JP2593865B2 - ヒトファクターｉに対する単クローン性抗体 - Google Patents
ヒトファクターｉに対する単クローン性抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なハイブリドーマ細胞株から分泌され
る、ヒトファクターＩに対する単クローン性抗体に関す
る。
る、ヒトファクターＩに対する単クローン性抗体に関す
る。
補体活性制御因子の一つであるヒトファクターＩは、
他の補体活性調節因子とともに、免疫複合体の不活性化
に関与し、その動態は自己免疫性疾患との関連で重要と
なってきている。したがって、ヒトファクターＩに対す
る特異抗体は、自己免疫性疾患の診断用として、生体試
料中に存在するヒトファクターＩのイムノアツセイ的手
法により高感度に定量する方法に使用できる。また、ヒ
トファクターＩは、生体試料中微量にしか存在せず不安
定であることから、精製操作の困難さおよび繁雑さを招
いており、より高度かつ簡単な分離精製操作が要求され
ている。その有効な解決方法として抗体アフィニティー
クロマトグラフィーが適している。
他の補体活性調節因子とともに、免疫複合体の不活性化
に関与し、その動態は自己免疫性疾患との関連で重要と
なってきている。したがって、ヒトファクターＩに対す
る特異抗体は、自己免疫性疾患の診断用として、生体試
料中に存在するヒトファクターＩのイムノアツセイ的手
法により高感度に定量する方法に使用できる。また、ヒ
トファクターＩは、生体試料中微量にしか存在せず不安
定であることから、精製操作の困難さおよび繁雑さを招
いており、より高度かつ簡単な分離精製操作が要求され
ている。その有効な解決方法として抗体アフィニティー
クロマトグラフィーが適している。
以上の目的から、ヒトファクターＩに対して高い特異
性と結合能を有する抗体を大量に得る必要がある。この
要求を満たす手段として、抗体産生細胞と腫瘍細胞とを
細胞融合させてハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、
これを培養することにより単クローン性抗体を生産する
という、k hlerとMilstein（Eur.J.Immunol.６,292（19
76））の方法が知られている。
性と結合能を有する抗体を大量に得る必要がある。この
要求を満たす手段として、抗体産生細胞と腫瘍細胞とを
細胞融合させてハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、
これを培養することにより単クローン性抗体を生産する
という、k hlerとMilstein（Eur.J.Immunol.６,292（19
76））の方法が知られている。
本発明は、上述の単クローン性抗体作成法に基づき得
られた抗ヒトファクターＩ単クローン性抗体、その製造
法、それを産生するハイブリドーマ細胞株、前記単クロ
ーン性抗体を利用したヒトファクターＩの定量法および
ヒトファクターＩの精製法に関するものである。
られた抗ヒトファクターＩ単クローン性抗体、その製造
法、それを産生するハイブリドーマ細胞株、前記単クロ
ーン性抗体を利用したヒトファクターＩの定量法および
ヒトファクターＩの精製法に関するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１） 免疫マウス脾細胞の調製 最終抗原濃度0.5mg/mlになるように、フロイントの完
全アジュバンドで1:1に希釈した精製ヒトファクターI
0.2mlの皮下注射により５週令のBalb/cマウスを免疫す
る。更に１週間おきに、フロイントの不完全アジュバン
トで1:1に希釈した精製ヒトファクターI 0.1mlで同様に
３回免疫した。最終免疫後３日目にマウスを殺し、無菌
的に脾臓を取り出す。
全アジュバンドで1:1に希釈した精製ヒトファクターI
0.2mlの皮下注射により５週令のBalb/cマウスを免疫す
る。更に１週間おきに、フロイントの不完全アジュバン
トで1:1に希釈した精製ヒトファクターI 0.1mlで同様に
３回免疫した。最終免疫後３日目にマウスを殺し、無菌
的に脾臓を取り出す。
脾臓を10％（v/v）の牛胎児血清、2mMのグルタミン、
10万I.U/lのペニシリン、0.1g/lのストレプトマイシン
および3.5g/lのグルコースを補充し重炭酸ナトリウムで
pHを7.2に調整したDulbecco′s Minimum Eagle Medium
