NO165961B - Fremgangsmaate til fremstilling av interferonproteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rens-

ning av humant interferon.

I foreliggende beskrivelse og krav skal uttrykket "protein" omfatte "glycoprotein".

Det er gjort mange forsøk på å rense humant interferon.

Formålet med disse rensningsforsøk har bl.a. vært å oppnå en fullstendig karakterisering av interferonartene til standard-iseringsformål. Hittil har imidlertid ingen av forsøkene på å

rense humant Le-form interferon vært helt vellykkete.

Foreliggende oppfinnelse bygger på tilveiebringelsen av rens-ningsmetoder som for første gang muliggjør fremstilling av alle komponenter av humant Le-form interferonprotein i det vesentlige fri for inaktive og av annen grunn uønskelige urenheter.

Le-formen av interferon er definert i et arbeid av E.A.

Havel1, B.Berman, C.A.Ogburn, K.Berg, K.Paucker og J.Vilcek, Proe.Nat.Acad.Sei. U.S.A., 72, 2185-2187 (1975).

Ifølge oppfinnelsen fremstilles humane Le-form interferon-proteiner, som under SDS PAGE ved anvendelse av en eksponentia i-gradientgel med en samlet interferonpåføring av 0,9 x IO<6> IFU

viser to store skarpe farvede proteinbånd med antiviral interferonaktivitet ved henholdsvis 18.400 og 20.100 Dalton og et mindre, farvet proteinbånd med antiviral interferonaktivitet mellom 20.300 og 20.400 Dalton, sammen med mindre topper av antiviral interferonaktivitet ved 19.500, 21.130 og 23.440

Dalton (hvilke Dalton-molekylvekter har en eksperimentell

usikkerhet på ± 200 Dalton) hvorved SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre farvede proteinregioner, og som under SDS PAGE ved anvendelse av en eksponentialgradientgel med en samlet interferonpåf©ring på 3,8 x IO<6> IFU viser seks farvede proteinbånd med antiviral interferonaktivitet, nemlig sterke bånd ved henholdsvis 18.410 Dalton og 20.180 Dalton, et middelkraftig bånd ved 20.420 Dalton og akkurat såvidt synlige bånd ved henholdsvis 19.500, 21.130 og 23.440 Dalton (hvilke Dalton-molekylvekter har en eksperimentell usikkerhet på

± 200 Dalton), hvor toppene av antiviral interferonaktivitet faller nøyaktig sammen med de farvede proteinbånd, og den nevnte SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre farvede proteinregioner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at en oppløsning som inneholder humant Le-form interferon underkastes affinitetskromatografi slik at de rensede, humane Le-form interferonproteiner holdes selektivt tilbake, og de nevnte tilbakeholdte interferon-proteiner elueres. Affinitetskromatografien kan omfatte antistoff-affinitetskromatografi eller en kombinasjon av ligand-affinitetskromatografi og påfølgende antistoff-affinitetskromatografi.

Når det anvendes en kombinasjon av ligand-affinitets- og antistoff-affinitetskromatografi-trinn, kan den spesifikke aktivitet av en. oppløsning av rå, ukonsentrerte, humane Le-form interferon-proteiner økes ved

(i) proteinutfelling av humane Le-form interferonproteiner fra nevnte oppløsning; og (ii) gelfiltrering av en oppløsning av de utfelte proteiner; og (iii) dialyse av fraksjonene med interferonaktivitet som er eluert efter gelfiltrering,

og de resulterende dialyserte proteiner med øket spesifikk aktivitet kan underkastes ligand-affinitets-kromatografi slik at de eluerte interferon-proteiner har en spesifikk aktivitet på minst 10~<7> IFU/mg protein, og derefter underkastes interferonproteinene med nevnte spesifikke aktivitet på minst IO<-7> IFU/mg protein, antistoff-affinitetskromatografi. Som det vil fremgå mer detaljert nedenfor, kan proteinutfellings-trinnet (i) omfatte tilsetning av KSCN og regulering av oppløsningens pH til 4,5; interferonfraksjonene for rensning i trinn (iii) kan inneholde vesentlig bare proteiner i området 10.000-20.000 Dalton, som bedømt ved elueringsoppførselen på gelfiltreringstrinnet; og gelfiltreringstrinnet (ii) kan utføres med en bufferoppløsning som inneholder ca. 25 volum% av en glykol så som etylenglykol , og kan ha en ionestyrke svarende til 1 M MaCl, pH ca. 7,2. Som forklart mer detaljert nedenfor, kan liganden som anvendes for ligand-kromatografitrinnet, være "Cibacron F3GA" eller en annen ligand som er istand til å binde humane Le-form interferoner i henhold til den mekanisme som utoves av "Cibacron F3GA". Spesielle eksempler på slike alternative ligander er gitt nedenfor. Ved å utføre ligand-af f initetskromatograf ien, kan oppløsningen som tilføres kolonnen

være en som inneholder et Le-form interferon i en form som har en spesifikk aktivitet på minst 50.000-100.000 IFU/mg protein, bufret til en pH på 6,5-8 med en ionestyrke som i alt vesentlig ikke overstiger ionestyrken av en 10-100 mM, særlig 20 mM, fosfatbuffer, pH 7,2 oppløsning, eventuelt sammen med et vann-oppløselig organisk oppløsningsmiddel så som etanol, i mengder fra 5-80%. Ytterligere detaljer vedrørende slike oppløsninger er gitt nedenfor.

Ved antistoff-affinitetskromatografien, er antistoffene fortrinnsvis matrix-immobiliserte. Opp til ca. 85% av antistoffene kan være kovalent bundet under immobiliseringstrinnet. Før binding til matrixen blir antistoffene fortrinnsvis i alt vesentlig befridd for eventuelle proteolytisk enzymatisk aktivitet ved behandling med enzym-inhibitorer og/eller enzym-destruk-torer, særlig ved behandling med matrix-immobilisert inhibitor og/eller enzymdestruktor. Ytterligere detaljer vedrørende slik behandling er gjengitt nedenfor.

Ved en hensiktsmessig utførelse av oppfinnelsen, tilføres

et konsentrert eller delvis renset interferon-preparat til affinitetskromatografi-systemet. Det faller også inn under oppfinnelsen å anvende et antistoff-affinitetskromatografi-trinn hvor antistoffene dannes mot eller i det vesentlige bare er rettet mot humane Le-interferonproteiner, eller én eller flere av komponentene derav. I slike tilfeller kan oppløsningen som tilføres til antistoff-affinitetsmatrixen, være en rå, ukonsentrert oppløsning av humant Le-form interferon.

Efter rensning ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen under anvendelse av affinitetskromatografi, kan de rensede humane Le-interf eronproteiner underkastes SDS-PAGE under anvendelse av en eksponentialgradientgel, og de humane Le-form proteiner kan derefter ekstraheres fra ett eller flere områder av SDS-PAGE-gelen. Ytterligere detaljer vedrørende slik ekstraksjon er gjengitt nedenfor.

De spesielle eksperimentelle betingelser, som har vært anvendt til den første fremstilling og karakterisering av de rene humane leukocytinterferonproteiner, fremgår av de nedenstående avsnitt "Materialer og Metoder" og "Eksperimentell del". Noen av de produkter og prosedyrer som inngår i fremstillingen

og karakteriseringen av de rene interferonproteiner, er i seg selv hittil ukjente.

Ved flere gjentatte eksperimenter er det blitt påvist at under de SDS PAGE- og fargingsbetingelser som er beskrevet i avsnittet "Materialer og Metoder", og ved en samlet interferon-på• føring på 0,9 x 10 6 IFU, viser rent humant leukocytinterferon i det vesentlige kun to skarpe fargete proteinbånd ved henholdsvis 18. 400 ± 200 og 20.100 t 200 Dalton og et mindre, farget proteinbånd mellom 20.300 t 200 oq 20.400 ± 200 Dalton.

I henhold til bestemmelse ved den nedenfor beskrevne proteinbestemmelsesmetode har det rene humane leukocytinterferon en spesifikk aktivitet på ca. 10 q IFU pr. mg protein; den fundne spesifikke aktivitet kan variere i noen qrad, avhengig av den anvendte proteinbestemmelsesmetode, oq den spesifikke aktivitet på proteinvektbasis anslås å være 2 x 10 O - 2 x 10 Q IFU pr.

mg protein. Det forhold at det rene interferon viser to kraftige distinkte bånd, er i overensstemmelse med hva som er funnet i den kjente teknikk under anvendelse av rå eller partielt rensete interferonprecarater som viste at humant leukocytinterferon omfatter minst to hovedarter. Ved en 'nøyere samlet interferonpå-f«ring, f.eks. på 3,3 x IO<6> IFU, har det ovennevnte SDS PAGE-system vist seg å være i stand til å vise et mer differensiert protednmønster omfattende seks interferonproteinbånd, nemlig de to sterkt fargete bånd ved henholdsvis 13.410 ± 200 Dalton og 20 . 130 t 200 Dalton, et me i lomste rkt farget bånd ved 20.420

200 Dalten (svarende til det ovennevnte mindre, fargete bånd)

oq såvidt synlige proteinbånd ved henholdsvis 19 . 500 i 200 Dalton, 21.130 i 200 Dalten oq 23.440 t 200 Dalton. Hver av de individuelle komponenter i de ovennevnte bånd i SDS PAGE-akrylamid-gradientqeien har vist seg å utvise biologiske interferonaktivi-teter: Antiviral aktivitet, evne til å nøytralisere alene antihumant leukocytinterferon (men i'- ;,' : e antihumant f ibroblnsti.n ter f eron) og anticellulær aktivitet samt en rekke såkalte ikke-virale aktiviteter, f.eks. potenserinq av "'.'nturnl Killer"-celler, potensering av MLC-CML, økning av HL/\-anti<q>ener etc.

Den komplette rensing av interferonproteiner gjør det for første gang mulig å produsere antiinterferon som er strengt spesifikt overfor de aktive interferonarter simpelthen ved å immunisere dyr med det rene interferonnrepara- eller ett eller flere av dets komponenter. Et sådant strengt monosoesifikt antiinterferon er ytterst nyttiq til antistoffaffinitetskromatografi til rensing av rå eller partielt renset interferon for på en simpel og økonomisk måte å fremstille store mengder av rent interferon eller høyt renset interferon til kliniske formål, standardisering, kjemiske undersøkelser, sekvensunder-søkelser, og som immunogen til ny fremstilling av monospesi-

fikt antiinterferon. Det ligger innenfor den foreliggende oppfinnelses rammer ikke blott å rense humant leukocytinterferon ved hjelp av det monospecifikke antistoff som er frembragt mot det rene humane leukocytinterferon, men også å rense andre interferontyper som kryssreagerer immunologisk med det monospesifikke antiinterferon, f.eks. "Namalva" interferon (humane lymfoblastoidinterferoner; Le form interferon utgjør ca. 85?i av den biologiske aktivitet av humant lymfoblastoid- eller Na-malvainterferon, jfr. E.A. Havell, Y.K. Yip og J. Vilcek, "Characterization of human lymphoblastoid (Namalva) interferon" J.gen.Virol., 38, 51-59 (1877)), og interferon inneholdende

Le formen vunnet ved dyrking av en mikroorganisme som inneholder DNA som koder for fremstillinqen av interferonproteiner (eller proteiner med de vesentlige biologiske interferonaktivi-tetsdeterminanter).

