JPS6352891A - ヒトファクターｉに対する単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なハイブリドーマ細胞株から分泌されるヒ
ト補体活性制御因子ファクターＩ（以下、「ヒトファク
ター１」という）に対する単クローン性抗体に関する。

補体活性制御因子の一つであるヒトファクターエは、他
の補体活性調節因子とともに、免疫複合体の不活性化に
関与し、その動態は自己免疫性疾患との関連でＭ３とな
ってきている。したがって、ヒトファクターＩに対する
特異抗体は、自己免疫性疾患の診断用として、生体試料
中に存在するヒトファクターエをイムノアッセイ的手法
により高感度に定量する方法に使用できる。また、ヒト
ファクターエは、生体試料中微量にしか存在せず不安定
であることから、精製操作の困難さおよび繁雑さを招い
ており、より高度かつ簡単な分離精製操作が要求されて
いる。その有効な解決方法として抗体アフィニティーク
ロマトグラフィーが適している。

以上の目的から、ヒトファクターＩに対して高い特異性
と結合能を有する抗体を大量に得る必要がある。この要
求を満たす手段として、抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細
胞融合させてハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、こ
れを培養することにより単クローン性抗体を生産すると
いう、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

６、２９２（１９７６）　）の方法が知られている。

本発明は、上述の単クローン性抗体作成法に基づき得ら
れた抗ヒトファクターＩ単りローン性抗体、その製造法
、それを産生ずるハイブリドーマ細胞株、前記単クロー
ン性抗体を利用したヒトファクターＩの定量法およびヒ
トファクター１の精製法に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

＋１１　　免疫マウス牌細胞の調製 ５週令のＢａ１ｂ／ｃマウスを最終抗原濃度ｏ、５ｍｙ
／１１になるように、フロイントの完全アジュバントで
１：１に希釈した精製ヒトファクターＩＯ，２ｇ／の皮
下注射により免疫する。更に１周問おきに、フロイント
の不完全アジュバントで１＝１に希釈した精製ヒトファ
クターＩＯ，１ｇ／　　で同様に３回免疫した。最終免
疫後３日でマウスを殺し、無菌的にｎ臓を取り出す。

牌臓を１０　＊　（Ｖ／ｖ　）の牛胎児血清、２　ｍＭ
のグルタミン、１０万１．Ｕ／ｌのペニシリン、０１ｙ
／１のストレプトマイシンおよび３．５９／ｌのグルコ
ースを補充し重炭酸ナトリウムでｐＨを７．２に調整し
たＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅａｇ
ｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（以下ＦＣ８−ｎＭｇＭ）中で、個
々の牌細胞になるようにくだいて懸濁する。

（２）　骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａ１ｂ／ｃ由来）骨随
腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−λｇ　８．６５３をＦｅ２−Ｄ
ＭＥＭ中で継代し、融合当日２　Ｘ　１０７以上の細胞
数を確保する。

（３）　　ハイブリドーマの作製 血清不含ＤＭＥＭ　Ｋ懸濁した牌細胞と骨髄腫細胞を１
０：１の細胞数比になるように混合し、１５００ＸＧで
５分間遠心する。上清を除去後、沈殿細胞をほぐし、予
め３７℃に加温した５０％ポリエチレングリコール（和
光１５４０　）１　ｙｉｌをゆっくりとかきまぜながら
静かに加え、２分後に３７　℃に加温した血清不含ＤＭ
ＥＭ　１　ｘｉをゆっくりとかぎまぜながら加える。同
様に、８　ｔｓｌの血清不含ＤＭＢＭを３分間でかきま
ぜながら加える。

１５００ＸＧ　５分間の遠心で細胞を沈殿させたのち、
４８ｄの２０％ＦＣ３−ＤＭＥＭに懸濁し２４穴培養用
プレートに１　ｍｌ　／穴ずつ分注し培養する。

融合して２４時間後に各培養液の半分を　２倍濃度のＨ
ＡＴ培地（０，１ｍＭのヒボキサンチン、０．４μＭの
アミノプテリンおよび１６μＭのチミジンを補充したＦ
ｅ２−ＤＭＥＭ　）で置換する。２〜３日間隔で新しい
ＨＡＴ　ｙ０＠地ととりかえ、Ｉ（人Ｔ培地中で増殖し
うるハイブリドーマを選択、維持する。ＨＡＴ培地は徐
々にＨＴ培地に変換し、更に徐々にＦｅ２−ＤＭＥＭに
変換する。

