UA115960C2 - Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf) - Google Patents

Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf) Download PDF

Info

Publication number
UA115960C2
UA115960C2 UAA201109302A UAA201109302A UA115960C2 UA 115960 C2 UA115960 C2 UA 115960C2 UA A201109302 A UAA201109302 A UA A201109302A UA A201109302 A UAA201109302 A UA A201109302A UA 115960 C2 UA115960 C2 UA 115960C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
human
amino acid
antibody
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201109302A
Other languages
English (en)
Inventor
Кеннет Д. Уайлд
Джеймс Дж. С. Трінор
Хайчунь Хуань
Хезер Іну
Тай Дж. Чжан
Френк Мартін
Original Assignee
Емджен, Інк.,
Е.Р. Сквібб & Санз, Л.Л.К.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Емджен, Інк.,, Е.Р. Сквібб & Санз, Л.Л.К. filed Critical Емджен, Інк.,
Publication of UA115960C2 publication Critical patent/UA115960C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

Винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить фармацевтично прийнятний носій і терапевтично ефективну кількість виділеного людського антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (NGF).

Description

Ця заявка стосується і претендує на пріоритет тимчасової заявки на патент США Мо 60/487,431, поданої 15 липня 2003 року, розкриття якої включено до цього опису шляхом посилання.
Галузь, до якої належить винахід
Цей винахід стосується людських моноклональних антитіл, що зв'язують фактор росту нервової тканини (МСЕ). Описуються також композиції та способи лікування болю та розладів, пов'язаних із болем.
Передумови створення винаходу
Кожного дня у Сполучених Штатах хронічний біль позбавляє працездатності більше двох мільйонів людей (Джессел (дев55еїІ), Келлі (КеПу), 1991, "Раїп апа АпаЇдезіа" іп РВІМСІРІ Е5 ОБГ
МЕШОВАЇ ЗСІЕЄМСЕ, 3 видання, (редактори Кандел (Капаєї), Шварц (Зспугап?), Джессел (УезвеїІ)), ЕІвемівї, Нью-Йорк). На жаль, існуючі способи лікування болю мають лише часткову ефективність і багато з цих способів лікування самі по собі спричинюють ослаблення здоров'я або мають небезпечні побічні ефекти. Наприклад, незважаючи на те, що такі нестероїдні протизапальні лікарські засоби ("М5АЇІЮОз5") як аспірин, ібупрофен та індометацин, є помірно ефективними проти запального болю, вони також є нирковими токсинами, і високі дози цих засобів є спричиненням подразнення шлунково-кишкового тракту, виникнення виразок, кровотеч та появи сплутаності свідомості. Хворі, ліковані опіоїдами, також часто відчувають сплутаність свідомості, а тривале застосування опіоїдів пов'язується із звичністю та залежністю. Місцеві анестезуючі засоби, наприклад, лідокаїн та мексілетин, одночасно пригнічують біль і викликають втрату нормальної чутливості.
Біль являє собою відчуття, основу якого становлять сигнали, що надходять (із навколишнього середовища, а передаються і інтерпретуються нервовою системою (дивись оглядову статтю Міллан (МійПап), 1999, Ргод. МеийгобріоІЇ. 57:1-164). Шкідливі подразники, наприклад, тепло та торкання, примушують спеціалізовані чутливі нервові закінчення у шкірі надсилати сигнали до центральної нервової системи ("ЦНС"). Цей процес називають сприйняттям болю, а периферичні чутливі нейрони, що його опосередковують, носять назву ноці(ре)цепторів (больових рецепторів). Залежно від інтенсивності сигналу від ноціцептора(ів) та виділення і обробки цього сигналу ЦНС, особа може сприйняти або може не сприйняти шкідливий подразник як больовий. Коли сприйняття болю особою відповідним чином співвідноситься з інтенсивністю подразника, біль виконує призначену йому захисну функцію.
Однак пошкодження тканин певних типів викликає явище, відоме як гіпералгезія або підвищена больова чутливість, у разі якої відносно нешкідливі подразники сприймаються як сильно болючі, оскільки больовий поріг особи знизився. Гіпералгезія може викликатись як запальним пошкодженням, так і пошкодженням нервової тканини. Особи, уражені запальними станами, наприклад сонячною еритемою, остеоартритом, колітом, кардитом, дерматитом, міозитом, невритом, дифузною хворобою сполучної тканини судин (яка включає ревматоїдний артрит і вовчак) тощо, часто відчувають посилене сприйняття болю. Подібним же чином травма, хірургічне втручання, ампутація, абсцес, каузалгія, дифузна хвороба сполучної тканини судин, демієлінізуюче захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, герпетичні інфекції, синдром набутого імунодефіциту (СНІД"), стан, спричинений токсинами, та стан, спричинений хіміотерапією, спричиняють пошкодження нервової тканини, наслідком чого є надмірний біль.
Оскільки механізми передачі ноціцепторами зовнішніх сигналів за нормальних та гіпералгетичних умов стають краще зрозумілими, на процеси, залучені до гіпералгезії, можна цілеспрямовано впливати для запобігання зниженню больового порогу і, таким чином, зниженню інтенсивності болю, що сприймається.
Було показано, що нейротрофні фактори відіграють значну роль у передачі фізіологічного та патологічного болю. Особливо важливим видається фактор росту нервової тканини (МО) (дивись оглядові статті Макмагон (МеМаноп), 1996, РН Тгап5. В. бос. опа. 351:431-440; та
Апфел (Арієї), 2000, Тне Сіїпіса! доштпаї ої Раїп 16:57-511). Було показано, що як місцеве, так і системне введення МО викликає гіпералгезію і алодинію (Левін (І ем/іп) та інші, 1994, Єиг. у.
Мешговзсі. 6:1903-1912). Внутрішньовенне вливання МО викликає у людей міалгію усього тіла, у той час як місцеве введення, окрім системних ефектів, спричинює гіпералгезію і алодинію на місці ін'єкції (Апфел (Арієї) та інші, 1998, Мейгоіоду 51:695-702). Значний обсяг даних вказує також на причетність ендогенного МОБ до станів, головною особливістю яких є біль. Наприклад, активація МОРЕ спостерігається у шваннівських клітинах гангліїв задніх корінців головного мозку (ра) впродовж щонайменше 2 місяців після пошкодження периферичної нервової тканини.
Повідомляли про підвищені рівні МСЕ у суглобах тварин, що страждають від різноманітних бо моделей артриту (наприклад, Алоу (АПІоє) та інші, 1993, Стоули Расіогз 2:149-155). Щодо людей,
то рівні МСЕ підвищені у синовіальній рідині хворих на ревматоїдний артрит або артрити інших типів (наприклад, Алоу (АїІоє) та інші, 1992, АпНітйїїв апа Апейтаїйбт 35:351-355). Окрім того, було показано, що антагонізм функції МСЕ запобігає виникненню гіпералгезії та алодинії, на моделях невропатичного та хронічного запального болю. Наприклад, на тваринних моделях невропатичного болю (наприклад, перев'язка нервового стовбура або спинномозкового нерва) системна ін'єкція МОЕ-нейтралізуючих антитіл запобігає виникненню як алодинії, так і гіпералгезії (Ремер (Натег!) та інші, 1999, Єик. У. Мешговсі. 11:837-846; та Ро (Но) та інші, 1999,
Раїп 79:265-274). Приклади анти-МОЕ антитіл, відомих у цій галузі, наведені, наприклад, у публікаціях МО 01/78698, УМО 01/64247, МО 02/096458 та МО 2004/032870; патентах США Мо 5,844,092, Мо 5,877,016 та Мо 6,153,189; Хонго (Нопдо) та інші, 2000, Нургідота 19:215-227;
Хонго (Нопдо) та інші, 1993, СеїЇ. Мої. Віої. 13:559-568; депонуваннях СепВапку Мо 039608, Мо
ИЗ39609, Мо І 17078 або Мо І 17077.
Зрозуміло, що існує потреба у нових безпечних та ефективних способах лікування болю, зокрема, шляхом цільового впливу на медіатори або загострювачі болю невеликої молекулярної маси, наприклад, МОРЕ.
Короткий виклад суті винаходу
Цей винахід пропонує нові людські моноклональні антитіла, що є терапевтично придатними для зняття болю. Зокрема, цей винахід пропонує моноклональні антитіла, що зв'язуються з фактором росту нервової тканини (МСЕ). За варіантом, якому віддають перевагу, згаданими моноклональними антитілами є людські моноклональні антитіла, що нейтралізують біологічні активності МСЕ ії є придатними для поліпшення ефектів МСЕ-опосередкованих больових реакцій. Цим винаходом пропонуються також клітини, що продукують і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, секретують до культуральних середовищ моноклональні антитіла за цим винаходом. Окрім їх застосування для лікування та зняття болю, антитіла за цим винаходом є придатними для лікування реакцій, пов'язаних з невропатичним та запальним болем.
Цей винахід додатково пропонує гібридні білки, що містять послідовність Ес-ділянки антитіла і одну або декілька послідовностей, позначених як ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 10,
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 12, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 14, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
Зо 18, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 20, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 22 і ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 79-130. Такі молекули можна одержати за допомогою способів, описаних, наприклад, у публікації міжнародної заявки УМО 00/24782, яку включено до цього опису шляхом посилання. Такі молекули можуть експресуватись, наприклад, у клітинах ссавців (наприклад, у клітинах яєчника китайського хом'ячка) або бактеріальних клітинах (наприклад, у клітинах Е. соїЇ).
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські антитіла і людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 2, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 4 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 6, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 4.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що включає константні ділянки важкого ланцюга
ЧИ, да, ІдаЗ, да, ДМ, ІдА та ІДЕ або будь-який їхній алельний варіант (як обговорюється у роботі Кабат (Кара) та інших, 1991, бедиепсе5 ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, п'яте видання, О.5.Оерайтепі ої Неайй апа Нитап Ббегуісе5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242, що включена до цього опису шляхом посилання), а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом містить амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга Іда2, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 4, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають 60 перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 8, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами, варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За додатковими аспектами, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 18 або
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 20, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За ще іншими додатковими аспектами, легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 16,
ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 20, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 24, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з МОРЕ, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язуються з
МО, де згадані антитіла містять: (а) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, або її
Зо антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 80, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (Б) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 82, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (с) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 84, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; або (4) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 86, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує також антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 7595, за варіантом, якому віддають перевагу, 80 95, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85 95, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90 Фо, 91 95, 92 о, 93 о, 94 Фо, 95 95, 96 о, 97 Фо, 98 95 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого 60 ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 80 95, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85 95, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90 95, 91 9, 92 Фо, 93 о, 94 Фо, 95 У, 96 Ов, 97 Ор, 9895 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 95 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, де згадане антитіло специфічно зв'язується з МОРЕ.
Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з МОРЕ, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 7595, за варіантом, якому віддають перевагу, 80 95, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85 95, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90 Фо, 91 Фо, 92 Фо, 93 Фо, 94 Фо, 95 о, 96 Фо, 97 Фо, 98 95 і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 95 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою будь- якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 14, ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 18, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 22, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 80 905, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85 95, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 9, 98 95 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 95 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16, де згадане антитіло специфічно зв'язується з МОР.
Цей винахід пропонує також одноланцюгові антитіла, одноланцюгові Ем антитіла, Е(абр) антитіла, Кар) антитіла і (Раб')» антитіла.
За конкретними аспектами, цей винахід пропонує легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Зо На додаток до цього, цей винахід пропонує важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 14, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 18 або
ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 22, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід має також відношення до виділених людських антитіл, що специфічно зв'язують
МИ, де згадане антитіло містить: (а) остовні ділянки людського важкого ланцюга, СОВІ1 ділянку людського важкого ланцюга, СОН2 ділянку людського важкого ланцюга та СОВЗ ділянку людського важкого ланцюга; і (б) остовні ділянки людського легкого ланцюга, СОВІ ділянку людського легкого ланцюга, СОВ2 ділянку людського легкого ланцюга та СОВЗ ділянку людського легкого ланцюга. За певними аспектами, СОНВІ1 ділянка людського важкого ланцюга може бути СОВІ1 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла (тАБб), позначеного 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 22, а СОВ1 ділянка людського легкого ланцюга може бути
СОВІ ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 24. За іншими аспектами, СОН2 ділянка людського важкого ланцюга може бути СОВ2 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 18, а СОНВ2 ділянка людського легкого ланцюга може бути СОВ2 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 20. За ще іншими аспектами,
СОВЗ ділянка людського важкого ланцюга є СОВЗ ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14, а СОВЗ ділянка людського легкого ланцюга є СОвВЗ ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16.
Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують фактор росту нервової тканини, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 85 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують МОБ, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену бо ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 12, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 80, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 82, ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 84, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 86, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 88, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 89,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 90, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 91 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 131, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Антитіла за цим винаходом характеризуються здатністю антагонізувати щонайменше одну іп міо та/або іп мімо активність, пов'язану з МСЕ поліпептидами. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділені людські антитіла проти людського МОГ з високою спорідненістю зв'язування з МОРЕ поліпептидами, де згадані антитіла зв'язуються з людським
Ма поліпептидом і відділяються від людського МОЄ поліпептиду з константою дисоціації (Ко) приблизно 50х1072 М або менше, як визначається за допомогою КіпЕХА, або які пригнічують
Маг -індуковану виживаність у іп міїго реакції нейтралізації з ІСво приблизно 1х108 М або менше.
За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділене людське антитіло проти людського МСЕ, що має наведені нижче характеристики: а) пригнічує МОЕ-індуковану виживаність у іп міто реакції нейтралізації з ІСво приблизно 1х109 М або менше;
Б) має СОВЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14; і с) має СОВЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16.
Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла або їх антигензв'язувальні чи імунологічно функціональні імуноглобулінові фрагменти, що специфічно зв'язуються з МО з високою спорідненістю, де згадані антитіла або фрагменти відділяються від людського МИ поліпептиду з Ко приблизно 1х1079 або менше і нейтралізують біологічну активність людського
МО у стандартній іп міо реакції з ІСвсо приблизно 1х108 М або менше, і де антитіла або фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: а) СОВА! ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: а'агазЗа"а», де: а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; аг - ароматичний амінокислотний залишок; аз - аліфатичний, полярний гідрофобний, ароматичний амінокислотний залишок; а" -
Зо нейтральний гідрофобний або аліфатичний амінокислотний залишок; і а? - аліратичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р) СОВ2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: р'бгрзрирорертререр'єртртгртзріиртортвртя, де: р' - аліфатичний, полярний гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; бр? - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; Б - полярний гідрофільний або ароматичний амінокислотний залишок; Б" - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; Бо-рУ, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; Б'Є - полярний гідрофільний, ароматичний або аліфатичний амінокислотний залишок; р"! - ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок; Б" - аліфатичний гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р'з - аліфатичний, гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; Б" ії р'Є, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; Б'» - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; і р" - аліфатичний кислий амінокислотний залишок; і с) СОВЗ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: ссгоЗстсзсботсвсястост р12р1Зс1и 1516017, де: с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; с- - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с і с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні або аліфатичні амінокислотні залишки; с? - відсутня або являє собою полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с/ - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; се - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; со - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с"!-с!3, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; с" - аліфатичний або ароматичний 60 гідрофобний амінокислотний залишок; с!» - полярний гідрофільний або нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; сб - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с"/ - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок.
За одним аспектом, а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а? - ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; аз - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; а!" - нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; а? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р' - аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; р" - Ме; 53 - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р" - полярний гідрофільний або ароматичний амінокислотний залишок; ро-рУ, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; Б" - аліфатичний амінокислотний залишок; Б" - Ту; 2 - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; бБ'З - аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; Б'Є ії р'є6, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; і р» - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; Б'7 - аліфатичний кислий амінокислотний залишок; с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с і с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні або аліфатичні амінокислотні залишки; с? - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; сб - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с" - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с8 - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; со - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с"!-с!3, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; с" - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний або нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; с!З - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с!" - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок.
