2の溶液に任意に５〜80％のエタノールのごと
き水混和性有機溶媒を加えた溶液を、シバクロンF3GAに
よつて与えられる機作にしたがつてインターフエロンと
結合しうるマトリツクス固定化リガンド上に注入し、そ
の後結合されたインターフエロンを溶離することからな
るヒトインターフエロンの精製法が含まれる。

マトリツクス固定化シバクロンF3GAの材料の例として
は、“ブルーデキストラン2000（Blue Dextran 200
0）”（マトリツクス：分子量200万のデキストラン）及
びブルーセフアロースCL-6B（Blue Sepharose CL-6B）
が挙げられる。これらの材料と他の材料及び通常のイン
ターフエロン精製にこれらのものを用いる場合のさらに
詳細な事項は、Bollin et al.,Preparative Biochemist
ry,８（４）,259〜274（1978）に示されている。

この発明では、固定化シバクトンF3GA組成物として、
（CNBr−活性化セフアロース4Bによつて）セフアロース
4Bにカツプリングさせたブルーテキストラン2000を用い
るのが好ましい。

この発明によつて、インターフエロンをこのタイプの固
定化リガンドから溶離する際、pH7.2に緩衝された0.6M
塩化ナトリウム溶液を用いると、極めて選択的に溶離さ
れることが見出されたのである。またこのpH7.2は用い
られるインターフエロン含有溶液についても好ましいpH
である。

第４図には、pH7.4の20mMリン酸塩緩衝液（PB）に対し
て透析し、部分的に精製したヒト白血球インターフエロ
ン（1ml,比活性度500,000IFU/mg蛋白）を、ブルーデキ
ストランセフアロース4Bのカラムに負荷したときの溶離
パターンを示した。フラクシヨンの大きさは5ml、流速
は35〜40ml/hであつた。カラムは20mMPBで２時間洗浄し
た後、0.2、0.4、0.6、0.8及び1.0Mの塩化ナトリウムの
PB（pH7.4）溶液で段階的に溶離した。はじめに負荷し
た液の定量結果は750,000IFUであつたが、全溶出液（Ｉ
＋II＋III）には754,000IFU（30ml中）含有されてい
た。従つて回収率は100％であつた。溶出液の比活性度
は2.1×10⁷IFU/mg蛋白であり、精製係数は42であつた。
溶出液をSDS PAGEで検査すると、殆んどの溶出蛋白（＞
98％）は50,000ダルトン以上のところに現われる（不純
物）（第４図の供給液、洗浄液および溶出液のSDS PAGE
を示す第4a図参照）。上記のことから明らかなように、
pH7.2に緩衝された0.6M塩化ナトリウム溶液がアフイニ
テイカラムに対してもつとも好ましい溶離液であるけれ
どもさらに広い範囲の濃度を選択することができること
にも留意すべきである。そしてこの発明には、0.5〜0.7
モル特に0.5〜0.65モル濃度でpHが6.5〜８に緩衝された
塩化ナトリウム水溶液又はpHが6.5〜８に緩衝されかつ
かような塩化ナトリウム溶液に相当するイオン強度を有
する他の水溶液による溶離法が含まれる。他の溶離液を
用いることもこの発明の範囲に含まれる。例として、ア
ミノ酸類、人工アミノ酸類、アンホリン類、蛋白類、蛋
白混合物の濃度を50％まで段階的及び／又は傾斜的に増
大させた塩類及び／又はエチレングライコールを挙げる
ことができる。上記のごとく、インターフエロン溶液は
アルコール特にエタノールのごとき水混和性有機溶媒と
共に用いてもよい。

この発明の一態様によつてアフイニテイクロマトグラフ
イで精製されるインターフエロンの代表的なものは、ヒ
トインターフエロン類（ヒト線維芽細胞インターフエロ
ン類は別として）：すなわち例えばヒト白血球インター
フエロン類、ヒトリンホブラストイドインターフエロン
類；及びヒトLe型インターフエロン蛋白類もしくはこの
インターフエロン蛋白生産のためのDNAコーテイングを
有する微生物クローンの培養によつて得られるその主要
部分；のごときヒトLe型インターフエロン蛋白類を含有
するインターフエロンである。〔ヒトリンホブラストイ
ドインターフエロン（ナマルバ）が小比率の線維芽細胞
特性のインターフエロン（Ｆ型−その生物学的活性の15
％に相当する）を含有するという事実は、ヒトリンホブ
ラストイドインターフエロンが、その大部分のインター
フエロン活性に関してこの発明によつて示されたごと
く、ヒト白血球インターフエロン蛋白類の決定因子と同
一の決定因子を有するヒトLe型インターフエロン蛋白類
（その生物学的活性の85％に相当する）を含有する一つ
のヒトLe型インターフエロンであるという事実を損うも
のではない。〕アフイニテイカラムに注入されるインターフエロン製剤
の比活性度として好ましいのは10⁵〜10⁶IFU/mg蛋白であ
り、例えば２×10⁵〜10⁶、約５×10⁵、５×10⁵〜10⁶IFU
/mg蛋白である。

この発明の態様に従つて操作されたアフイニテイクロマ
トグラフイカラムからの溶出液も治療用に興味ある生成
物である。この生成物は、純ヒトアルブミン血清を標準
に用いるロウリイ法（Lowry procedure）基準で、30×1
0⁶〜10⁸、例えば30×10⁶〜70×10⁶IFU/mg蛋白のごとき
少なくとも30×10⁶IFU/mg蛋白の比活性度を有する場合
が多い。ヒトに投与するため、この製剤には、滅菌と発
熱物質が存在しないことを保証するための予防策のごと
き通常の製薬上の予防策がなされる。この製剤の投与量
は、全活性度基準で、純インターフエロンについて上記
した投与量に相当するものである。

“実験”の項で説明されるように、アフイニテイクロマ
トグラフイカラムからの溶出液は、純インターフエロン
に至る当初の実験では、抗体が部分的に精製されたヒト
白血球インターフエロンに対して生じた免疫グロブリン
である吸収抗体アフイニテイカラムを通過させることに
よつて最終の精製がなされ、次いでマトリツクス固定化
粗ヒト白血球インターフエロンのカラムを何回か通過す
ることによつて混入した蛋白に対する抗体が除去され
る。下記の詳細な説明で明らかなように、粗インターフ
エロンとマトリツクス（例えばセフアロース4Bのごと
き）との共有結合的結合は、インターフエロン自体の免
疫学的決定因子を破壊するが（98％以上）、大半の不純
物の決定因子を破壊しないことは明らかである。このこ
とは、部分的に精製された白血球インターフエロンに対
して生じた免疫グロブリンをカラムを通過（通常数回）
させると、その抗不純物がカラムに残留し、一方抗イン
ターフエロンはカラムを通過することを意味する。かよ
うな吸収された抗インターフエロン（数回吸収された）
はそのアフイニテイクロマトグラフイの後の抗体アフイ
ニテイクロマトグラフイに用いられる。