（以下FCS−DMEM）中で、個々の脾細胞になるようにく
だいて懸濁する。
10万I.U/lのペニシリン、0.1g/lのストレプトマイシン
および3.5g/lのグルコースを補充し重炭酸ナトリウムで
pHを7.2に調整したDulbecco′s Minimum Eagle Medium
（以下FCS−DMEM）中で、個々の脾細胞になるようにく
だいて懸濁する。
（２） 骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス（Balb/c由来）骨髄腫細
胞株P3−X63−Ag8.653をFCS−DMEM中で継代し、融合当
日２×107以上の細胞数を確保する。
胞株P3−X63−Ag8.653をFCS−DMEM中で継代し、融合当
日２×107以上の細胞数を確保する。
（３） ハイブリドーマの作製 血清不含DMEMに懸濁した脾細胞と骨髄腫細胞を10:1の
細胞数比になるように混合し、1500×Ｇで５分間遠心す
る。上清を除去後、沈殿細胞をほぐし、予め37℃に加温
した50％ポリエチレングリコール（和光1540）1mlをゆ
っくりとかきまぜながら静かに加え、２分後に37℃に加
温した血清不含DMEM1mlをゆっくりとかきまぜながら加
える。同様に、8mlの血清不含DMEMを３分間でかきまぜ
ながら加える。1500×G5分間の遠心で細胞を沈殿させた
のち、48mlの20％FCS−DMEMに懸濁し24穴培養用プレー
トに1ml/穴ずつ分注し培養する。
細胞数比になるように混合し、1500×Ｇで５分間遠心す
る。上清を除去後、沈殿細胞をほぐし、予め37℃に加温
した50％ポリエチレングリコール（和光1540）1mlをゆ
っくりとかきまぜながら静かに加え、２分後に37℃に加
温した血清不含DMEM1mlをゆっくりとかきまぜながら加
える。同様に、8mlの血清不含DMEMを３分間でかきまぜ
ながら加える。1500×G5分間の遠心で細胞を沈殿させた
のち、48mlの20％FCS−DMEMに懸濁し24穴培養用プレー
トに1ml/穴ずつ分注し培養する。
融合して24時間後に各培養液の半分を２倍濃度のHAT
培地（0.1mMのヒポキサンチン、0.4μＭのアミノプテリ
ンおよび16μＭのチミジンを補充したFCS−DMEM）で置
換する。２〜３日間隔で新しいHAT培地ととりかえ、HAT
培地中で増殖しうるハイブリドーマを選択、維持する。
HAT培地は徐々にHT培地に変換し、更に徐々にFCS−DMEM
に変換する。
培地（0.1mMのヒポキサンチン、0.4μＭのアミノプテリ
ンおよび16μＭのチミジンを補充したFCS−DMEM）で置
換する。２〜３日間隔で新しいHAT培地ととりかえ、HAT
培地中で増殖しうるハイブリドーマを選択、維持する。
HAT培地は徐々にHT培地に変換し、更に徐々にFCS−DMEM
に変換する。
ハイブリドーマの十分な増殖が認められるウェルにつ
いて、培養上清中の抗体の存在の有無をファクターＩを
固相に吸着させたEnzyme−linked immunosorbent assay
法（ELISA法）によって検出する。抗体価の認められた
ウェルについて、限界希釈法によりクローニングを３〜
４回繰り返し、安定した抗体産生の認められたものを、
抗ヒトファクターＩ単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ株とし３−２−３、１−３−３、１−１−１、１−５
−３、３−６−１および２−５−２を選択する。
いて、培養上清中の抗体の存在の有無をファクターＩを
固相に吸着させたEnzyme−linked immunosorbent assay
法（ELISA法）によって検出する。抗体価の認められた
ウェルについて、限界希釈法によりクローニングを３〜
４回繰り返し、安定した抗体産生の認められたものを、
抗ヒトファクターＩ単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ株とし３−２−３、１−３−３、１−１−１、１−５
−３、３−６−１および２−５−２を選択する。
（４） 単クローン性抗体の調製 本発明の上記ハイブリドーマ細胞株は、栄養培地中
（FCS−DMEM）で大量培養可能であり、その培養上清液
から、単クローン性抗体を得ることができる。
（FCS−DMEM）で大量培養可能であり、その培養上清液
から、単クローン性抗体を得ることができる。
一方、抗体を大量に生産する方法として、ハイブリド