ハイブリドーマが十分に増殖し、培地が黄変したら、培
養上滑中の抗体の存在の有無をファクターＩＹ固相に吸
着させたＥｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｒｒｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ法（ｐｒ、ｔｓｌ法）によっ
て検討する。抗体価の認められたウェルについて、限界
希釈法によりクローニングを３〜４回繰り返し、安定し
た抗体産生の認められたものな、抗ヒトファクターエ単
りローン性抗体産生ハイ−プリドーマ株とじ３−２−３
、３−３−３、３−１−１、？−５−３．３−６−１　
　および２−５−２　　を選択する。

（４）　　単クローン性抗体の調製 本発明の上記ハイブリドーマ細胞株は、栄養培地中（Ｆ
ｅ２−ＤＭＥＭ　）で大蓋増養・増殖可能であり、その
培養土清液から、単クローン性抗体を得ることができる
。

一方、抗体を大量に生産する方法として、ハイブリドー
マ細胞株をマウス腹腔中に移植して腹水腫瘍として大量
増殖させる方法を採用できる。

ｎａｌｂ／ｃマウスにプリスタン（２１６＋　１０１　
＝４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、１
０日後にハイブリドーマを腹腔内移植した。

１４〜２１日後に腹水の貯留が認められ、血清および腹
水中に高濃度（約１〜５η／ｇ／）　　の抗体が生産さ
れる。

本発明の抗体は、培養上清、腹水から精製しないで使用
できるが、目的によりＭ製することもできる。

すなわち、ＤＥＡＥ　ａｆｆｉ　ｇｅｔ　ｂｌｕｅ、　
Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ−ａｇａｒｏｓｅ、　５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ等のカラムクロマトグラフィーによ
り、本抗体を殆んど純品にまで精製することができる。

本発明の単クローン性抗体３−２−３および１−３−３
はＩｇＧ１でありいずれも重鎮はγ１、軽鎖は左のクラ
スに属するものである。本発明の単クローン性抗体３−
６−１は１ｇＧ５であり１鎖はγ５、軽鎖は大のクラス
に属するものである。また、本発明の単クローン性抗体
１−１−１、３−５−３および２−５−２はＩｇＭであ
り、いずれもＭ鎖はμ、軽鎖はｋのクラスに属するもの
である。これらの抗体はいずれもヒトファクターエを認
識するが、ファクターｌ以外のヒト血清蛋白質、例えば
血清アルブミン、Ｃ３、ヒトファクターＢ、　ヒトファ
クターＨ，トランスフェリン、プロパージンなどと交叉
性を示さない非常に特異性の高い性質を有しており、有
用性にすぐれた単クローン性抗体として使用できる。

（５１本発明単クローン性抗体の応用 本発明の抗体を用いることで精製が困難であったヒトフ
ァクターエな、簡単に殆んど純品にまで精製することが
可能である。たとえば、ａｆｆｉ　ｇｅｌ　１０　（バ
イオラド社）に精製した本発明の抗体を結合させ固相上
に固定化された抗体をもつゲルを作製する。このゲルに
生体試料を加え、試料中の抗原を抗体に結合させ、洗浄
後、抗体に結合した抗原のみを溶出させ、純品のヒトフ
ァクターＩを単離することができる。

また、本発明の単クローン性抗体を用いて、生体試料中
のヒトファクターＩの定量を行なうことができる。たと
えば、本発明の抗体２−５−２、３−１−１、３−５−
３のいずれかを結合した固相に、量のわかった純品のヒ
トファクター■を加え、一定時間保温ののち忙洗沙する
。次に、酵素標識した１−３−３，３−２−３のいずれ
かを加え、一定時間保温したのち洗浄し、酵素活性を測
定することにより検量線を求める。次に、純品のヒトフ
ァクターエの代わりに生体試料を用いて、前述と同じ操
作を行ない検量線とてらし合わせることにより、生体試
料中のヒトファクター１を定量することができる。酵素
標識のかわりに放射能標識をしておいてもよい。もちろ
んこの定量法は一例をあげたもので、本発明を限定する
ものではない。

