SE465573B - Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor - Google Patents

Description

5 10 15 20 35 llåß 573 n annan peptid som omfattas av uppfinningen har följande formel: Gly-Asp-Lys-'llir-Thr-Ala-'Iltr-Asp-lle-Lys-Gly-Lys-Glu, och denna peptid motsvarar en konserverad region i NGF-proteinet motsvarande aminosyrerestema 23 till 35 i moget NGF-protein. Prov genomförda i samband med forskning ledande till denna uppfmning visar att antikroppar bildade mot denna peptid igenkänner nativt NGF-protein.

Relevanta antikroppar kan vara riktade antingen mot någon av peptidema beskrivna ovan eller mot både sådana peptider och nativt NGF.

Antikropparna kan vara antingen polyklonala eller monoklonala.

Uppfinninen omfattar även ett förfarande för bestämning av närvaro av moget NGF eller dess prekursor i biologiskt prov- material. Nämna förfarande är baserat på interaktion mellan an- tikroppar erhållna genom immunisering mot en peptid enligt upp- fínníngen eller NGF eller dess prekursor. Sådan bestämning kan ,vara kvalitativ eller kvantitativ beroende på vilken typ av diagnos som utförs och syftet med bestämningen.

Provmaterialet för sådan bestämning kan vara hjärnvävnad från däggdjur inklusive hjärnvävnad av humant ursprung.

I det följande, när hänsyftning göres till levande djur eller levande däggdjur avses termema inkludera även människa.

Denna uppfinning kommer att illustreras vidare nedan med hänvisning till bilagda ritningar, där: Fig. 1A visar homolog antikroppsbindning till NGF-peptider såsom en funktion av antiserum koncentration; Fig. IB visar binding av affirtitetsrenade peptidanfilcoppar till deras homologa peptider som en funktion of koncentration av immunoglobulinema (Ig); Fig. IC visar antikroppsbinding till olika NGF-peptider såsom en funktion av antiserum koncentration; Fig. 2A visar bindning av antikroppar mot peptider till ß-NGF-proteinet som en funktion av koncentration av de affinitetsrenade immunoglobulinerna; Fig. 2B visar en jämförelse av hur olika antisera mot ß-NGF binds till NGF-peptid P3; och .

Fig. 2C visar hur ett antiserum mot mus ß-NGF binds till olika syntetiska NGF-peptider. 10 15 20 35 465 573 EXEMPEL 1 Syntes av NGF-peptider Hydrofila partier utvalda med hjälp av hydrofilicitetsvärden (TP Hopp och KR Woods (1981): Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. N atl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828) i proNGF och moget NGF utvaldes för peptidsyntes (Tabell I). Peptiderna P1 till P6 syntetiserades av Cambridge Research Biochemicals Ltd., England, med en beräknad renhet bättre än 80% kontrollerade genom aminosyreanalys, HPLC och masspektrometri.

Peptiderna P7 och P8 syntetiserades vänligen av Doktorema Tamas Bartfai och Ianis Abens vid Arrheniuslaboratoriet, Biokemiska institutionen, Stockholms universitet. Likheter med andra proteinsekvenser än NGF för var en av dessa peptider kontrollerades med hjälp av ”GeneBank” utan att några omfattande likheter kunde upptäckas utom för NGF.

EXEMPEL 2 Konjugeríng och produktion av peptidantikroppar Alla peptider konjugerades till "keyhole limpet hemocyanin CKLHY' före användning för immunisering. KLH (8-10 mg) kopplades för varje konjugering med 3-10 mg peptid. Kopplingar-na uppnåddes med m-maleimidobenzoic acid N- hydroxy-succinintide eller N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate för att erhålla N-terminalt bundna konjugat av Pl-PS och P7-P8 och ett C-terniinalt bundet konjugat av P6. Efter dialysis användes peptid-KLH-konjugaten för att immunisera kaniner (Tabell II). Varje kanin erhöll en initial dos på ca. 400 pg konjugat i Freunds kompletta adjuvans intramuskulärt såväl som via multipla intradermala injektioner. Efter en månad erhöll kaninerna fyra boosterinjektioner med en veckas mellanrum, var och en bestående av ca. 200 pg konjugat i inkomplett adjuvans före avlivning.

Rening av antikroppar Affinitetskolonner tillverkades för var och en av de 8 peptiderna, 3 ml ECH-sepharos 4B (Pharmacia) kopplades med 2 mg peptid (koppling via en förlängningsarm till antinogrupper) med hjälp av N-etyl-N-(3- dimetylanñnopropyD-carbodiimid hydroklorid enligt tillverkarens instruktioner. Varje gel packades i en liten kolonn och antiserum spätt 15-faldigt i 0,1 M Tris-HCl (pH 8) med 0,5 M NaCl fick passera flera gånger genom kollonen.