ーマ細胞株をマウス腹腔中に移植して腹水腫瘍として大
量増殖させる方法を採用できる。
ーマ細胞株をマウス腹腔中に移植して腹水腫瘍として大
量増殖させる方法を採用できる。
Balb/cマウスにプリスタン（2,6,10,14−テトラメチ
ルペンタデカン）を腹腔内投与し、10日後にハイブリド
ーマを腹腔内移植した。14〜21日後に腹水の貯留が認め
られ、血清および腹水中に高濃度（約１〜5mg/ml）の抗
体が生産される。
ルペンタデカン）を腹腔内投与し、10日後にハイブリド
ーマを腹腔内移植した。14〜21日後に腹水の貯留が認め
られ、血清および腹水中に高濃度（約１〜5mg/ml）の抗
体が生産される。
本発明の抗体は、培養上清、腹水から精製しないで使
用できるが、目的により精製することもできる。
用できるが、目的により精製することもできる。
すなわち、DEAE affi gel blue,Protamineagarose,Se
pharose CL−6B等のカラムクロマトグラフィーにより、
本抗体を殆んど純品にまで精製することができる。本発
明の単クローン性抗体３−２−３および１−３−３はIg
G1でありいずれも重鎖はγ１、軽鎖はκのクラスに属す
るものである。本発明の単クローン性抗体３−６−１は
IgG3であり重鎖はγ３、軽鎖はκのクラスに属するもの
である。また、本発明の単クローン性抗体１−１−１、
１−５−３および２−５−２はIgMであり、いずれも重
鎖はμ、軽鎖はκのクラスに属するものである。これら
の抗体はいずれもれもヒトファクターＩを認識するが、
ファクターＩ以外のヒト血清蛋白質、例えば血清アルブ
ミン、C3、ヒトファクターＢ、ヒトファクターＨ、トラ
ンスフェリン、プロパージンなどと交叉性を示さない非
常に特異性の高い性質を有しており、有用性にすぐれた
単クローン性抗体として使用できる。
pharose CL−6B等のカラムクロマトグラフィーにより、
本抗体を殆んど純品にまで精製することができる。本発
明の単クローン性抗体３−２−３および１−３−３はIg
G1でありいずれも重鎖はγ１、軽鎖はκのクラスに属す
るものである。本発明の単クローン性抗体３−６−１は
IgG3であり重鎖はγ３、軽鎖はκのクラスに属するもの
である。また、本発明の単クローン性抗体１−１−１、
１−５−３および２−５−２はIgMであり、いずれも重
鎖はμ、軽鎖はκのクラスに属するものである。これら
の抗体はいずれもれもヒトファクターＩを認識するが、
ファクターＩ以外のヒト血清蛋白質、例えば血清アルブ
ミン、C3、ヒトファクターＢ、ヒトファクターＨ、トラ
ンスフェリン、プロパージンなどと交叉性を示さない非
常に特異性の高い性質を有しており、有用性にすぐれた
単クローン性抗体として使用できる。
（５） 本発明単クローン性抗体の応用 本発明の抗体を用いることで精製が困難であったヒト
ファクターＩを、簡単に殆んど純品にまで精製すること
が可能である。たとえば、精製した本発明の抗体をaffi
gel 10（バイオラド社）ゲルに結合させ固相上に固定
化された抗体をもつゲルを作製する。このゲルに生体試
料を加え、試料中の抗原を抗体に結合させ、洗浄後、抗
体に結合した抗原のみを溶出させ、純品のヒトファクタ
ーＩを単離することができる。
ファクターＩを、簡単に殆んど純品にまで精製すること
が可能である。たとえば、精製した本発明の抗体をaffi
gel 10（バイオラド社）ゲルに結合させ固相上に固定
化された抗体をもつゲルを作製する。このゲルに生体試
料を加え、試料中の抗原を抗体に結合させ、洗浄後、抗
体に結合した抗原のみを溶出させ、純品のヒトファクタ
ーＩを単離することができる。
また、本発明の単クローン性抗体を用いて、生体試料
中のヒトファクターＩの定量を行うことができる。たと
えば、本発明の抗体２−５−２、１−１−１、１−５−
３のいずれかを結合した固相に、一定濃度の純品のヒト
ファクターＩを加え、一定時間保温ののちに洗浄する。
次に、酵素標識した１−３−３、３−２−３のいずれか
を加え、一定時間保温したのち洗浄し、酵素活性を測定
することにより検量線を求める。次に、純品のヒトファ
クターＩの代わりに生体試料を用いて、前述と同じ操作
を行ない検量線とてらし合わせることにより、生体試料
中のヒトファクターＩを定量することができる。酵素標
識のかわりに放射標識した抗体も使用可能である。もち
ろんこの定量法は一例をあげたもので、本発明を限定す
るものではない。
中のヒトファクターＩの定量を行うことができる。たと