粗ヒト白血球インターフエロンの代りに、“インターフ
エロン抗体アフイニテイクロマトグラフイ”特にこの発
明の単一特異性抗体を用いて行われるインターフエロン
抗体アフイニテイクロマトグラフイから得られる“洗浄
水”もこの目的に使用できるし、又はかような洗浄水は
粗ヒト白血球インターフエロンと共に用いることもでき
る。またいくつかのインターフエロン抗体アフイニテイ
クロマトグラフイから得られるすべての不純物が集めら
れ、これらの不純物は粗ヒト白血球インターフエロンの
代りかもしくは該インターフエロンと合して用いること
ができる。

“実験”の項から明らかなように、アフイニテイカラム
類すなわちブルーデキストランセフアロースカラム及び
抗体アフイニテイカラムの好ましい操作法は、これら２
つのカラムを連結し、ブルーテキストランカラムからの
溶出液を同時に抗体アフイニテイカラムに負荷する方法
である。この方法はブルーデキストランカラムからの溶
出液を別個に扱つたならば起りうる損失を防止する。

ヒトLe型インターフエロン蛋白の最後の濃縮工程には、
SDSで沈澱させることによつて蛋白を濃縮する独特の方
法が用いられる。この方法では、この発明のもう一つの
態様を構成するものであり、好ましくは0.1〜４重量
％、特に約0.1重量％のSDSを含有する蛋白溶液からSDS
又はその塩を沈澱させ、SDS又はその塩と該蛋白との一
種又は複数種の錯体からなる沈澱を得、その沈澱を溶液
から分離し、好ましくは０〜４℃で遠心分離し、次いで
その沈澱を小容積の液体に再溶解することからなるもの
である。このSDSを沈澱させるには、ａ）約15分間、温
度を０℃に低下させるか又はｂ）SDS又はSDS−蛋白錯体
で沈澱を形成する例えばカリウム塩のごとき塩を加えて
行うのが適切である。この方法は純粋又は精製されたイ
ンターフエロンの水溶液を濃縮する価値ある方法であ
り、上記のごとく、ヒトLe型インターフエロン蛋白を濃
縮する優れた方法であることが見出されたのである。

この発明に従つて行われる全精製系列は著しく活性度を
保持することが見出された。すなわち出発量が７×10⁵
ガンマの蛋白から単離された純インターフエロンは１ガ
ンマ以下か１ガンマに等しいものであつた（SDS PAGEの
蛋白のバンドを比較して測定）。しかし粗インターフエ
ロンの出発バツチから純インターフエロンに至るまでの
全インターフエロン活性度は４×10⁶IFUから1.85×10⁶I
FUに減少したに過ぎなかつた（約50％）。このことはそ
の精製系列及び上記系列の重要な段階の独特な特性を強
調している。

材料及び方法インターフエロンの分析は、公知の標準法〔Berg K.,Se
quential Antibody Affinity Chromatography of Human
Leukocyte Interferon,Scand.J.Immunol.６,77〜86（1
977）,VERO細胞（猿の腎臓の細胞）及び攻撃性ウイルス
（challenge virus）として水胞性口内炎ウイルス（VS
V）を使用〕に従つて行われた。全インターフエロンの
単位（IFU）は国際参照単位（69/19B単位:MRC,mill Hil
l,U.K.から得た。）で表わされる。

インターフエロン：粗ヒト白血球インターフエロンはCa
ntellが記載のインターフエロン誘発因子としてセンダ
イウイルスを用いる方法（Cantell,K.,Hirvonen,S.,^Ｍo
gensen,K.E.and Pyhｌ,L.,Human Leukocyte Interf
eron:production,purification,stability and animal
experiments;Waymouth,C.,The Prod^ｕction and use of
Interferon for the Treatment and Brevention of Hu
man Virus Infections,PP35〜38;1973年レイクプラシツ
ドで開催されたTiss^ｕe Culture AssociationWorkshop
の会報（生体外の部第３巻）及びメリーランド州ロツク
ビルのTissue Culture Associationの会報）で生産され
た。５×10⁵IFU/mg蛋白の比活性度を有する一部分精製
されたインターフエロン（RIF）が、Cantell,K,Hirvone
n,S.,Mogensen,K.E.and Pyhｌ,L.らが上記文献中に
記載のエタノールによる沈澱法で粗濃縮ヒト白血球イン
ターフエロン（CIF）が得られた。

粗ナマルバインターフエロンは、実質的にStranderらが
記載のインターフエロン誘発因子としてセンダイウイル
スを用いる方法（Production of human lymphoblastoid
interferon,J.Clin.Microbiol.１ 116〜1249（197
5）〕で製造された。

インターフエロン中和法：抗インターフエロンを測定す
るこの方法は、次の仕方でマイクロ−分析系で行つ
た。:2万VERO細胞／ウエルを100μｌの媒体中に接種し
湿らしたキヤビネツト中５％CO₂で保持した。２日目媒
体を該細胞から除去し、各ウエルに６〜8IFU/mlの濃度
のインターフエロンを含有する抗血清の希釈液（媒体で
の）の100μｌを加えた（該血清とインターフエロンは
１時間、37℃で予め培養した）。３日目に媒体を除去
し、全ウエルに100μl VSV（媒体で10^-3.5まで希釈）を
加えた。４日目に、CPE（細胞変性効果）が測定され
た。そして抗インターフエロン力価の測定のため終点と
して50％破壊試験が行われた。その力価は国際中和単位
（IFU-NU）/mlで表わされる。

PIFに対する非単一特異性抗インターフエロンが一部羊
又は一部うさぎを使つてMogensen,K.E.,Pyhｌ,Liis
a and Cantell,K.,Acta path.microbiol.scand.Sect.B,
83 443-450（1975）に従つて製造された。羊抗インター
フエロンの力価は100〜25万IFU-NU/mlであつた。うさぎ
抗インターフエロン製造のために、PIF（２×10⁵IFU）
を２年間以上１週間毎にうさぎに対し皮下注射した。う
さぎ抗インターフエロンの力価は、15,000〜30,000IFU-
NU/mlであつた。全免疫グロブリンは、50％硫酸アンモ
ニウムで沈澱させ次いで、pH7.2のリン酸塩緩衝食塩水
（PBS）に対し透析して単離された。