実施例１　ハイブリドーマ細胞株の生体内培養６週令の
Ｂａ１ｂ／ｃマクスにブリスタン（２゜６、１０、３４
−テトラメチルペンタデカン：アルドリッチ社）０．５
ｇｔ／匹を腹腔内投与後、バイブリド−・マ細胞株をＩ
Ｑ７細胞細胞７腔腹腔内与した。１４〜２１日後に貯留
した腹水を採取し、２０００　Ｘ　Ｇで１０分、１０Ｇ
、０ＯＯＸＧで３０分間遠心を行ない、単クローン性抗
体を含む上清液を集めた。この方法により、約１〜１０
”ｆｌ／ｍｌの高濃度の単クローン性抗体３−２−３、
３−３−３、３−１−１、３−５−３．３−６−１およ
び２−５−２　を含有する腹水を得た。

実施例２　腹水からの単クローン性抗体３−２−３．３
−６−１および１−１−３−３（Ｉタイプ）の精製 常法圧したがい、ＤＥＡＥ　Ａｆｆｉ　ｇｅｌ　ｂｌｕ
ｅ　　（バイオラド社）ゲル２００ｓ＋ｌを２０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，２）緩衝液で平衡化し、　
それに同緩衝液で透析した実施例１で得られた腹水を吸
着させた。同緩衝液で充分洗浄後、ＯｍＭから１００ｍ
ＭのＮａＣＪのりニア−グラジェントのカラムクロマト
グラフィーにより、殆んど純品のＭ製単りローン性抗体
３−２−３を得た。同様にして、精製単クローン性抗体
１−３−２および３−６−１を得た。

実施例３　腹水からの単クローン性抗体１−１−１、３
−５−３および２−２−５−２（Ｉタイプ）の精製 実施例１で得られた腹水を０、３　Ｍ　Ｎａｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ−８０ｍＭ　Ｎａｃｊ　（ｐＨ７，５）の緩衝
液で透析した。

これを同緩衝液で平衡化したプロタミン−アガロースゲ
ルに吸着した後に、同緩衝液で充分に洗浄した。次いで
、　　１、３　Ｍ　ＮａＣｊを添加した同緩衝液で流す
と、単クローン性抗体１−１−１が溶出された。この分
画を濃縮し、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂによるゲ
ルろ過を行なったところ、殆んど純品の単クローン性抗
体１−１７４を得ることができた。他の単クローン性抗
体１−５−３および２−５−２についても同様の方法に
より、殆んど純品の抗体を得ることができた。

実施例４　単クローン性抗体３−２−３を用いたヒトフ
ァクターＩの精製 常法により、Ａｆｆｉ　ｇｅｌ　１０アガロースゲル（
バイオラド社）１ｍ／と前述の精製単クローン性抗体３
３−２−３２０Ｉ１を４℃で４時間混合し、ゲルに抗体
を結合させた。反応後、未反応の抗体を洗浄し、さらに
１Ｍのエタノールアミンで処理すること忙より抗体の固
相への結合を完了させた。この条件では、加えた抗体の
９０　％が固相に結合していた。

次にこの単クローン性抗体３−２−３結合アガロースゲ
ル１１１１を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、０、
３４ＭＮａＣ１（ｐＨ７，３）の緩衝液で平衡化した。

　これに同緩衝液で透析したヒト血漿５０１１を吸着し
、血漿中のヒトファクターＩを抗体と結合させた後、非
結合物を洗浄し除去した。次に固相に結合したヒトファ
クターＩを０、３　Ｍ　ｇｌｙｃｉｎｅ　−）ＩＣＪ（
ｐＨ３，０）で溶出させ、殆んど純品のヒトファクター
エ約５　Ｑが得られた。

実施例５　単クローン性抗体を用いたヒトファクターＩ
の定量 単クローン性抗体１−１−１、３−５−３および２−５
−２のうちいずれか一つを第１抗体として、１００ａ９
／ｍｌの濃度で９６穴ＥＩＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社）
に１００μｌ／穴ずつ分注し、４でで　−夜装置した。