えば、本発明の抗体２−５−２、１−１−１、１−５−
３のいずれかを結合した固相に、一定濃度の純品のヒト
ファクターＩを加え、一定時間保温ののちに洗浄する。
次に、酵素標識した１−３−３、３−２−３のいずれか
を加え、一定時間保温したのち洗浄し、酵素活性を測定
することにより検量線を求める。次に、純品のヒトファ
クターＩの代わりに生体試料を用いて、前述と同じ操作
を行ない検量線とてらし合わせることにより、生体試料
中のヒトファクターＩを定量することができる。酵素標
識のかわりに放射標識した抗体も使用可能である。もち
ろんこの定量法は一例をあげたもので、本発明を限定す
るものではない。
実施例１ ハイブリドーマ細胞株の生体内培養６週令の
Balb/cマウスにプリスタン（2,6,10,14−テトラメチル
ペンタデカン：アルドリッチ社）0.5ml/匹を腹腔内投与
後、ハイブリドーマ細胞株を107細胞／匹腹腔内へ投与
した。14〜21日後に貯留した腹水を採取し、2000×Ｇで
10分、100,000×Ｇで30分間遠心を行ない、単クローン
性抗体を含む上清液を集めた。この方法により、約１〜
10mg/mlの高濃度の単クローン性抗体３−２−３、１−
３−３、１−１−１、１−５−３、３−６−１および２
−５−２を含有する腹水を得た。
Balb/cマウスにプリスタン（2,6,10,14−テトラメチル
ペンタデカン：アルドリッチ社）0.5ml/匹を腹腔内投与
後、ハイブリドーマ細胞株を107細胞／匹腹腔内へ投与
した。14〜21日後に貯留した腹水を採取し、2000×Ｇで
10分、100,000×Ｇで30分間遠心を行ない、単クローン
性抗体を含む上清液を集めた。この方法により、約１〜
10mg/mlの高濃度の単クローン性抗体３−２−３、１−
３−３、１−１−１、１−５−３、３−６−１および２
−５−２を含有する腹水を得た。
実施例２ 腹水からの単クローン性抗体３−２−３、３
−６−１および１−３−３（IgGタイプ）の精製 常法にしたがい、DEAE Affi gel blue（バイオラド
社）ゲル200mlを20mM Tris−HCl（pH7.2）緩衝液で平衡
化し、それに同緩衝液で透析した実施例１で得られた腹
水を吸着させた。同緩衝液で充分洗浄後、0mMから100mM
のNaClのリニアーグラジェントのカラムクロマトグラフ
ィーにより、殆んど純品の精製単クローン性抗体３−２
−３を得た。同様にして、精製単クローン性抗体１−３
−２および３−６−１を得た。
−６−１および１−３−３（IgGタイプ）の精製 常法にしたがい、DEAE Affi gel blue（バイオラド
社）ゲル200mlを20mM Tris−HCl（pH7.2）緩衝液で平衡
化し、それに同緩衝液で透析した実施例１で得られた腹
水を吸着させた。同緩衝液で充分洗浄後、0mMから100mM
のNaClのリニアーグラジェントのカラムクロマトグラフ
ィーにより、殆んど純品の精製単クローン性抗体３−２
−３を得た。同様にして、精製単クローン性抗体１−３
−２および３−６−１を得た。
実施例３ 腹水からの単クローン性抗体１−１−１、１
−５−３および２−５−２（IgMタイプ）の精製 実施例１で得られた腹水を0.1M Na phosphate−80mM
NaCl（pH7.5）の緩衝液で透析した。これを同緩衝液で
平衡化したプロタミン−アガロースゲルに吸着させた後
に、同緩衝液で充分に洗浄した。次いで、1.1M NaClを
添加した同緩衝液により、単クローン性抗体１−１−１
を溶出することができた。この分画を濃縮し、Sepharos
e CL−6Bによるゲルろ過を行なったところ、殆んど純品
の単クローン性抗体１−１−１を得ることができた。他
の単クローン性抗体１−５−３および２−５−２につい
ても同様の方法により、殆んど純品の抗体を得ることが
できた。
−５−３および２−５−２（IgMタイプ）の精製 実施例１で得られた腹水を0.1M Na phosphate−80mM
NaCl（pH7.5）の緩衝液で透析した。これを同緩衝液で
平衡化したプロタミン−アガロースゲルに吸着させた後
に、同緩衝液で充分に洗浄した。次いで、1.1M NaClを
添加した同緩衝液により、単クローン性抗体１−１−１
を溶出することができた。この分画を濃縮し、Sepharos
e CL−6Bによるゲルろ過を行なったところ、殆んど純品
の単クローン性抗体１−１−１を得ることができた。他
の単クローン性抗体１−５−３および２−５−２につい