化学試薬類 CNBrはフルカ製（−20℃で貯蔵）を用い
た。電気泳動法用の特に純粋なドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）はBritish Drug House（BDH）を通じて購入し
た。ソヤビーントリプシン阻害剤（STI）とＬ−リジン
はシグマ社から得た。セフアロース4B、CNBr−活性化セ
フアロース4B、CH−活性化セフアロース4B及びエポキシ
活性化セフアロース6Bは、すべてフアーマシア社（デン
マーク）から購入した。

結合方法免疫グロブリンとセフアロース4Bとの共有結
合的な結合は、K.Bergが先にScand.J.Immunolog.,６,77
-86（1977）に記載したのと同じ方法でなされた。免疫
グロブリンの80〜85％のみがむらなく結合された。

蛋白の分析は、ロウリイ法の変形法〔Berg K.,Sequenti
al Antibody Affinity Chromatography of Human Leuko
cyte Interferon,Scand.J.Immunol.,６,77〜86（197
7）〕でなされ、（LKB Calculation Absorptioner Ultr
alab Systemを用い、）検出可能な最少量の蛋白が１〜
２μg/mlであつた。結晶性の牛血清アルブミンを標準蛋
白として用いた。精製インターフエロンの蛋白濃度（全
体で１〜５μｇ）を測定するのに次の手法が採用され
た。すなわち、SDSを最終的に0.1％の濃度まで添加し、
これを蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した蛋白の試
料をさらにSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（S
DS PAGE,後記参照）で試験した。染色した蛋白のバンド
の強度を種々の量の既知の標準と比較し（SDS PAGEによ
る；後記参照）、蛋白の全量を算出したがその偏差は５
〜10％であり、蛋白の検出可能な最少量は0.1μｇ（全
体で）であつた。この方法で得られる結果は、実測値と
いうよりもラフな計算値として役立つものである。

アフイニテイクロマトグラフイは４℃で行われた。その
ゲル懸濁液は、カラムに充填する前に脱ガスされた。充
填は蠕動ポンプを用い、充填用緩衝液のカラム容積の３
〜５倍量で洗浄して行われた。ターフエロン滴定用の試
料（100μｌ）は、プール又は個々のフラクシヨンから
採取されその日に滴定するか又はプラスチツク管に入れ
て凍結（−20℃）しその後滴定した。希釈は媒体（10％
小牛血清含有）でなされた。

抗体アフイニテイクロマトグラフイは、特にBergが記載
した方法で行われた〔Sequential Antibody Affinity C
hromatography of Human Leukocyte Interferon,Scand.
J.Immunol.,６,77〜86（1977）〕。充填緩衝液として0.
1M NaOA/0.3M NaCl,pH7.2（流速40ml/h）が用いられ
た。段階的溶離は、少量のクエン酸（pHを確実に2.4に
保持するに足る）含有の0.1M HOAc/0.3M Naclで行われ
た。カラムを使用しない際は、ペニシリン、ストレプト
マイシン、ゲンタマイシン及びクロラムフエニコール
（各１％）含有のPBS 1M Nacl中４℃で保管した。カラ
ムを精製を目的として使用する前は、最初に100mlの充
填用緩衝液で次いで溶離緩衝液で洗浄し、最後に20〜30
mlの充填用緩衝液で平衡にさせた。この洗浄サイクル
は、特に10⁷IFU/mg蛋白以上の比活性度のインターフエ
ロンを処理するとき、“天然”の蛋白を避けるのに必要
であつた。インターフエロン溶出液を集めるのに用いた
プラスチック管は１％SDSの100μｌで予め濡らしておい
た。

SDS PAGE 精製、濃縮されたインターフエロン製剤は、
そのポリペプチド成分を、20cm長の分離ゲル,0.75mm厚
（ビオラツド221型:2重垂直平板ゲル電気泳動セル）及
び７〜10cm長のスタツキングゲル（Stacking gel）を用
いるSDS PAGE平板ゲルで分析された。約９〜22％ポリア
クリルアミドの指数勾配のゲルは、Knight,E.,Interfer
on:Purification and initial characterization from
human diploid cells.Proc.nath.Acad.Sci.USA 73 520
〜523（1976）に記載のごとく、11mlの22％アクリルア
ミド溶液と約32mlの９％溶液とを簡単な氷冷勾配器中で
混合して作製された。Laenomli記載の非連続緩衝液系
〔Laenomli,U.K.Cleavage of Structural Proteins Dur
ing Assembly of the Head of Bacteriophage T4,Natur
e 227,680〜685（1970）〕が用いられた。このゲルは予
め２時間冷却（10℃）しておいてから電気泳動分析法に
付されるが、10mA（約20V）で開始され、一定条件下（L
KB電源）一夜（10℃）で行われた。分析試料は、トラツ
キング染料を含有しSDSが2.5％、グルコースが５％の0.
1Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解（又は希釈）さ
れた（試料緩衝液）。そのゲルは、コマシイブルー（Co
massie Blue,50％メタノール、40％水及び10％酢酸混合
物中1.25mg/ml）にて、予め固定処理することなしに、1
5分間、室温下、一定揺動下で染色し、次いで７％酢酸
（５％メタノール）中で脱色した。ゲルは良質の紙〔例
えば、ワツトマンクロマトグラフイ紙（17mm）〕上で、
加熱減圧下、ゲル乾燥機（ビオラツド，ゲル平板乾燥機
224型）を用いて乾燥された。５種の異つたモレキユラ
ーマーカーの0.1μｇ〜10μg/20μｌ溶液〔ラクトアル
ブミン（14,400ダルトン）；ソヤビーントリブシン阻害
剤（20,100ダルトン）；炭酸脱水酵素（30,000ダルト
ン）；オバルブミン（43,000ダルトン）；牛血清アルブ
ミン（67,000ダルトン）；ホスホリラーゼ（94,000ダル
トン）（デンマーク，フアーマシヤ社の電気泳動法用校
正キツトとして入手）〕をSDS PAGEに付し、染色した。
この方法で決定された分子量は約±200ダルトンの実験
精度であることに留意すべきである。

染色蛋白のバンドが精製インターフエロン製剤の平行し
たSDS PAGEから得られた対応するバンドと比較され、イ
ンターフエロン蛋白の全濃度が評価された。SDS PAGEか
ら生物学的プロフイルを得るため、インターフエロン測
定用のゲルの一部を残りのゲルから切り取り、ガラス板
上４℃で（しめらせた箱内）に保管した。そのゲルの主
要部は15分間染色し、３〜５分間脱色すると、弱いバン
ドがブルー色をバツクグランドとして明確に見えるよう
になり、14,000ダルトンと30,000ダルトンに対応する蛋
白のバンドの正確な位置を決定することができた。その
ゲルの染色しなかつた部分、すなわち14,000ダルトンと
30,000ダルトンとの間の蛋白だけを含有している部分を
切り取り、鋭利なナイフで1mm片に細切した。これらの
切片をテフロンロツドで完全に細かくくだいた後0.1M S
DSの0.5mlで溶離してこれらの切片のインターフエロン
が得られた。室温で５時間振動させた後、上澄液のイン
ターフエロン活性を測定した。個々のフラクシヨンは添
加物を加えずに−20℃で凍結した。