次いで、０、３％ツイーン２ｏを含有するＱ、Ｉ　Ｍ　
ＰＨ１（ＩＪン酸緩衝液）にて３回洗浄した後、１％牛
血清アルブミン／ｐＢｓ１０ｏμ！を加え、４℃で一夜
放置し、プレート穴のブロックを行なった。０、３％ツ
イーン２０／ＰＢＳでよく洗浄後、一定量のヒトファク
ターＩを１００μｊ／穴ずつ分注し、室温に２時間放置
した。０、３％ツイーン２０／ＰＢＳでよく洗浄後、第
２抗体としてペルオキシダーゼを結合した単クローン性
抗体３−２−３および１−３−３のうちのいずれか一つ
１００μＶ／Ｉｌをｌ０ｒＪμｌ／穴ずつ分注し、　室
温にて２時間放置した。同緩衝液にて洗浄後、基質液Ｃ
２，５ｍＭ　ＡＢＴＳ　（２，２’−アジノジ（３−エ
チルベンズチアゾリン）−６′−スルホン酸）、５ｍＭ
Ｈ２Ｏ２，０，１ｍＭリン酸−クエン醒緩＠　’Ｆｉｔ
ｌｙ　（ｐＨ４，０））を１００μｌ／穴ずつ加え、室
温にて１時間反応させた。

比色計にて４１５ｎｍの吸光度を測定した。　その結果
、第１図に示すような検ｉｍが得られ、数ｎ９を限界と
して、ヒトファクターＩの定量ン行なうことができた。

また、ここに示したのとは、別の組み合せで、ヒトファ
クターＩの定量が可能であり、また酵素免疫法のほかに
、ラジオイムノアッセイにも応用できる。

実施例６　単クローン性抗体の認識部位Ｍ製ヒトファク
ターＩは、分子ｔ５ｏ、ｏｏｏのＨ鎖と３８．ＯＯＱの
Ｌ鎖がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）したものである
が、本発明の単クローン性抗体がいずれの鎖を認識する
のかを、ＥＬＩＳ人法にて調べた。

なお、ＨｅとＬ鎖は、ヒトファクターＩをβ−メルカプ
トエタノールにて還元後、遊離したＳＨ基をモノヨード
酢酸にてブロックし、高速液体クロマトグラフィーによ
るゲルろ過を行ない分離Ｍ製し用いた。

ヒトファクターＩを１０μＩ　／ｍｌの１度で９６穴Ｅ
ＩＡ用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、４″Ｃに
て一夜放置した。次いで、Ｑ、１９６ツイーン２０含Ｗ
　ＰＢＳにて３回洗浄した後、１％牛血清アルブミン／
ＰＢ８２００μ！を加えブロックした。同緩衝液にて洗
浄後、ヒトファクター■、Ｈ鎖およびＬ＠のそれぞれの
溶液と単クローン性抗体とを同時に上記プレートに入れ
、室温にて４時間放置した。上記と同様に洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識した２次抗体（抗マウスイムノグロブ
リン）を加え、室温にて２時間放置した。同緩衝液にて
洗浄後、基質液（２，５ｍＭ　ＡＲＴＳ、　５ｍＭ　Ｈ
２Ｏ２，０１１ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４，
０））を１００μｌ／穴ずつ加え、　室温にて１時間反
応させ、比色計にて４１５ｎｍの吸光度を測定した。そ
の結果、第１表に示すごとく、単クローン性抗体１−３
−３はＨ鎖と、２−５−２はＬ鎖と結合することがわか
った。また、１−２−３、３−１−１．３−６−１およ
び１−５−３はいずれのフラグメントとも結合しなかっ
た。