I flertalet fall hade antiserumet först passerat en annan kolonn innehållande en ' icke besläktad peptid för att avlägsna eventuella icke spedfikt bindande komponenter. Efter sköljning, eluerades kolonnen med 4,5 M MgClg i 0.05 M 15 4 6 5 5 7 3 NaAc-buffert, pH 5,0, och antikroppstoppen i eluatet lokaliserades genom absorption vid 280 nm. Toppen insamlades, dialyserades extensivt och förvarades fryst.

EXEMPEL 3 Andra testade sera Som jämförelsematerial renades normala kaninantikroppar på protein A- .

Sepharos (kanin nr. 3). Antikroppar mot musens ß-NGF från kanin (Ig 17) eller får (Ig 28) affinitetsrenades mot N GF kopplat till CN Br-aktiverat Sepharos 4B so_m tidigare beskrivits (Ebendal T, Olson L, Seiger Å (1983): The level of nerve growth factor (NGF) as a function of innervation. Exp. Cell Res. 148: 311-317; Ebendal T, Olson L, Seiger Å, Belew M (1984): Nerve growth factors in chick and rat tissue. In Black IB (ed): "Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development," New York: Plenum pp. 231-242). Därtill undersöktes serum från en annan normal kanin (nr. 19) och från tvâ kaniner immuniserade med musens ß-NGF (nr. 10 och 30). Slutligen inkluderades en kanin (nr. 46) som först hade immuniserats med ß-NGF (200 ug) och därefter erhållit fyra boosterinjektioner med P3-KLH (200 ug varje gång).

EXEMPEL 4 Enzymímmunoassay (ELISA) Till ytan på 96-skå1iga immunoplattor bands olika peptider, KLH eller ß- NGF (alla vid koncentrationen 1 ug/ ml) i 0,05 M karbonatbuffert (pH 9,6).

Plattorna blockerades med 1% bovint serum albumin (BSA), och sedan tillsattes spädningar av peptidantikroppama eller de affinitetsrenade antikroppama till skålarna. De inkuberades vid 4°C över natt. Efter omfattande tvättning påvisades bunda antikroppar med biotinylerade antikanin antikroppar (Vector Labs., CA) åtföljt av streptavidin-konjugerat ß-galactosidas (Bethesda Research Labs., MD). Énzyrnaktivitet mättes med en fluorometrisk plattläsare (Dynatech Micnofluor) efter tillförsel av metylumbelliferyl-ß-galactoside.

”Bíaassaay” av NGP-hämmande aktivitet NGF-aktivitet påvisades i en assay med sympatiska ganglier från kyckling- embryo explanterade till en kollagengel (Ebendal T, Olson L, Seiger Å, Belew M (1984): Nerve growth factors in chick 'and rat tissue. In Black IB (ed): ”Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development," New York: Plenum pp. 231-242). 10 15 20 465 573 Effekten av stigande koncentrationer antiserum på den NGF-inducerade fiberutväxten bestämdes med hjälp av denna assay. ma-:wELs ' Immunohistokemi NGF-peptidantikroppama karakteriserades även immunohistokerniskt i spottkörtlar från vuxna hanmöss som hållits isolerade minst 24 timmar före avlivande för att garantera vilotillstánd i spottkörtlarna. Spottkörtlarna fixerades genom att djuren perfunderades med 4% paraformaldehyd och körtlama efterfixerades genom immersion i samma fixeringsmedel ytterligare 2 timmar (Olson L, Ayer-LeLievre C, Ebendal T, Seiger Å (1987): Nerve growth factor-like immunoreactivities in rodent salivary glands and testis. Cell Tissue Res 248: 275- 286). Kryostatsnitt (5-14 um) inkuberades (4°C över natt) med de affinitetsrenade anfikfoppanta från 1 fiiizo ug/ m1 i føsfaibuffraa koksamasning (Pas) i närvaro av 0,3% Triton X-100. Efter tvätt, isolerades de bunda antikropparna genom inkubation i en timme vid rumstemperatur med fluorescein-ísotliiocyanat- märkta antikanin- eller antifårantikroppar. Efter ytterligare tvätt monterades snitten med täckglas i en blandning av glycerol och PBS (9:1) innehållande 0,1% p-phenylen diamin för att motverka ”fading” (fluorescensförluster vid mikroskopering) (Johnson GD, de C Nogueira-Araujo GM (1981): A simple method of reducing the fading of immunofluroescence during microscopy. I.