Ved en interferonpåførin^ on 0,0 x 10^ IFU viser de rene humane leukocytintsrferonproteiner sea som de ovennevnte tre individuelle proteinbånd i SDS PAGE-akryiamidaradientaelen sammen med fem-seks biologiske topper. Om det finnes fem eller seks biologiske bånd avhenaer av de n"Jy ak tirre steder hvor aeien skjæres. Det vises til fig. 1 som viser et raraet SDS PAGE-aradier.tael-stykke fremstilt ved denne oåførinq sem beskrevet i avsnittet "Materialer og Metoder". Det er blitt onvist at hvert av oro-teinbåndene har tydelig interferonaktivi tet. Det vises til fig. 2 som er en teqning av et SDS-stykke fra et annet fersok med samme interferonpåførina, idet fir:. 2 egsa viser den med båndene forbundne interferonaktivitetsprefii, bestemt sem beskrevet under "Materialer ocr Metoder". Det sees fem bioloniske inter-ferontopper sammen med tre tydeli<q>e faccrete proteiner. Av fi<q>.

2 sees det klart at proteinbåndene er strengt samrnenfallende med toppene for interferonaktivitet. Dette viser at proteinene er interferonproteiner. Det er viktic å bemerke at interferonakti-vitetsprofilen naturligvis vil avhenge av aen nøyaktige posisjon av de individuelle utskjæringer av aeien. I fig. 2 er den individuelle interferonaktivitet for det mindre bånd ved 20.410 i 200 D~. lton ikke så tydelig, men ved andre forsøk med samme interferon-påføring er det blitt påvist at det mindre bånd i seg selv be-sitter interferonaktivitet, og i forsøk med en høyere påførinq, jfr. nedenfor, har det mindre bånd vist seq å være en tydelig interferonunderart. Den mengde interferonaktivitet fra SDS PAGE'n som finnes i de tilsvarende interferonutskjæringer, svarer lineært til mengden av protein bestemt ut fra intensiteten av proteinbåndenes farging. Den utvetydige eksistens av de to hoved-interferonbånd og det mindre bånd er således blitt påvist i de forsøk som er illustrert i fig. 1 oa 2. Ved forsøk, hvor inter-feronpåføringen i systemet var høyere, er det ovennevnte mer detaljerte båndmønster blitt påvist, slik som det er illustrert i fig. 3 (seks interferonproteiner sammen med seks biologiske topper bestemt etter farging og avfarging). Da det er kjent at interferon som

er behandlet med SDS, vil bibeholde sine immunologiske determinanter og endog uttrykker (eller bevarer) sin antigenisitet på

en mer tydelig måte sammenlignet med ikke-SDS-behandlet interferon (som vist ved irrtmu.niserincrer av mus med preparater av humant leukocytinterferon av Paucker et al. 'Dalton, B.F., Onburn, C.A., Paucker, K., Producticn of antibodies to human interferens in mice, Infect. Immun. 19 (2), 570-574 (1973), np 4; 25-30)), ajør orepa-rativ SDS PAGE det mulig ikke bare å onnnå hver av komponentene i isolert form, men o<q>så å utfare immuniscrinaen med de isolerte komponenter sii.-: som det illustreres i det følaende.

Uttrykt med hensyn til spesifikk aktivitet har det

humane interferon eller arter derav, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, en spesifikk aktivitet

på ca. 2 x 10^ - 2 x IO<9> IFU or. mg protein. Da metodologien med hensyn til proteinbestemmelse varierer betydelig, er de an-ajeldende tall for den spesifikke aktivitet av mindre betydning enn det forhold at de individuelle^artor er påvist ved SDS PAGE.

De rene interferonproteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen

kan derfor mer hensiktsmessig uttrykkes som humane Le form interferonproteiner som under de SDS PAGE- og farginsbetingelser som er definert i foreliggende beskrivelse ved en samlet inter-feronpåføring på 0,9 x IO<6> IFU viser to store skarpe fargete proteinbånd med antirival interferonaktivitet ved henholdsvis 18.400 og 20.100 Dalton og et mindre, farget proteinbånd med antiviral interferonaktivitet mellom 20.300 og 20.400 Dalton,

sammen med mindre topper av anti viral interferonaktivitet ved 19.500, 21.130 og 23.440 Dalton (hvilke Dalton molekylvekter har en eksperimentell usikkerhet på - 200 Dalton), hvorved SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre fargete proteinregioner; eller som humane Le form interferonproteiner

som under de SDS PAGE- og farginsbetingelser som er definert i nærværende beskrivelse, ved en samlet interferonpåføring på 3,8 x 10 IFU viser seks fargete proteinbånd med antiviral interferonaktivitet, nemlig sterke bånd ved henholdsvis 18.410 Dalton og 20.180 Dalton, et middels kraftig bånd ved 20.420 Dalton, og akkurat så vidt synlige bånd ved henholdsvis 19.500 Dalton, 21.130 Dalton og 23.440 Dalton (hvorved de nevnte Dalton-molekylvekter har en eksperimentell usikkerhet på - 200 Dalton), hvorved toppene av antiviral interferonaktivitet

faller nøyaktig sammen med de fargete proteinbånd, og hvorved SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre fargete proteinregioner.

Det er viktig å bemerke at de individuelle komponenter

i de ovennevnte bånd av SDS PAGE-gelen viser biologisk interferonaktivitet, evne til å nøytralisere antihumant leukocyttinterferon og anticellulær aktivitet etc.

Med hensyn til opprinnelse kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes på humant leukocyttinterferon fremstilt under anvendelse av humane celler eller fra dyrkete humane lymfoblastoidceller (Namalva-celler) eller proteiner fremstilt ved dyrking av en mikroorganisme som inneholder DNA som koder for interferonet eller en viktig del derav, og også humane Le form interferoner som er av annen opprinnelse, men som stemmer overens med de ovennevnte karakteristika.

Det er velkjent at humane Le form interferoner har en

rekke viktige terapeutiske aspekter i mennesker, herunder antiviral- og antitumoraktivitet, og med tilveiebringelse av det rene humane Le form interferon er det blitt mulig ytterligere å utnytte disse nyttige egenskaper, f.eks. som et preparat inneholdende det rene humane Le form interferonprotein eller

de rene humane Le form interferonproteiner tilpasset til administrering til mennesker eller dyr til oppnåelse av profylaktiske eller terapeutiske effekter eller til immunisering. Et sådant preparat kan f.eks. være beregnet til parenteral, internasal eller topisk administrering.

En særdeles nyttig formu ering av de rene interferon-proteiner fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en vandig oppløsning. Rene interferonproteiner i vandig oppløsning bør stabiliseres, og valget av stabiliserings-

middel vil avhenge av oppløsningens anvendelse. Når opp-løsningen skal anvendes til administrering til mennesker, f.eks. parenteral administrering, brtr stabiliseringsmidler være et fysiologisk akseptabelt stabiliseringsmidde1, oq et egnet stabilise-ringsmiddel er et protein eller en kombinasjon av proteiner som er ikke-toksisk og ikke-immunogen i mennesker, f.eks. humane serumproteiner eller fraksjoner derav, samt humant albumin. Et typisk foretrukket stabiliserinqsmiddel er IL humant albumin.

Den normale konsentrasjon av rene interferonproteiner i preparater til parenteral administrering til mennesker vil være i området svarende til 1-20 millioner IFU pr. ml, og en normal daglig dose vil være 3-10 millioner, f.eks. 5-10 millioner, IFU i alt, fortrinnsvis administrert 1 eller 2 qancrcr daglig ved intramusku-iær injeksjon. Ved f rems ti 1 line; av oooiøsninger av rent interferon til administrerinc til mennesker vil man iaktta normale farmasøvtiske foranstaltnin<g>er som vanligvis iakttas i forbindelse med frems tillinqen av parenterale preparater, så som foranstaltninger tii sikring av sterilitet o<q> frihet fra pyroqenisitet.

Når det stabiliserte preparat er en vandin opplesning a'/ rent humant Le form interferonprotein eller rene humane Le form interferonproteiner til anvendelse til immuniserinc; av dyr til fremstilling av monospesifikt antiinterferon, er stabiliserina med SDS (natriumdodecyIsuJfat) til dannelse av et SDS-kompleks av det rene humane Le form interferonprotein eller de rene humane Le form interferenproteiner en foretrukket stabilisering i betrakt-ning av det ovennevnte forhold, at SDS øker interferons' antigenisitet og/eller stabilitet. Sem det forklares mer detaljert i der følgende, kar. rent inccrfercn-SDS-kombinasjonen eller -komplekset dannes simpel chen '/ed å tilsette SDS til de rene vandige interferonproteiner, fortrinnsvis i en konsentrasjon på ca. 0,1 vektL beregnet på oppløsningen, ved pH-verdi 7,2. SDS-komplekset av det rene humane Le form interferonprotein eller de rene humane Le form interferonproteiner er verdifult på grunn av sin stabilitet, og en særdeles interessant form for dette kompleks som er velegnet til oppbevaring og transport (hensiktsmessig ved lav temperatur, f.eks. ved en temperatur på høyst 4°C eller fortrinnsvis -20°C), er komplekset isolert i fast form som beskrevet nedenfor. Det ligger innen den foreliggende oppfinnelses rammer å anvende andre stabiliseringsmidler av detergenttypen til dette formål. En ytterligere foretrukket form for de rene humane Le form interferonproteiner er en form i hvilken de er bundet til Cibacron Blue F3GA eller en annen ligand, som er i stand til å binde interferonproteinene i overensstemmelse med den mekanisme som utvises av Cibacron Blue F3GA, slik som det forklares mer detaljert i det følgende.

pH-verdien av oppløsningen av det rene interferonprotein til immunisering av dyr til fremstilling av monospesifikt anti-interferon er fortrinnsvis ca. 7,2, og en egnet buffer er PBS (fosfatbuffret saltoppløsning).

Det til immunisering av dyr beregnete stabiliserte preparat av rent interferonprotein kan ytterligere inneholde en adjuvans til ytterligere økning av antigenisiteten, og en egnet adjuvans er Freunds adjuvans.