／′ ／′。

第１表 実施例７　単クローン性抗体の特性 ヒトファクターＩによる免疫抜合体の不活化活性は、補
体依存性のウサギ抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ　ｃｅｌ
ｌ　）溶血反応の抑制を指標として測定できる。前述の
槓製単クローン性抗体を０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ　（！
チレンジアミン四酢酸）　−ＧＶＢ（ゲラチンベロナー
ル緩衝液）ｐＨ６，２にて８釈し、ヒトファクターＩと
３７で、２ｆ４間反応させた。次に、ヒトファクターＨ
の存在下、ヒト袖体Ｃ４，Ｃ３結合ＥＡ　ｃｅｌｌ　−
（ＥＡＣ４３ｃｅｌｌ　）と３Ｔ″Ｃ１４５分間反応さ
せた。０．５ｍＭＭｇ２”　・０、３５ｍＭ　Ｃａ２＋
を含むグルコースゲラチンペロナール緩衝油ｐＨ７，４
（ＤＣＶＢ＋　）にて赤血球を洗浄後、同緩衝液忙懸濁
させ、補体成分Ｂ、Ｐ、Ｄを加え３０℃にて３０分間、
さらにヒト補体成分Ｃ５゜Ｃ６，Ｃ７，ＣＢ、　Ｃ９を
加え、３７″Ｃにて１時間反応させた。反応後、２５Ｇ
Ｏｒｐｍ、５分遠心を行ない、上清の４１４ｎｍにおけ
る吸光度を測定することにより浴血度の値を求めた。そ
の結果、単クローン性抗体３−２−３および１−３−３
は濃度依存的にヒトファクター１活性を阻害し、第１表
に示すごとく単クローン性抗体３−２−３は最大１００
％、１−３−３は最大５０％阻害した。単クローン性抗
体１−１−１．２−５−２および１−５−３については
阻害活性は認められなかった。

一方、単クローン性抗体３−６−１はヒトファクターエ
活性を濃度依存的に上昇させ、最大１９６％に上昇させ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素免疫測定法を用いたヒトファクターＩの
検量線を示す。横軸は、ヒトファクター１の含有量を示
し、縦軸は４１５ｎｍの吸光度を示す。 特許出該人　三共株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト補体活性制御因子ファクター I に対して特異
   性を有する単クローン性抗体。 ２、単クローン性抗体が１−１−１、１−３−３、１−
   ５−３、２−５−２、３−２−３および３−６−１であ
   る特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。 ３、ヒト補体活性制御因子ファクター I に対して活性
   を阻害する特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗
   体。 ４、単クローン性抗体が３−２−３および１−３−３で
   ある特許請求の範囲第３項記載の単クローン性抗体。 ５、ヒト補体活性制御因子ファクター I に対して活性
   を上昇させる特許請求の範囲第１項記載の単クローン性
   抗体。 ６、単クローン性抗体が３−６−１である特許請求の範
   囲第５項記載の単クローン性抗体。 ７、ヒト補体活性制御因子ファクター I に対して特異
   性を有する単クローン性抗体を分泌するハイブリドーマ
   細胞株。 ８、単クローン性抗体が１−１−１、１−３−３、１−
   ５−３、２−５−２、３−２−３および３−６−１であ
   る特許請求の範囲第７項記載のハイブリドーマ細胞株。 ９、ハイブリドーマ細胞株が細胞株１−１−１、１−３
   −３、１−５−３、２−５−２、３−２−３および３−
   ６−１である特許請求の範囲第７項または第８項記載の
   ハイブリドーマ細胞株。 １０、ハイブリドーマ細胞株を培養し、産生される抗体
   を回収することを特徴とするヒト補体活性制御因子ファ
   クター I に対して特異性を有する単クローン性抗体の
   製法。 １１、単クローン性抗体が１−１−１、１−３−３、１
   −５−３、２−５−２、３−２−３および３−６−１で
   ある特許請求の範囲第１０項記載の製法。 １２、ハイブリドーマ細胞株が細胞株１−１−１、１−
   ３−３、１−５−３、２−５−２、３−２−３および３
   −６−１である特許請求の範囲第１０項または第１１項
   記載の製法。 １３、ヒト補体活性制御因子ファクター I に対して特
   異性を有する単クローン性抗体を固相と結合させ、次い
   でそれに生体試料を加えてそれに含まれているヒト補体
   活性制御因子ファクター I と前記単クローン性抗体と
   を結合させ、次いでヒト補体活性制御因子ファクター
   I を固相から分離することを特徴とするヒト補体活性制
   御因子ファクター I を単離精製する方法。 １４、単クローン性抗体が１−１−１、１−３−３、１
   −５−３、２−５−２、３−２−３および３−６−１で
   ある特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、ヒト補体活性制御因子ファクター I と放射能標
   識または酵素標識した単クローン性抗体とを用いて、生
   体試料中に含まれるヒト補体活性制御因子ファクター
   I を定量する方法。 １６、単クローン性抗体が１−１−１、１−３−３、１
   −５−３、２−５−２、３−２−３および３−６−１で
   ある特許請求の範囲第１５項記載の方法。