Immunol. Methods 43: 349-350; Platt IL, Michael AF (1983): Retardation of fading and enhancement of intensity of immunofluorescence by p-phenylenediamine.

I. Histochem. Cytochem. 31: 840-842). Snitten utvärderade med hjälp av epifluorescensmikroskopi (Nikon Microphot FX) och distribution och intensitet hos fluorescensen skattades på blindmärkta glas. Fluorescensintensiteter skattades semikvantitativt på en skala från 0-5. 10 15 20 4 6 5 5 7 3 RESULTAT Antisera mot de 8 syntetiska N GF-peptidema erhölls från kaniner (Tabell I) efter att peptiderna konjugerats med KLH. Alla peptidkonjugat resulterade i antisera som i ELISA-test bands till respektive NGF-peptid (Tabell H). Serumtitrar (flerfaldiga spädningar) mätta med ELISA varierade från l:l0.000 till 1:1.000.000.

Peptid P2 gav höga bakgrundsvärden när den användes för att täcka immunskålarna, vilket nödvändiggjorde konjugering med bovint serum- albumin (BSA) före binding till skålama för att uppnå ändamålsenliga skatmingar av titrarna av antisera mot P2. Titrar mätta med KLH-täckta skålar överskred titrarna för peptidbinding och var i storleksordningen 1:1.000.000 till 1:l0.000.000.

Alla peptidantisera affinitetskromatograferades på kolonner till vilka peptiderna hade kopplats. Immunoglobulinbehållningen var av storleksordningen 50-200 ug/ ml antiserum (Tabell II). Behållningen motsvarade bara i viss utsträckning de relativa titrama hos de olika antisera.

Binding av några av de olika peptidantisera till respektive NGF-peptid som en funktion av serumspädning visas i Figur 1A. Antisera band till skikt av respektive peptider mycket effektivare än normalt kaninserum vid motsvarande koncentrationen Vissa peptidantisera var särskilt bra, ehuru strikta järnförelse icke är möjliga, eftersom olika peptider kan tänkas adsorberas olikartad till mikroskålarna.

Liknande resultat erhölls med affinitetsrenade peptidantikroppar (Figur IB). Signalen visavis KLH-täckta skålar reducerades samtidigt 50- till SOO-falt (ingen illustration). Sålunda drogs slutsatsen att de använda procedurema för affinitetsrening är användbara för att förstärka den specifika signalen t.ex. för immunohistokemíska studier.

Peptidantikropparnas spedficitet testades ytterligare med ELISA genom att testa antiserum mot en given peptid mot skålar med en serie olika syntetiska NGF-peptider. Ett eicempel visas i Figur IC, varav följer att den homologa kombinationen leder till den uppenbart bästa bindingen. Emellertid sågs viss bindning även till andra peptider än den som använts för immunisering (Fig.

IC). ' 10 15 20 35 465 573 Dessa fynd visar att antikroppar som är specifika mot de olika syntetiska NGF-peptiderna bildas som en följd av immunisering av kaniner coh att antikroppama kan renas effektivt genom affinitetskromatografi. ELISA användes sedan för att undersöka huruvida någon av peptidantikroppama kände igen motsvarande peptidsekvens i nativt ß-NGF-protein. Som jämförelse inkluderades kaninantikroppar (nr. 17) mot mus ß-NGF i ELISA med NGF-täckta immunskålar (Fig. 2A). Av de olika peptidantikropparna band endast Ig37 och 38, båda riktade mot peptid P3, starkt till moget ß-NGF-protein. Signalstyrkoma erhållna med dessa två antikroppar var nära de som sågs med affinitetsrenad anti-NGF-antikropp (Fig. 2A). De andra peptidantikroppama bands till NGF minst två tiopotenser mindre effektivt, vissa inte över bakgrundsnivåer erhållna med normalt kaninimmunoglobulin. Låga bindingsnivåer mot nativt NGF erhölls även med användade av prekursorspecifika peptidantikroppar. Fynden talar för att peptid P3 är unik genom att orsaka bildning av antikroppar som känner igen moget nativt NGF-protein.

Vidare undersöktes huruvida P3 är en epitop i ß-NGF som hittas i polyklonala antisera erhållna genom immunisering med ß-NGF. Tre antisera (AS 10, 17 och 30) undersöktes i en PS-ELISA, där alla kände igen den syntetiska peptiden klart över bakgrundsnivåer även om de skiljde sig åt i sin relativa förmåga att binda till P3 (Fig. 2B). De tre NGF-antisera bands till P3 ungefär en tiopotens mindre effektivt än anti-P3 antiserumet AS 38 självt. Ett antiserum (AS 46) erhållet genom immunisering med ß-NGF, följt av boosterinjektioner med PB-KLH, gav samma höga binding till P3 skålar som homologt P3-antiserum (Fig. 2B).