実験純ヒト白血球インターフエロン蛋白及びリンホブラスト
イドインターフエロン蛋白の製造粗ヒト白血球インターフエロンの濃縮 3lの粗ヒト白血球インターフエロンに、pH7.2でKSCNを
0.5M濃度まで加えた。マグネチツクスタラーで攪拌しな
がら１規定の塩酸を加えてpHを4.5まで下げてインター
フエロン（と不純物）を含有する蛋白の沈澱を得た。こ
の沈澱を、1M Naclと25容量％のエチレングリコール含
有のPBS（リン酸塩溶液で緩衝された塩水,pH7.2）150ml
中に溶解し、４℃で2lの同じ緩衝液に対して３回充分透
析を行つた。この濃縮された粗ヒト白血球インターフエ
ロン（HuLeCIF）の比活性度は５〜10×10³IFU/mg蛋白で
あり、回収率は約98％であつた。

粗ナマルバインターフエロンの濃縮約8,000IFU/mlの力価を有する１の粗ナマルバインタ
ーフエロンに、pH7.2でKSCNを0.5M濃度まで加えた。マ
グネチツクスタラーで攪拌しながら１規定の塩酸を加え
てpHを4.5に下げ、インターフエロン（と不純物）を含
有する蛋白の沈澱を得た。その沈澱を1M Naclと25容量
％のエチレングリコール含有のPBS（pH7.2）50ml中に溶
解し、４℃で2lの同じ緩衝液に対し３回充分に透析を行
つた。この濃縮された粗ナマルバインターフエロン（Na
CIF）の比活性度は10〜12×10³IFU/mg蛋白であり、回収
率は約98％であつた。

ゲル過 100cm長のカラム（直径2.6cm,フアーマシヤK2.6×100）
に、４℃で1M Naclと25容量％のエチレングリコール含
有のPBS（pH7.2）中にウルトロゲル（Ultrogel）AcA 5/
4（LKB,デンマーク）を充填した。そのカラムをその３
倍容量の緩衝液で洗い、カラムを安定化させた。10〜15
mlのHuLeCIF（エチレングリコール濃度が25容量％で1M
NaclのpH7.4のPBS中で前記のごとく調製したもの）をカ
ラムに充填し、次いでそのカラムを上記の充填用緩衝液
で“溶離”し、各フラクシヨンのインターフエロン活性
を分析した。そのインターフエロン含有フラクシヨンを
合し、原インターフエロン活性度の約95％を回収した。
ゲル過したヒト白血球インターフエロン含有溶出液の
比活性度はほぼ10⁶IFU/mg蛋白であつた。これは200の精
製係数に相当する。モレキユラーマーカで測定すると、
そのインターフエロンの分子量は10,000〜20,000ダルト
ンの範囲にある。個々のフラクシヨンを滴定すると18,0
00ダルトンの位置に極大値を示すブロードなピークを一
つだけを示した。

上記と同じ仕方で、10mlのNaCIF（エチレングリコール
濃度が25容量％でNacl濃度が1MでありpH7.4のPBS中で前
記のごとく調製されたもの）をカラムに充填し、次いで
前記と同じ仕方で“溶離”を行つた。回収率は約90％で
あつた。このゲル過されたナマルバインターフエロン
含有溶出液の比活性度は、ほぼ10⁶IFU/mg蛋白で、これ
は精製係数100に相当する。モレキユラーマーカーで測
定するとこのインターフエロンの分子量は10,000〜20,0
00ダルトンの範囲にある。個々のフラクシヨンを滴定す
ると18,000ダルトンの位置に極大値を示す一つのブロー
ドなピークを示した。

HuLeCIFとNaCIFの上記ゲル過操作についてのそれぞれ
のゲル過曲線を第５図及び第６図に示した。そして、
“HULEIF"はヒト白血球インターフエロンを示し、一方
“NALYIF"はナマルバ（リンホブラストイド）インター
フエロンを示す。そのインターフエロン活性は蛋白の主
要部分から有効に分離されていることが明確に認められ
る。

ブルーデキストランクロマトグラフイ上記のようにして得られた、ゲル過されたヒト白血球
インターフエロン溶液を、４℃、pH7.2の20mMPBの200倍
容量に対して徹底的に透析を行つた。この透析を２回行
い、全透析時間は約24時間であつた。その透析された溶
液（25ml,1.8×10⁶IFU）をブルーデキストラン−セフア
ロース4Bのカラムに充填した。そのカラムの直径は1cm
で長さは10cmであつた。このカラムは、pH7.4の20mMPB
（リン酸塩緩衝液）の200〜300mlで予め洗浄した。透析
されたインターフエロン調製試料をその平衡化されたカ
ラムに入れ、次いでカラムを75mlのPBで洗浄した。その
洗浄液には4,500IFUの活性度が認められた。そのカラム
を0.6M Nacl,20mM PB（pH7.2）で溶離し、インターフエ
ロン活性の95％以上を6mlの溶出液中に回収した（イン
ターフエロン滴定により測定）。

正確に同じ方法で、上記ゲル過ナマルバインターフエ
ロン溶液を徹底的に透析に付した後、ブルーデキストラ
ンクロマトグラフイに付した。ブルーデキストランクロ
マトグラフイに供給したものの力価は1,600,000IFUであ
り、その洗浄液は50mlの力価は70,000IFUであつた。溶
出液は0.6M Nacl pH7.2のPBによる溶離によつて得られ
た。ナマルバインターフエロンのブルーデキストランク
ロマトグラフイを第７図に示した。ナマルバインターフ
エロンの線維芽細胞部は、上記条件下このカラムからは
溶離されなかつた。しかしエチレングリコール濃度が25
％、1M NaclのpH7.2のPBを用いれば溶離されるであろ
う。

上記ブルーデキストランカラムは、臭化シアンで活性化
されたアガロース（セフアロース4B）にカツプリングさ
れたブルーデキストラン（分子量200万のデキストラン
2,000に固定化されたシバクロンブルーF3GA）のカラム
であつた。従つて、そのカラムのより完全な名称はブル
ーデキストラン・セフアロース4Bである。この種のカラ
ムはBollinらの前記文献に記載されている。溶離した
後、そのカラムを、エチレングリコール濃度が25％、Na
cl濃度が1.5M及びリン酸塩濃度が20mMのPBの25〜30mlで
溶離することによつて洗浄した。このカラムを使用しな
い際は、４℃でこの緩衝液中に保存された。上記のごと
く、カラムへの負荷条件には種々な量（０〜50％）のア
ルコール類のごとき疎水性試薬を使用することも含まれ
る。