ても同様の方法により、殆んど純品の抗体を得ることが
できた。
実施例４ 単クローン性抗体３−２−３を用いたヒトフ
ァクターＩの精製 常法により、Affi gel 10アガロースゲル（バイオラ
ド社）1mlと前述の精製単クローン性抗体３−２−3 20m
gを４℃で４時間混合し、ゲルに抗体を結合させた。反
応後、未反応の抗体を洗浄し、さらに1Mのエタノールア
ミンで処理することにより抗体の固相への結合を完了さ
せた。この条件では、加えた抗体の90％が固相に結合し
ていた。
ァクターＩの精製 常法により、Affi gel 10アガロースゲル（バイオラ
ド社）1mlと前述の精製単クローン性抗体３−２−3 20m
gを４℃で４時間混合し、ゲルに抗体を結合させた。反
応後、未反応の抗体を洗浄し、さらに1Mのエタノールア
ミンで処理することにより抗体の固相への結合を完了さ
せた。この条件では、加えた抗体の90％が固相に結合し
ていた。
次にこの単クローン性抗体３−２−３結合アガロース
ゲル1mlを20mM Tris−HCl、0.14M NaCl（pH7.3）の緩衝
液で平衡化した。これに同緩衝液で透析したヒト血漿50
mlを吸着させ、血漿中のヒトファクターＩを抗体と結合
させた後、非結合物を洗浄し除去した。次に固相に結合
したヒトファクターＩを0.1Mglycine−HCl（pH3.0）で
溶出させ、殆んど純品のヒトファクターＩ約5mgが得ら
れた。
ゲル1mlを20mM Tris−HCl、0.14M NaCl（pH7.3）の緩衝
液で平衡化した。これに同緩衝液で透析したヒト血漿50
mlを吸着させ、血漿中のヒトファクターＩを抗体と結合
させた後、非結合物を洗浄し除去した。次に固相に結合
したヒトファクターＩを0.1Mglycine−HCl（pH3.0）で
溶出させ、殆んど純品のヒトファクターＩ約5mgが得ら
れた。
実施例５ 単クローン性抗体を用いたヒトファクターＩ
の定量 単クローン性抗体１−１−１、１−５−３および２−
５−２のうちいずれか一つを第１抗体として、100μg/m
lの濃度で96穴EIA用プレート（Nunc社）に100μl/穴ず
つ分注し、４℃で一夜放置した。次いで、0.1％ツイー
ン20を含有する0.1M PBS（リン酸緩衝液）にて３回洗浄
した後、１％牛血清アルブミン/PBS100μｌを加え、４
℃で一夜放置し、各ウェルのブロッキングを行なった。
0.1％ツイーン20/PBSで十分洗浄後、一定量のヒトファ
クターＩを100μl/穴ずつ分注し、室温に２時間放置し
た。0.1％ツイーン20/PBSで十分洗浄後、第２抗体とし
てペルオキシダーゼを結合した単クローン性抗体３−２
−３および１−３−３のうちのいずれか一つ100μg/ml
を100μl/穴ずつ分注し、室温にて２時間放置した。同
緩衝液にて洗浄後、基質液〔2.5mM ABTS｛2,2′−アジ
ノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６′−スルホン
酸｝、5mM H2O2、0.1mMリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.
0）〕を100μl/穴ずつ加え、室温にて１時間反応させ
た。
の定量 単クローン性抗体１−１−１、１−５−３および２−
５−２のうちいずれか一つを第１抗体として、100μg/m
lの濃度で96穴EIA用プレート（Nunc社）に100μl/穴ず
つ分注し、４℃で一夜放置した。次いで、0.1％ツイー
ン20を含有する0.1M PBS（リン酸緩衝液）にて３回洗浄
した後、１％牛血清アルブミン/PBS100μｌを加え、４
℃で一夜放置し、各ウェルのブロッキングを行なった。
0.1％ツイーン20/PBSで十分洗浄後、一定量のヒトファ
クターＩを100μl/穴ずつ分注し、室温に２時間放置し
た。0.1％ツイーン20/PBSで十分洗浄後、第２抗体とし
てペルオキシダーゼを結合した単クローン性抗体３−２
−３および１−３−３のうちのいずれか一つ100μg/ml
を100μl/穴ずつ分注し、室温にて２時間放置した。同
緩衝液にて洗浄後、基質液〔2.5mM ABTS｛2,2′−アジ
ノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６′−スルホン
酸｝、5mM H2O2、0.1mMリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.