За конкретним аспектом, а! - бег, Авр або Тпг; аг - Туг; аз - Аа, 5ег, Ттр або Сту; а" - Меї або
Пе; а» - Ні, Сіу або Авп; 5 - Туг, СПУ, Пе або Авр; ре - Пе; 03 - бег, ТАг, Туг або Авп; р - Тгтр, Ага або
Рго; ро - Бег, Азп або сту; ре - Зег, Аг, Авр або Стпу; Б" - Зег, Ні або Спу; 8 - 5ег, Пе, Авр або Тнг; р - Ї еи, Пе або Тнг; ро - Спу, Гуз або РНе; р" - Тут; р: - АІа або 5ег; р'з - А5р, Спіу або Рго; р -
Зег; р» - МаЇ або РНе; Б'Є - Гуз або Сп; Б - СПу; с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; с- - відсутня або являє собою Туг; с3 та с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою Туг, Азп, Ма! або Си; с? - відсутня або являє собою 5ег, Сіу або Тр; сб - відсутня або являє собою 5ег, Спіу, Сіи або І ей; с" - Спу, Ага або Азр; с8 - Ттр, Ріо, Зег або
Тиг; с? - Ні5, Спу або Туг; с"? - Маї, Туг або Агу; с!!-с"3, незалежно одна від одної, являють собою зЗег, Ріє, Туг, Авр або Авп; с" - Ріє, Ма! або Спу; с!» - Меї або Авр; с'б - відсутня або являє собою Авзр або Авп; і с"" - Туг або Ма).
За іншим конкретним аспектом, а! - бег або Авр; аг - Туг; аз - АІа або 5ег; а" - Меї або Пе; аз -
Ні або Авп; р! - Туг або Сіу; р: - Ме; 63 - бег, ТАг, Туг або Авп; р" - Тгр, Агу або Рго; р - бег або
Ап; 66 - бег або Аг; Б - Ніз або Спу; 58 - Пе або Ти; 09 - І ей, Пе або Ти; р'9 - Сіу або Ре; 5 -
Ту 62 - Аа або 5ег; р'з - Авр або Спу; ря - Бег; р» - МаЇ або РНе; р'Є- | уз або Сп; 67 - Спу; с! - відсутня або являє собою іу; с - відсутня або являє собою Туг; с3 та с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою Туг, Сіу або Маї; с" відсутня або являє собою 5ег; се - Зег або
СПу; с" - Спу або Ага; с8 - Ттр або Рго; с? - Ніз, Сіу або Туг; со - МаЇ або Тут; с"-с13, незалежно одна від одної, являють собою 5ег, Туг, Рне або Авр; с" - Рпє або Маї; с!» - Меї або Авр; с'б відсутня або являє собою Авр; і с"" - Туг або Маї. За іншими конкретними аспектами: а) СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 22, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 18, ії СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14; рБ) СОВІ! важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 92, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 93, ії СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 94; с) СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 98, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність,
представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 99, їі СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 100; а) СОВІ! важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 104, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 105, і СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 106; е) СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 110, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 111, і СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 112;
У СОВА важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 116, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 117, і СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 118.
Цей винахід пропонує також виділене людське антитіло або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, що специфічно зв'язується з МО, де згадане антитіло або фрагмент містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: а) СОВІ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: а'агаза"азабатаваза ба атег, де: а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; аг, а" і аг, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; аз, а», а" і ав, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; а? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; аб - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; а? - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і а - аліфатичний, ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок; р) СОВ2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: р'рерзр"рорерт,
Зо де: р' - аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; ре - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; р3 та р", незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні, аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; р» - полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; Бе - полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; і Б/ - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с) СОВЗ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: с! сесЗсісосбссвсЗс! ос! 1 с! ге Зс! 4с! зс! вс! 7, де: с" ї с7, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; с", с? і се, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; с" - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с8 - полярний гідрофільний або гідрофобний амінокислотний залишок; і с? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і де згадане антитіло або фрагмент відділяється від людського МОРЕ поліпептиду з Ко приблизно 1х1079 або менше і нейтралізує біологічну активність людського МОРЕ у стандартній іп міо реакції з ІСво приблизно 1х103 М або менше.
За одним аспектом, а", а", а", а" і а, незалежно одна від одної, являють собою полярні
БО гідрофільні амінокислотні залишки; аг, аб, а" ії аг, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; а? - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; а? - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а"? - аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; р' - аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; ре - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; БУ, р" і р", незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; р і ре, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; с і с-, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; с", с5 і сб, 60 незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; с" - відсутня або являє собою аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с8 - гідрофобний амінокислотний залишок; і с? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок.
За конкретним аспектом, а", а", а" і а" - Агу, бег, Сіп та 5ег, відповідно; а: - Аа; а? - Сіу або бег; ав- бег або Пе; а? - відсутня, бег або Спу; а"9 - ДІа, Туг, Тгтр або Ре; р! - Авр, Спу, Аа або Маї; ре ії 03 - Аа та 5ег, відповідно; Б" - бег або Авп; Бр: - І ви або Агу; Бе - Спи, Аа або Сп; Б" - бег або
Тис! ї се - Сп; с3- Ре, Туг, Ага або Аа; с" - Азп, Спіу або бег; с? - бег або Авп; сб - Туг, бег, Тр або Ре; с" - відсутня, Рго або Нів; с8- І єм, Тр, Туг або Аг; і с? - ТНг.
За іншим конкретним аспектом, а", аг, аз, а" і а" - Агу, Аа, 5ег, Сп та 5ег, відповідно; а» - Сіу або 5ег; а? - Зег або Пе; а? - відсутня, бег або Спіу; а" - Аіа або Туг; 8 - Азр або Су; 0-2 і 03 - АІа та зЗег, відповідно; Б" - 5ег або Авп; ре - Ї еи або Аг; 05 - Спи, Аа або Сп; Б" - бег або Тиг; с! ї се -
Сп; с3- Рне, Туг, Агу або Аа; с" - Азп, Спу або бе"; с» - Зег або Авп; се - Тут, Зег, Тр або РНе; с" - відсутня, Рго або Нів; се - І еи, Ттр, Туг або Ага; і се - ТНу.
За іншими конкретними аспектами: а) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 24, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 20, ї СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16; р) СОВА легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 95, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 96, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 97; с) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 101, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 102, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 103; а) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 107, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 108, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 109; е) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 113, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 114, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 115;
У СОВІ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 119, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 120, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 121; 9) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 122, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 123, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 124;
Р") СОВТ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 125, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 126, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 127; її СОВ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 128, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 129, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 130;
Ї) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 132, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 133, і СОВЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 134.
Частиною цього винаходу є також полінуклеотидні послідовності, що кодують нові людські антитіла проти людського МО, вектори, що містять полінуклеотидні послідовності, що кодують людські антитіла проти людського МО, клітини-хазяї, трансформовані векторами, що містять полінуклеотиди, що кодують людські антитіла проти людського МО, композиції, що містять людські антитіла проти людського МОБ та способи її одержання та застосування.
Цей винахід пропонує також способи визначення рівня МОРЕ у біологічній пробі, що включають стадію контактування згаданої проби з антитілом за цим винаходом або його антигензв'язувальним фрагментом. Анти-МОЕ антитіло за цим винаходом може застосовуватись у будь-якому відомому аналітичному методі, наприклад, реакціях конкурентного зв'язування, прямих та непрямих сендвіч-методах, методах імунопреципітації та твердофазному імуноферментному аналізі (ЕПІЗА) (дивись Сола (боіа), 1987, Мопосіопаї!
Апііродієз: А Мапиаї ої Тесппідев, рр. 147-158, СВО Ргезв, Іпс.) для виявлення та кількісного визначення МО. Антитіла можуть зв'язувати МО зі спорідненістю, що відповідає застосованому аналітичному методу.
На додаток до цього, цей винахід пропонує способи лікування захворювання, пов'язаного з підвищеним продукуванням МСЕ або підвищеною чутливістю до МОЕ, що включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одне антитіло за цим винаходом або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий Фрагмент, індивіду, який цього потребує.
Конкретні варіанти здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, стануть очевидними з наведеного нижче докладнішого опису певних варіантів здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, та формули винаходу.
Короткий опис фігур
На Фіг. 1 зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності МСЕ у реакції нейтралізації на основі нейронів ОВС; моноклональними антитілами 404, очищеними з кондиціонованих середовищ для гібридом.
На Фіг. 2 зображені графіки, що демонструють експресію УНІ, стимульовану активністю людського МО і нейтралізацію активності МСЕ у реакціях нейтралізації на основі нейронів ОС анти-МЕЕ моноклональним антитілом (404), очищеним із кондиціонованих середовищ для гібридом.
На Фіг. З зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності МСЕ у реакціях нейтралізації на основі нейронів ОВСь тимчасово експресованими рекомбінантними моноклональними анти-МОЕ антитілами 404, експресованими як ІдДС1 або Ідса2 та у клітинах, вирощених у ролерній культурі (В) або у спін-культурі (5).
Зо На Фіг. 4 зображений порівняльний аналіз послідовностей нейротрофінів. Цифрові позначення та елементи вторинної структури над послідовностями відносяться до зрілого людського МОРЕ. Консервативні залишки помічені зірочкою, а ділянки з низькою гомологією послідовностей заштриховані. Людський МОИЕ - ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 135; мишачий МО -
ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 136; ВОМЕ -Мо 137; МТЗ - ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 138.
На Фіг. 5 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВІ важкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 98), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 104), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 110), 4246 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 116), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 92) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 22).
На Фіг. 6 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВ2 важкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 99), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 105), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 111), 446 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме117), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме93) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 18).
На Фіг. 7 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВЗ важкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 100), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 106), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 112), 4246 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 118), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 94) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 14).
На Фіг. 8 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВ1І легкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 95), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 107), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 113), 4сба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 119), 425460 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 122), 4сб6с (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 125), 4246а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 128), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 132), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 95) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 24) (антитіло 4с6а на різних
Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 402460 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36с на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 40564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6е на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На Фіг. 9 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВ2 легкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 96), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 108), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 114), 4сба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 120), 42460 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 123), 4с6бс (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 126), 4246а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 129), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо (510) 133), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 96) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 20) (антитіло 4с26а на різних
Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 402460 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36с на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 40564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6е на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На Фіг. 10 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВЗ легкого ланцюга анти-МСЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 97), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 109), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 115), 4сба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 121), 42465 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 124), 4сб6с (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 127), 4246а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 130), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 134), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 97) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16) (антитіло 4с26а на різних
Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 402460 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36с на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 40564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6е на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На Фіг. 11 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності легкого ланцюга анти-
МОБ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 82), 6НеО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 84), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 86), 4сба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 88), 42465 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 89), 4с6с (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 90), 42;46а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 91), 4ббе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 131), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 80) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 12) (антитіло 4с6ба на різних
Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 40260 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36с на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 40564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6е на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На фіг. 12 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності важкого ланцюга анти-
МОРЕ антитіл 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 10), 4026 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 87), 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 81), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 79), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 85) та 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 83).
Докладний опис конкретних варіантів здійснення винаходу, яким віддають перевагу
Назви розділів, що застосовуються у цьому описі, переслідують лише організаційні цілі і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об'єкт опису. Усі посилання, згадані у цьому описі,
Зо включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі.
Визначення
Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин можна вдаватись до традиційних методів (наприклад, електропорації, ліпофекції). Ферментативні реакції та методи очищення можуть здійснюватись за специфікаціями виробника, за традиційними для цієї галузі методиками або за наведеним описом. Подальші методики та процедури можуть, у цілому, здійснюватись за способами, добре відомими у цій галузі, та за описами, наведеними у різноманітних загальних та спеціалізованих джерелах, які наводяться шляхом посилання та обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, довідник Сембрук (бЗатргоокК) та інші, 2001, МОГ! ЕСШШ АВ СІОМІМС: А
ГЕВОВАТОНУ МАМИАЇ, З видання, Со 5ргіпд Натог І арогаїогу Рге55, Соїй З5ргіпд Нагтбог,
Нью-Йорк, який включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. У разі відсутності конкретних визначень, у цьому описі у зв'язку з та по відношенню до лабораторних процедур та методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної та фармацевтичної хімії застосовується номенклатура, що є добре відомою і традиційно застосовуваною у цій галузі. Подібним чином, для хімічного синтезу, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів, композицій, їх доставки та лікування хворих можуть застосовуватись традиційні методи.
Слід розуміти, що наведені нижче терміни, що вживаються у описі цього винаходу, у разі відсутності інших визначень, мають таке значення: Словосполучення "біологічна властивість", "біологічна характеристика" і термін "активність" відносно антитіла за цим винаходом застосовуються у цьому описі взаємозамінно і означають (але не обмежуються) спорідненість і специфічність відносно антигенної детермінанти (наприклад, зв'язування людського антитіла проти людського МСЕ з людським МОР), здатність до антагонізування активності цільового поліпептиду (наприклад, активності МО), іп мімо стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями або характеристиками антитіла, що піддаються визначенню і визнаються у цій галузі, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з гомологами цільового поліпептиду нелюдського походження або, взагалі, з іншими білками або тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців.
Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або вимірюватись за 60 допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі, але без обмеження, за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5ЗА), конкурентного ЕГІ5А, аналізу поверхневого плазменного резонансу, іп міо та іп мімо реакцій нейтралізації (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, відповідно до потреб. Конкретні активності та біологічні властивості людських антитіл проти людського МОЄ докладно описані у наведених нижче
Прикладах.
Словосполучення "виділений полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, кКДНК або синтетичного походження чи їх комбінації, причому, завдяки своєму походженню, згаданий виділений полінуклеотид (1) не є пов'язаним із цілим полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, у складі якого виділений полінуклеотид знаходиться за природних умов, (2) є зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (3) не зустрічається за природних умов, як частина більшої послідовності.
Словосполучення "виділений білок", що згадується у цьому описі, означає, що цільовий білок (1) є вільним від щонайменше деяких інших білків, з якими він знаходиться за нормальних умов, (2) є по суті вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, від того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) було відділено від щонайменше приблизно 50 відсотків полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він є пов'язаним за природних умов, (5) не є зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з частинами білка, з якими згаданий "виділений білок" є зв'язаним за природних умов, (6) є функціонально зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (7) не зустрічається за природних умов. Такий виділений білок може кодуватись геномною ДНК, кКДНК, мРНК або іншою РНК синтетичного походження чи будь- якою їх комбінацією. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий виділений білок є по суті вільним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, що знаходяться у його природному оточенні, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному тощо). "Виділеним" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене та/або виділене зі складової його природного оточення. Забруднювальними складовими його природного оточення є матеріали, які могли б перешкодити діагностичному або терапевтичному
Зо застосуванням антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло буде очищеним (1) до рівня, що перевищує 95 95 (мас.) антитіла, що визначається за методом Лоурі, а за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, до рівня, що перевищує 99 95 (мас), (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з центрифугальною чашкою, або (3) до однорідності за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (505-РАСЕ) за відновних або невідновних умов із застосуванням барвника кумасі блакитного або, за варіантом, якому віддають перевагу, срібла. Виділене антитіло включає антитіло іп 5йй у межах рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна складова природного середовища антитіла буде відсутньою.
Терміни "поліпептид" або "білок" означають молекули, що мають послідовність нативних білків, тобто білків, продукованих природними клітинами та специфічними нерекомбінантними клітинами, генно-інженерними або рекомбінантними клітинами, і включають молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка або молекули, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот нативної послідовності. Терміни "поліпептид" та "білок", зокрема, означають анти-МОЕ антитіла або послідовності, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот анти-Має антитіла.
Термін "фрагмент поліпептиду" означає поліпептид, що має делецію на амінокінці, делецію на карбоксильному кінці та/або внутрішню делецію. За певних варіантів здійснення довжина фрагментів становить від щонайменше 5 амінокислот до приблизно 500 амінокислот. Буде зрозуміло, що, за певними варіантами здійснення довжина фрагментів становить щонайменше 5,6,8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 амінокислот. Особливо придатні фрагменти поліпептидів містять функціональні домени, у тому числі зв'язувальні домени. У разі анти-МаЕ антитіла, придатні фрагменти містять (але не обмежуються) СОВ (гіперваріабельну) ділянку, варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла або лише його варіабельну ділянку, що містить дві гіперваріабельні ділянки тощо.