För att pröva om någon av de andra peptiderna skulle kännas igen av antiserum mot NGF sattes AS 10, 17 och 30 till hela serien NGF-peptider i en ELISA. Peptíden P3 gav reproducerbart hög binding med antikroppama (Fig. 2C).

AS 17 bands även till P4, vilket var mindre tydligt med AS 10 och 30.

Antiserumet AS 46 (det kombinerade NGF/ P3 antiserumet) kände även det endast igen P3 och icke någon av de andra peptiderna.

Möjligheten att peptidantikropparna skulle kurma störa NGF-aktiviteten undersöktes i en bioassay med hjälp av explanterade sympatiska ganglier från kyckling (Ebendal T, Olson L, Seiger Å, Belew M (1984): Nerve growth factors in chick and rat tissue. In Black IB (ed): “Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development." New York: Plenum pp 231-242). NGF-inducerad fiberutväxt (stimulerad med hjälp av mus ß-NGF) blockerades inte av något av 10 15 20 465 573 peptidantisera, inte ens när de var närvarande i höga koncentrationer (3%) i skålarna (ingen illustration). Affinitetsrenade antikroppar mot peptid P3 kunde inte heller blockera utväxtsvaret (testat vid koncentrationer upp till 8 pg Ig 38 per ml). Denna egenskap hos peptidantikrppar påminner om oförmågan hos monoklonala antikroppar mot NGF att blockera ß-NGF-inducerad fiberväxt i ganglietestet. Peptid P3 (i koncentrationen 100 ng/ ml) kunde inte heller ersätta NGF vad gäller nervfiberutväxtstimulering, och vidare kunde peptid P3, tillsatt i kraftigt molärt överskott interferera med biologisk aktivitet hos N GF. I en tusenfaldig spädning blockerade emellertid NGF-antiserum AS 46 det ß-NGF- inducerade fiberutväxtsvaret hos sympatiska ganglier.

Immunohistokemi Egenskaper hos peptidantisera och afñnitetsrenade antikroppar utvärderades även med hjälp av immunohistokemisk teknik i hanmusens submandibulariskörtel. Olika immunoglobulinpreparationer från de 19 kaniner som immuniserats med de åtta olika peptiderna (Tabell II) testades immunohistokemiskt. I många fall genomfördes preadsorptionstest med respektive peptider. Dessutom jämfördes när det gäller peptid 4 och 5, de affinitetsrenade preparationerna med de exkluderade fraktionerna från affinitetskolonnerna. Slutligen gjordes jämförelser med distributionen av immunofluorescens i spottkörtel inducerad med affinitetsrenade antikroppar.

EXEMPEL 6 Följande peptid: Glu-Pro-His-Ser-Glu-Ser-Asn-Val-Pro-Ala-Gly-I-Iis-'Ilxr-Ile. syntetiserades av Cambridge Resesarch Biochemicals Ltd., England, med en beräknad renhet av >80% och kontrollerades med aminosyreanalysis, HPLC och masspektrometri. Peptiden motsvarar position -103 till -90 i den humana NGF- prekursorn.

Med derma peptid genomfördes samma behandlingar och procedurer såsom beskrivits i Exemplen 2-5 ovan och med samma användbara resultat. Det noterades också att ehuru peptiden motsvarar en sekvens i den humana NGF- prekursom, så kunde renade antikroppar mot peptiden också bindas till NGF- prekursor från råtta, trots skiljaktigheter i aminosyreammansättning.