Det er også mulig å øke og/eller stabilisere antigenisiteten av de rene Le form interferonproteiner eller det individuelle protein ved kobling til en immunogenbærer (slik at det rene interferonprotein eller de rene interferon-proteiner presenteres som en slags "hapten") i overensstemmelse med velkjente prinsipper. Som eksempler på immunogene bærere kan nevnes PPD (Purified Protein Derivative) og BCG (Bacille Calmette Guérin). Anvendelsen av slike immunogene bærere foretrekkes imidlertid ikke for nærværende.

Da de fargete interferonproteinbånd i SDS PAGE fullstendig eller i meget vesentlig grad har bibeholdt deres antigenisitet, er det også mulig å anvende de fargete interferonproteiner direkte utskåret fra en SDS PAGE som antigenpreparater til immunisering av immuniserbare dyr, så som kaniner.

Det har interessant nok vist seg at antistoffer frem-

bragt mot ett av de rensede interferonproteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen, er i stand til å nøytralisere de andre rensede proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen.

I overensstemmelse med velkjente prinsipper kan det monospesifikke antiinterferon fremstilt ifølge oppfinnelsen anvendes til påvisning av det tilsvarende interferon eller den tilsvarende interferonkomponent i biologiske væsker så som ved radioirruinuno-assay eller beslektede teknikker. Som det imidlertid er nevnt ovenfor, ligger en interessant og viktig utnyttelse av de monospesifikke antistoffer i anvendelsen til rensing av interferon-holdige oppløsninger ved antistoffaffinitetskromatografi.

Til dette formål immobiliseres antistoffene på en matriks på

i og for seg kjent måte, idet de hensiktsmessig bindes kovalent til en egnet antistoffaffinitetskromatografimatriks så som tverrbundet agarose, f.eks. Sepharose 4B fra Pharmacia. Rensingen av interferonholdige oppløsninger ved antistoff-af f initetskromatograf i kan utføres i overensstemmelse med en hvilken som helst av de velkjente metoder, enten chargevis eller, fortrinnsvis, under anvendelse av det matriks-immobiliserte antistoff anbragt i en søyle.

Fremstillingen av antistoffaffinitetssøyler under anvendelse av det monospesifikke antiinterferon on driften av sådanne søyler utføres på i og for seg kjent måte. Den interferonholdige opp-løsning som påføres på disse søylor, kan være et rått, ukonsentrert interfercnpreparat, eller den kan være et konsentrert eller partielt renset interfercnpreparat. Det interferonpreparat som påføres på søylen, kan være ot hvilket som helst interferon-preparat inneholdende humane Le form interferon, dvs. humane leukocytinterfercner, humane lymfoblastoidinterferoner (Namalva-interferoner) eller interferon (eller viktige deler derav) som er fremstilt ved dyrking av en mikroorganisme inneholdende DNA som koder for interferonet, som beskrevet ovenfor. Anvendelse av antistoffer mot partielt renset humant leukocytinterferon ved antistoff-affinitetskromatografi til rensing av Namalva-interferon og leukocytinterferon er allerede blitt beskrevet, jfr. f.eks. Sean. J. Immunol. , 8, 429-436 (1978). Den viktigste forbedring ligger imidlertid i at monospesifikt antiinterferon vil tilbakeholde i det vesentlige alene humant Le-form interferonprotein, idet de øvrige proteiner i preparatet vil passere gjennom søylen. Meget små mengder urenheter hitrørende fra spontan kryssreaktivitet kan ikke utelukkes, selv ikke når de anvendte antistoffer er antistoffer produsert ved hybridom-teknikk, som bortsett herfra må forventes å "produsere" (reagere med) alene rene interferonproteiner.

Ved egnede dimensjoner for slike antis*-->f f søyler (som kan utformes i overensstemmelse med velkjente prinsipper for antistoff-af f initetskromatograf isøyler) kan søylene anvendes til storindustrien rensing av interferon fra et rått interferon-preparat til oppnåelse av rene (eller høyrensede) interferon-proteiner i søyleeluatet. De rene (eller høyrensede) interferon-proteiner som fremstilles på denne måte, stabiliseres med egnede stabilisatorer i overensstemmelse med deres tilsiktede anvendelse, slik som det er beskrevet ovenfor.

Da interferonet i de interfonpreparater som påføres på de monospesifikke antiinterferonsøyler, er til stede i vanligvis meget lave konsentrasjoner på vektbasis, og da det skal isoleres så store mengder som mulig av det verdifulle interferon, er det viktig å minimere den eventuelle nedbryting av interferonproteinene som kunne skyldes tilstedeværelsen av proteolytisk aktivitet i noe biologisk stoff, hvormed interferonet bringes i kontakt, og et aspekt av den foreliggende oppfinnelse går ut på at eventuelt tilstedeværende proteolytisk aktivitet fjernes fra ethvert biologisk materiale med hvilket det interferon som skal renses, er i kontakt.

Ved antistoff-affinitetskromatografien er det hensiktsmessig at antistoffene, før de bindes til matrixen, behandles med matrix-immobilisert enzyminhibitor eller enzymdestruktor som ikke er skadelig for immunoglobuliner (eller de viktigste fragmenter derav). Antistoffene kan således føres gjennom en søyle av matrix-immobilisert poly-L-lysin og/eller matrix-immobilisert Soyabean Trypsin-inhibitor og/eller matrix-immobilisert kallikrein-inaktivator. Et eksempel på en egnet behandling av antistoffene er passasje gjennom en søyle av poly-L-lysin som er kovalent bundet til tverrbundet agarose så som Sepharose 4B etterfulgt av en passasje gjennom en søyle av Soyabean Trypsin-inhibitor som er bundet kovalent til samme matrix. Det har vist seg at denne fjerning av proteolytisk aktivitet øker utbyttet av interferonaktivitet ved rensing av interferonholdige oppløsninger ved antistoffaffinitetskromato-graf i .

Når det monospesifikke antiinterferon bindes kovalent til

en matrix så som tverrbundet agarose, bindes det fortrinnsvis i en sådan utstrekning at den samlede mengde antistoff som bindes kovalent tii matrixen, svarer til høyst 35L av de immunoglobuliner som anvendes ved det kovalente bindingstrinn, således som det er beskrevet av oppfinneren i Scand. J. Immunolog., 6, 77-(1977). Dette fører til den høyeste utvinning av interferon fra søylen.

De rensingstrinn som utføres i henhold til den foreliggende oppfinnelse til fremstilling av de rene humane leukocytt-interferonproteiner (humane Le form interferonproteiner) ut fra rått humant leukocyttinterferon, kan som nevnt ovenfor omfatte konsentrering ved felling av proteiner med KSCN, gelfiltrering, ligandaffinitetskromatografi og antistoff-af f initetskromatograf i . Selv om disse trinn er i og for seg kjent i interferonteknikken, utgjør den særlige kombina-

sjon derav og de bestemte betingelser som anvendes ved visse av operasjonene, nye trekk, av hvilke noen i seg selv utgjør aspekter av den foreliggende oppfinnelse. Den bestemte måte,

på hvilken trinnene utføres, og den bestemte kombinasjon av operasjoner har ført til optimal rensing og konsentrering av interferonet med minimalt tap av interferonproteiner under sekvensen.

KSCN-utfellingen utføres fortrinnsvis ved å senke pl!-verdien av det rå interferon inneholdende en KSCN-konsentras jon på 0,5 M til pH 4,5 i stedet for den konvensjonelle senking til pH 3,5. Dette fører til en betydelig lavere mengde protein i fellingen, hvilket letter de senere rensingstrinn.

Gelfiltreringen utføres mod en bufferoppløsning inneholdende 25 volumprosent etylenglykol, hvilken oppløsning er 1 molar med hensyn til NaCl, inklusive PBS ( pil 7,2). Dette fører til en meget bedre atskillelse enn ved anvendelse av PBS eller lav pH-verdi (2,4) alene, eller ved anvendelse av urinstoff, PBS ved pH-verdi 7,2. De oluatfraks joner som i det vesentlige kun inneholder proteiner i området 10.000-20.000 Dalton, samles.

Ligandaffinitetskromatografien utføres på en hittil ukjent og ytterst fordelaktig måte og utgjør ot viktig aspekt av den foreliggende oppfinnelse: Ligandaffinitetskromatografien utføres under spesifiserte betingelser på en interferon med en spesifikk aktivitet på minst 50.000-100.000 IFU pr. mg protein, idet det som ligand anvendes immobilisert Cibacron Blue F3GA. Anvendelse av Cibacron Blue F3GA som ligand for affinitetskromatografien av interferon var i og for seg kjent, men i henhold til den foreliggende oppfinnelse har det vist seg at denne ligands selektivitet økes drastisk når det anvendes bestemte kombina-sjoner av betingelser: Det påførte interferon bør ha en meget høyere spesifikk aktivitet, f.eks. en spesifikk aktivitet på minst 50.000-100.000 IFU pr. mg protein, enn ved de konvensjonelle anvendelser av denne ligandtype (hvor det påføres rått humant leukocytinterferon med en spesifikk aktivitet på ca.

3-5 x 10"^ IFU pr. mg protein), og den oppløsning, hvori interferonet påføres på søylen, bør være i pH-området 6,5-8 og bør ha en ionstyrke som ikke vesentlig overstiger ionstyrken av en 10-100, især 20, mM f os f a tbuf f c r , pll-verdi 7,2. Når det påføres en slik relativ høy spesifikk aktivitet av interferonet, endres ligandens spesifisitet, og det skjer en kraftigere grad av selektiv binding av interferonproteincne til liganden. Cibacron F3GA antas å vekselvirke med interferonproteiner på

en måte som viser eksistensen av en "dinucleotid-fold" og ved denne vekselvirkning synes det å ha samme bindingssted sem polyribonucleotidcr. Det formodes at de særlig fordelaktige egenskaper som Cibacron F3GA utviser under de ovenfor beskrevne kritiske betingelser, også utvises av de andre medlemmer av den klasse, hvortil denne ligand hører, og det foreliggende aspekt av oppfinnelsen er derfor en fremgangsmåte til rensing av humant interferon som går ut på at man påfører en vandig oppløs-ning inneholdende humant Le form interferonprotein i en form som har en spesifikk aktivitet på minst 50.000-100.000 IFU pr. mg protein, hvorved oppløsningen er bufrct til en pH-verdi på 6,5-8 og har en ionstyrke som i det vesentlige ikke overstiger ionstyrken av en 10-100, især 20, mM fos fatbufferoppløsning, pH-verdi 7,2, eventuelt sammen med et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel så som etanol i mengder på 5-80', på en matrix-immobilisert ligand som er i stand til å binde interferonet i henhold til den mekanisme som utøves av Cibacron F3GA, og deretter eluerer det således bundne interferon.

Eksempler på materialer som er matriximmobilisert

Cibacron F3GA, er "Blue Dextran 2000" (matrix: dextran med molekylvekt 2 millioner) oq Blue Sepharose CL-6B. Ytterligere detaljer angående disse og andre materialer og deres anvendelse ved den konvensjonelle interferonrensing fremgår av Bollin et al., Preparative Biochemistry, 8 (4), 259-274, (1978).