ブルーデキストランクロマトグラフイから0.6M Naclで
溶離されたものは、ヒト白血球インターフエロン及びナ
マルバインターフエロンの両者について、70×10⁶IFU/m
g蛋白の比活性度を示す。従つてこれらのインターフエ
ロンは治療を目的としてヒトに非経口投与しうるもので
あり、この点については通常用いられるPIF製剤よりも
はるかに高純度の製剤である。この用途に用いるため、
この溶出液は上記のごとき生理学的に受容な安定剤、例
えば１％のヒトアルブミンで安定化される。

さらに精製し純インターフエロンを製造するため、ブル
ーデキストランカラムから得られた溶離液は、抗体アフ
イニテイクロマトグラフイカラムに直接移される。最も
有利なのは、抗体アフイニテイクロマトグラフイカラム
を、下記のように“タンデムシステム”にブルーデキス
トランカラムと連結することである。

タンデムアフイニテイクロマトグラフイ上記のようにしてブルーデキストランカラムを溶離する
のに代つて、溶離を行う前にブルーデキストランカラム
の出口と抗体カラムの入口とを結合することによつてブ
ルーデキストランカラムと平衡化された抗体カラムとが
連結される。この方法ではブルーデキストランカラムか
らの溶出液は直ちに抗体カラムによつて“キヤツチ”さ
れる。この組合わせは、0.6M Nacl,20mM PB,pH7.2の溶
離条件が抗体カラムの負荷条件として用いうるという事
実を利用するものである。20mlの溶出液／“負荷緩衝
液”（この“負荷緩衝液”は、もちろん同時にブルーデ
キストランカラムから溶離されたインターフエロンを含
有している）を用いて溶離／負荷を行つた後、この２つ
のカラムをはずし、次いで抗体カラムを上記のごとく溶
離する前にさらに洗浄する。抗体カラムからのヒト白血
球インターフエロン溶出液は10⁹IFU/mg蛋白以上の比活
性度（上記測定法による）を示す純インターフエロン蛋
白を含有する。純インターフエロン蛋白を安定化するに
は、抗体カラムからの溶出液を集める管（フラクシヨン
サイズ2ml）を各々10μｌの１％ SDSで予め濡らしてお
いた。インターフエロン含有溶出液をプールした後、追
加のSDSを全濃度を0.1重量％まで加えた。

プールされ、0.1％SDSで安定化されたインターフエロン
含有溶出液は、氷浴中で０℃に予め冷却された20mlのス
テンレス鋼製管に移される。15分後、沈澱が生成する。
この沈澱を４℃で20分間20,000rpmの遠心分離法で分離
される。上澄液（インターフエロン活性なし）を排棄
し、沈澱を4mlの8M尿素溶液に再溶解し、8ml容量、10,0
00分子量カツトのミリポア濃縮セル（Millipore concen
tration cell）に移され、室温で約100μｌまで濃縮さ
れる。その後この濃縮物に4lの4M尿素溶液（p.a.）を加
え、その溶液を室温で約100μｌまで濃縮した。１〜3ml
の蒸留水を加え、その溶液を再度20μｌ容量まで濃縮
し、次いで20μｌのSDS試料電気泳動緩衝液と混合し
た。得られた溶液の20μｌを下記の“SDS PAGE"の項に
記載の特性決定に用いた。

上記の抗体アフイニテイクロマトグラフイカラムは、次
のようにして吸収された非単一特異性抗−PIFを用いる
“結合手法”にしたがつて作製された。すなわち全量で
10⁶IFU-NUの抗インターフエロン免疫グロブリン（4mlの
羊抗インターフエロン血清に相当）をヒト血清が結合さ
れたセフアロース4Bの150mlカラムに３回吸収させ、次
いでCIF-エポキシセフアロースカラムに４回吸収させ次
いで下記“抗インターフエロンの吸収”の項とScand.Im
munol.８,429-436（1978）とに記載のCIF CHで活性化さ
れたセフアロース4Bに２回吸収させた。免疫グロブリン
は、最終的にはポリ−Ｌ−リジン−セフアロースカラム
に１回吸収させ、次いでソヤビーントリブシン阻害剤−
セフアロースカラムに２回吸収させた。

ナマルバインターフエロンのブルーデキストランクロマ
トグラフイからの溶出液を２分した。その一方を下記の
SDS PAGE電気泳動法に用いた。250,000IFUのものを、前
記の吸収させた抗体カラムに負荷して結果を第８図に示
した。洗浄水中にはインターフエロンは全く認められな
かつた。インターフエロンは、通常どおりpHを2.4に下
げて溶離され、235,000IFU（0.1％SDSの存在下で収集）
が回収された。この溶出液を上記のようにして濃縮しさ
らにSDS PAGEで試験した。

SDS PAGE SDS PAGE電気泳動法は前記“原料及び方法”の項に記載
したのと同様にして行つた。純ヒト白血球インターフエ
ロン蛋白の電気泳動法による染色スラブを第１図に示し
た。第２図は、他の実験で得た染色スラブと染色してい
ない平行したゲルストリツプから溶離した対応するイン
ターフエロン活性とを図式的に示したものである。この
２つの図から、この２つの実験間のすぐれた再現性は明
らかであり、20,100と20,180との差は実験精度の範囲内
である。前記のごとく、その生物学的ピークは正確にそ
れら蛋白類と一致している。第１図から、そのインター
フエロン製剤が完全に純品であることはSDS PAGEによつ
て明らかである。他の蛋白のバンドは全く認められな
い。

第９図に、純ナマルバインターフエロン蛋白類（Ａ）と
ブルーデキストランカラムから得た溶出液（Ｂ）のそれ
ぞれのSDS PAGE（0.9×10⁶IFU負荷）から得た染色スラ
ブを示す。第１図と比較すると、純ナマルバインターフ
エロンのバンドは、同量用いた純ヒト白血球インターフ
エロンのバンドと本質的に一致していることが分かるで
あろう。

インターフエロンに対し指向された活性を有するハイブ
リドマ細胞の決定２月令の３匹のバルブ/C（Babl/C）マウスを次のような
方法でヒト白血球インターフエロンで免疫にされた。

第１回の注射（40,000IFU）は各マウスの背中の皮下に
行つた。毎週70,000IFUを皮下注射して免疫化を続け
た。最終の注射は静脈注射がなされ、No.1のマウスには
９週目に、No.2及び３のマウスには10週目にそれぞれ行
われた。