Термін "специфічний зв'язувальний агент" означає природну або штучну молекулу, яка специфічно зв'язується з мішенню. Прикладами специфічних зв'язувальних агентів є (але ними не обмежуються) білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і ліпіди. За певними варіантами здійснення специфічним зв'язувальним агентом є антитіло.
Термін "специфічний МО Е-зв'язувальний агент" означає специфічний зв'язувальний агент, який специфічно зв'язує будь-яку частину МОРЕ. За певними варіантами здійснення специфічним
МаЕ-зв'язувальним агентом є антитіло, що специфічно зв'язується з МОРЕ.
Термін "імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент", що застосовується у цьому описі, означає фрагмент поліпептиду, що містить щонайменше гіперваріабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом є здатним до зв'язування з антигеном. За варіантами, яким віддають перевагу, антиген являє собою ліганд, що специфічно зв'язується з рецептором. За цими варіантами здійснення зв'язування імунологічно функціонального імуноглобулінового фрагмента за цим винаходом запобігає зв'язуванню ліганду з його рецептором, з перериванням біологічної реакції, що є наслідком зв'язування ліганду з рецептором. За варіантом, якому віддають перевагу, імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом специфічно зв'язується з МОРЕ. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згаданий фрагмент специфічно зв'язується з людським МО.
Термін "природний", що застосовується у цьому описі і стосується об'єкта, означає те, що цей об'єкт може бути знайденим у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі вірусах), яка може бути виділена із природного джерела і навмисно людиною не модифікувалась, є природною.
Термін "функціонально зв'язаний" означає, що складові, до яких застосовується цей термін, знаходяться у взаємозв'язку, який надає їм можливість здійснення притаманних їм функцій за відповідних умов. Наприклад, контрольна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодувальною послідовністю білка, є сполучена з нею таким чином, що експресія кодувальної послідовності білка відбувається за умов, сумісних із транскрипційною активністю контрольних послідовностей.
Термін "контрольна послідовність", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які можуть забезпечувати експресію, процесинг або внутрішньоклітинну локалізацію кодувальних послідовностей, з якими вони зв'язані. Природа
Зо таких контрольних послідовностей може залежати від організму-хазяїна. За конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для прокаріот можуть містити промотор, сайт зв'язування рибосом і термінатор транскрипції. За іншими конкретними варіантами здійснення, контрольні послідовності для еукаріот можуть включати промотори, що містять один або множину сайтів упізнання факторів транскрипції, енхансерних послідовностей транскрипції, термінаторів транскрипції та послідовностей поліаденілування. За певними варіантами здійснення "контрольні послідовності" можуть включати лідерні послідовності та/або послідовності гібридизаційного партнера.
Термін "полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає одноланцюгові або дволанцюгові нуклеїновокислотні полімери довжиною щонайменше 10 нуклеотидів. За певними варіантами здійснення нуклеотидами, що входять до складу полінуклеотиду, можуть бути рибонуклеотиди або дезоксирибонуклеотиди чи модифікована форма нуклеотиду будь-якого з цих типів. Згадані модифікації включають модифікації основ, наприклад, бромуридину, модифікації рибоз, наприклад, арабінозиду та 2"3З'дидезоксирибози та модифікації внутрішньонуклеотидних зв'язків, наприклад, фосфоротіоату, фосфородітіоату, фосфороселеноату, фосфородиселеноату, фосфороанілотіоату, фосфороаніладату (РІ фосфороамідату. Термін "полінуклеотид", зокрема, включає однониткові та двониткові форми
ДНК.
Термін "олігонуклеотид", що застосовується у цьому описі, включає природні і модифіковані нуклеотиди, зв'язані природними та/або штучними олігонуклеотидними зв'язками.
Олігонуклеотиди являють собою субпопуляцію полінуклеотидів, члени якої є, як правило, однонитковими і мають у довжину 200 або менше нуклеотидів. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають від 10 нуклеотидів до 60 нуклеотидів у довжину. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 нуклеотидів або від 20 нуклеотидів до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути однонитковими або двонитковими, наприклад, для застосування при конструюванні генетичного мутанту.
Олігонуклеотиди за цим винаходом можуть бути смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами відносно білок-кодувальної послідовності.
Термін "природні нуклеотиди" означає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди" означає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими бо групами тощо. Термін "олігонуклеотидні зв'язки" означає олігонуклеотидні зв'язки, наприклад,
фосфоротіоат, фосфородітіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороаніладат, фосфороамідат тощо. Дивись, наприклад, Лапланш (ГаРіапсне) та інші, 1986, Мисі. Асіавє Вев., 14:9081; Стек (5іес) та інші, 1984, )У. Ат. Спет. бос, 106:6077; Стейн (Зіеїп) та інші, 1988, Мисі. Асіаз Вев., 16:3209; Зон (27оп) та інші, 1991, Апіі-Сапсег Огид Оезідп, 6:539; Зон (70п) та інші, 1991, ОПСОМОСІЕОТІОЕВ АМО АМАГОСИОЕ5: А РААСТІСАЇ
АРРАОАСН, стор. 87-108, (редактор Ф. Екстейн (Р. ЕсКвієїп)), Охтога Опімегейу Ргев55, Охіога
Епаїапа; Стек (5іес) та інші, патент США Мо 5,151,510; Ульман (пІтапп), Пейман (Реутап), 1990, Спетісаї! Вемієм, 90:543, розкриття яких наведено у цьому описі шляхом посилання для будь-якої мети. Олігонуклеотид може містити виявну мітку, яка надає можливість виявлення олігонуклеотиду або його гібридизації.
Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Вектором одного з типів є "плазміда", що являє собою кільцеву петлю двониткової ДНК, до якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК.
Вектором іншого типу є вектор на основі вірусного геному, де додаткові сегменти ДНК можуть бути лігованими до вірусного геному. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітини-хазяїні, до якої вони були введені (наприклад, вектори на основі бактеріального геному, що мають бактеріальний сайт ініціювання реплікації та вектори на основі епісом ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори не на основі епісом ссавців) можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до згаданої клітини і, таким чином, розмножуватися разом із геномом хазяїна. Більше того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються у цьому описі, як "рекомбінантні вектори експресії" (або просто "експресійні вектори"). Взагалі, експресійні вектори, придатні для методу рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть застосовуватись взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найпоширенішу форму вектора. Цей винахід, однак, включає інші форми експресійних векторів, наприклад, вектори на основі вірусного геному (наприклад, реплікаційно-дефектні ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які здійснюють еквівалентні функції.
Словосполучення "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає клітину, до якої було введено рекомбінантний експресійний вектор. Фахівцям у цій галузі буде
Зо зрозуміло, що такі терміни, як мається на увазі, означають не лише конкретну клітину-об'єкт, але і потомство такої клітини. Оскільки у подальших генераціях можуть відбуватись певні модифікації унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, таке потомство може, по суті не бути ідентичним батьківській клітині, однак воно, як і до того, включається до обсягу терміну "клітина-хазяїн", який застосовується у цьому описі. Для експресії антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії в хазяїні, у тому числі бактеріальні, дріжджові, бакуловірусні системи експресії та системи експресії у ссавцях (а також системи експресії з фаговою індикацією). Прикладом придатного експресійного вектора на основі бактеріального геному є рОС19. Для рекомбінантної експресії антитіл, клітина-хазяїн трансфікується одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, що кодує легкі та важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і, за варіантом, якому віддають перевагу, секретуються до живильного середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть виділятись. Стандартна методика рекомбінантних ДНК застосовується для одержання генів важких і легких ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів та введення цих векторів до клітин-хазяїв, описаних, наприклад, у довіднику Сембрук (ЗатрбгоокК) та інші, 2001, МОГЕСОГАВ СІ ОМІМа: А ГАВОВАТОНУ МАМОАГ., Соїа Зргіпа Нагрог
Ї арогайогієз, (під редакцією Осбел Ф.М. (А!йвиреї! Е.М.) та інших, Сштепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг
Віоіоду, Стеєпе Рибіїзпіпуд Авзосіайіев, (1989)) та у патенті США Мо 4,816,397 на ім'я Босс (Во55) та інші.
Термін "клітина-хазяїн" застосовують для позначення клітини, яку було трансформовано або яка є здатною до трансформування нуклеїновокислотною послідовністю з подальшою експресією вибраного гена, який становить інтерес. Згаданий термін доти включає потомство батьківської клітини, незалежно від того, чи є згадане потомство ідентичним вихідній батьківській клітині за морфологією або організацією генетичного матеріалу, доки є присутнім вибраний ген.
Термін "трансдукція" означає перенесення генів від однієї бактерії до іншої, як правило, за допомогою фага. "Трансдукція" означає також набуття та перенесення еукаріотних клітинних послідовностей ретровірусами.
Термін "трансфекція" означає захоплення клітиною чужорідної або екзогенної ДНК і клітина бо є "трансфікованою" у разі, коли екзогенна ДНК була введена досередини клітинної мембрани. У цій галузі добре відомі численні методи трансфекції, які розкриваються у цьому описі. Дивись, наприклад, Грехем (Станат) та інші, 1973, Мігоіоду 52:456; Сембрук (ЗатрбгоокК) та інші, 2001,
МОГЕСОГАВ СІОМІМа: А ГАВОВАТОНУ МАМИАЇ, Соїй 5ргіпуд Нагбог Іарогаїйогієв; Девіс (Рамів) та інші, 1986, ВАБІС МЕТНОЮ5З ІМ МОГЕСИОІ АВ ВІОГ ОС, ЕІвемієг; Чу (Спи) та інші, 1981, Сепе, 13:197. Такі методи можуть застосовуватись для введення до придатних клітин- хазяїв однієї або декількох екзогенних ДНК.
Термін "трансформація", що застосовується у цьому описі, означає зміну генетичних характеристик клітини, і клітина є трансформованою у тому разі, коли вона була модифікована таким чином, що містить нову ДНК. Наприклад, клітина є трансформованою у тому разі, коли її піддали генетичній модифікації порівняно з її нативним станом. Після трансфекції або трансдукції, трансформуюча ДНК може рекомбінуватись із ДНК клітини шляхом фізичної інтеграції з хромосомою клітини або може тимчасово підтримуватись як епісомний елемент без реплікації або може реплікуватись незалежно як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, коли ДНК реплікується разом із поділом клітини.
Термін "природний" або "нативний", у разі застосування у зв'язку з біологічними матеріалами, наприклад, молекулами нуклеїнової кислоти, поліпептидами, клітинами-хазяями тощо, означає матеріали, які знаходяться у природі, і не зазнавали маніпуляції з боку людини.
Аналогічно, термін "штучний" або "ненативний", що застосовується у цьому описі, означає матеріал, який є відсутнім у природі або який був структурно модифікованим або синтезованим людиною.
Термін "антиген" означає молекулу або частину молекули, здатну до зв'язування селективним зв'язувальним агентом, наприклад, антитілом, і додатково здатну до застосування у організмі тварини для продукування антитіл, здатних до зв'язування з антигенною детермінантою цього антигену. Антиген може мати одну або декілька антигенних детермінант.
Термін "ідентичність", як відомо у цій галузі, означає спорідненість між послідовностями двох чи декількох поліпептидних молекул або двох чи декількох нуклеїновокислотних молекул, що визначається шляхом порівняння їх послідовностей. Термін "ідентичність" у цій галузі означає також ступінь спорідненості послідовностей між нуклеїновокислотними молекулами або поліпептидами, відповідно, що визначається сумісністю ниток двох чи декількох нуклеотидних або двох чи декількох амінокислотних послідовностей. "Ідентичність" встановлює відсоток ідентичних співпадінь між меншими з двох або декількох послідовностей з впорядкованим розміщенням двониткових розривів (у разі їх присутності), який визначають за допомогою конкретної математичної моделі або комп'ютерної програми (тобто "алгоритмів").
Термін "подібність" застосовують у цій галузі відносно спорідненої концепції, але на відміну від "ідентичності", "подібність" означає ступінь спорідненості, який включає як ідентичні співпадіння, так і консервативні замінні співпадіння. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а усі залишкові амінокислоти є неконсервативними замінами, у такому разі відсоток як ідентичності, так і подібності буде дорівнювати 50 95. Якщо, у тому самому прикладі, є п'ять додаткових позицій, де є консервативні заміни, у такому разі відсоток ідентичності залишиться на рівні 50 95, а відсоток подібності буде становити 75 95 (15/20). Таким чином, у тих випадках, де є консервативні заміни, відсоток подібності між двома поліпептидами буде вищим за відсоток ідентичності між цими двома поліпептидами.
Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів може бути легко обчислена за відомими методами. До них належать (але ними не обмежуються) методи, описані у СОМРОТАТІОМАЇ МОГЕСОГАВ ВІОГОСМ (редактор Леск А.М. (ГезКк А.М.)), 1988, Охота
МОпімегзПйу Ргезв, Мем МЖМоїк; ВІОСОМРОТІМОа: ІМЕОВМАТІС5З АМО СЕМОМЕ РАОЕСТ5, (редактор Сміт Д.В. (Зтійй О.МУ.)), 1993, Асадетіс Ргез5, Мем Моїк; СОМРИОТЕВ АМАЇ У5І5 ОБ
ЗЕОШЕМСЕ БАТА, Рай 1, (редактори Гріффін А.М. (Спійіп А.М.), Гріффін Г.Дж. (Стініп Н.С.)), 1994, Нитапа Рге5з5, Мем/ Уегзеу; фон Гейне Дж. (моп Неїпів с), ЗЕОШОЕМСЕ АМАГСМУ5БІВ ІМ
МОГ ЕСШОГАВ ВІОГОСУ, 1987, Асадетіс Рге55; БЕОШСЕМСЕ АМАЇ У5І5 РАЇІМЕН, (Грібсков В. (апреКом У.), Деверо Дж. (Оємегеих 9.)), 1991, М. 5іосКіоп Ргезв, Мем/ Могк; Карілло (Сапгіо), 1988, БІАМ У. Арріїєй Маїйй., 48:1073; Дурбін (ЮОитбіп) та інші, 1998, ВІОГОСІСАЇ 5ЕОШОЕМСЕ
АМАЇ У5І5, Сатргдде Опімегейу Ргев5.
Методи визначення ідентичності, яким віддають перевагу, розробляються таким чином, щоб вони забезпечували найбільшу сумісність між послідовностями, що перевіряються. Методи визначення ідентичності описуються у доступних комп'ютерних програмах. Методи комп'ютерних програм із визначення ідентичності двох послідовностей, яким віддають перевагу, включають (але ними не обмежуються) пакет програм СО, що містить програми САР (Деверо (Оємегеих) та інші, 1984, Мисі. Асій Вев., 12:387; Сепеїйс5 Сотршег Стоцир, Опімегейу ої 60 Муівсопвіп, Мадібзоп, штат Вісконсін), ВГАБТР, ВІ АЗТМ та ЕРА5ТА (Алтшул (АїЇївспиї) та інші,
1990, У. Мої. Віої, 215:403-410). Програма ВІ АЗТХ є доступною від Національного центру з біотехнологічної інформації (Майопа! Сепієг Тог Віоїєсппоіоду Іптоптайоп (МСВІ)) та з інших джерел (ВІ А5Т Мапиаї, Алтшул (АїЇївспиї) та інші, МСВ/МІ М/МІН Веїпезаа, МО 20894; Алтшул (АїїзспиЇ) та інші, 1990, дивись вище). Для визначення ідентичності може застосовуватись також добре відомий алгоритм Сміта Уотермена (Зтіїй УУаїептап аІдогпййт).
Наслідком застосування певних схем порівняльного аналізу з впорядованим розміщенням двох амінокислотних послідовностей може виявитись сумісність лише короткої ділянки двох згаданих послідовностей, і ця невелика впорядковано розміщена ділянка може мати дуже високу ідентичність послідовностей, незважаючи навіть на відсутність значної спорідненості між двома непроцесованими послідовностями. Відповідно, за певними варіантами здійснення наслідком застосування вибраного методу порівняльного аналізу (програма САР) виявиться впорядковане розміщення, що охоплює щонайменше 50 суміжних амінокислот цільового поліпептиду.