Ifølge oppfinnelsen foretrekkes det som immobilisert

Cibacron F3GA-materiale å anvende Blue Dextran 2000 koblet til Sepharose 4B (ved hjelp av CNBr-aktivert Sepharose 4B).

Elueringen av interferonet fra denne type immobilisert

ligand har ifølge oppfinnelsen vist seg å være ytterst selektiv når det anvendes 0,6 M NaCl buffret til en pH-verdi av 7,2, og pH-verdi 7,2 er også den foretrukne pll-vcrdi av den påførte interferonholdige oppløsninq.

Det vises til fig. 4 som viser olueringsmflnstret for en

Blue Dextran-Sepharose 4B-søyie som er ladet med partielt renset humant leukocytinterferon (1 ml), spesifikk aktivitet 500.000 IFU pr. mg protein, etter grundia dialyse mot 20 mM fosfatbuffer (PB), pH-verdi 7,4. Fraksjonenes størrelse var 5 mi, oq strømninqs-hastigheten var 35-40 ml/h. Søylen ble vasket med 20 mM PB i 2 timer før den ble eluert trinnvis med henholdsvis 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,0 M NaCl i PB 7,4. Det samlede eluat (I + II III) inne-holdt 754.000 IFU (i 30 ml), og den opprinnelig påførte mengde var bestemt til 750.000 IFU..Utbyttet var derfor 100 ^. Eluatets spesifikke aktivitet var 2,1 x 10 ' IFU pr. mg protein. Rensings-faktoren var 42. Ved kontroll av eluatene i en SDS PAGE viste de fleste av de eluerte proteiner (-'981) sea over 50 . 000 Dalton (urenheter), jfr. fig. 4a, som viser en SDS PAGE av innført materiale, vaskeandel og eluat fra fig. 4. Selv om 0,6 M NaCl buffret til pH-verdi 7,2 er en ytterst foretrukken eluant for affinitetssøylen, slik som det fremaår av det ovenstående,, vil det også bemerkes at et bredere konsentrasjonsområde er ganske selektivt, og oppfinnelsen omfatter elueringen med vandig NaCl-oppløsning i en konsentrasjon på 0,5-0,7, især 0,5-0,65, molær og buffret til en pH-verdi på 6,5-8, eller noen annen vandig oppløs-ning buffret til en pli-verdi på 6,5-3 og med en ionstyrke svarende til en sådan NaCl-oppløsnin<q>. Anvendelsen av andre eluanter ligger også innenfor oppfinnelsens rammer. Som eksempler kan nevnes salter og/eller etylenglycol i trinnvis og/eller gradientvis tiltakende konsentrasjon opp til 50%, aminosyrer, kunstige aminosyrer, amfoliner og proteiner samt proteinblandinger. Som ovenfor nevnt kan interferonoppløsningen påføres sammen med et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel så som alkohol, især etanol.

Det interferon som renses ved affinitetskromatografien i henhold til dette aspekt av oppfinnelsen, er typisk et interferon inneholdende humane Le form interferonproteiner så som humane interferoner (bortsett fra humane fibroblastinterferoner), dvs. f.eks. humane leukocytinterferoner, humane lymfoblastoidinterferoner og humane Le form interferonproteiner eller viktige deler derav, når de især er fremstilt ved dyrking av en mikroorganisme-klon som inneholder DNA som koder for produksjonen av dette interferonprotein. (Det forhold at humant lymfoblastoidintcrferon (Namalva) inneholder en mindre andel av interferon av fibroblast-karakter (F-form - svarende til 15L av den biologiske aktivitet), endrer ikke ved det faktum at humant lymfoblastoidinterferon med hensyn til sin overveiende interferonaktivitet er et humant Le form interferon derved at det inneholder humane Le form interferon-proteiner (svarende til 85°, av den biologiske aktivitet) med determinanter som er identiske med determinantene i humane leukocytinterferonproteiner, således sem det er blitt påvist i henhold til den foreliggende opofinnelse!.

Det foretrekkes at den spesifikke aktivitet av det interferon-preparat som paffes på affinitetssøylen, er 100.000-1.000.000,

så som 200.000-1.000.000, f.eks. ca. 500.000, f.eks. 500.000-1.000.000, IFU pr. mg protein.

Eiuatet fra affinitetskromatografisøylen som kjøres i overensstemmelse med dette aspekt av oppfinnelsen, kan være et interessant produkt også til terapeutisk anvendelse. Det vil ofte ha en spesifikk aktivitet på minst 30 :■: 10° IFU pr. mg protein, basert på Lowry-metoden under anvendelse av rent humant albuminscrum som standard, så som 30 x IO<6> - 10<3>, f.eks. 30 x 10<6> - 70 x 10<6> IFU pr. mg protein. Til administrering til mennesker skal dette preparat underkastes vanlige farmasøytiske foranstaltninger, så

som foranstaltninger til sikring av sterilitet og frihet for pyrogenisitet. Doseringen av detre preoarat vil svare til den dosering som er ancitt ovenfor for det rene interferon på en total aktivitetsbasis.

Som forklart i den eksperimentelle del ble eluatet fra affinitetskromatografien i de opprinnelige forsøk som førte til det rene interferon, underkastet en avsluttende rensing ved passasje gjennom en absorbert antistoffaffinitetssøyle, i hvilken antistoffene er Immunogiobu liner som er frembragt mot partielt renset humant leukocytinterferon, cg som deretter er underkastet fjerning av antistoffer mot forurensendende proteiner ved flere passasjer gjennom søyler av matrix-immobilisert rått humant leukocytinterferon. Som det fremgår av den nedenstående mer detaljerte forklaring, ødelegner den kovalente bindina av rått interferon til en matrix (som f.eks. Sepharose 4B) de immunologiske determinanter av selve interferonet ('--98"), men øyen-synlig ikke determinantene hos størstedelen av urenhetene, o<q >dette betyr at når immunoqlobuliner som er frembraqt mot partielt renset leukocytinterferon, føres (normalt flere qanqer) gjennom søylen, vil antiurenhetene deri bli tilbakeholdt på søylen, mens antiinterferonet vil passere søylen. Dette absor-berende antiinterferon (absorbert flere qanaer) ble anvendt i antistoffaffinite tskromatografitrinnet etter af f ini tetskromato-grafien. I stedet for rått humant leukocytinterferon vil det også kunne anvendes "vaskeandelen" fra "in te rferonantis to f faffi-nitetskromatografier", især interferonantistoffaffinitetskromato-grafier utført under anvendelse av det menospesi fikke antistoff ifølge oppfinnelsen, eller sådanne "vaskeandeler" kunne anvendes sammen med det rå humane leukocytinterferon. Man ville oaså kunne kombinere alle urenhetene fra flere interferonantistoffaffinitets-kromatograf ier, oq disse urenheter kunne anvendes i stedet for eller kombineres med det rå humane leukoevtinter fe r on.

Som det fremqår av den eksperimentelle del, er en foretrukken fremgangsmåte til drift av affinitetssøylene, dvs. Blue Dextran-Sepharose-søylen og antis to f f af f ini te tssøy ler., å forbinde de to' søyler, slik at eluatet fra Blue Dextran-søylen på samme tid lader antistoffaffinitetssøylen. Herved unngås noe tap som ellers ville kunne oppstå hvis eluatfraksjonene fra Blue Dextran-søylen ble behandlet separat.

I den avsluttende konsentre ring av de humane Le form interferonproteiner ble anvendt en unik frem<q>anqsmåte til konsentrering av proteiner ved utfellina med SDS. Denne fremnangsmåte utgjør et ytterligere aspekt av den forelignende oppfinnelse oq går ut på at SDS eller et salt derav utfelles fra en oppløsninq av proteiner som inneholder SDS, fortrinnsvis i en konsentrasjon på O,1-4 vekt%, især ca. 0,1 vektV til oppnåelse av et bunnfall omfattende et kompleks eller komplekser av SDS eller et salt derav med proteiner, bunnfallet atskilles fra oppløsningen, fortrinnsvis ved sentrifugering ved 0-4°C, og bunnfallet gjen-oppløses i et mindre væskevolum. Utfellingen av SDS kan hensiktsmessig oppnås enten ved a) senking av temperaturen til 0°C i ca. 15 minutter eller b) tilsetting av et salt, f.eks. et K<+->salt som danner et bunnfall med SDS eller med SDS-protein-komplekser. Denne fremgangsmåte er en verdifull fremgangsmåte til konsentrering av vandige oppløsninger av rene eller rensede interferoner, og som anført ovenfor har den vist sen å utgjøre en fortrinnlig måte til konsentrering av humane Le form interferonproteiner.

Den totale rensingssekvens som utføres i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, har vist seg å være ytterst aktivitetsbcvarcnde: fra en utgangsmcnqdc av proteiner på 7 :< 10^ gamma, er det isolerte rene interferon mindre enn eller likt med 1 gamma (bestemt ved sammenligning av proteinbånd på

SDS PAGE). Likevel er den samlede nedqanq i total interferonaktivitet fra utgancTsbatchen av rått interferon til det rene interferon kun fra 4 x IO<6> IFU til 1,85 x 10° IFU (ca. 50%). Dette fremhever den enestående karakter av rensingssekvensen og de ovennevnte kritiske trinn derav.

MATERIALE?, OG METODER.

Interferonassavs ble utført i overensstemmelse med den velkjente standardmetode (Rom, K. , Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human Leukocyte Interferon, Scand. J. Immunol. 6,

77-86 (1977)) under anvendelse av VERO-celler (a<p>enyreceller) og Vesicular Stomatitis-virus (VSV) som challenge-virus. Alle interferonenheter (IFU) er uttrykt i internasjonale referanse-enheter (69/19 3-er.hoter) (69/19 B-referanse er fra MRC, Mill Hill, England).

Interferon. Rått humant leukocytinterferon er produsert i overensstemmelse med den av Cantell beskrevne metode (Cantell, K., Hirvonen, S., Moaensen, K.E. oa Pyhålå, L., Human leukocyte interferon: production, purificaticn, stability and animal expe-riments. In: The Production and Use of Interferon for the Treat-ment and Prevention of Human Virus Infections pp. 35-38, Waymouth, C. (ed.), Proceedinas of a Tissuc Culture Association Workshop held at Lake Placid, 1973 (In Vitro Monograph, volume 3), Tissue Culture Association, Rockville, Md.) under anvendelse av Sendai-virus som interferonfremkaller. Partielt renset interferon (PIF) med en spesifikk aktivitet på 5 x IO<5> IFU/mq protein er fremstilt ut fra rått konsentrert humant leukocytinterferon (CIF) ved etanolisk utfelling som beskrevet av Cantell, K., Hirvonen, S., Mogensen, K.E. og Pyhala, L., loe.eit.