抗インターフエロンの生成は、マウスから得た血清試料
について、インターフエロン中和試験法を用いて測定し
た。インターフエロン中和試験を実験室的にチエツクす
るため、内部抗インターフエロンIgG製剤（部分的に精
製されたヒト白血球インターフエロン製剤をうさぎに注
射することによつて生ずる）が通常含まれていた。マウ
スから得た血清試料は、はじめの６週間、抗インターフ
エロン活性を全く示さなかつたがその後に顕著な抗イン
ターフエロン活性が見出された。

最後の注射をしてから２〜４日後に、マウスの背中を切
開し殺し、その脾臓を殺菌条件下に取出した。各脾臓を
PBS中で均質化した後、その均質化された細胞の懸濁液
を遠心分離管に移し、４℃で５分間、170Gで遠心分離し
た。その細胞をPBS中に再び懸濁させ２回目の遠心分離
を行つた後、血清を含まないDMEN（約0.5ml/脾臓）中に
再び懸濁させた。細胞の全量は、No.1マウスでは10⁸、N
o.2とNo.3マウスはいずれも0.8×10⁸であつた。その生
育性（Vlabitity）は約85〜90％であつた。

下記の方法でポリエチレングリコールで処理することに
よつて、各マウスから得た脾臓細胞懸濁液を、次のよう
なしかたで10⁷のX63Ag8（HPRT-）骨髄腫細胞（myeloma
cell）と融合させた。すなわち10⁸のマウス脾臓細胞と1
0⁷８−アザグアニン−耐性骨髄腫細胞（X63Ag8;NSI/1Ag
4-1;SP2/O-Ag14）とを、50mlのコニカルプラスチック遠
心分離管（フアルコン2070）に入れて混合した。この分
離管を血清を含まないDMEMで満たし、４℃で10分間、17
0〜200Gで遠心分離した。上澄液を注意深く除去し、次
いで37℃において、温度が37℃の50％ポリエチレングリ
コール溶液の0.7mlを、ゆるやかに回転しながら１分間
かけて滴下して加えた。37℃で90秒間保温した後、温か
い血清を含まぬDMEMの15mlをきわめてゆつくり添加した
（１〜２分間で）。その後、その混合物を10分間200Gで
遠心分離し、その細胞ペレツトをコスタートレイ（Cost
ar tray）に接種するため50mlの完全DMEM-FCS中に懸濁
させた。

各融合物から得た、1mlづつの48個の培養物をコスター
トレイに接種した（２つのトレイ×24孔／脾臓＝48培養
物／マウス）。10〜15日後、No.1マウスの21個の培養物
に生育が認められ、No.2マウスの培養物については生育
が認められず、No.3マウスについては（さらに接種した
後）150培養物に生育が認められた。

細胞を、コスタートレイのようにマクロフアージの“フ
イーダー層”を有する25mlNUNC瓶中の5mlの培養物中に
移した。培地の取替え時、上澄液が得られ、これら濃厚
な培養物から得た細胞を液体窒素中で凍結した。

No.1マウスから得た個々の培養物の上澄液について、イ
ンターフエロン中和試験法を用いて陽性クローンの検出
を行つた。この方法によつて、一つの陽性クローンが、
非常に低い力価（約２〜3IFU-NU/ml）であるのが見出さ
れた。

純インターフエロン蛋白（SDS PAGEによつて純粋である
とされた）による抗インターフエロンの生産 SDS PAGEによつて特徴づけられる、前記タンデムアフイ
ニテイクロマトグラフイから得られた溶出液を次に示す
ように、うさぎの免疫に使用した。

約10⁶IFU単位のものを約1mlに濃縮し、PBSに対し10℃で
一夜透析した。２匹のうさぎに、それぞれ、この方法で
作製した10⁶IFUのものを皮下注射した。

この注射を２週間毎に繰返し、抗体の生成は下記第２表
から明らかである。

SDS PAGEから切り取つた純染色インターフエロン蛋白に
よる抗インターフエロンの生産免疫化は、本願明細書第14頁記載の方法にしたがい、直
接、免疫抗原性の製剤として、細切されたインターフエ
ロンを含有し（及び部分的に洗浄され脱色された）ゲル
懸濁液を用いて行つた。

No.3のうさぎを18,400±200ダルトン種で免疫にし、他
のNo.4のうさぎは20,100±200ダルトン種で免疫にした
（15週後に死亡）。第３表に示すごとくよい結果が得ら
れた。

18,400ダルトン種の20,100ダルトン種に対する抗原性及
びその逆の抗原性上記二つの種の抗原決定因子が同一であることを示すた
めに、下記の交差中和実験を行つた。

インターフエロン蛋白を、前記方法によつて、18,400±
200ダルトン種のSDS PAGEバンドと20,100±200ダルトン
種のSDS PAGEとから溶離し、次いでこの２つの種の５〜
10IFUを含有する溶液を作製した。この２つの種からの
抗インターフエロン溶液は前記のようにしてうさぎ中で
作製され、合計20IFU/NU/ml含有するように希釈した。1
0IFUの18,400ダルトンのインターフエロン種と10IFUの2
0,100ダルトンのインターフエロン種をそれぞれ含有す
る純インターフエロン種の1mlづつに、18,400ダルトン
種の抗インターフエロンの溶液1mlと20,100ダルトン種
の抗インターフエロンの溶液1mlを可能なすべての組合
わせでそれぞれ混合した。すなわち各々の種の抗インタ
ーフエロンは別々に、両者の種のインターフエロンと混
合した。37℃で１時間後、残つているインターフエロン
活性を通常のインターフエロン滴定法で測定した（前記
“原料と方法”の項参照）。いずれもインターフエロン
活性は見出されなかつた。すなわち18,400±200ダルト
ン種と20,100±200ダルトン種のそれぞれに、抗−18,40
0±200ダルトン種と抗−20,100±200ダルトン種をそれ
ぞれ別個に混合するかまたこれとは逆に該抗インターフ
エロンを混合するとインターフエロンは検出されなかつ
た。換言すれば完全中和が起つたのである。それ故に、
この２つのインターフエロン種は同一の抗原決定因子を
示していると結論することができる。このことは、抗1
8,400±200ダルトン種が両インターフエロン種を精製用
の単一特異性抗体として使用しうること、また抗−20,1
00±200ダルトン種及びこの２つの種の混合物について
も同様であることを意味する。同じ仕方で行つた他の実
験は、６つの生物学的ピークの各々が、２つの主要な種
に対して生じた各抗血清によつて完全に中和されるとい
うことを示した。

ナマルバSDS PAGEから単離された２つの主要な種が同様
の結果を与えるだろうということ、換言すればこの２つ
の主要な種も交差反応を行い、抗原性についてはHuLeIF
と同一であることを示すであろうということが分かる
（抗原性及び分子量については、HuLeIF18,400±200と
ナマルバ18,400±200並びにHuLeIF20,100±200とナマル
バ200,100±200はそれぞれ同一である）。