Наприклад, у разі застосування комп'ютерного алгоритму САР (Сієпеїйсв Сотриїєг Стоир,
МОпімегейу ої М/івсопвіп, Мадібзоп, штат Вісконсін), два поліпептиди, у яких слід визначити відсоток ідентичності послідовностей, впорядковано розміщуються для оптимального співпадіння їх відповідних амінокислот ("суміщений відрізок", як визначається алгоритмом). За певними варіантами здійснення разом з алгоритмом застосовують штрафні бали за розрив (які обчислюються, як потроєна середня діагональ, де "середня діагональ" є середнім значенням діагоналі застосованої порівняльної матриці; "діагональ" являє собою бал або число, що приписується кожному абсолютному співпадінню амінокислоти конкретною порівняльною матрицею) і штрафні бали за довжину розриву (які, як правило, дорівнюють одній десятій штрафних балів за розрив), а також порівняльну матрицю, наприклад, РАМ 250 або ВІ ОБОМ 62. За певними варіантами здійснення алгоритмом застосовується також стандартна порівняльна матриця (дивись Дейхофф (Раупйоїй) та інші, 1978, Айав ої Ргоїєїп Зедоепсе апа зЗігисіцге, 5:345-352 щодо порівняльної матриці РАМ 250; Хенікофф (Непікоїй) та інші, 1992,
Ргос. Маї!. Асад. сі ОБА, 8542: 10915-10919 щодо порівняльної матриці В ОБОМ 62).
За певними варіантами здійснення параметри порівняння поліпептидних послідовностей охоплюють наведене нижче:
Зо алгоритм: Нідлмен (МееадіІетагп) та інші, 1970, 9. Мої. Віої, 48:443-453; порівняльна матриця: В ОБИМ 62 від Хенікофф (Непікоїй) та інші, 1992, дивись вище; штрафні бали за розрив: 12; штрафні бали за довжину розриву: 4; поріг подібності: 0.
З вищенаведеними параметрами корисною може бути програма САР. За певними варіантами здійснення вищезгадані параметри є параметрами за замовчуванням для порівняння поліпептидних послідовностей (без штрафних балів за закінчення розриву) із застосуванням алгоритму САР.
Термін "гомологія" означає ступінь подібності між білююовими або нуклеїновокислотними послідовностями. Інформація щодо гомології є корисною для розуміння генетичної спорідненості певних видів білків або нуклеїнових кислот. Гомологія може визначатись шляхом впорядкованого розміщення і порівняння послідовностей. За типовим варіантом, для визначення гомології амінокислот, білкову послідовність порівнюють із базою даних відомих білкових послідовностей. Гомологічні послідовності мають спільні функціональні одиниці на якійсь ділянці своїх послідовностей. Високий ступінь подібності або ідентичності, як правило, є свідченням гомології, хоча низький ступінь подібності або ідентичності не обов'язково вказує на відсутність гомології.
Для визначення гомології шляхом порівняння амінокислот однієї послідовності з амінокислотами іншої послідовності може застосовуватись декілька варіантів підходів. Взагалі, згадані варіанти підходів можна підрозділити на дві категорії: (1) порівняння фізичних характеристик, а саме полярності, заряду, вандерваальсівського об'єму, для створення порівняльної матриці; і (2) порівняння ймовірної заміни амінокислоти у послідовності будь-якою іншою амінокислотою, що грунтується на спостереженні багатьох білкових послідовностей відомих гомологічних білків, і створення Матриці Прийнятних Точкових Мутацій (Роїіпі Ассерієй
Мшигаїйоп Маїгіх (РАМ)).
Відсоток ідентичності може обчислюватись шляхом застосування голки для відбирання програм (пакет програм ЕМВО55) або розширювача програм (пакет програм ЕМВО55) чи узгоджування програм Х, як модуля вектора МТІ пакета програм 9.0.0, із застосуванням значень параметрів, за замовчуванням (наприклад, 5 штрафних балів за присутність двониткового розриву, 15 штрафних балів за відкриття двониткового розриву, 6,6 штрафних балів за довжину двониткового розриву).
У цьому описі застосовуються двадцять традиційних амінокислот та їхні скорочені позначення. Дивись довідник ІММОМО! ОС11М-А 5ММТНЕ5І5 2 видання, (редактори Е.С. Голаб (Е.5. Соїшб), Д.Р. Грен (О.В. Степ)), 5іпацег Авзосіаїев: Зупдепапа, штат Массачусетс, 1991, який включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Стереоізомери (наприклад, Ю-амінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот; штучні амінокислоти, наприклад, со-, о-двозаміщені амінокислоти, М-алкіламінокислоти, молочна кислота та інші нетрадиційні амінокислоти можуть також бути придатними складовими для поліпептидів за цим винаходом. Прикладами нетрадиційних амінокислот є: 4-гідроксипролін, у-карбоксиглутамат, в5-
М,М,М-триметиллізин, є-М-ацетиллізин, О-фосфосерин, М-ацетилсерин, М-формілметіонін, 3- метилгістидин, 5-гідроксилізин, со-М-метиларгінін та інші подібні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептидів, яке застосовується у цьому описі, лівостороннім напрямом є напрям до амінокінця, а правостороннім напрямом є напрям до карбоксильного кінця, відповідно до стандартного застосування і традиції.
Природні залишки можуть підрозділятись на класи на основі властивостей звичайних бічних ланцюгів: 1) гідрофобні: норлейцин (Мог), Меї, Аа, Маї, І ей, Пе, РНне, Тр, Туг, Рго; 2) полярні гідрофільні: Агу, Азп, Авр, Стій, Спи, Нів, Гуз, Зег, ТНг; 3) аліфатичні: Аа, Спу, Пе, І еи, Маї, Рго; 4) аліфатичні гідрофобні: Аа, є, І єи, Маї, Рго; 5) нейтральні гідрофільні: Сувз, Зег, ТНг, Авп, Сп; 6) кислі: Авр, Си; 7) основні: Нів, І ув, Аго; 8) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Сіу, Рго; 9) ароматичні: Нів, Тгр, Туг, РНе; і 10) ароматичні гідрофобні: РНе, Ттр, Туг.
Консервативні амінокислотні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів іншим членом того самого класу. Консервативні амінокислотні заміни можуть охоплювати штучні амінокислотні залишки, які, як правило, включаються скоріше хімічним синтезом пептидів, аніж синтезом у біологічних системах. Сюди включаються пептидоміметики та інші обернені або інвертовані форми амінокислотних складових.
Неконсервативні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Такі замінені залишки можуть вводитись на ділянки людського антитіла, що є гомологічними з антитілами нелюдського походження або на негомологічні ділянки молекули.
У разі здійснення таких замін, за певними варіантами здійснення, до уваги може прийматись гідропатичний індекс амінокислот. Кожній амінокислоті, на основі характеристик її гідрофобності та заряду, був приписаний гідропатичний індекс. Вони є такими: ізолейцин (4,5); валін (14 2); лейцин (13,8); фенілаланін (12,8); цистеїн/цистин (2,5); метіонін (41,9); аланін (41,8); гліцин (- 0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5).
Важливість гідропатичного індексу амінокислот при наданні білку інтерактивної біологічної функції є зрозумілою у цій галузі (дивись, наприклад, Кайт (Куїє) та інші, 1982, 9). Мої. Віої, 157:105-131). Відомо, що певні амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають подібний гідропатичний індекс або коефіцієнт, і зберегти, як і досі, подібну біологічну активність. При здійсненні замін, виходячи з гідропатичного індексу, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 52. За певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах «1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах х0,5.
У цій галузі зрозуміло також, що заміна подібних амінокислот може здійснюватись ефективніше на основі гідрофільності, зокрема, у тому разі, коли одержаний таким чином біологічно функціональний білок або пептид призначається для застосування у імунологічних варіантах здійснення, що розкриваються у цьому описі. За певними варіантами здійснення найбільша місцева середня гідрофільність білка, яка регулюється гідрофільністю прилеглих амінокислот, корелює з його імуногенністю та антигенністю, тобто з біологічними властивостями білка.
Цим амінокислотним залишкам були приписані наведені нижче значення гідрофільності: аргінін (13,0); лізин (43,0); аспартат (ї3,0:21); глутамат (ї3,0:21); серин (10,3); аспарагін (0,2); бо глутамін (0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5:241); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-
1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); і триптофан (-3,4). При здійсненні замін, виходячи з подібних значень гідрофільності, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться у межах :2, за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах «1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 0,5. За послідовностями основних амінокислот, на основі гідрофільності, можуть також бути ідентифіковані антигенні детермінанти. Ці ділянки називають також "коровими ділянками антигенних детермінант".
Зразкові амінокислотні заміни наведені у Таблиці 1.
Таблиця 1
Амінокислотні заміни
Вихідні залишки Зразкові заміни перевагу ле | їешМа,МеАа, Рпе. норлейцин.///-/ | -( їв: бе | норлейцин,Пе,Ма, МебАа, Рпе.д/-:/ | її
Вихідні залишки Зразкові заміни перевагу
Досвідчений фахівець зможе визначити відповідні варіанти поліпептиду, як наведено у цьому описі, за допомогою добре відомих методів. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може визначити відповідні ділянки молекули, які можуть бути змінені без руйнування активності, обираючи мішенню ті ділянки, які, як гадають, не є важливими для активності. За іншими варіантами здійснень досвідчений фахівець може визначити залишки та ділянки молекул, які зберігаються серед подібних поліпептидів. За додатковими варіантами здійснень навіть ділянки, які можуть бути важливими для біологічної активності або для структури, можуть бути піддані консервативним амінокислотним замінам без знищення біологічної активності або без виявлення негативного впливу на структуру поліпептидів.
На додаток до цього, фахівець у цій галузі може переглянути дані структурно- функціональних досліджень, які визначають залишки подібних поліпептидів, що є важливими для активності або структури. Приймаючи до уваги результати такого порівняння, досвідчений фахівець може прогнозувати важливість амінокислотних залишків у білку, що відповідають амінокислотним залишкам, важливим для активності або структури у подібних білків. Фахівець у цій галузі для таких визначених важливих амінокислотних залишків може вибрати хімічно подібні амінокислотні заміни.
Фахівець у цій галузі може також проаналізувати об'ємну структуру і амінокислотну
Зо послідовність у зв'язку з такою структурою у подібних поліпептидів. Приймаючи до уваги таку інформацію, фахівець у цій галузі може прогнозувати впорядковане розміщення амінокислотних залишків антитіла відповідно до його об'ємної структури. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може уникнути варіанта внесення радикальних змін до амінокислотних залишків, які передбачаються на поверхні білка, оскільки такі залишки можуть бути залученими до важливих взаємодій з іншими молекулами. Більше того, фахівець у цій галузі може розробити експериментальні варіанти, які включають заміну однієї амінокислоти на кожному бажаному амінокислотному залишку. Після цього згадані варіанти можуть перевірятись у реакціях визначення активності, відомих фахівцям у цій галузі. Такі варіанти можуть застосовуватись для збирання інформації щодо придатних варіантів. Наприклад, у разі визначення того, що наслідком заміни певного амінокислотного залишку є знищена, небажано знижена або невідповідна активність, варіанти з такою заміною можуть виключатись. Іншими словами, виходячи з інформації, зібраної шляхом подібних звичайних експериментів, фахівець у цій галузі може легко визначити амінокислоти, які слід виключити з процесу замін або самостійно, або у поєднанні з іншими мутаціями.
Ряд наукових публікацій присвячено прогнозуванню вторинної структури. Дивись Молт (Моціу), 1996, Си. Ор. іп Віоїесн., 7:422-427; Чу (Спо) та інші, 1974, Віоспетівігу, 13:222-245;
Чу (Спо) та інші, 1974, Віоспетівігу, 113:211-222: Чу (Спо) та інші, 1978, Адм. Епгутої!. Веїаї.
Агеа5 Мої. Віої, 47:45-148; Чу (Спо) та інші, 1979, Апп. Веу. Віоспет. 47:251-276; Чу (Спо) та інші, 1979, Віорпув. 9., 26:367-384. Окрім того, зараз є доступними комп'ютерні програми, що допомагають визначити вторинну структуру. Один із методів прогнозування вторинної структури базується на моделюванні гомології. Наприклад, два поліпептиди або білки, що мають ідентичність послідовності, яка перевищує 30 95, або подібність, яка перевищує 40 95, часто мають подібну структурну топологію. Нещодавнє збільшення обсягу бази даних із структури білків (РОВ) забезпечує значне посилення ступеню прогнозованості вторинної структури, у тому числі потенційної кількості складок у межах структури поліпептиду або білка. Дивись Холм (Но!т) та інші, 1999, Мисі. Асіа. Нев5., 27:244-247. Висунули припущення (Бреннер (Вгеппег!) та інші, 1997, Си. Ор. Бігисі. Віо!., 7:369-376) про існування обмеженої кількості складок у даного поліпептиду або білка і про те, що після визначення критичної кількості структур, структурне прогнозування стане набагато точнішим.
Додаткові методи прогнозування вторинної структури включають "нарізання різьби" (Джоунс
Ко) (Чопе5), 1997, Си. Ор. Бігисі. Віо!., 7:377-387; Сіппл (5іррі) та інші, 1996, Зтисіште 4:15-19), "аналіз профілю" (Боуї (Воміє) та інші, 1991, бсіепсе 253:164-170; Грібсков (СпіреКоум) та інші, 1990, Меїй. Епгут. 183:146-159; Грібсков (СпіреКоу) та інші, 1987, Ргос. Маї. Асай. 5сі. 84:4355- 4358) та "еволюційний зв'язок" (дивись Холм (Но!Іт), 1999, (дивись вище); та Бреннер (Вгеппег"), 1997 (дивись вище)).
За певними варіантами здійснення варіанти антитіл включають глікозиловані варіанти, де кількість та/або тип сайту глікозилування був змінений, порівняно з амінокислотними послідовностями вихідного поліпептиду. За певними варіантами здійснення білкові варіанти включають більшу або меншу кількість М-зв'язаних сайтів глікозилування, аніж нативний білок.
М-зв'язаний сайт глікозилування характеризується послідовністю: Авп-Х-5ег або Авзп-Х-ТНг, де амінокислотним залишком, позначеним як Х, може бути будь-який амінокислотний залишок, за винятком проліну. Заміна амінокислотних залишків для одержання цієї послідовності забезпечує одержання потенційно нового сайту для додання М-зв'язаного вуглеводного ланцюга. За альтернативним варіантом заміни, які ліквідують цю послідовність, будуть видаляти існуючий М-зв'язаний вуглеводний ланцюг. Пропонується також реаранжування М- зв'язаних вуглеводних ланцюгів, де один або декілька М-зв'язаних сайтів глікозилування (як правило, природних) ліквідуються з утворенням одного або декількох нових М-зв'язаних сайтів.
Додаткові варіанти антитіл, яким віддають перевагу, включають цистеїнові варіанти, де, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, один або декілька цистеїнових залишків видаляють або замінюють на іншу амінокислоту (наприклад, серин). Цистеїнові варіанти можуть бути придатними у тому разі, коли антитіла повинні повторно укладатись до біологічно активної конформації, такої як, наприклад, після виділення нерозчинних тілець включення. Цистеїнові варіанти, як правило, мають меншу кількість залишків цистеїну, аніж нативний білок і, типово, мають парну їх кількість для зведення до мінімуму взаємодій, що є наслідком неспарованих залишків цистеїну.
За додатковими варіантами здійснення варіанти антитіл можуть включати антитіла, що містять модифікований Ес-фрагмент або модифіковану константну ділянку важкого ланцюга. Ес- фрагмент (де скорочення означає "фрагмент, що кристалізується") або константна ділянка важкого ланцюга можуть бути модифіковані шляхом мутації для надання антитілу змінених характеристик зв'язування. Дивись, наприклад, Бартон (Випоп), Вуф (М/оої), 1992, Адмапсез іп бо Іттипоіоду 51:1-84; Равеч (Намеїсі), Болланд (ВоїІапа), 2001, Аппи. Неу. Іттипої. 19:275-290;
Шіддс (ЗПієЇїд5) та інші, 2001, Чопа! ої Віої. Сет. 276:6591-6604; Теллман (ТеПетап),
Джунханс (Чипоапапв), 2000, Іттипоіоду 100:245-251; Медсан (Медезап) та інші, 1998, Єиг. У.