0）〕を100μl/穴ずつ加え、室温にて１時間反応させ
た。
比色計にて415nmの吸光度を測定した。その結果、第
１図に示すような検量線が得られ、数ngを限界として、
ヒトファクターＩの定量を行なうことができた。また、
ここに示したのとは、別の組み合わせで、ヒトファクタ
ーＩの定量が可能であり、また酵素免疫法のほかに、ラ
ジオイムノアッセイにも応用できる。
１図に示すような検量線が得られ、数ngを限界として、
ヒトファクターＩの定量を行なうことができた。また、
ここに示したのとは、別の組み合わせで、ヒトファクタ
ーＩの定量が可能であり、また酵素免疫法のほかに、ラ
ジオイムノアッセイにも応用できる。
実施例６ 単クローン性抗体の認識部位 精製ヒトファクターＩは、分子量50,000のＨ鎖と38,0
00のＬ鎖がジスルフイド結合（Ｓ−Ｓ結合）したもので
あるが、本発明の単クローン性抗体がいずれの鎖を認識
するのかについて、ELISA法にて調べた。
00のＬ鎖がジスルフイド結合（Ｓ−Ｓ結合）したもので
あるが、本発明の単クローン性抗体がいずれの鎖を認識
するのかについて、ELISA法にて調べた。
なお、Ｈ鎖とＬ鎖は、ヒトファクターＩをβ−メルカ
プトエタノールにて還元後、遊離したSH基をモノヨード
酢酸にてブロックし、高速液体クロマトグラフィーによ
るゲルろ過を行ない分離精製し用いた。
プトエタノールにて還元後、遊離したSH基をモノヨード
酢酸にてブロックし、高速液体クロマトグラフィーによ
るゲルろ過を行ない分離精製し用いた。
ヒトファクターＩを10μg/mlの濃度で96穴EIA用プレ
ートに100μl/穴ずつ分注し、４℃にて一夜放置した。
次いで、0.1％ツイーン20含有PBSにて３回洗浄した後、
１％牛血清アルブミン/PBS200μｌを加えブロックし
た。同緩衝液にて洗浄後、ヒトファクターＩ、Ｈ鎖およ
びＬ鎖のそれぞれの溶液と単クローン性抗体とを同時に
上記プレートに入れ、室温にて４時間放置した。上記と
同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した２次抗体（抗
マウスイムノグロブリン）を加え、室温にて２時間放置
した。同緩衝液にて洗浄後、基質液〔2.5mM ABTS,5mM H
2O2,0.1mMリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）〕を100μl
/穴ずつ加え、室温にて１時間反応させ、比色計にて415
nmの吸光度を測定した。その結果、第１表に示すごと
く、単クローン性抗体１−３−３はＨ鎖と、２−５−２
はＬ鎖と結合することがわかった。また、３−２−３、
１−１−１、３−６−１および１−５−３はいずれのフ
ラグメントとも結合しなかった。
ートに100μl/穴ずつ分注し、４℃にて一夜放置した。
次いで、0.1％ツイーン20含有PBSにて３回洗浄した後、
１％牛血清アルブミン/PBS200μｌを加えブロックし
た。同緩衝液にて洗浄後、ヒトファクターＩ、Ｈ鎖およ
びＬ鎖のそれぞれの溶液と単クローン性抗体とを同時に
上記プレートに入れ、室温にて４時間放置した。上記と
同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した２次抗体（抗
マウスイムノグロブリン）を加え、室温にて２時間放置
した。同緩衝液にて洗浄後、基質液〔2.5mM ABTS,5mM H
2O2,0.1mMリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）〕を100μl
/穴ずつ加え、室温にて１時間反応させ、比色計にて415
nmの吸光度を測定した。その結果、第１表に示すごと
く、単クローン性抗体１−３−３はＨ鎖と、２−５−２
はＬ鎖と結合することがわかった。また、３−２−３、
１−１−１、３−６−１および１−５−３はいずれのフ
ラグメントとも結合しなかった。
実施例７ 単クローン性抗体の特性 ヒトファクターＩによる免疫複合体の不活化活性は、
補体依存性のウサギ抗体感作ヒツジ赤血球（EA cell）
溶血反応の抑制を指標として測定できる。前述の精製単
クローン性抗体を0.01M EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）−GVB（ゲラチンベロナール緩衝液）pH6.2にて希釈
し、ヒトファクターＩと37℃、２時間反応させた。次
に、ヒトファクターＨの存在下、ヒト補体C4,C3結合EA
cell（EAC 43 cell）と37℃、45分間反応させた。0.5mM
Mg2+・0.15mM Ca2+を含むグルコースゲラチンベロナー