純インターフエロン蛋白の生物学的効力抗ウイルス活性第３図に示した６つの染色された蛋白のバンドの各々に
ついて抗ウイルス活性を測定した。ゲルを２つのスロツ
トに充填し両者とも染色した。１つのスロツトの染色さ
れたバンドを第３図のA₁に示した。他方のスロツトは短
時間脱色し（50％メタノール、45％H₂O₂、５％酢酸中
で）、湿潤ゲル中のインターフエロン蛋白の正確な位置
を記録し、そのゲルを水で洗い、その後第３図Ｂに示し
たごとくスライスした。ゲルスライスの番号を第３図の
Ｃに示した。また、各インターフエロン蛋白バンドを、
隣接するものと混合することなく、ゲルから正確に切り
取つた。各スライスを“原料及び方法”の項に記載した
のと同じ方法で溶離し、“原料及び方法”の項に記載の
通常のインターフエロン滴定法を用いその生物学的プロ
フアイルを第３図に示した。SDS PAGEから切り取つて溶
離された６つの種の各々の中和活性を抗白血球インター
フエロンに対して調べたがすべての種が同じ抗血清によ
つて完全に中和されることが見出された。第３図のイン
ターフエロンの回収率が、予め染色せずに行う通常の
“SDS PAGE溶離”（18,400±200ダルトン種を除く）と
比べてむしろ低かつた（20％）ということは、ほとんど
のインターフエロン種の生物学的活性は、抗原性と比べ
て選択的に破壊されたということを示している。抗白血
球インターフエロンに対する中和試験において、“第３
図から溶離された”インターフエロン蛋白は、天然の
（粗）ヒト白血球インターフエロンよりも、インターフ
エロン活性基準で計算して３〜５倍も有効に抗白血球イ
ンターフエロンを中和することができた。このことは生
物学的活性に応答しうる決定因子が選択的に破壊される
ことを示している。

非−抗ウイルス効力純ヒト白血球インターフエロン種の非−抗ウイルス効力
を３つの系で調べた。

１）抗細胞活性純インターフエロン蛋白の抗細胞活性は、第２図に示し
たSDS PAGE溶離フラクシヨンから得られた純インターフ
エロン蛋白の1:1000希釈物（媒体中）と共にダウデイ細
胞（Daudi cells）を培養し、インターフエロンなしの
対照と比べながらトリチウム放射性標識チミジン〔I.He
ron and K.Berg,The actions of interferon are poten
tiated at elevated temperature,Nature,274 508〜510
（1978）〕が相対的に低下するのを確認することによつ
て研究された（第２図上部の“％G-I"は発育阻止％を示
す）。明らかなように、その“抗細胞曲線”は抗ウイル
ス曲線に顕著に追随している。このことは、純粋の天然
のヒト白血球インターフエロンの５つの種がすべて抗ウ
イルス活性と抗細胞活性との両者を有することを立証し
たのである。それぞれの“抗細胞性のピーク”は“イン
ターフエロンピーク”の対応する大きさと直線的には変
化しない。このことは多分ダウデイ細胞系の感受性を反
映している〔J.Hilfenhaus,H.Damm,H.E.Karges and K.
E.Manthey,Growth inhibition of human lymphoblastoi
d Daudi cells in vitro by interferon preparations,
Arch.Virol.51,87-97（1976）〕。19,500ダルトンにお
ける小さなインターフエロンピークはその抗細胞性曲線
に対応するピークを生じなかつた。しかし、希釈度が10
倍低い場合（1:100）、抗細胞性活性の小さいが顕著な
ピークが観察された（記載せず）。

２）リンパ球及び単核細胞上の主要組織適合性抗原（MH
C）の圧出（expression）。

β_２−系MHC（主要組織適合性抗原）の圧出が選択的に
増加することは、〔I.Heron,M.Hokland ＆ K.Berg（197
8），“Enhanced expression of β_２ microglobulin a
nd HLA on human lymphoid cells by interferon",Pro
c.Natl.Acad.Sci.75:6215-6222（PNAS75として下記に引
用）〕に記載のごとく部分的精製ヒト白血球インターフ
エロンを用いて観察された。２つの主要なヒト白血球イ
ンターフエロン種（18,400及び20,100ダルトン，第１図
参照）は各々、約100IFU/ml培地の量で測定した。上記
の効力は、これらの純粋な分子種を用いて見出された
が、一方抗ウイルス活性が記録された領域以外のゲルス
ライスの溶出液は何ら効力を示さなかつた。かくして、
リンパ球細胞へのMHC抗原の圧出を選択的に増大させる
効力はこのインターフエロン分子固有の特性であること
が立証されたのである。

３）ナチユラルキラー細胞系（NK系）の強化作用第10図は抗ウイルス性プロフアイルを示す（第２図に関
連して記載したのと同じ仕方でSDS PAGEで測定）。その
ゲルから得た種の各々について、そのNK強化活性はPNAS
75に記載の方法を用いて測定した。下方の曲線に示され
た抗ウイルス活性を有するフラクシヨンは、上方の曲線
に示されたような増大したNKを示した。一方、“ベース
ライン”のフラクシヨンは増大したNKを与えなかつた。
１本の矢印は食塩水だけの消極的な対照例を示し、２本
の矢印は、積極的な対照例として用いた部分精製ヒト白
血球インターフエロン（PIF）を示している。約100IFU
の抗ウイルス単位の各インターフエロン製剤をml当り添
加した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号１４８４／８０ (32)優先日 1980年４月２日 (33)優先権主張国デンマ−ク（ＤＫ）審判番号平1−12671 (56)参考文献特開昭55−94320（ＪＰ，Ａ) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 92（２），Ｐ．324 −330，1979 Ｓｃｏｎｄ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．８（５）Ｐ．429−436，1978 Ｔｅｘ．Ｒｅｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．35 （ｌｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｙｓｔ．) Ｐ．187−192，1977 ＳｃｏｎｄＪ．ｌｍｍｕｎｏｌ６（１−２），Ｐ．77−86，1977