Іттипої! 28:2092-2100; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання. Такі мутації можуть включати заміни, додання, делеції або будь-яку їх комбінацію, і здійснюються, як правило, сайт-спрямованим мутагенезом із застосуванням одного або декількох мутагенних олігонуклеотидів за методами, опис яких наведено у цьому описі, або за методами, відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Сембрук (ЗатбгооК) та інші МОГЕСШОГАВ СІОМІМС: А
ГАВОВАТОНУ МАМОАЇ, З видання, 2001, Сода 5ргіпд Натбог, М.У. та Бергер (Вегаєг), Кіммел (Кітте!), МЕТНООБЗ ІМ ЕМАУМОГ ОДУ, том 152, Сіціде то МоїІесшіаг Сіопіпд Тесппіднев, 1987,
Асадетіс Ргез5, Іпс., Зап Оієдо, штат Каліфорнія, які включено до цього опису шляхом посилання).
За певними варіантами здійснення амінокислотними замінами є заміни, які: (1) знижують сприйнятливість до протеолізу, (2) знижують сприйнятливість до окиснення, (3) змінюють зв'язувальну спорідненість для утворення білкових комплексів, (4) змінюють зв'язувальні спорідненості та/"або (5) надають або модифікують інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких поліпептидів. За певними варіантами здійснення одиночна амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (за певними варіантами здійснення консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (за певними варіантами здійснення на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що забезпечує міжмолекулярні контакти). За варіантами здійснення, яким віддають перевагу, консервативна амінокислотна заміна, як правило, суттєво не змінює структурних характеристик вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не руйнує спіралі, що існує у вихідній послідовності, і не руйнує вторинної структури інших типів, що характеризує вихідну послідовність). Приклади визнаних у цій галузі вторинних та третинних структур поліпептидів описані у РАЕОТЕЇМ5,
ЗІТВОСТОВЕЗ АМО МОГ ЕСШТАВ РЕАЕЇІМСІРІЕ5, (редактор Крейтон (Стгеідніоп)), 1984, М.Н.
Егеетап апа Сотрапу, Мем/ Моїк; ІМГВОВОСТІОМ ТО РЕОТЕІМ 5ТАВОСТИОВЕ (редактори К.
Бренден (С. Вгапаєп), Дж. Туз (У. Тоо7є)), 1991, Сапапа Рибріїзнпіпу, Мем Мо, М.МУ.; Торнтон (Тнпотіоп) та інші, 1991, Маїшге 354:105; кожну з цих робот включено до цього опису шляхом посилання.
Зо Аналоги пептидів широко застосовують у фармацевтичній промисловості як непептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Непептидні сполуки такого типу називають "пептидними міметиками" або "пептидоміметиками". Дивись
Фошер (Рашйспегеє), 1986, Аду. Огид Вев. 15:29; Вебер (Мебег"), Фрідінгер (Егеїдіподєг), 1985, ТІМ5, 392; Еванс (Емапв) та інші, 1987, у). Мед. Спет. 30:1229; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Такі сполуки часто розробляються за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидоміметики, структурно подібні до терапевтично придатних пептидів, можуть застосовуватись для одержання подібного терапевтичного або профілактичного ефекту. Взагалі, пептидоміметики є структурно подібними до парадигматичного поліпептиду (тобто поліпептиду, що має біохімічну властивість або фармакологічну активність), наприклад, людського антитіла, але мають один або декілька пептидних зв'язків, факультативно заміненими зв'язком, вибраним з групи, що включає: -СН»е-
МН-, -СНе-5-, -СНо-СНе-, -СНЕСН- (цис і транс), -СООСН»-, -СН(ІОНІСН-- і -СН2г5О-, методами, добре відомими у цій галузі Систематична заміна однієї або декількох амінокислот консенсусної послідовності на ЮО-амінокислоту того самого типу (наприклад, ЮО-лізин замість | - лізину) може застосовуватись у певних варіантах здійснення для одержання більш стійких пептидів. На додаток до цього, обмежені пептиди, що містять консенсусну послідовність або по суті ідентичний варіант консенсусної послідовності, можуть одержуватись за допомогою методів, відомих у цій галузі (Різо (Ві?70), Герат (Сієгазсі), 1992, Апп. Вем. Віоспет. 61:387; ця робота включена до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі); наприклад, шляхом додання внутрішніх залишків цистеїну, здатних до утворення міжмолекулярних дисульфідних містків, що циклізують пептид.
Термін "антитіло" або "антитіло-пептид(и)" означає інтактне антитіло або його зв'язувальний фрагмент, що конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування. За певними варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують методами рекомбінантних ДНК. За додатковими варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Зв'язувальні фрагменти включають (але ними не обмежуються) К(аб), К(аб"), Каб)», Ем та одноланцюгові антитіла.
Термін "важкий ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно МОРЕ. Термін "легкий 60 ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно МСЕ. Непроцесований важкий ланцюг включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, Мн-ділянку, та три константні ділянки важкого ланцюга, Сні, Сн2 і Сн3. Мн-ділянка знаходиться на амінокінці поліпептиду, СнЗ-ділянка знаходиться на карбоксильному кінці. Термін "важкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований важкий ланцюг та його фрагменти. Непроцесований легкий ланцюг включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, Мі-ділянку, та константну ділянку легкого ланцюга, Сі-ділянку. Подібно важкому ланцюгу, варіабельна ділянка легкого ланцюга знаходиться на амінокінці поліпептиду. Термін "легкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований легкий ланцюг та його фрагменти. Е(ар)-фрагмент включає один легкий ланцюг, Сні і варіабельні ділянки одного важкого ланцюга. Важкий ланцюг молекули
Каб) не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга. Е(аб')- фрагмент включає один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, що містить більшу частину константної ділянки, між ділянками Сні і Сн2, завдяки чому між двома важкими ланцюгами може утворюватись міжланцюговий дисульфідний зв'язок з утворенням молекули К(аб')». Ем-ділянка включає варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів, однак їй бракує константних ділянок. Одноланцюгові антитіла є молекулами Гм, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів з'єднуються гнучким лінксером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, який являє собою антигензв'язувальну ділянку. Одноланцюгові антитіла докладно обговорюються у публікації міжнародної заявки на М/О 88/01649 і патентах США Мо 4,946,778 і Мо 5,260,203.
Слід розуміти, що двовалентне антитіло, окрім "мультиспецифічного" або "мультифункціонального" антитіла, за певними варіантами здійснення включає зв'язувальні сайти, що мають ідентичну антигенну специфічність.
При визначенні зв'язування та специфічності антитіла за цим винаходом, антитіло по суті пригнічує адгезію ліганду до рецептора, коли надлишок антитіла зменшує кількість ліганду, зв'язаного з рецептором щонайменше приблизно на 20 95, 40 95, 60 9, 80 95, 85 95 або більше (що визначається, іпієг аїа, із застосуванням іп міїго реакції конкурентного зв'язування).
Словосполучення "нейтралізуюче антитіло" означає молекулу антитіла, здатну блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію антигену-мішені, з яким вона зв'язується. Відповідно, "нейтралізуюче" анти-МСЯЕ антитіло є здатним блокувати або суттєво знизити ефекторну
Зо функцію МСЕ, наприклад, зв'язування з рецептором та/або викликання клітинної реакції.
Словосполучення "суттєво знизити" означає щонайменше приблизно 60 95, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 7095, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 75 95, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 80 95, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85 95, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше приблизно 90 95 зниження ефекторної функції антигену-мішені (наприклад, людського МОРЕ).
Термін "антигенна детермінанта" включає будь-яку детермінанту, за варіантом, якому віддають перевагу, поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. За певними варіантами здійснення антигенні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і за певними варіантами здійснення можуть мати специфічні об'ємні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Антигенна детермінанта являє собою ділянку антигену, яка зв'язується антитілом. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків та/або макромолекул. За варіантами, яким віддають перевагу, кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «108 М, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «107 М і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «1079 М.
Антитіло зв'язує "по суті ту саму антигенну детермінанту", що і еталонне антитіло, коли два антитіла розпізнають ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються. Найширше застосовуваними і швидкими методами визначення того, чи зв'язують два антитіла ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються, є конкурентні реакції, які можуть розроблятись для здійснення у найрізноманітніших форматах, із застосуванням міченого антигену або міченого антитіла. Як правило, антиген іммобілізують на субстраті, і здатність немічених антитіл до блокування зв'язування мічених антитіл визначається за допомогою радіоактивних або ферментних міток.
Термін "агент" застосовують у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних 60 сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів.
Терміни "мітка" або "мічений", що застосовуються у цьому описі, означають включення виявного маркера, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинових складових, які можуть бути виявлені міченим авідином (наприклад, стрептавідином, який, за варіантом, якому віддають перевагу, містить виявний маркер, наприклад, флуоресцентний маркер, хемілюмінесцентний маркер, або який має ферментативну активність, що може бути виявлена оптичними або колориметричними методами). За певними варіантами здійснення згадана мітка може також бути терапевтичною. У цій галузі відомі різні методи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть ефективно бути застосовані у методах, що розкриваються у цьому описі. Прикладами міток для поліпептидів є (але ними не обмежуються) наведені нижче: радіоактивні ізотопи або радіоактивні нукліди (наприклад, ЗН, С, 719М, 855, 90М, 99тТс, Пп, 125), 191), флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцинізотіоціанат або РІТС, родамін або лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, р-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки, гаптенові мітки, наприклад, біотинільні групи, та попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, розпізнані вторинним репортером (наприклад послідовності зі зв'язаними парами залишків лейцину, зв'язувальні сайти вторинних антитіл, ділянки зв'язування металів або мітки антигенних детермінант). За певними варіантами здійснення мітки приєднуються спейсерними групами (наприклад (СНг)», де п«приблизно 20) різної довжини для зменшення можливої стеричної невідповідності.
Термін "біологічна проба", що застосовується у цьому описі, означає (але не обмежується) будь-яку кількість речовини від живої особини або раніше живої особини. Такі живі особини включають (але не обмежуються) людей, мишей, мавп, пацюків, кролів та інших тварин. Такі речовини включають (але не обмежуються) кров, сироватку, сечу, клітини, органи, тканини, кістку, кістковий мозок, лімфатичні вузли та шкіру.
Термін "фармацевтичний агент або лікарський засіб", що застосовується у цьому описі, означає хімічну сполуку або композицію, здатну індукувати бажаний терапевтичний ефект у разі відповідного введення хворому. Слід розуміти, що словосполучення "фармацевтично ефективна кількість" у відношенні фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька антитіл за цим винаходом, означає, за цим винаходом, кількість згаданої фармацевтичної
Зо композиції, що є здатною до запобігання, у згаданого хворого, зниження порогу чутливості до зовнішніх подразників із поверненням згаданого порогу чутливості до рівня, порівнянного з тим, що спостерігається у здорових суб'єктів. "Розладом" є будь-який стан, що поліпшується у разі лікування за цим винаходом. Терміни "розлад" та "стан" застосовуються у цьому описі взаємозамінно і включають хронічні та гострі
Маг-опосередковані розлади або М(Е-опосередковані захворювання, у тому числі ті патологічні стани, які сприяють виникненню у ссавця згаданого розладу.
Словосполучення "Ма Е-опосередковане захворювання" та "МОаР-опосередкований стан" означають будь-який медичний стан або розлад, що пов'язується зі зростанням рівнів МСЕ або підвищенням чутливості до МО, у тому числі (але без обмеження) гострий біль, зубний біль, біль, викликаний травмою, біль, викликаний хірургічним втручанням, біль унаслідок ампутації або абсцесу, каузалгію, демієлінізаційні захворювання, невралгію трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, синдром набутого імунодефіциту ("СНІД"), стан, спричинений токсинами, стан, спричинений хіміотерапією, головний біль у цілому, мігрень, сильний нападоподібний головний біль з періодичними рецидивами, змішані серцево-судінні та несерцево-судинні синдроми, головний біль, викликаний гіпер- або гіпотензією, запалення у цілому, артрит, ревматичні захворювання, вовчак, остеоартрит, запальні захворювання кишечнику, синдром подразненої товстої кишки, запальні захворювання очей, запальні розлади або нестабільність сечового міхура, псоріаз, скарги на шкірні захворювання із запальними складовими, сонячну еритему, кардит, дерматит, міозит, неврит, дифузну хворобу сполучної тканини судин, хронічні запальні стани, запальний біль та пов'язані з цим гіпералгезію та алодинію, невропатичний біль та пов'язані з цим гіпералгезію та алодинію, діабетичний невропатичний біль, біль унаслідок пошкодження симпатичних сенсорних нервів, синдроми деаферентації, астму, пошкодження або дисфункцію епітеліальної тканини, простий герпес, порушення вісцеральної рухливості на респіраторних, статево-сечових, шлунково-кишкових або серцево-судинних ділянках, рани, опіки, алергічні шкірні реакції, свербіж, вітіліго, загальні захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, виразки шлунка, виразки дванадцятипалої кишки, вазомоторний або алергічний риніт, бронхіальні розлади, дисменорею, диспепсію, гастроезофагеальний рефлюкс, панкреатит і вісцералгію.
Словосполучення "ефективна кількість" та "терапевтично ефективна кількість", що застосовуються у цьому описі, у разі застосування відносно носія або фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька людських антитіл проти людського МО, означає кількість або дозу, достатню для викликання бажаного результату (тобто у разі лікування із застосуванням носія або фармацевтичної композиції, що містить людські антитіла проти людського МОЕ за цим винаходом, бажаним результатом є, наприклад, бажане зменшення запалення та/або болю) або підтримання зменшення рівня однієї або декількох біологічних активностей МСЕ, що спостерігається. Конкретніше, терапевтично ефективною кількістю є кількість людського антитіла(-іл) проти людського МОРЕ, достатня для пригнічення, впродовж деякого періоду часу, одного або декількох клінічно визначених патологічних процесів, що пов'язуються зі згаданим станом, наприклад, запалення або болю, у суб'єкта, якого піддають іп мімо лікуванню за допомогою згаданого засобу. За цим винаходом, "ефективна кількість" анти-
МО антитіла може запобігати, припиняти, контролювати або зменшувати відчуття болю, пов'язаного з будь-яким болісним медичним станом. У способах за цим винаходом термін "контроль" та його граматичні варіанти застосовуються для позначення запобігання, часткового або повного пригнічення, зменшення, затримки або уповільнення небажаного явища, наприклад, болю. Ефективна кількість може різнитися залежно від конкретного вибраного носія або людського антитіла(іл)у проти людського МО, і залежить також від різноманітних факторів та станів, пов'язаних із суб'єктом, якого піддають лікуванню, а також тяжкості розладу.
Наприклад, у разі, якщо носій або людське антитіло(-а) проти людського МОРЕ повинні вводитись іп мімо, факторами, які повинні прийматись до уваги, є вік, маса та стан здоров'я хворого, а також криві залежності "доза-ефект" та дані щодо токсичності, одержані у передклінічних дослідах на тваринах. Якщо засіб має контактувати з клітинами іп міо, слід розробити також різноманітні передклінічні іп міо дослідження для визначення таких параметрів, як поглинання, час напіввиведення, доза, токсичність тощо. Визначення ефективної кількості або терапевтично ефективної кількості даного засобу знаходиться у межах здатності фахівців у цій галузі.
Терміни "фактор росту нервової тканини" та "МОЄ", що вживаються у цьому описі, означають нативну послідовність МСЕ усіх видів ссавців, у тому числі рекомбінантний людський
Ма 1-120, представлений ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 30.
Зо Словосполучення "по суті чистий" або "по суті очищений", що застосовується у цьому описі, означає сполуку або різновид, представлений переважним різновидом (тобто на молярній основі, це різновид у складі композиції, кількісно переважаючий будь-який інший окремий різновид). За певними варіантами здійснення по суті очищеною фракцією є композиція, де згадані різновиди становлять щонайменше приблизно 50 відсотків (на молярній основі) усіх присутніх макромолекулярних різновидів. За певними варіантами здійснення по суті чиста композиція буде містити більше ніж приблизно 8095, 8595, 9095, 9595 або 9995 усіх макромолярних різновидів, присутніх у композиції. За певними варіантами здійснення різновид є очищеним по суті до однорідності (забруднювальні різновиди у складі композиції не можуть бути виявлені за допомогою традиційних методів виявлення), коли композиція містить по суті один макромолекулярний різновид.