Rått Namalva interferon er fremstilt i det vesentlige som beskrevet av Strander et al., Production of human lymphoblastoid interferon, J.Clin.Microbiol. 1, 116-124 (1975) under anvendelse av Sendai-virus som interferonfremkaller. Interferon- nøytralisas jon til bestemmelse av antiinterferon utføres i et mikroassaysystem på følgende måte: 20.000 VERO-celler pr. fordypning podes i 100 '.il medium og holdes ved 5% CG^

i et befuktet kabinett. På dag 2 fjernes mediet fra cellene, og i hver fordypning anbringes 100 :il av en fortynning (i medium) av antiserumet inneholdende en interferonkonsentrasjon på 5-3 IF<T>J/ml (serum og interferon er preinkubert ved 37°C i 1 time). På dag 3 fjernes mediet, og i alle fordypnin<g>ene anbringes 100 ::1 VS V (fortynnet til 10 ^'^ i medium). På daa 4 bestemmes CPE (cyta-patogen effekt), og 50Vs destruksjon regnes som sluttpunkt for bestemmelsen av antiinterferontiteren. Titerne uttrykkes som interferonnøytralisasjonsenheter (IFU-NU) pr. mi.

Ikke- mcnospesi fikt an tiinte rferon mot PIF fremstilles i overensstemmelse med Mogensen, K.E., Pyhala, Liisa og Cantell, X., Acta path.microbiol.scand. Sect.B, 33, 443-450 (1975), dels i sauer og dels i kaniner. Titeren av saue-antiinterferonet er 100-250.000 IFU-NU/ml. Til fremstilling av kaninantiinterferonet injiseres

en kanin ukentlig subkutant med PIF (2 x 10^ IFU) i mer enn 2 år. Titeren av kaninantiinterferonet er 15.000-30.000 IFU-NU/ml.

Alle immunoglobuliner isoleres ved utfelling med SOL ammonium-sulfat etterfulgt av en dialyse mot fos fatbuffersaltoppløsning (PBS), pH-verdi 7,2.

Kjemikalier. CNBr er fra Fluka (oppbevart ved -20°C). Matriumdo-decylsulfat (SDS), spesielt rent til elektroforese, er kjøpt gjennom British Drug House (BDH). Soyabean Trypsin-inhibitor (STI) og L-lysin er fra Sigma. Sepharose 4B, CNBr-aktivert Sepharose 4B, CH-aktivert Sepharose 4B og opoksy-aktivert Sepharose 6B er alle fra Pharmacia (Danmark).

Bindings prosedyre r. Den kovalente binding av irrjnunoglobulinene

r.il Sepharose 4B utføres som t.-.dligere beskrevet av K. Berg

i Scand.J.Immunolog., 6, 77-86, (1977). Med vilje bindes kun 80-85% av immunoglobulinene.

Proteinbestemmelser utføres ved en modifikasjon av Lowry-prose-dyren (Berg, K., Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human Leukocyte Interferon, Scand. J.Immunolog., 6. 77-86 (1977)), som tillater deteksjon av 1-2 ijg/ml som det laveste nivå av påviselige proteiner (under anvendelse av et "LK3 Calculation Absorptioner Ultralab System"). Krystallinsk bovint serumalbumin anvendes som standardprotein. Til bestemmelse av proteinkonsen-trasjonen av det rensede interferon (1-5 ug i alt) anvendes følgende prosedyre: SDS tilsettes inntil en sluttkonsentrasjon på 0,1%. Den lyofiliserte proteinprøve undersøkes ytterligere på en SDS-poiyakryiamidgelelcktroforese (SDS PAGE, se nedenfor) etter en dialyse mot destillert vann. Intensiteten av de fargete proteinbånd sammenlignes med kjente standarder i forskjellige mengder (jfr. nedenfor under SDS PAGE), oa de samlede mengder proteiner bedømmes. Avvikene er 5-10't, og det lavest detekterbare nivå av proteiner er 0,1 ug fi alt). Resultatene fra denne metode tjener som et rått skjønn og er ikke som noen nøyaktig måling.

Affinitetskromato<g>rafier utføres ved 4°C. Gelsuspensjcnene avgas-ses før de pakkes i søylene. Pakkinaen utføres ved vaskinq med 3-5 leievolum iadebuffer under anvendelse av en peristaltisk pumpe. Prøver (100 :;1) tii in te r fe r on t i tro ringe r uttaes fra enten sammen-helninger eller individuelle fraksjoner oa titreres på samme dag eller fylles i plastbeholdere (-20°C) og titreres senere. Fortyn-ningene utføres i medium (inklusive 10?; kalveserum) .

Antistoffaffinitetskromatografi utføres i det vesentlige som beskrevet av Berg (Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human' Leukocyte Interferon, Scand. J. Immunol., 6, 77-86 (1977)). Som Iadebuffer anvendes 0,1 M NaOA/0,3 M NaCl ved pH-verdi 7,2 (strømningshastighet 40 ml/h). Trinnvis eluering utføres med 0.1 M HOAc/0,3 M NaCl under anvendelse av en meget liten mengde sitronsyre (nok tii å holde pH-verdien sikkert ved 2,4). Når søylen ikke er i drift, oppbevares den ved 4°C i PBS 1 M NaCl inneholdende penicillin, streptomycin, gentamycin og kloramfenieol (1% av hver). Før anvendelsen av søylen til rensingsformål er den vasket med 100 ml iadebuffer og deretter med 10 ml elueringsbuffer og til slutt ekvilibrert med 20-30 ml Iadebuffer. Denne vaskings-syklus er nødvendig for å unngå "spontane" proteiner, især når det arbeides med interferon med spesifikke aktiviteter over 10^ IFU/mg protein. De plastrør som anvendes til oppsamling av interferoneluatet, forbefuktes med 100 ;:1 1% SDS.

SDS PAGE. De rensede konsentrerte interferonpreparater analyseres for polypeptidkomponenter på SDS PAGE-plategeler under anvendelse av 20 cm lange atskillelsesgeler, 0,75 mm tykke (Bio Rad-modell 221: dobbelt lodrett plategelelektroforesecelle) og 7-10 cm lang stakingsgel. Eksponensialgradientgeler på ca.

9-22% polyakrylamid fremstilles ved blanding av 11 ml 22 Vs akryl-amidoppløsning med ca. 32 ml 9Vs oppløsning i en enkel isavkjølt gradientanordning som beskrevet i Knight, E., Interferon: Purifi-cation and initial characterization from human diploid cells.

Proe. natn. Acad.Sci. U.S.A. 73, 520-523 (1976). De.t anvendes et diskontinuerlig buffersystem som beskrevet av Laenomli (Laencmli, U.K., Cleavage of Structural Proteins During Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227, 630-685 (1970)). Gelen for-avkjøles i 2 timer (10°C) før det: begynnes med den egentlige elektroforese som utføres natten over (10°C) ved konstant effekt (LKB-effektdel) , idet det begynnes med 10 mA (og ca. 20 7} . De prøver som skal analyseres, oppløses feller fortynnes) i 0,1 M Tris, HC1 (pH-verdi 6,8) 2,5 i SDS og 5-: glukose inneholdende et sporings f argestof f (prøvebuf f er) . Geler! farges i Comassie Blue (1,25 mg/ml i 501 metanol, 40", H.,0 og 10" eddiksyre) uten forutgående fiksering i 15 minutter ved romtemperatur under konstant vipping og avfarges i 7% eddiksyre (5<?,> metanol). Gelene tørres på papir av god kvalitet (f.eks. Whatman Chromatographic-papir (17 mm)) undervarme og vakuum under anvendelse av en geltørker (Bio Rad, gelplatetørkcr, modell 224). Oppløsninger av fem forskjellige moleky Imarkører, fra 0,1 \ :a til 10 -:g av hver markør pr. 20 ul, - laktalbumin (14.400 Dalton); Soyabean Trypsin-inhibitor (20.100 Dalton); karbonsyreanhydrasc (30.000 Dalton); ovalbumin (43.000 Dalton); bovint serumalbumin (67.000 Dalton); fosforylase (94.000 Dalton) (levert som elektroforesekalibrerings-sett (Pharmacia, Danmark)) - underkastes SDS PAGE og farges. Det skal bemerkes at de molekylvekter som bestemmes på denne måte, er gjenstand for en eksperimcnt"ll nøyaktighet på ca. t 200 Dalton. De fargete proteinbånd sammenlignes med de tilsvarende bånd frem-kommet fra en parallell SDS PAGE av et renset interferonpreparat,

og den samlede konsentrasjon av interferonproteiner bedømmes.

Til oppnåelse av en biologisk profil fra en SDS PAGE utskjæres

en del av gelen som skal brukes til interferonbestemmelse, fra resten av gelen og holdes ved 4°C (i en befuktet kasse) på en glassplate. Hovedparten av gelen farges i 15 minutter; etter avfarging i ytterligere 3-5 minutter sees ganske tydelig svake bånd på en blå bakgrunn, hvorved den nøyaktige plassering av proteinbånd svarende til 14.000 og 30.000 Daltens kan bestemmes. Den ufargete del av gelen utskjæres, således at den kun inneholder proteiner på mellom 14.000 og 30.000 Dalton og deles ytterligere i stykker på 1 mm ved hjelp av skarpe kniver. Interferonet fra disse utskjæringer elueres med 0,5 ml 0,1 M SDS etter en fullstendig findeling ved hjelp av en teflonstang. Etter 5 timer ved romtemperatur (vipping) bestemmes interferonaktiviteten av supernatanten. De enkelte fraksjoner fryses ved -20°C uten additiver.

EKSPERIMENTELL DEL.

Fremstilling av rene humane leukocyt- og lymfcblastoidinterferon-proteiner.

Konsentrering av rått humant leukocytinterferon. Tii 3 liter rått humant leukocytinterferon settes KSCN inntil en konsentrasjon på 0,5 M ved pH-verdi 7,2. pH-verdien senkes ved tilsetting av 1 N HC1 til 4,5 (maa<p>.etisk omrøring) , hvorved det fåes et pro-teinbunnfall inneholdende interferon (og en del av urenhetene). 3unnfallet oppløses i 150 ml PBS (fosfatbufret saltoppløsning, pll-verdi 7,2) inneholdende 1 M NaCl oa 25 volumprosent etylenglykol og dialyseres grundig mot 3 aanger 2 liter av samme buffer ved 4°C. Det rå konsentrerte humane leukocytinterferons (HuLeCIF) spesifikke aktivitet er 5-10 x 10<3> IFU/mg protein. Utbyttet var ca. 9 8",.