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ナトリウムドデシルスルフアートポリ
アクリルアミド傾斜電気泳動（SDS PAGE）染色条件下0.
9×10⁶IFUの全インターフエロン負荷で、18,400と20,10
0ダルトンに抗ウイルス性インターフエロン活性を有す
る２つの主要なシヤープな染色蛋白バンド、20,300と2
0,400ダルトンの間に、抗ウイルス性インターフエロン
活性を有する次位の染色蛋白バンド並びに、19,500、2
1,130及び23,440ダルトンに抗ウイルス性の小さなピー
クを示し（但し、上記ダルトン分子量の実験精度は±20
0ダルトンである）、該SDS PAGEアクリルアミドグラ
ジエントが本質的に染色インターフエロン蛋白のみであ
るヒト型Le型インターフエロン蛋白。
【請求項２】ナトリウムドデシルスルフアートポリ
アクリルアミド傾斜電気泳動染色条件下3.8×10⁶IFUの
全インターフエロン負荷で、抗ウイルス性インターフエ
ロン活性を有する６つの染色蛋白バンド、すなわち18,4
10と20,180ダルトンに強いバンド、20,420ダルトンに中
程度の強いバンド、及び19,500、21,130と23,440ダルト
ンに見える程度のバンド（ダルトン分子量の実験精度は
±200ダルトン）を示し、抗ウイルス性インターフエロ
ン活性のピークは正確に染色蛋白バンドに一致し、かつ
該SDS PAGE アクリルアミドグラジエントが本質的に
染色インターフエロン蛋白のみであることで更に特徴付
けられる特許請求の範囲第１項記載のヒトLe型インター
フエロン蛋白。
【請求項３】抗ウイルス性インターフエロン活性を有す
る蛋白が、SDS PAGEポリアクリルアミド傾斜電気泳動に
おいて染色バンドとして表れる個々の蛋白である特許請
求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白。
【請求項４】抗ウイルス性インターフエロン活性を有す
る蛋白が、SDS PAGEポリアクリルアミド傾斜電気泳動に
おいて18,400±200ダルトンに表れる蛋白である特許請
求の範囲第３項記載の蛋白。
【請求項５】抗ウイルス性インターフエロン活性を有す
る蛋白が、SDS PAGEポリアクリルアミド傾斜電気泳動に
おいて20,100±200ダルトンに表れる蛋白である特許請
求の範囲第３項記載の蛋白。
【請求項６】抗ウイルス性インターフエロン活性を有す
る蛋白が、SDS PAGEポリアクリルアミド傾斜電気泳動に
おいて20,300と20,400ダルトンの間、19,500ダルトン、
21,130ダルトン又は23,440ダルトンに表れる（実験精度
±200ダルトン）蛋白である特許請求の範囲第３項記載
の蛋白。
【請求項７】種々の量の既知標準との比較ナトリウム
ドデシルスルフアートポリアクリルアミド傾斜電気泳
動染色で評価し、少なくとも蛋白mg当り10⁹IFUの比活性
度を有する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の蛋
白。
【請求項８】種々の量の既知標準との比較ナトリウム
ドデシルスルフアートポリアクリルアミド傾斜電気泳
動染色で評価し、蛋白mg当り２×10⁹IFUの比活性度を有
する特許請求の範囲第７項記載の蛋白。
【請求項９】抗細胞活性を表しかつ天然キラーセル系を
強化することで付加的に特徴付けられる特許請求の範囲
第１〜８項の何れかに記載の蛋白。
【請求項１０】特許請求の範囲第５項、第１項又は第２
項記載の蛋白に対して生じた抗体を中和しうることで付
加的に特徴付けられる特許請求の範囲第４項記載の蛋
白。
【請求項１１】特許請求の範囲第４項、第１項又は第２
項記載の蛋白に対して生じた抗体を中和しうることで付
加的に特徴付けられる特許請求の範囲第５項記載の蛋
白。
【請求項１２】特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
蛋白に対して生じた抗体を中和しうることで付加的に特
徴付けられる特許請求の範囲第３項記載の蛋白。
【請求項１３】ヒト白血球インターフエロン蛋白である
特許請求の範囲第１又は２項に記載の蛋白。
【請求項１４】ヒトリンホブストイド（Namalva）イン
ターフエロンLe型蛋白である特許請求の範囲第１又は２
項に記載の蛋白。
【請求項１５】ナトリウムドデシルスルフアートポ
リアクリルアミド傾斜電気泳動（SDS PAGE）染色条件下
0.9×10⁶IFUの全インターフエロン負荷で、18,400と20,
100ダルトンに抗ウイルス性インターフエロン活性を有
する２つの主要なシヤープな染色蛋白バンド、20,300と
20,400ダルトンの間に、抗ウイルス性インターフエロン
活性を有する次位の染色蛋白バンド並びに、19,500、2
1,130及び23,440ダルトンに抗ウイルス性の小さなピー
クを示し（但し、上記ダルトン分子量の実験精度は±20
0ダルトンである）、該SDS PAGEアクリルアミドグラ
ジエントが本質的に染色インターフエロン蛋白のみであ
るヒトLe型インターフエロン蛋白を活性成分として含有
することを特徴とするヒトLe型インターフエロン感受性
疾患状態の治療用医薬製剤。
【請求項１６】非経口、鼻内又は局所投与用に調整され
る特許請求の範囲第15項記載の製剤。
【請求項１７】安定化した水性溶液の形である特許請求
の範囲第15項記載の製剤。
【請求項１８】安定化剤が、ヒトに対して非毒性でかつ
非免疫性である蛋白又は蛋白の組合せである特許請求の
範囲第17項記載の製剤。
【請求項１９】安定化剤がヒト血清蛋白及びその分画部
分、及びヒトアルブミンからなるグループから選択され
る特許請求の範囲第18項記載の製剤。
【請求項２０】純インターフエロンの濃度が、10⁶〜２
×10⁷IFU/mlに対応する範囲である特許請求の範囲第15
〜19項の何れかに記載の製剤。
【請求項２１】粗製のヒトLe型インターフエロン蛋白含
有溶液に、（ｉ）KSCNを添加し、pHを4.5に調製するこ
とにより蛋白を沈殿させ、（ii）この蛋白を溶解して透
析した後ゲル濾過し、（iii）次いで、リガントアフ
ィニティクロマトグラフイに付し、（iv）さらに抗体
アフイニテイクロマトグラフイに付し、かつその保持
されたインターフエロン蛋白を溶離することからなるナ
トリウムドデシルスルフアートポリアクリルアミド
傾斜電気泳動（SDS PAGE）染色条件下0.9×10⁶IFUの全
インターフエロン負荷で、18,400と20,100ダルトンに抗
ウイルス性インターフエロン活性を有する２つの主要な
シヤープな染色蛋白バンド、20,300と20,400ダルトンの
間に、抗ウイルス性インターフエロン活性を有する次位
の染色蛋白バンド並びに、19,500、21,130及び23,440ダ
ルトンに抗ウイルス性の小さなピークを示し（但し、上
記ダルトン分子量の実験精度は±200ダルトンであ
る）、該SDS PAGEアクリルアミドグラジエントが本質
的に染色インターフエロン蛋白のみであるヒトLe型イン
ターフエロン蛋白の製造法。