ル緩衝液pH7.4（DGVB++）にて赤血球を洗浄後、同緩衝
液に懸濁させ、補体成分B,P,Dを加え30℃にて30分間、
さらにヒト補体成分C5,C6,C7,C8,C9を加え、37℃にて１
時間反応させた。反応後、2500rpm、５分遠心を行な
い、上清の414nmにおける吸光度を測定することにより
溶血度の値を求めた。その結果、単クローン性抗体３−
２−３および１−３−３は濃度依存的にヒトファクター
Ｉ活性を阻害し、第１表に示すごとく単クローン性抗体
３−２−３は最大100％、１−３−３は最大50％阻害し
た。単クローン性抗体１−１−１、２−５−２および１
−５−３については阻害活性は認められなかった。
補体依存性のウサギ抗体感作ヒツジ赤血球（EA cell）
溶血反応の抑制を指標として測定できる。前述の精製単
クローン性抗体を0.01M EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）−GVB（ゲラチンベロナール緩衝液）pH6.2にて希釈
し、ヒトファクターＩと37℃、２時間反応させた。次
に、ヒトファクターＨの存在下、ヒト補体C4,C3結合EA
cell（EAC 43 cell）と37℃、45分間反応させた。0.5mM
Mg2+・0.15mM Ca2+を含むグルコースゲラチンベロナー
ル緩衝液pH7.4（DGVB++）にて赤血球を洗浄後、同緩衝
液に懸濁させ、補体成分B,P,Dを加え30℃にて30分間、
さらにヒト補体成分C5,C6,C7,C8,C9を加え、37℃にて１
時間反応させた。反応後、2500rpm、５分遠心を行な
い、上清の414nmにおける吸光度を測定することにより
溶血度の値を求めた。その結果、単クローン性抗体３−
２−３および１−３−３は濃度依存的にヒトファクター
Ｉ活性を阻害し、第１表に示すごとく単クローン性抗体
３−２−３は最大100％、１−３−３は最大50％阻害し
た。単クローン性抗体１−１−１、２−５−２および１
−５−３については阻害活性は認められなかった。
一方、単クローン性抗体３−６−１はヒトファクター
Ｉ活性を濃度依存的に上昇させ、最大196％に上昇させ
た。
Ｉ活性を濃度依存的に上昇させ、最大196％に上昇させ
た。
第１図は、酵素免疫測定法を用いたヒトファクターＩの
検量線を示す。横軸は、ヒトファクターＩの含有量を示
し、縦軸は415nmの吸光度を示す。
検量線を示す。横軸は、ヒトファクターＩの含有量を示
し、縦軸は415nmの吸光度を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトファクターＩに対して特異性を有し、
ヒトファクターＩの活性を上昇させることを特徴とする
単クローン性抗体。 - 【請求項２】単クローン性抗体が３−６−１である、特
許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7406286 | 1986-03-31 | ||
| JP61-74062 | 1986-03-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6352891A JPS6352891A (ja) | 1988-03-07 |
| JP2593865B2 true JP2593865B2 (ja) | 1997-03-26 |
Family
ID=13536331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62035311A Expired - Lifetime JP2593865B2 (ja) | 1986-03-31 | 1987-02-18 | ヒトファクターｉに対する単クローン性抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2593865B2 (ja) |
-
1987
- 1987-02-18 JP JP62035311A patent/JP2593865B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｊ．，Ｖｏｌ．２０３，Ｐ．２９３−２９８（１９８２） |
| Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６５，Ｐ．２１１−２２４（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6352891A (ja) | 1988-03-07 |
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