Konsentrering av rått Namalva- interferon. Til 1 liter rått Namalva-interferon med en titer på ca. 3000 IFU/ml settes KSCN inntil en konsentrasjon på 0,5 M ved pH-verdi 7,2. pH-verdien senkes ved tilsetting av 1 N tICl til 4,5 (magnetisk omrøring), hvorved det fåes et proteinbunnfai 1 inneholdende interferonet (og en del av urenhetene). Bunnfallet opoløses i 50 ml PBS ved pH-verdi 7,2 inneholdende 1 M NaCl og 25 volumprosent etylenglykol og dialyseres grundig mot 3 ganger 2 liter av samme buffer ved 4°c. Det rå konsentrerte Nanvilva-interferons (NaCIF! spesifikke aktivitet er 10-12 x 10<3> IFU/mq protein. Utbyttet er ca. 98%.

Gelfiltrering. En 100 cm lang søyle (2,6 cm i diameter, Pharmacia K 2,6/100) pakkes med Ultrogel AcA 5/4 (LKB Danmark) i PBS inneholdende 1 M NaCl og 25 volumprosent etylenglykol ved

4°C (pH-verdi 7,2). Etter vasking av søylen med 3 leievolum buffer er søylen stabilisert. Søylen påføres 10-15 ml HuLeCIF (fremstilt som beskrevet ovenfor i 25 volumprosent etylenglykol, IM NaCl i pBS, pH-verdi 7,4), og søylen "elueres" med påførings-bufferen, hvoretter fraksjonene avprøves for interferonaktivitet. De interf eronholdige fraksjoner forenes, og 95?, av den opprinnelige interferonaktivitet gjenvinnes. Den spesifikke aktivitet av de gelfiltrerte eluater inneholdende humant leukocytinterferon er tett ved 1.000.000 IFU mg/protein, hvilket svarer til en rensingsfaktor på 200. Som det er bestemt ved hjelp av mciekyl-markører, svarer interferonets molekylvekt til et område på fra 10.000 til 20 .000 Dalton. Titreringer av enkeitfraks joner av-slører kun én bred topp med et maksimum på 18.000 Dalton.

På samme måte som beskrevet ovenfor påføres søylen 10 ml NaCIF (fremstilt som beskrevet ovenfor i 25 volumprosent etylenglykol, 1 M NaCl i PBS, pH-verdi 7,4), og "elueringen" utfores på samme måte som beskrevet ovenfor. Utbyttet er ca. 90^. Den spesifikke aktivitet av det gelfiltrerte eluat inneholdende Namalva-interferon er tett ved 1.000.000 IFU/mg protein, hvilket svarer til en rensings faktor på 100. Interferonets molekylvekt - bestemt ved hjelp av molekylmarkører - svarer til et område fra lO.OOOtil 20.000 Dalton. Titreringer av de individuelle fraksjoner avslører en bred topp med et maksimum på 18.000 Dalton.

Gelfiltreringskurvene for den ovenfor beskrevne ge1 filtrering av HuLeCIF og NaCIF er vist i henholdsvis fig. 5 og 6, og "HULEIF" betegner det humane leukocytinterferon, mens "NALYIF" betegner Namalva-(lymfoblastoid)-interferonet. Det sees klart at interferonaktiviteten atskilles effektivt fra størstedelen av proteinene.

Blue Dextran- kromatografi. Den gelfiltrerte humane leukocvt-interferonoppløsning, fremstilt som beskrevet ovenfor, dialyseres uttømmende mot 200 volum 20 mM PB, pH-verdi 7,2 ved 4°C. Dialysen foretas 2 ganger, hvilket gir en samlet dialysetid på ca. 24 timer. Den dialyserte oppløsning (25 ml, inneholdende 1,8 x 10<0> IFU)

påføres en søyle av Blue Dextran-Sepharosc 4B. Søylens dia-

meter er 1 cm og dens lengde 10 cm. Søylen forvaskes med

200-300 ml 20 mM PB (fosfatbuffer) ved pH-verdi 7,4. Det dialyserte interferonpreparat påføres den ekvilibrerte søyle,

og søylen vaskes med 75 ml PB. I vaskevæskcn finnes 4500 IFU. Søylen elueres med 0,6 M NaCl, 20 mM PB, pH-verdi 7,2, hvorved

mer enn 95% av interferonaktiviteten gjenvinnes i 6 ml eluat, bestemt ved interferontitrering.

På nøyaktig samme måte dialyseres den ovennevnte gelfiltrerte Namalva-interferonoppløsning uttømmende og underkastes deretter Blue Dcxtran-kromatografi. Til Blue Dextran-kromatografien innføres 1.600.000 IFU. Vaskevæsken består av 70.000

IFU i 50 ml. Eluatet oppnåes ved hjelp av 0,6 M NaCl'i PB (pH-verdi 7,2). Blue Dextran-kromatografien av Namalva-interferonet elueres ikke fra søylen under de ovennevnte betingelser, men forventes å elueres ved anvendelse av f.eks. 251 etylenglykol i 1 M NaCl, pH-verdi 7,2.

Den ovennevnte Blue Dextran-soyle er "en søyle av 3iue Dextran (Cibacron 31ue F3GA immobiiisert på Dextran 2000 (molekylvekt 2 millioner) ) koblet tii cyanogenbromid-aktivert agarose (Sepharose 4B) Den mer fullster.diqe betegnelse for søylen er således 3iue Dextran-Sepharose 4B). Denne type søyle er beskrevet av Bollin et al,

loe. eit. Etter eiuering renses søylen ved eluering med 25-30 ml 25Vs etylenglykol, 1,5 M NaCl i 20 mM P3. Søylen oppbevares i denne buffer ved 4 JZ når den ikke anvendes. Som ovenfor nevnt kan påføringsbetingelsene også omfatte bruken av hydrofobe reagenser så som alkoholer i varierende mengder (0-50:,).

0,6 M NaCl-eluatene fra Blue Dcxtran-kromatografien viser en spesifikk aktivitet på 70 :< 10° IFU/mg protein for både det humane leukocytinterferon oc for Namalva-interferonet. De er således begge egnet til parenteral administrering til mennesker til terapeutiske formål og er i denne henseende meget renere preparater enn de alminnelig anvendte PIF-preparater. Tii dette bruk stabiliseres eluatene med fysiologisk akseptable stabilisatorer som beskrevet ovenfor, f.eks. I<5>; humant albumin.

Til ytterligere rensinq og til fremstillin<g> av rent interferon overføres eluatene fra 3lue Dextran-søylen direkte tii en antistoffaffinitetskrcmatografisøyle. I den mest fordelaktige utføreises form kombineres antistof fa f finitetskromatografisøylen med 3lue Dextran-søylen i et "tandemsystem" som beskrevet nedenfor: Tandemaffinitetskromatografi. 1 stedet for å eluere Blue Dextran-søylen som beskrevet ovenfor kombineres Blue Dextran-søylen med den ekvilibrerte antistoffsøyle før elueringen, idet ut-løpet av Blue Dextran-søylen forbindes med innløpet til anti-stoffsøylen. På denne måte "oppfanges" eluatet fra Blue Dextran-søylen øyeblikkelig av antistoffsøylen. Denne kombinasjon ut-nytter det forhold at elueringsbetingelsene (0,6 M NaCl, 20 mM PB, pH-verdi 7,2) kan anvendes som påføringsbetingelser for antistoff-søylen. Etter eluering/påføring under anvendelse av 20 ml eluat/ "påføringsbuffer" (denne "påføringsbuffer" inneholder selvfølgelig samtidig det interferon som er eluert fra Blue Dextran-søylen), skilles de to søyler fra hverandre, og antistoff-søylen vaskes ytterligere, før den elueres som beskrevet ovenfor. Det humane leukocytinterferoneluat fra antistoffsøylen inneholder rene interferonproteiner som viser en spesifikk aktivitet på mer enn 10<9 >IFU/mg protein (bedømt ved den ovenfor beskrevne bes temmeIses-metode). Til stabilisering av de rene interferonproteiner for-vætes hvert av de rør i hvilke eluatet fra antistoffsøylen opp-samles (fraksjons-størrelse 2 ml), med 100 ul IVs SDS. Etter oppsamling av det interferonholdige eluat tilføres ytterligere SDS inntil en samlet konsentrasjon på 0,1 vektprosent. De oppsamlede interferon-hoidige eluater stabilisert med 0,1%'s SDS overføres til et 20 mi rør av rustfritt stål, forav-kjølt til 0°C i et isbad. Etter 15 minutter dannes et bunnfall. Bunnfallet isoleres ved sentrifugering ved 20.000 rpm ved 4°C i 20 minutter. Supernatanten kasseres (ingen interferonaktivitet), og bunnfallet gjenoppløses i 4 ml 8 M urinstoff og overføres til en Millipore-konsentrasjonscelle, størrelse 8 ml, filter med en avskjæring ved en molekylvekt på 10.000, og konsentreres til ca. 100 )j1 ved romtemperatur. Deretter settes ytterligere 4 ml 4 M analyserent urinstoff til konsentratet, og oppløsningen konsentreres til ca.. 100 ul ved romtemperatur. 1-3 ml destillert vann tilsettes, og oppløsningen konsentreres igjen til et volum på 20 ul og blandes med 20 ul SDS elektroforesebufforprøve. 20 ul av den resulterende oppløsning anvendes til karakterisering som beskrevet i avsnittet "SDS PAGE" nedenfor.

Den ovennevnte antistoffaffinitetskromatografisøyle er fremstilt i overensstemmelse med "Bindingsprosedyrer" under anvendelse av ikke-monospesifikt anti-PIF som er absorbert som følger: en samlet mengde på 10^ IFU-NU antiinterferonimmunoglobuliner (svarende til 4 ml saue-antiinterferonserum) absorberes 3 ganger på en 150 ml søyle av humant serum bundet til Sepharose 4B, etterfulgt av 4 absorberinger på en CIF-epoksy-Sepharosesøyle og 2 absorberinger på en CIF-CH-aktivert Sepharose 4B som beskrevet i nedenstående avsnitt "Absorpsjon av antiinterferon" og i Scand.J. Immunol., 8, 429-436 (1978). Endelig absorberes immunoglobulinene på en poly-L-lysin-Sepharosesøyle (én gang) og på en Soyabean Trypsin-inhibitor-Sepharosesøyle (to ganger).

Eluatet fra Blue Dextran-kromatografien av Namalva-interferon deles i to porsjoner. Den ene porsjon anvendes til SDS PAGE elektroferose som beskrevet.neden for. 250.000 IFU påføres den absorberte antistoffsøyle som vist i fin. 8. Det finnes ingen interferon i vaskevæsken. Interferonet elueres som vanlig ved å senke pll-verdien til 2,4, og 2 35 . 000 IFU (oppsamlet i nærvær av 0,1%'s SDS) gjenvinnes. Dette eluat konsentreres som beskrevet ovenfor og undersøkes ytterligere i SDS PAGE.