Uppfinningen är ett viktigt bidrag till bestämningstekniker på så sätt att nivåerna av såväl NGF-prekursor som moget NGF i sig kan bestämmas med 4 6 5 5 7 3 hjälp av peptider i denna uppfinning. Det är viktigt när det gäller att erhålla korrekt diagnos av sjukdomar i nervsystemet, eftersom relationen mellan nivåer av prekursor och nivå av moget NGF kan bli avgörande för bedömning av vilken behandling som skall tillgripas. Sålunda kan onormala nivåer av moget NGF hos en människa orsakas antingen av överproduktion därav eller av minskad konsumtion därav. Således kan prekursornivån vara avgörande när det gäller att bedöma sjukdomsorsak och på så sätt möjliggöra korrekt behandling. 465 573 TABELL1 Syntetiska NGF och Pro-NGP-peptider' Pepfid Position nr Species Sequence Start Slut P1 Höna (Thyfl-Glu-'Iïïr-Lys-Cys-Arg-Asp-Pro- 54 69 Arg-Prc-Val-Ser-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly P2 Höna Cys-Val-Leu-Ser-Arg-Lys-Ser-Gly-Arg-Pro 109 118 P3 Råtta (mus) (Cysßly-Asp-Lys-Thr-'Iïu-Ala-'Ilxr-Asp- 23 35 höna, lle-Lys-Gly-Lys-Glu människa) P4 Råtta Cys-Arg-Ala-Pro-Asn-Pro-Val-Glu-Ser-Gly 58 67 P5 Råtta (mus) (Cys)-Glu-Pro-Tyr-'Iïxr-Asp-Ser-Asn-Val- -103 -90 Pro-Glu-Gly-Asp-Ser-Val P6 Råtta (mus, Ser-Prø-Arg-Val-Leu-Phe-Ser-'ITu-Gln- -38 -28 människa) Pro-(Cys) P7 Råtta (Lys)-Va1-Leu-Ser-Arg-Lys-A1a-Ala- 111 120 Arg-Arg-Gly P8 Råtta (Cys)-Val-Lys-Ala-Leu-'Iïmr-'Ilxr-Asp- 87 97 Asp-Lys-Gln-Ala *Aminosyrarester givna inom parentes har 1 för att möjliggöra konjugering. agts till respektive NGF-sekvenser 4 6 5 5 7 3 TABELL H Studerade NGF-peptid antisera 5 Peptid nr. Kanin AS-nr. ELISA-titer Behállning (lig IgG/ 1111)* 10 P1 32 1: 200.000 60 33 1: 100.000 90 35 1: 10.000 15 44 1:1.000.000 70 48 1: 200.000 120 15 P2 34 1: 10.000 30 36 1: 100.000 200 P3 37 1; 4oo.ooo 40 20 38 1:1.000.000 80 P4 39 1:1.000.000 100 P5 41 1: 100.000 60 25 42 1: 10.000 30 P6 43 1: 100.000 80 49 1: 100.000 100 30 P7 45 1: 10.000 150 50 1: 20.000 90 P8 51 1: 200.000 220 52 1: 100.000 40 35 *Värden hänför sig till behållning av specifik peptidantilcropp per ml antiserum efter affinitetskromatagrafi

Claims (13)

465 575 'z PATENTKRAV

1. Peptid med formeln: Glu-Pro-His-Ser-Glu-Ser-Asn-Val-Pro-Ala-Gly-His-Thr-Ile; Gly-Asp~Lys-Thr-Thr-A1a-Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu, eller immunogent motsvarande förlängda eller förkortade for- mer härav exkluderande nativa NGF och prekursorer därav.

2. Peptid enligt patentkravet 1 med formeln: Glu-Pro-Hís-Ser-Glu-Ser-Asn-Val-Pro-Ala-Gly-His-Thr-Ile.

3. Peptid enligt patentkravet 2 med formeln: Gly-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu.

4. Peptid enligt något av de föregående patentkraven för diagnostisk användning vid kvantitativ bestämning av NGP och dess prekursorer hos levande djur eller människa.

5. Antikroppar riktade mot peptid enligt något av de före- gående patentkraven.

6. Antikroppar enligt patentkravet 5 riktade mot peptiden enligt patentkravet 2.

7. Antikroppar enligt patentkravet 5 riktade mot peptiden enligt patentkravet 3.

8. Antikroppar enligt något av patentkraven 5 till 7 vil- ka är polyklonala.

9. Antikroppar enligt något av patentkraven 5 till 7 vilka är monoklonala.

10. Förfarande för bestämning av närvaro av moget NGF och/eller en prekursor härav i ett biologiskt prov under an- vändning av interaktionen mellan antikropparna enligt något av patentkraven 5 till 9 och nämnda NGF eller nämnda prekursor.

ll. Förfarande enligt patentkravet 10 för kvantitativ be- stämning av en prekursor till moget NGF i ett biologiskt prov av interaktionen mellan antikropparna enligt något av patent- kraven 6, 8 och 9 och nämnda prekursor.

12. Förfarande enligt patentkravet 10 för kvantitativ be- stämning av en prekursor till moget NGF i biologiskt provma- terial av interaktion mellan antikropparna enligt något av pa- tentkraven 7, 8 och 9 och nämnda NGF.

13. Förfarande enligt något av patentkraven 10 till 12, vari nämnda provmaterial består av hjärnvävnad från däggdjur.