Термін "хворий" означає людей і тварин. "Лікування" або "лікувати" означає терапевтичне лікування, профілактичні або запобіжні заходи. До тих, що потребують лікування, належать ті, що вже мають захворювання, а також схильні до появи захворювання, або ті, появі захворювання у яких необхідно запобігти.
Якщо контекстом не вимагається іншого, терміни у однині будуть включати множину, а терміни у множині будуть включати однину.
За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла, спрямовані проти МСЕ, можуть застосовуватись для лікування невропатичного та запального болю і МОагЕ-опосередкованих захворювань, у тому числі (але без обмеження) згаданих вище.
За одним з аспектів цього винаходу пропонуються повністю людські моноклональні антитіла, які були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським МО. За іншим аспектом винахід пропонує нуклеїнові кислоти, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінових молекул, зокрема, послідовності, що відповідають їхнім варіабельним ділянкам. Конкретними варіантами здійснення цього аспекту винаходу є послідовності, що відповідають гіперваріабельним ділянкам (СОН5), зокрема, СОВІ1І-СОВЗ, важких і легких ланцюгів, що пропонуються цим винаходом. За ще іншим аспектом, цей винахід пропонує клітини гібридом та лінії клітин, що експресують імуноглобулінові молекули та антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла за цим винаходом. Цей винахід бо пропонує також біологічно та імунологічно очищені препарати антитіл, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональних антитіл, що були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським МИ.
Можливість клонування та реконструювання людських локусів величиною у мільйони п.н. у дріжджових штучних хромосомах (УАСв) та їх введення до мишачої зародкової лінії, надає вигідний підхід до встановлення функціональних складових дуже великих або приблизно картованих локусів, а також розробки корисних моделей людського захворювання. Окрім того, застосування такої методики для заміни мишачих локусів їхніми людськими еквівалентами надає унікальну можливість зрозуміння механізмів експресії та регуляції продуктів людського гена у процесі їх розвитку, їх зв'язку з іншими системами та їх залучення до індукування і розвитку захворювання.
Важливим практичним варіантом застосування такої методики є "гуманізація" мишачої гуморальної імунної системи. Введення людських імуноглобулінових (Ід) локусів мишам, у яких ендогенні Ід гени були інактивовані, надає можливість вивчення механізмів, що лежать у основі програмованої експресії та складання антитіл, а також їх ролі у розвитку В-клітин. На додаток до цього, подібна методика забезпечує джерело продукування повністю людських моноклональних антитіл (МАБ5).
Термін "людське антитіло" означає антитіла, що мають варіабельні і константні ділянки, які по суті відповідають імуноглобуліновим послідовностям людської зародкової лінії. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються ссавцями, окрім людини, у тому числі (але без обмеження) гризунами, наприклад, мишами та пацюками, і зайцеподібними, наприклад, кроликами. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються клітинами гібридоми. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються рекомбінантним шляхом.
Термін "рекомбінантний" у відношенні антитіла означає антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними способами. Репрезентативними прикладами є антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, трансфікованого до клітини-хазяїна, антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних гібридних людських антитіл, антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами (дивись, наприклад, Тейлор Л.Д. (Тауїог 1.0.) та інші,
Зо Мис. Асідх Ве5. 20:6287-6295, (1992)) або антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені будь-якими способами, що залучають розщеплення послідовностей людського імуноглобулінового гена на інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні ділянки, одержані з імуноглобулінових послідовностей людської зародкової лінії.
Людські антитіла мають щонайменше три переваги над нелюдськими та гібридними антитілами для застосування при лікуванні людей: 1) оскільки ефекторна ділянка антитіла є людською, вона може краще взаємодіяти з іншими складовими частинами людської імунної системи (наприклад, ефективніше знищувати клітини- мішені за допомогою комплементзалежної цитотоксичності (СОС) або антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОСС)); 2) людська імунна система не повинна розпізнавати людське антитіло, як чужорідне і, завдяки цьому, гуморальна імунна відповідь проти такого введеного антитіла повинна бути слабкішою, аніж проти повністю чужорідного нелюдського антитіла або частково чужорідного гібридного антитіла; 3) повідомляли про те, що введені нелюдські антитіла мають набагато коротший час напіввиведення у системі кровообігу людини, аніж час напіввиведення людських антитіл. Час напіввиведення введених людських антитіл буде по суті ідентичним до часу напіввиведення природних людських антитіл, що надасть можливість рідшого введення менших доз.
Очікується, таким чином, що повністю людські антитіла зведуть до мінімуму імуногенні та алергійні реакції, притаманні мишачим моноклональним антитілам та дериватизованим із мишачих моноклональних антитіл і, завдяки цьому, підвищать ефективність та безпечність введених антитіл. Повністю людські антитіла за цим винаходом, таким чином, можуть застосовуватись для лікування хронічного та рецидивного болю, лікування якого потребує повторного введення антитіл. Таким чином, одна з конкретних переваг анти-МОЕ антитіл за цими винаходом полягає у тому, що згадані антитіла є повністю людськими і можуть вводитись хворим безболісним чином з одночасним зведенням до мінімального рівня негативних реакцій, які традиційно пов'язуються з людськими антимишачими антитілами або іншими раніше описаними частково людськими антитілами від інших видів, окрім людини.
Фахівець у цій галузі може одержати лінії мишей, дефіцитних щодо продукування мишачих бо антитіл, з великими фрагментами людських Ід локусів, завдяки чому такі миші продукують людські антитіла за відсутності мишачих антитіл. Великі людські Ід фрагменти можуть зберігати велике розмаїття варіабельних генів, а також відповідну регуляцію продукування і експресії антитіл. Завдяки використанню мишачих клітинних механізмів для диверсифікації та добору антитіл і відсутності імунологічної толерантності до людських білків, спектр репродукованих людських антитіл у таких мишачих лініях надає високоспоріднені антитіла проти будь-якого антигену, що становить інтерес, у тому числі людських антигенів. За допомогою гібридомної технології можуть продукуватись і відбиратись антигенспецифічні людські моноклональні антитіла бажаної специфічності.
Можуть застосовуватись трансгенні тварини (наприклад, миші), що є здатними, у разі імунізації до продукування повного спектру людських антитіл за відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Наслідком перенесення сукупності людських зародкових імуноглобулінових генів до таких ембріональних мутантних мишей буде продукування людських антитіл у разі антигенної стимуляції (дивись, наприклад, Джейкобовіц (ЧаКороміїв) та інші, Ргос.
Маїй!. Асад. сі. ОБА, 90:2551-2555, (1993); Джейкобовіц (ЧаКобоміїв) та інші, Майте, 362:255-258, (1993); Бруггемен (Вгиддетапп) та інші, Меаг іп Іттип., 7:33 (1993); Маїште 148:1547-1553 (1994), Майте Віоїесппоіоду 14:826 (1996); Гросс Дж.А. (1055 У.А.) та інші, Маїшиге, 404:995-999 (2000); та патенти США Мо 5,877,397, Мо 5,874299, Мо 5,814,318, Мо 5,789,650, Мо 5,770,429, Мо 5,661,016, Мо 5,633,425, Мо 5,625,126, Мо 5,569,825 та Мо 5,545,806 (кожен з яких включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання для будь-якої цілі)). Людські антитіла можуть також продукуватись у бібліотеках із проявленням у фагах (Хугенбум (Ноодепроот), Вінтер (УУіпієг), У. Мої. ВіоІ., 227:381 (1992); Маркс (МаїК5) та інші, У. Мої. ВіоіІ., 222:581 (1991)).
Доступними для одержання людських моноклональних антитіл є також методи Коул (Соіє) та інших і Бернер (Воеєтпег!) та інших (Коул (Соіє) та інші, Мопосіопа! Апіїродієх апа Сапсег ТПнегар,
Адап В. І ів5, стор. 77 (1985); Бернер (Воеєгпеї!) та інші, У. Іттипої, 147(1):86-95 (1991)).
Рекомбінантні людські антитіла можуть також бути піддані іп міо мутагенезу (або, у разі застосування тварин, трансгенних за людськими Ід послідовностями, іп мімо соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності МН та Мі ділянок рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, у разі одержання з послідовностей, пов'язаних із людськими зародковими МУН та МІ. послідовностями, можуть не існувати за природних умов у
Зо межах зародкового спектру людських антитіл іп мімо.
За певними варіантами здійснення досвідчений фахівець для продукування гібридних антитіл такими мишами може застосовувати константні ділянки від інших видів, окрім людини, разом із людською(ими) варіабельною(ими) ділянкою(ами).
Структура природних антитіл
Структурні одиниці природних антитіл являють собою, як правило, тетрамер. Кожен із таких тетрамерів, як правило, складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один повномірний "легкий" ланцюг (молекулярна маса якого становить, як правило, приблизно 25 кДа) і один повномірний "важкий" ланцюг (молекулярна маса якого становить, як правило, приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева ділянка кожного легкого і важкого ланцюга, як правило, включає варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 або більше амінокислот, що, як правило, несе відповідальність за розпізнавання антигенів. Карбоксикінцева ділянка кожного ланцюга, як правило, має константну ділянку, що несе відповідальність за ефекторну функцію. Людські легкі ланцюги, як правило, класифікуються як легкі ланцюги типів каппа і ламбда. Важкі ланцюги, як правило, класифікуються як важкі ланцюги типів мю, дельта, гамма, альфа або епсилон і визначають ізотип антитіла, як ЯМ, дО, да, ІДА та ІЧЕ, відповідно. Ід має декілька підкласів, у тому числі (але без обмеження), Ідс1, ІдСе2г, ДдсЗ та ІдДС4. (ДМ має підкласи, що включають (але не обмежуються) ІДМІ та ІЗ9М2. ІДА подібним чином підрозділяється на підкласи, що включають (але не обмежуються) ІдАї та ІдАг. Варіабельні та константні ділянки у межах повномірних легких і важких ланцюгів сполучаються, як правило, ")" ділянкою, довжина якої становить приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг включає також "ОО" ділянку, довжина якої становить приблизно 10 або більше амінокислот. Дивись, наприклад, РОМОАМЕМТАЇ ІММОМОГ ОС, розділ 7, (редактор Пол В. (Раш! МУ.)), 1989, Вамеп Ргезв, М.М. (ця робота включена до цього опису у повному обсязі шляхом посилання для будь-яких цілей). Варіабельні ділянки кожної пари (легкий/важкий ланцюг) утворюють, як правило, антигензв'язувальний центр.
Варіабельні ділянки, як правило, демонструють таку саму загальну структуру, що і відносно консервативні остовні ділянки (ЕР), і сполучаються трьома гіперваріабельними ділянками, які називають також Ппу-ділянками (СОРВ5). Гіперваріабельні ділянки двох ланцюгів кожної пари впорядковано розміщаються остовними ділянками, які можуть забезпечити можливість бо зв'язування зі специфічною антигенною детермінантою. Від М-кінця до С-кінця варіабельні ділянки як легких, так і важких ланцюгів включають, як правило, домени ЕНІ, СОВІ, ЕН2г, СОН,
ЕВЗ, СОВЗ та ЕВ4. Приналежність амінокислот до кожного домену відповідає, як правило, визначенням, наведеним у довіднику Кабаї б5едиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегевзі (1987 та 1991, Маїйопаї Іпвійшіез ої Неан, Веїпезаа, штат Мериленд) та роботах Чотья (Споїпіа), Леск (І е5К), 1987, 9. Мої. Віої. 196:901-917; Чотья (Споїпіа) та інші, 1989, Маїшиге 342:878-883.
Біспецифічні або гетеровалентні антитіла
Біспецифічне або гетеровалентне антитіло, як правило, являє собою штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкий ланцюг/легкий ланцюг та два різні зв'язувальні центри.
Біспецифічні антитіла можна одержати різноманітними методами, у тому числі (але без обмеження) шляхом злиття гібридом або зв'язування Е(аб')-фрагментів. Дивись, наприклад,
Сонгсівілаії (б5оподвзіміїаї), Лахман (Іасптапп), 1990, Сііп. Ехр. Іттипої. 22:315-321; Костелні (Козіє!пу) та інші, 1992, У. Іттипої. 148:1547-1553.
Одержання антитіл
Цей винахід пропонує антитіла, що зв'язуються з людським МО. Ці антитіла можуть продукуватись шляхом імунізації повномірним МОРЕ або його фрагментами. Антитіла за цим винаходом можу бути поліклональними або моноклональними та/Лабо можуть бути рекомбінантними антитілами. За варіантами, яким віддають перевагу, антитілами за цим винаходом є людські антитіла, які одержують, наприклад, шляхом імунізації трансгенних тварин, здатних до продукування людських антитіл (дивись, наприклад, міжнародну патентну заявку, публікація УУО 93/12227).
Гіперваріабельні ділянки (СОВ5) варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів анти-МаЕ антитіл за цим винаходом можуть пересаджуватись до остовних ділянок (ЕВв) того самого або іншого виду. За певними варіантами здійснення гіперваріабельні ділянки варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів анти-МОСЕ антитіла можуть пересаджуватись до консенсусних людських остовних ділянок. Для одержання консенсусних людських остовних ділянок, остовні ділянки амінокислотних послідовностей декількох людських важких або легких ланцюгів впорядковано розміщують для визначення консенсусних амінокислотних послідовностей.
Остовні ділянки важкого або легкого ланцюга анти-МОСЯЕ антитіла можуть бути замінені основними ділянками іншого важкого або легкого ланцюга. Рідкі амінокислоти у остовних ділянках важких і легких ланцюгів анти-МСЕ антитіла, як правило, не замінюються, у той час як решта амінокислот остовних ділянок можуть замінюватись. Рідкими амінокислотами є специфічні амінокислоти, які знаходяться у положеннях, які вони, як правило, у остовних ділянках не займають. Пересаджені варіабельні ділянки анти-МСЕ антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись із константною ділянкою, що відрізняється від константної ділянки анти-МаОЕ антитіла. За альтернативним варіантом, пересаджені варіабельні ділянки є частиною одноланцюгового Ем-антитіла. Пересадження гіперваріабельної ділянки описують, наприклад, у патентах США Ме 6,180,370, Мо 5,693,762, Мо 5,693,761, Ме 5,585,089 та Мо 5,530,101, які включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі.
Антитіла за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, одержують за допомогою трансгенних мишей, до антитілопродукувальних клітин яких була введена значна частина людського антитілопродукувального локусу. Ці миші були також додатково піддані генно-інженерним заходам для того, щоб перетворитись на дефіцитних із продукування ендогенних мишачих антитіл. Такі миші є здатними до продукування людських імуноглобулінових молекул і антитіл, і не продукують мишачих імуноглобулінових молекул та антитіл або продукують їх у значно зменшеному обсязі. Методики досягнення такого результату розкриваються у патентах, заявках та посиланнях, які розкриваються у наведеному описі. За варіантами, яким віддають перевагу, досвідчений фахівець може застосовувати методи, розкриті у міжнародній патентній заявці, публікація УУО 98/24893, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. Дивись також роботу Мендес (Мепаеє?) та інші, 1997,
Маїшге Сепеїїсв 15:146-156, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою.
Моноклональні антитіла (тАб5) за цим винаходом можуть продукуватись різноманітними методами, у тому числі за традиційною методикою продукування моноклональних антитіл, наприклад, за стандартною методикою гібридизації соматичних клітин Колер (Копіє!) та
Мілстейн (Міївівїп) (1975, Маїште 256:495). Незважаючи на те, що перевагу віддають методикам гіоридизації соматичних клітин, застосовуватись, у принципі, можуть і інші методики продукування моноклональних антитіл, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація В- лімфоцитів.
Тваринною системою для одержання гібридом, якій віддають перевагу, є миші. Спосіб продукування гібридом мишачим організмом є добре розробленим, а схеми імунізації та методи виділення імунізованих спленоцитів для злиття є добре відомими у цій галузі. Відомими є також клітини, що зливаються (наприклад, клітини мишачої мієломи) та методики злиття.