SDS PAGE. SDS PAGE-elektroforesen utføres som beskrevet under "Materialer og Metoder" ovenfor. Den fargete plate fra elektroforesen av de rene humane ieukocytinterferonproteiner er vist i fig. 1. Fig. 2 viser skjematisk den fargete plate fra et annet forsøk sammen med den tilsvarende interferonaktivitet eluert fra en ufarget parallell gclstrimmel. Den slående repro-duserbarhet mellom de to forsøk frem<g>år av de to figurer, idet forskjellen mellom 20.100 og 20.130 ligger innen for forsøksusik-herheten. Som tidligere nevnt faller de biologiske topper nøy-aktig sammen med proteinene.

Det fremgår av fig. 1 at in terferonpreparatet er fullstendig rent i henhold til SDS PAGE. Det er overhodet ikke andre synlige proteinbånd.

Fig. 9 viser den fargete plate fra SDS PAGE (påføring 0,9 x 10^ IFU) av rene Namalva-interferonproteiner (A) og av eluatet fra Blue Dextran-søylen (B). Det bemerkes ved sammenlikning med fig. 1 at båndene av det rene Namalva-interferon er i det vesentlige identiske med båndene av rent humant leukocytinterferon på-ført i samme mengde.

Etablering av hybridomceller med aktivitet mot interferon.

3 Balb/c-hunmus, 2 måneder gamle, immuniseres med humant leukocytinterferon på følgende måte: Den første injeksjon (40.000 IFU) foretas subkutant i ryggen på hver mus. Immuniseringen fortsettes hver uke med subkutan injeksjon av 70.000 IFU. Den siste injeksjon gis intravenøst i henholdsvis 9. (mus 1) og 10. uke (mus 2 og 3).

Utviklingen av antiinterferon bestemmes på serumprøver fra musene ved bruk av interferonnøytralisasjonstesten. Et internt antiinterferon-IgG-preparat (produsert ved injeksjon av kaniner med delvis renset humant leukocytinterferonpreparat) medtaes som vanlig som laboratoriekontroll av in terfcronnøytralisasjonssystemet. Serumprøvene fra musene viser inaen antiinterferonaktivitet de første seks uker. Deretter sees en uttalt antiinterferonaktivitet:

Musene drepes ved at man brekker halsen på dem to tii fire dager etter den siste injeksjon, og deres milt fjernes under sterile betingelser. Etter homogenisering av hver milt i ?BS overføres den homogeniserte ccllesuspensjon til sentrifugerør og sentrifugeres i 5 minutter ved 170 g ved 4°C. Cellene gjensuspenderes i PBS, og etter en ytterligere sentrifugerinc gjensuspenderes de i serumfri DMEM (ca. 0,5 ml pr. milt). Det sam-

lede antall celler er 10<8> (mus 1), 0,3 :< IO<8> (mus 2) og 0,8 x IO<8 >(mus 3). Levedyktigheten er omkrina 85-90%.

Ved behandling med polyetylenglykol på den nedenfor beskrevne måte sammensmeltes miltcellesuspensjonen fra hver mus med 10^

X6 3Ag8 (HPRT-) myelomaceller på følacndc måte: 10 8 musemiltceller og 10 8-azaguanin-resistente myelomaceller (X6 3Ag8; NSI/lAg 4-1;

SP 2/0-Ag 14) biandes i et 50 ml konisk plastsentrifugerør (Falcon 2070). Røret fylles med serumfri DMEM og sentrifugeres i 10 minutter ved 170-200 g og 4°C. Supernatanten fjernes omhyggelig, og ved 37°C tilsettes en samlet mengde på 0,7 ml 50%'s polyetylenglykol-oppløsning med en temperatur :.-å 37°C dråpevis i løpet av 1 minutt ved lett omrøring. Etter inkubasjon i 90 sekunder ved 37°C tilsettes 15 ml varm serumfri DMEM meget langsomt

(i løpet av 1-2 minutter). Deretter sentrifugeres blandingen i 10- minutter ved 200 g, og celleklumpen gjensuspenderes i 50 ml komplett DMEM-FCS til utpoding i Costar-brett.

Fra hver av fusjonene podes 48 kulturer på hver 1 ml i Costar-brett (2 brett med hver 24 hull pr. milt = 48 kulturer pr. mus). Etter 10-15 dager iakttas vekst i 21 kulturer (mus 1), 0 kulturer (mus 2) og (efter ytterligere utpoding) 150 kulturer (mus 3) .

Cellene overføres til 5 ml's kulturer i 25 ml NUNC-flasker som, likesom Costar-brettene, inneholder et "fødelag" av makro-fager. Ved å skifte medium oppnås supe rna tantene, og fra disse tette kulturer fryses cellene i flytende nitrogen.

De enkelte kulturers supernatantcr fra mus 1 underkastes deteksjon av positive kloner ved anvendelse av interferon-nøytralisas jonstes ten. På denne måte finnes det én positiv klon, men med en meget lav titer (ca. 2-3 IFU.NU pr. mi).

Fremstilling av antiinterferon ved hjelp av rene interferon-proteiner (rent i henhold til SDS PAGE).

Eluatet fra den ovennevnte tandemaffinitetskromatografi, karakterisert ved hjelp av SDS PAGE, anvendes til immunisering av kaniner på følgende måte: Ca. 1.000.000 IFU-enheter konsentreres til ca. 1 ml cg dialyseres mot P3S ved 10°C natten over. To kaniner injiseres subkutant med hver 1.000.000 IFU fremstilt på ovennevnte måte. Injeksjonen gjentaes annenhver uke. Utviklingen av antistoffer fremgår av tabell II:

Fremstilling av antiinterferon ved hjelp av rene fargete interferonproteiner utskåret fra en SDS PAGE.

Immuniseringen utføres i overensstemmelse med protokollen beskrevet på side 11 i nærværende beskrivelse under anvendelse av den findelte interferon-holdige (cg delvis vaskete og avfargete) gelsuspensjon direkte som immunogcnpreparat. En kanin (III) immuniseres med 18.400 i 200 Dalton-arten, og en annen kanin (IV) immuniseres med 20.100 ± 200 Dalton-arten (døde etter uke 15). Det oppnås gode resultater, slik som det fremgår av tabell III:

Antigenisitet av 18. 400 Dalton- arten mot 20. 100 Dalton- arten

og omvendt.

Til påvisning av at de antigene determinanter av de ovenstående arter er identiske, utføres følgende kryssnøytralisa-sjonsforsøk: Interferon elueres fra SDS PAGE-båndet fra 18.400 t 200 Dalton-arten og SDS PAGE-båndet fra 20.100 t 200 Dalton-arten

på den ovenfor beskrevne måte, og det fremstilles oppløsninger inneholdende 5-10 IFU av de to arter. Oppløsninger av anti-interferon fra de to arter, fremstilt i kaniner som beskrevet ovenfor, fortynnes til ialt å inneholde 20 IFU-NU pr. ml.

Alikvoter (1 ml) av de rene interferonarter inneholdende hen- . holdsvis 10 IFU av 18.400 Dalton interferonarten og 10 IFU av 20.100 Dalton interferonarten blandes med henholdsvis 1 ml 18.400 Dalton-art antiinterferonoppløsning og 1 ml 20 . 100 Dalton-art antiinterferonoppløsning i alle mulige permutasjoner, dvs. at antiinterferonet fra hver art blandes separat med interferonet av hver art. Etter 1 time ved 37<C>C bestemmes eventuell igjen-værende interferonaktivitet ved den vanlige interfercntitrering

(jfr. "MAterialer og Metoder" ovenfor). Det ble ikke funnet noen interferonaktivitet. Det iakttaes således ingen interferon når henholdsvis 18 . 400 t 200 Dalton-arten og 20 . 100 t. 200 Dalton-arten blandes separat med hver av anti-18.400 t 200 Dalton-arten og anti-20.100 Z 200 Dalton-arten og omvendt, med andre ord, det skjer fullstendig nøytralisasjon. Det kan derfor konkluderes at de to interferonarter utviser samme antigene determinanter.

Dette betyr at anti-18.400 t 200 Dalton-arten kan anvendes som

et monospesifikt antistoff til rensing av begge interferonarter,

og det samme gjelder anti-20.100 Z 200 Dalton-arten samt for en blanding av de to arter. Ytterligere forsøk utført på. samme måte viser at hver av de seks biologiske topper nøytraliseres fullstendig av hvert av de antisera som produseres mot de to hovedarter.

Det er høyst sannsynlig at de te hovedarter isolert fra

Namalva SDS PAGE gir samme resultat, med andre ord, at de også kryssreagerer og utviser identitet med HuLelF hva angår antigenisitet, (slik at HuLelF 18.400 ± 200 er identisk med Namalva 18 . 400 - 200 , både hva angår anticrenisitet og molekylvekt, og HuLelF 20.100 t 200 tilsvarende er identisk med Namalva 20.100 Z 200).

Biologiske virkninger hos de rene interferonproteiner.

Antiviral aktivitet.

Den antivirale aktivitet av hvert av de seks fargete proteinbånd vist i fig. 3 bestemmes. Gelen er ladet i to spalter som begge er fargete. De fargete bånd i den ene spalte vises ved A

i fig. 3. Den annen spalte avfarges i kort tid (i 50^ metanol, 45% ^C^, 5% eddiksyre), den nøyaktige plassering av interferonproteinene i den våte gel registreres, og gelen vaskes i vann og utskjæres som vist ved B i fig. 3. Antallet av gelutskjæringer er vist ved C i fig. 3. På denne måte blir hvert interferonproteinbånd skåret nøyaktig ut av gelen uten å bli blandet med det tilstøtende bånd. Hver utskjæring elueres som beskrevet i avsnittet "Materialer og Metoder", og den biologiske profil som er vist i fig. 3, konstrueres under anvendelse av den vanlige interferontitrering beskrevet i "Materialer og Metoder". Møytra-liseringsaktiviteten av hver av de seks arter utskåret og eluert av SDS PAGE kontrolleres mot anti-leukocytinterferon, og det viser seg at alle arter nøytraliseres fullstendig av det samme anti-serum. Utvinningen av interferon i fig. 3 er temmelig lav,

(20%) sammenlignet med normal "SDS PAGE-eluering" uten for-farging (unntatt for 18.400 t 200 Dalton-arten), hvilket indikerer at den biologiske aktivitet hos de fleste interferonarter ødelegges selektivt sammenlignet med antigenisiteten. I nøytralisasjons-test mot antileukocytinterferon er interferonproteinene "eluert fra fig. 3" i stand til å nøytralisere antileukocytinterferonet 3-5 ganger mer effektivt enn naturlig (rått) humant leukocytinterferon, beregnet på basis av interferonaktivitet, hvilket indikerer en selektiv ødeleggelse av de determinanter som er ansvarlige for den biologiske aktivitet.

Ikke- antivirale virkninger.

De ikke-antivirale virkninger av den rene humane leukocyt-interferonart kontrolleres i 3 systemer:

1) Anticellulær aktivitet.

De rene interferonproteiners anticellulære aktivitet undersøkes ved å inkubere Daudiceller med 1:1000 fortyn-

ninger (i medium) av rene interferonproteiner fremstilt av de eluerte SDS PAGE-fraks joner som vist i fig. 2 og kon-statere den relative senkning av Tritiummerket Thymidin (I. Heron og K Berg, The actions of interferon are potentiated as elevated temperature, Nature, 274, 508-510 (1978)) sammenlignet med kontroller uten interferon (fig. 2, øverste del, hvor "% G-I" betegner ?; vekstinhibering) . Det sees tydelig at "den anticellulære kurve" meget nøye følger den antivirale kurve. Dette viser at alle 5 arter av rent naturlig humant leukocytinterferon inneholder både den antivirale aktivitet og den anticellulære aktivitet. Størrelsen av de forskjellige "anticellulære topper" varierer ikke lineært med den tilsvarende størrelse av "interferontoppene", hvilket muligens avspeiler Daudi-cellesysternets følsomhet (J. Hilfenhaus, H.

Damm, H.E. Karges og K.E. Manthey, Growth inhibition of human lymphoblastoid Daudi cells in vitro by interferon preparations, Are. Virol. 51 , 37-97 (1976)). Den lille in te rfcrontopp ved 19.500 Dalton forårsaker ingen tilsvarende topp i den anticellulære kurve. Ved en 10 ganger svakere fortynning (1:100) sees imidlertid en liten, men tydelig topp av anticellulær aktivitet (ikke vist). 2) Uttrykkelse av major histokompatibilitetsantigen (MHC) på lymfocyter og monocyter.

Det iakttas selektiv økning i 32~assosiert MHC (major histokompatibilitetsantigen) -uttrykkelse ved anvendelse av delvis renset humant leukocytinterferon, således som det er beskre-

vet av I. Heron, M. Hokland og K. Berg (1978), "Enhanced expres-sion of 37 microglobulin and HLA on human lymphoid cells by interferon", Proe. Nati. Acad. Sei, 75: 6215-6222 (omtalt nedenfor som PNAS 75) Hver av de to største humane leukocytinterferon-arter (18.400 og 20.100 Dalton, jfr. fig. 1) avprøves i doser på ca. 100 IFU pr. ml kulturmedium. Den ovennevnte effekt konsta-teres ved anvendelse av disse rene moiekylarter, mens eluater av gelutskjæringer uten for de områder der det noteres antiviral aktivitet, ikke har noen effekt. Det er således bevist at virk-

ningen av selektiv økning av MHC antigenuttrykkelse på lymfoide celler er en iboende egenskap hos interferonmole-kyler. 3) Potensering av Natural Killer-cellesystemet (NK-systemet).

Fig. 10 viser den antivirale profil (bestemt på en SDS PAGE på samme måte som beskrevet i forbindelse med fig. 2). Hver av artene fra gelen bedømmes med hensyn til NK-økende aktivitet under anvendelse av den metode som er beskrevet i PNAS 75. Fraksjoner med antiviral aktivitet som vist i den nedre kurve gir øket NK, således som det er vist i den øverste kurve, mens "basislinje"-fraks joner ikke gir øket NK. En pil angir at kun saltoppløsning er tilsatt som negativ kontroll, og to piler angir at delvis renset humant leukocytinterferon (PIF) er anvendt som positiv kontroll. Det tilsettes ca. 100 IFU antivirale enheter av hvert interferonpreparat pr. ml.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av humane Le-form interferon-proteiner, som under SDS PAGE ved anvendelse av en eksponentialgradientgel med en samlet interferonpåf©ring av 0,9 x IO<6> IFU viser to store skarpe farvede proteinbånd med antiviral interferonaktivitet ved henholdsvis 18.400 og 20.100 Dalton og et mindre, farvet proteinbånd med antiviral interferonaktivitet mellom 20.300 og 20.400 Dalton, sammen med mindre topper av antiviral interferonaktivitet ved 19.500, 21.130 og 23.440 Dalton (hvilke Dalton-molekylvekter har en eksperimentell usikkerhet på ± 200 Dalton) hvorved SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre farvede proteinregioner, og som under SDS PAGE ved anvendelse av en eksponentialgradientgel med en samlet interferonpåføring på 3,8 x IO<6> IFU viser seks farvede proteinbånd med antiviral interferonaktivitet, nemlig sterke bånd ved henholdsvis 18.410 Dalton og 20.180 Dalton, et middelkraftig bånd ved 20.420 Dalton og akkurat såvidt synlige bånd ved henholdsvis 19.500, 21.130 og 23.440 Dalton (hvilke Dalton-molekylvekter har en eksperimentell usikkerhet på ± 200 Dalton), hvor toppene av antiviral interferonaktivitet faller nøyaktig sammen med de farvede proteinbånd, og den nevnte SDS PAGE-akrylamidgradienten viser i det vesentlige ingen andre farvede proteinregioner, karakterisert ved at en oppløsning inneholdende humane Le-form interferon-proteiner underkastes affinitetskromatografi, slik at nevnte humane Le-form interferonproteiner holdes selektivt tilbake, og derefter elueres de tilbakeholdte interferonproteiner.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at affinitetskromatografien omfatter en kombinasjon av ligand-affinitetskromatografi og påfølgende antistoff-affinitets-kromatograf i .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at a) den spesifikke aktivitet av en oppløsning av rå, ukonsentrerte, humane Le-form interferonproteiner økes ved (i) proteinfelling av humane Le-form proteiner fra nevnte opplesning, (ii) gelfiltrering av en oppløsning av de utfelte proteiner, og (iii) dialyse av fraksjonene med interferonaktivitet som er eluert efter gel-filtrering, og b) de resulterende dialyserte interferonproteiner med øket spesifikk aktivitet underkastes ligand-affinitetskromatografi, slik at de eluerte interferonproteiner har en spesifikk aktivitet på minst IO<7> IFU/mg protein, og c) interferonproteinene med nevnte spesifikke aktivitet på minst IO<7> IFU/mg protein underkastes antistoff-affinitets-kromatograf i.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at proteinutfelningstrinnet (i) omfatter tilsetning av en forbindelse KSCN og justering av oppløsningens pH-verdi til 4,5.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 3 eller 4, karakterisert ved at det som interferon-fraksjoner som skal renses i trinn (iii), anvendes slike som i alt vesentlig bare inneholder proteiner fra området 10.000 til 20.000 Dalton, som bedømt ved deres elueringsoppførsel ved gel-filtreringsstadiet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at gelfiltreringstrinnet (ii) utføres med en bufferopp-løsning som inneholder ca. 25 volum% av en glykol så som etylenglykol og har en ionestyrke svarende til ionestyrken av en IM NaCl-oppløsning, ved pH-verdi ca. 7,2.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 2-6, karakterisert ved at det som ligand ved ligandkromatografien anvendes Cibacron F3GA® eller en annen slik ligand som kan binde humane Le-form interferonproteiner ved mekanismen som utøves av produktet Cibacron F3GA®, særlig Blue Dextran 2000®, Blue Sepharose C1-6B® og til Sepharose 4B© koblet Blue Dextran®, eller en slik ligand immobilisert på dekstran med en molekylvekt på ca. 2.000.000 Dalton koblet til fornettet agarose, så som Blue Dextran® koblet kovalent til produktet Sepharose 4B®.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det som oppløsning som underkastes ligand-affinitets-kromatograf i , anvendes en vannoppløsning inneholdende human Le-form interferon i en form som har en spesifikk aktivitet på minst 50.000 100.000 IFU/mg protein, hvilken oppløsning er bufret til en pH-verdi på 6,5-8 og har en ionestyrke som i det vesentlige ikke overstiger 10-100 mM, særlig 20 mM, med fosfatbuffer (pH 7,2), eventuelt sammen med et vann-blandbart organisk oppløsningsmiddel, så som etanol, i mengder på 5-80%.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at elueringen utføres med en vannoppløsning bufret til en pH-verdi på 6,5-8 og med en ionestyrke svarende til ionestyrken hos en 0,5-0,7, særlig 0,5-0,65 molar NaCl-oppløsning, fortrinnsvis en vannoppløsning med en ionestyrke svarende til ionestyrken hos en 0,6 molar NaCl-oppløsning og bufret til en pH-verdi på 7,2.

10. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at man anvender en affinitetskromatografi som omfatter antistoff-affinitetskromatografi, hvor antistoffene er matriks-immobiliserte antistoffer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at høyst 85% av de antistoffer som tilføres matriksen under immobiliseringstrinnet, blir kovalent bundet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at antistoffene før binding til matriksen blir vesentlig befridd for all proteolytisk enzymatisk aktivitet ved behandling med enzyminhibitorer og/eller enzymdestruktorer, særlig med matriks-immobiliserte enzyminhibitorer og/eller enzymdestruktorer.

13. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 10-12, karakterisert ved at det som oppløsning som føres til antistoff-affinitetsmatriksen anvendes et konsentrert eller delvis renset interferon-preparat.

14. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 10-12, karakterisert ved at antistoff-affinitets-kromatograf ien utføres med antistoffer fremstilt mot eller i alt vesentlig bare rettet mot en hvilket som helst av interferonproteinene fremstilt ifølge krav 1.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det som oppløsning som tilføres antistoff-affinitetsmatriksen anvendes et urenset, ukonsentrert interferonpreparat.

16. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-15, karakterisert ved at det humane Le-form interferon i den oppløsning som underkastes antistoff-affinitets-kromatograf i , velges fra gruppen bestående av humane leukocytt-interferoner, humane lymfoblastoid(Namalva)-interferoner og proteiner med de vesentlige for interferon karakteristiske determinanter, som de i krav 1 angitte proteiner har, eller de vesentlige immunologiske determinanter som de i krav 1 angitte proteiner har, bl.a. slike proteiner som er produsert ved dyrking av en mikroorganisme inneholdende DNA som koder slike proteiner.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-16, karakterisert ved at det efter affinitetskromatografien underkastes interferonproteinene SDS-PAGE under anvendelse av en eksponentialgradientgel, og humane Le-form interferonproteiner ekstraheres derefter fra ett eller flere områder av SDS-PAGE gelen.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at man utvinner et interferonprotein med molekylvekt bestemt med nevnte SDS-PAGE på 18.400 ± 200 Dalton.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at man utvinner et interferonprotein med molekylvekt bestemt med nevnte SDS-PAGE på 20.100 ± 200 Dalton.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at man utvinner et interferonprotein med molekylvekt bestemt med nevnte SDS-PAGE på mellom 20.300 og 20.400, 19.500, 21.130 eller 23.440 Dalton.

21. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-20, karakterisert ved at man utvinner et interferonprotein som er renset, Le-form protein av humant lymfoblastoid(Namalva)-interferon.