За варіантом, якому віддають перевагу, людські моноклональні антитіла, спрямовані проти
Ма, можуть одержуватись за допомогою трансгенних мишей, які, замість мишачої імунної системи, несуть складові частини людської імунної системи. Ці трансгенні миші, яких у цьому описі позначають як "НиМар" мишей, несуть в собі мінілокус людського імуноглобулінового гена, що кодує неаранжовані імуноглобулінові послідовності людського важкого ланцюга (типів у та у) і легкого ланцюга типу к, разом із цільовими мутаціями, які інактивують локуси ендогенних ланцюгів типів м і к (Лонберг (І опрего) та інші, 1994, Маїйге 368:856-859). Відповідно, миші демонструють знижену експресію мишачого ІДМ або к і, у відповідь на імунізацію, введені трансгени людського важкого ланцюга і легкого ланцюга зазнають зміну класу і соматичну мутацію з продукуванням високоспоріднених людських моноклональних антитіл дае к (Лонберг (опрего) та інші (дивись вище); Лонберг (І опрего), Гушар (Низлаїг), 1995, Іпіет. Веу. Іттипої. 13:69-93; Гардінг (Нагаіпу), Лонберг (Гопрега), 1995, Апп. М.М. Асайд. Зсі. 764:536-546).
Одержання НимМар мишей докладно описано у роботах Тейлор (Тауїог) та інші, 1992, Мисівіс
Асіаз Рез. 20:6287-6295; Чен (Спеп) та інші, 1993, Іпієгпайопа! Іттипоіоду, 5:647-656; Тайон (Тиаїйоп) та інші, 1994, 9). Іттипої. 152: 2912-2920; Лонберг (Іопрего) та інші, 1994, Маїшиге 368:856-859; Лонберг (ІГопрег9), 1994, НапароокК ої Ехр. Ріпаптасоіоду 113:49-101; Тейлор (Тауюою та інші, 1994, Іпіегпайопа! Іттипоіоду 6:579-591; Лонберг (І опрегу), Гушар (Низлаг), 1995, Іптет. Веум. Іттипої. 13:65-93; Гардінг (Нагаїіпо), Лонберг (І опбрега), 1995, Апп. М.У. Асай.
Зсі 764:536-546; Фішвайлд (РівНУліІіЯ) та інші, 1996, Маїйге Віоїеснппоіоду 14:845-851, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Дивись також патенти США Мо 5,545,806; Мо 5,569,825; Мо 5,625,126; Мо 5,633,425; Мо 5,789,650; Мо 5,877,397; Мо 5,661,016; Мо 5,814,318; Мо 5,874,299; та Мо 5,770,429 (усі на ім'я Лонберг (І опрега) та Кей (Кау)), а також патент США Мо 5,545,807 (на ім'я Сурані (Зигапі) та інші); міжнародні заявки УМО 93/1227 (опублікована 24 липня 1993 року); МО 92/22646 (опублікована 23 грудня 1992 року); та МО 92/03918 (опублікована 19 березня 1992 року), розкриття яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За альтернативним варіантом, для одержання людських анти-
МОР антитіл можуть застосовуватись трансгенні миші ліній НСо7, НСо12 і КМ, опис яких
Зо представлено у наведених нижче Прикладах.
Цей винахід пропонує людські моноклональні антитіла, які є специфічними до і нейтралізують біологічно активні людські МОЄ поліпептиди. Цей винахід пропонує також амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюгів антитіла, які є високоспецифічними до і нейтралізують МСЕ поліпептиди, у тому разі, коли вони зв'язуються з ними. Ця висока специфічність надає можливість людським антитілам проти людського МОЕ та людським моноклональним антитілам із подібною специфічністю бути ефективним імунотерапевтичним засобом для лікування МОаР-асоційованих захворювань.
За одним з аспектів, цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що зв'язують ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіло 404, яке пропонується цим винаходом.
За одним з аспектів, цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що містять щонайменше одну з амінокислотних послідовностей, представлених ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 10, Мо 12, Мо 14, Мо 16, Мо 18, Мо 20, Мо 22, Мо 24 та Мо 79-130, що зв'язують антигенну детермінанту МСЕ поліпептидів із високою спорідненістю і є здатними до антагонізування активності МСЕ поліпептидів. За варіантом, якому віддають перевагу, ці антитіла зв'язують ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіло 404, яке пропонується цим винаходом.
За варіантами, яким віддають перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з МОГ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х109 М або менше і пригнічують Маг-індуковану виживаність у іп міо реакції нейтралізації з ІСбо 1х107 М або менше. За варіантами, яким віддають більшу перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з МОЄ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х1079 М або менше і пригнічують МОаЕ-індуковану виживаність у іп міїго реакції нейтралізації з ІСво 1х108 М або менше. За варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з людським МОРЕ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х10-7 М або менше і пригнічують МОЕ-індуковану виживаність у іп міо реакції з
ІСво 1х109 М або менше. Приклади людських антитіл проти людського МО, які задовольняють вищезгаданим критеріям зв'язування та нейтралізації, наведені у цьому описі.
Людське антитіло проти людського МСЕ за цим винаходом, якому віддають найбільшу перевагу, позначається як 404 і має МІ та МН поліпептидні послідовності, представлені 60 ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12 та ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, відповідно. Полінуклеотидна послідовність,
що кодує МІ ї МН 404 представлена ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 11 та ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 9, відповідно. Властивості людських антитіл проти людського МОБ за цим винаходом розкриваються, зокрема, у Прикладах. Особливої уваги заслуговує показана у цьому описі висока спорідненість до МОЄ поліпептиду і висока здатність антагонізувати активність МИЕ поліпептиду.
Константа дисоціації (Ко) людського антитіла проти людського МСЕ може визначатись поверхневим плазмонним резонансом, як у цілому описано у Прикладі 9. Взагалі, аналізом поверхневого плазмонного резонансу (ЗРА) із застосуванням системи ВіАсоге (РНаптасіа
Віозепзог, Різсаїажау, штат Нью-Джерсі) у масштабі реального часу визначають зв'язувальні взаємодії між лігандом (рекомбінантний МСЕ поліпептид, іммобілізований на біосенсорній матриці) та речовиною, яку піддають аналізу (антитіла у розчині). Аналіз поверхневого плазмонного резонансу може здійснюватись також шляхом іммобілізації речовини, яку піддають аналізу (антитіла на біосенсорній матриці), і представленням ліганду (рекомбінант М у розчині).
Константа дисоціації (Ко) людського антитіла проти людського МСЕ може визначатись також за методикою КіпЕхХА. За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла зв'язуються з
МОБ з Ко у межах приблизно 109 М-1072 М. Термін "Ко", що застосовується у цьому описі, означає константу дисоціації конкретної взаємодії антитіла-антигена. Для цілей цього винаходу
Ко визначали як показано у Прикладі 9.
За варіантами, яким віддають перевагу, антитіла за цим винаходом належать до ізотипів
ІС, Ічс2, ОЗ або Ідс4. За варіантом, якому віддають перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу ДСЗ. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу ЇДС1. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу ІДС22. За іншими варіантами здійснення антитіла за цим винаходом належать до ізотипів
ІОМ, ІдА, І9Е або Ідо. За варіантами здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, згадані антитіла містять людський легкий ланцюг типу каппа та людський важкий ланцюг да, дае,
ІЗ або Ідсі. Експресію антитіл за цим винаходом, що містять константну ділянку важкого ланцюга Ідсі або ІдД022, описують у наведених нижче Прикладах. За конкретними варіантами здійснення варіабельні ділянки згаданих антитіл лігуються до іншої константної ділянки, окрім константної ділянки ізотипів ДС, ІдСе, Ідс3 або Ідс24. За певними варіантами здійснення
Зо антитіла за цим винаходом клонували для експресії у клітинах ссавців.
За певними варіантами здійснення наслідком консервативних модифікацій важких ланцюгів і легких ланцюгів анти-МС антитіл (і відповідних модифікацій кодувальних нуклеотидів) буде одержання анти-МОЕ антитіл, що мають функціональні і хімічні характеристики, подібні відповідним характеристикам анти-МОЕ антитіл, що розкриваються у цьому описі. У протилежність до цього, значні модифікації функціональних та/або хімічних характеристик анти-
МО антитіл можуть здійснюватись шляхом вибору замін у амінокислотній послідовності важких і легких ланцюгів, що значно відрізняються за їх ефектом на підтримання (а) структури молекулярного остову на ділянці заміни, наприклад, листової або спіральної конформації, (Б) заряду або гідрофобності молекули на цільовій ділянці, або (с) об'єму бічного ланцюга.
Наприклад, "консервативна амінокислотна заміна" може залучати заміну нативного амінокислотного залишку ненативним залишком, що незначно або зовсім не впливає на полярність або заряд амінокислотного залишку у цьому положенні. Окрім того, будь-який нативний залишок поліпептиду може також бути заміненим на аланін, як описувалось раніше для "мутагенезу методом ідентифікації аланіну".
Бажані амінокислотні заміни (консервативні або неконсервативні) можуть визначатись фахівцями у цій галузі під час виникнення необхідності у таких замінах. За певними варіантами здійснення амінокислотні заміни можуть застосовуватись для ідентифікації важливих залишків анти-МСЕ антитіла або для посилення чи ослаблення спорідненості анти-МОЕ антитіл, опис яких наведено.
Як добре відомо, наслідком незначних замін у амінокислотній послідовності, наприклад, видалення, додання або заміни однієї, декількох або навіть декількох десятків амінокислот, може бути одержання алельної форми вихідного білка, яка має по суті ідентичні властивості.
Таким чином, на додаток до антитіл, опис яких наведено, інші "по суті гомологічні" антитіла можуть легко розроблятись і одержуватись із застосуванням різноманітних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Взагалі, модифікації генів можуть легко здійснюватись різноманітними добре відомими методами, наприклад, сайт-спрямованим мутагенезом. Таким чином, цей винахід передбачає "варіантні" або "мутантні" людські антитіла проти МОРЕ, що мають характеристики по суті подібні характеристикам людських антитіл проти
МО, які розкриваються у цьому описі. (Дивись, наприклад, УУО 00/56772, яку у повному обсязі бо включено до цього опису шляхом посилання). Таким чином, згаданий термін "варіантне" або
"мутантне" у відношенні до людського антитіла проти МО означає будь-яку зв'язувальну молекулу (молекулу Х) (ї) гіперваріабельні ділянки СОВІ, СОВ2 і СОВЗ важкого ланцюга або гіперваріабельні ділянки СОВІ, СОВ2 і СОВЗ легкого ланцюга якої, взяті у цілому, є щонайменше на 80 95 гомологічними, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше на 90 95 гомологічними, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше на 95 95 гомологічними гіперваріабельним ділянкам, представленим ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 14, Мо 18 і
Мо 22 або ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 16, Мо 20 і Мо 24, відповідно, і (ії) варіант або мутант якої є здатним до пригнічення активності людського МСЕ такою самою мірою, що і еталонне людське антитіло проти МОБ, яке має остовні ділянки, ідентичні остовним ділянкам молекули Х.
За звичайних умов варіант людського антитіла проти МСЕ буде мати гіперваріабельні ділянки легкого та/або важкого ланцюга, які, взяті у цілому, мають щонайменше приблизно 80 95 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 85 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 91 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 92 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 94 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 96 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 97 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 99 95 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 14, Мо 18 їі Мо 22 тал"або ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 16,
Мо 20 і Мо 24, відповідно.
За варіантом, якому віддають більшу перевагу, варіант людського антитіла проти МОЕ буде мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 80 95 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 81 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 82 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 83 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 86 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 87 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 88 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8995 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 91 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 92 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 93 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 96 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 97 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 98 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими
ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Ме 12, Мо 80, Мо 82, Мо 84, Мо 86, Мо 88, Мо 89, Мо 90 або Ме 91, та/або варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 70 95 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 75 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 80 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 81 95 ідентичність послідовностей, бо за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 82 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 84 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 86 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 87 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 89 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 91 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 92 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 94 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 96 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 97 95 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 99 95 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 10, Мо 81, Мо 83, Мо 85 або Мо 87.
Термін "варіант" відносно полінуклеотиду означає нуклеїновокислотну молекулу, що має щонайменше приблизно 75595 ідентичність нуклеїновокислотної послідовності з полінуклеотидною послідовністю за цим винаходом. За звичайних умов полінуклеотидний варіант буде мати щонайменше приблизно 7595 ідентичність нуклеїновокислотної послідовності, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 80 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 81 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за
Зо варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 82 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 83 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8495 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8695 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 87 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8895 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 89 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 91 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9295 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 93 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 95 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9695 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 97 95 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей з новою амінокислотною послідовністю, що розкривається у цьому описі.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує антитіла, що мають відсоток ідентичності з антитілом за цим винаходом або антитіло, що містить варіабельну ділянку 60 важкого ланцюга, варіабельну ділянку легкого ланцюга, СОВІТ, СОВ2 або СОВЗ ділянку, що має відсоток ідентичності з варіабельною ділянкою важкого ланцюга, варіабельною ділянкою легкого ланцюга, СОНІ, СОН2 або СОВЗ ділянкою за цим винаходом, як показано у наведеному у цьому описі Прикладі 10 та Фігурах 5-10.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 70 95 або 75 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 80 б, 85 95 або 95 95 гомологічною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8095, 8595 або 9595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 75 95, 80 95 або 85 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 85, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 75 95 або 80 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 56 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 70 95, 7595, 80 956 або 90 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 85 95 або 90 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 80, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 7495, 9095 або 9495 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 88, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 80 95, 85 95 або 87 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 89, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8595, 9095 або 9495 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 90, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 85 Ус, 90 9, 95 965 або 99 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 91, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 80 95, 90 95, 95 95 або 96 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 82, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95, 85 Фо, 90 У, 95 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 84, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8595, 9095, 9595, 9895 або 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 86, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За певними іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОВІ людського важкого ланцюга, де згадана СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 4095 або 6095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 98, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 105, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 110 або
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 22, чи її антигензв'язувальному або імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОНВ2 людського важкого ланцюга, де згадана СОНВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 7095, 8295 або 94595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 99, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному бо імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7695 ідентичною амінокислотній
Зо послідовності, представленій, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 106, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 5995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме18, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 96 ідентичною /амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 117, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 7095, 7595 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 111, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За ще іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОВІТ людського легкого ланцюга, де згадана СОВІ має амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 70 95 або 80 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 101, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 95, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 119, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 75 95, 80 95 або 90 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 122, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 80 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 125, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 24, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 107, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 70 95 або 80 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 113, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За додатковими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОВ2 людського легкого ланцюга, де згадана СОВ2 має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 70 95 або 85 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 102, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 ідентичною /амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 96, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме120, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 123, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 126, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 129, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 20, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме108, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 133, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 114, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОВЗ людського легкого ланцюга, 60 де згадана СОНЗ має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 70 95 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 103, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 97, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме121, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 або 78 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 127, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 130, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70 95 або 85 95 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 109, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 78 95 ідентичною /амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 134, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 115, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
Послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіла 404 представлені
ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 10 і Мо 12, відповідно. Однак багато потенційних залишків, що контактують із гіперваріабельною ділянкою, є придатними для заміни іншими амінокислотами, але незважаючи на це, антитіло зберігає значний ступінь спорідненості з антигеном. Подібним же чином, багато залишків остовних ділянок, які не контактують із гіперваріабельними ділянками важких і легких ланцюгів, можуть сприйняти заміни амінокислот із відповідних положень інших людських антитіл, людських консенсусних амінокислот або з інших мишачих антитіл, без значної втрати спорідненості або неімуногенності людського антитіла. Можна
Зо вдатись до вибору різних альтернативних амінокислот для одержання версій розкритих анти-
МО антитіл та їхніх фрагментів, що мають різні комбінації спорідненості, специфічності, неімуногенності, легкості одержання та інші бажані властивості.
За альтернативними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть експресуватись у інших лініях клітин, окрім ліній клітин гібридом. За цими варіантами здійснення для трансформації відповідних клітин-хазяїв ссавців можуть застосовуватись послідовності, що кодують конкретні антитіла. За цими варіантами здійснення трансформація може здійснюватись за допомогою будь-якого відомого способу введення полінуклеотидів до клітини-хазяїна, у тому числі, наприклад, шляхом пакування полінуклеотиду до вірусу (або до вектора на основі вірусного геному) і трансдукції клітини-хазяїна згаданим вірусом (або вектором) чи за допомогою методів трансфекції, відомих у цій галузі, як описано у патентах США Мо 4,399,216,
Мо 4,912,040, Мо 4,740,461 та Мо 4,959,455 (усі з яких включені до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі). Взагалі, застосована методика трансформації може залежати від хазяїна, що піддається трансформації. Методи введення гетерологічних полінуклеотидів до клітин ссавців є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) декстран- опосередковану трансфекцію, осадження фосфатом кальцію, полібрен-опосередковану трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, пакування полінуклеотиду(-ів) до ліпосом та пряму мікроін'єкцію ДНК до ядер.
Нуклеїновокислотну молекулу, що кодує амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга, варіабельної ділянки важкого ланцюга, константної ділянки легкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга МОЕ-антитіла за цим винаходом, вводять до відповідного експресійного вектора за допомогою стандартного методу лігування. За варіантами, яким віддають перевагу, константна ділянка важкого ланцюга або легкого ланцюга анти-МСОЕ антитіла додається до С-кінця відповідної варіабельної ділянки і лігується до експресійного вектора. Згаданий вектор, як правило, вибирають таким чином, щоб він був функціональним у конкретній застосованій клітині-хазяїні (тобто згаданий вектор є сумісним із механізмами клітини-хазяїна такою мірою, що може відбуватись ампліфікація та/або експресія гена). Огляд експресійних векторів дивись у роботі МЕТН. ЕМ/2. 185 (редактор Геддел (Соєдавє!)), 1990, Асадетіс Ргезв.
За типовим варіантом, експресійні вектори, що застосовуються у будь-якій з клітин-хазяїв, 60 будуть містити послідовності для підтримання плазмід та для клонування і експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, які за певними варіантами здійснення у сукупності називають "фланкуючими послідовностями", будуть, як правило, включати одну або декілька з наведених нижче нуклеотидних послідовностей: промотор, одну або декілька енхансерних послідовностей, сайт ініціації реплікації, термінатор транскрипції, повну інтронну послідовність, що містить донорну та акцепторну точку сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, сайт зв'язування рибосоми, послідовність поліаденілування, полілінкерну ділянку для введення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид для експресії та селективний маркерний елемент. Кожна з цих послідовностей обговорюється нижче.
За факультативним варіантом, згаданий вектор може містити послідовність кодування "мітки", тобто олігонуклеотидну молекулу, розміщену на 5' або 3' кінці поліпептидної кодувальної послідовності анти-МОСЕ антитіла; згадана олігонуклеотидна послідовність кодує поліНів (наприклад, гексанів) або іншу "мітку", наприклад, РІ АС, НА (гемаглютинін вірусу грипу) або тус, для яких існують комерційно доступні антитіла. Ця мітка, як правило, зливається з поліпептидом при його експресії, ії може правити за засіб афінного очищення або виявлення
МО антитіла у клітині-хазяїні. Афінне очищення може здійснюватись, наприклад, шляхом хроматографування на колонках із застосуванням антитіл проти згаданої мітки, як афінної матриці. За факультативним варіантом, згадана мітка може у подальшому видалятись з очищеного анти-МОЕ антитіла різними способами, наприклад, шляхом застосування певних пептидаз для розщеплення.
Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто від того самого виду та/або штаму, що і клітина-хазяїн), гетерологічними (тобто від інших видів, окрім виду клітини-хазяїна або штаму), гібридними (тобто комбінація фланкуючих послідовностей з більше ніж одного джерела), синтетичними або нативними. Як таким, джерелом фланкуючої послідовності може бути будь-який прокаріотний або еукаріотний організм, будь-який хребетний або безхребетний організм або будь-яка рослина, за умови, що згадана фланкуюча послідовність є функціональною у клітинних механізмах клітини-хазяїна і може бути активованою клітинними механізмами клітини-хазяїна.
Фланкуючі послідовності, придатні для згаданих векторів за цим винаходом, можна одержати за допомогою будь-якого з декількох способів, добре відомих у цій галузі. За типовим варіантом, фланкуючі послідовності, придатні для цього винаходу, будуть попередньо ідентифікуватись шляхом картування та/або рестриктазного розщеплення і можуть, таким чином, виділятись з відповідного тканинного джерела за допомогою відповідних рестриктаз. У деяких випадках, повна нуклеотидна послідовність фланкуючої послідовності може бути відомою. У такому разі, фланкуюча послідовність може бути синтезована за допомогою наведених у цьому описі методів синтезу або клонування нуклеїнових кислот.
Незалежно від того, чи є відомою уся або лише частина фланкуючої послідовності, цю фланкуючу послідовність можна одержати за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСВ) та/або шляхом скринінгу геномної бібліотеки за допомогою відповідного зонда, наприклад, олігонуклеотиду та/або фрагмента фланкуючої послідовності від того самого або іншого виду. У разі, коли фланкуюча послідовність є невідомою, фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, може бути виділеним із більшого відрізку ДНК, що може містити, наприклад, кодувальну послідовність або навіть інший ген або гени. Виділення може здійснюватись шляхом рестриктазного розщеплення з одержанням відповідного фрагмента ДНК з подальшим виділенням шляхом очищення на лунках із гелем агарози, хроматографування на колонках
ОіадепФ (Спаївжопи, штат Каліфорнія) або за допомогою інших методів, відомих досвідченому фахівцю. Вибір відповідних ферментів для досягнення згаданої мети буде очевидним для пересічного фахівця у цій галузі.
Сайт ініціації реплікації являє собою, як правило, частину тих прокаріотних експресійних векторів, які одержують з комерційних джерел, і згаданий сайт допомагає у разі ампліфікації вектора у клітина-хазяїні. Якщо обраний вектор не містить сайту ініціації реплікації, його можна синтезувати хімічним шляхом, виходячи з відомої послідовності, та лігувати до вектора.
Наприклад, сайт ініціації реплікації з плазміди РВА322 (фірма Мем Епдіапа Віоїар5, Вемепу, штат Массачусетс) є придатним для більшості грамнегативних бактерій, а різноманітні вірусні сайти (наприклад, 5М40, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу везикулярного стоматиту (УМ) або вірусу папіломи, наприклад, вірусу папіломи людини (НРУ) або вірусу папіломи великої рогатої худоби (ВРУ)) є придатними для клонування векторів у клітинах ссавців. Взагалі, така складова, як сайт ініціації реплікації не є необхідною для експресійних векторів ссавців (наприклад, сайт ініціації реплікації 5440 часто застосовують лише тому, що він містить також ранній промотор бо вірусу).
Термінатор транскрипції, як правило, знаходиться у прямому (3) напрямку відносно кінця поліпептидної кодувальної ділянки і призначений для закінчення транскрипції. Термінатор у клітинах-прокаріотах являє собою, як правило, С-С-збагачений фрагмент, за яким іде полі(Т)- послідовність. Незважаючи на те, що термінатор легко клонується з бібліотеки або навіть одержується з комерційних джерел як частина вектора, він може бути легко синтезованим за допомогою методів синтезу нуклеїнових кислоти, наприклад, наведених у цьому описі.
Маркерний ген, що селектується, Селектований маркерний ген кодує білок, необхідний для виживання та росту клітини-хазяїна, яка вирощується на селективному культуральному середовищі. Типові селектовані маркерні гени кодують білки, які (а) забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, тетрацикліну або канаміцину у разі прокаріотних клітин-хазяїв; (Б) доповнюють ауксотрофні дефіцити клітини; або (с) постачають критичні поживні речовини, недоступні із живильних середовищ повного або певного складу.
Переважними селектованими маркерними генами є ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до ампіциліну та ген стійкості до тетрацикліну. Перевага полягає у тому, що ген стійкості до неоміцину може також застосовуватись для добору як прокаріотних, так і еукаріотних клітин- хазяїв.
Для ампліфікації гена, який буде експресуватись, можуть застосовуватись інші селектовані гени. Ампліфікація являє собою процес, під час якого гени, необхідні для продукування білка, критичного для росту або виживання клітини, послідовно повторюються у хромосомах наступних генерацій рекомбінантних клітин. Прикладами придатних селектованих маркерів для клітин ссавців є дигідрофолатредуктаза (ОНЕРЕ) та безпромоторні гени тимідинкінази. Клітини- трансформанти ссавців піддаються селекційному тиску, у разі якого лише трансформанти виявляються специфічно пристосованими для виживання завдяки присутності у векторі селектованого гена. Селекційний тиск накладається шляхом культивування трансформованих клітин за умов, при яких концентрація селекційного засобу у живильному середовищі поступово збільшується, наслідком чого є ампліфікація як селектованого гена, так і ДНК, що кодує інший ген, наприклад, антитіло, що зв'язується 3 МОЕ поліпептидом. Як наслідок, з ампліфікованої
ДНК синтезуються підвищені кількості поліпептиду, наприклад, анти-МОИЕ антитіла.
Сайт зв'язування рибосоми є, як правило, необхідним для ініціювання трансляції мРНК і
Зо характеризується присутністю послідовності Шайна-Делгарно (прокаріоти) або послідовності
Козака (еукаріоти). Згаданий елемент знаходиться, як правило, у прямому (3) напрямку відносно промотору і зворотному (5") напрямку відносно кодувальної послідовності поліпептиду, що буде експресуватись.
У деяких випадках, наприклад, коли бажаним є глікозилування експресійної системи, представленої еукаріотною клітиною-хазяїном, для поліпшення глікозилування або виходу можна здійснювати маніпуляції з різними пре- або пропослідовностями. Наприклад, можна змінити сайт пептидазного розщеплення конкретного сигнального пептиду або додати пропослідовності, які також можуть вплинути на глікозилування. Кінцевий білковий продукт може мати у -1 положенні (відносно першої амінокислоти зрілого білка) одну або декілька додаткових амінокислот, зв'язаних з експресією, які могли бути неповністю видаленими.
Наприклад, кінцевий білковий продукт може мати один або два амінокислотні залишки на сайті пептидазного розщеплення, приєднані до амінокінця. За альтернативним варіантом, наслідком застосування деяких сайтів ферментативного розщеплення може буде дещо укорочена форма бажаного поліпептиду, якщо фермент виявляє свою дію на такій ділянці у межах зрілого поліпептиду.
Вектори експресії та клонування за цим винаходом будуть, як правило, містити промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і є функціонально зв'язаним із молекулою, що кодує анти-МО!Е антитіло. Промоторами є нетранскрибовані послідовності, які знаходяться у зворотному напрямку (тобто 5) відносно стартового кодону структурного гена (як правило, приблизно у межах від 100 п.н. до 1000 п.н.), що контролюють транскрипцію структурного гена.
Промотори, за традицією, об'єднують одним або двома класами: індуцибельні промотори і конститутивні промотори. Індуцибельні промотори ініціюють підвищені рівні транскрипції з ДНК під своїм контролем у відповідь на деяку зміну умов культивування, наприклад, присутність або відсутність поживної речовини або зміну температури. Конститутивні промотори, з іншого боку, одностайно транскрибують ген, з яким вони є функціонально зв'язаними, тобто з незначним або повною відсутністю контролю за експресією гена. Добре відомою є велика кількість промоторів, що розпізнаються різноманітними потенційними клітинами-хазяями. Придатний промотор функціонально зв'язується з ДНК, що кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг, що містить анти-
МИ антитіло за цим винаходом, шляхом видалення згаданого промотору з ДНК-джерела бо рестриктазним розщепленням і введенням бажаної промоторної послідовності до вектора.
У цій галузі добре відомими є також придатні промотори для застосування з дріжджовими клітинами-хазяями. Дріжджові енхансери застосовуються переважно з дріжджовими промоторами. Придатні промотори для застосування з клітинами-хазяями ссавців є добре відомими і включають (але без обмеження) промотори, одержані з геномів таких вірусів, як вірус поліоми, вірус віспи птиці, аденовірус (наприклад, аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птиці, вірус цитомегалії людини, ретровіруси, вірус гепатиту В і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, мавпячий вірус 40 (5М40). До інших придатних промоторів ссавців належать гетерологічні промотори ссавців, наприклад, промотори теплового шоку та промотор актину.
Додаткові промотори, що можуть становити інтерес, включають (але не обмежуються): ранній промотор 5М 40 (Бернуа (Вегпоіїв)), Шамбон (Спатброп), 1981, Маїште 290:304-10); промотор СММ (Томсен (Потвзвеп) та інші, 1984, Ргос. Маї!Ї. Асад. ОБА 81:659-663); промотор, що міститься у З3' довгому кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса (Ямамото (Уататоїо) та інші, 1980, СеїІ 22:787-797); промотор тимідинкінази вірусу герпесу (Вагнер (У/адпег) та інші, 1981,
Ргос. Май. Асай. сі. Ш.5.А. 78:1444-14453; промотор та регуляторні послідовності гена металотіоніну (Брінстер (Вгіпвієї) та інші, 1982, Маїшге 296:39-42); та промотори прокаріот, наприклад, промотор бета-лактамази (Вілла-Камароф (МіПа-Катагоїй) та інші, 1978, Ргос. Маї).
Асайд. Зсі. Ш.5.А., 75:3727-3731); або їас промотор (Дебер (ОевВоег!) та інші, 1983, Ргос. Маї).
Асад. сі. О.5.А., 80:21-25). Інтерес становлять також наведені нижче ділянки транскрипційного контролю тварин, які демонструють тканинну специфічність і застосовуються у трансгенних тварин: контрольна ділянка гена еластази І, що є активною у ацинарних клітинах підшлункової залози (Свіфт (Змій) та інші, 1984, Сеї! 38:639-646; Орніц (Огпії7) та інші, 1986, Соїд бргіпд
Натог Зутр. Омцапі. Віої. 50:399-409 (1986); Макдоналд (Масропаїд), 1987, Нераїйоіоду 7:425- 515); контрольна ділянка інсулінового гена, що є активною у бета-клітинах підшлункової залози (Ханахан (Напапйагп), 1985, Майшге 315:115-22); контрольна ділянка імуноглобулінового гена, що є активною у лімфоїдних клітинах (Гросшедл (Сто55спеді) та інші, 1984, Сеєї! 38:647-658; Адамес (Адатев) та інші, 1985, Майте 318:533-538; Александер (АІехапавег!) та інші, 1987, Мої. Сеї!. Віої, 7:1436-1444); контрольна ділянка вірусу пухлин молочної залози мишей, що є активною у тестикулярних клітинах, клітинах молочної залози, лімфоїдних клітинах та тканинних
Зо базофільних гранулоцитах (Ледер (І єдег) та інші, 1986, СеїЇ 45:485-495); контрольна ділянка альбумінового гена, що є активною у печінці (Пінкерт (Ріпкеп) та інші, 1987, Сепе5 апа Оемеїі. 1:268-276); контрольна ділянка гена альфа-фетобілка, що є активною у печінці (Крумлауф (Кгитіаці) та інші, 1985, Мої. СеїІ. Віо!І., 5:1639-1648; Хаммер (Наттег) та інші, 1987, Зсієпсе 235:53-58); контрольна ділянка гена альфа 1-антитрипсину, що є активною у печінці (Келсі (Кеїзеу) та інші, 1987, Сепез апа Оемеї. 1:161-171); контрольна ділянка гена бета-глобіну, що є активною у мієлоїдних клітинах (Могрем (Модгат) та інші, 1985, Мате 315:338-340; Колліас (КоїПав) та інші, 1986, Сеї! 46:89-94); контрольна ділянка основного мієлінового білка, що є активною у олігодендроцитах головного мозку (Рідхед (Веаднєадй) та інші, 1987, Сеї! 48:703- 712); контрольна ділянка гена легкого ланцюга-2 міозину, що є активною у скелетних м'язах (Сані (Запі), 1985, Маїшиге 314:283-286); та контрольна ділянка гена гонадотропінвивільнювального гормону, що є активною у гіпоталамусі (Мейсон (Мавоп) та інші, 1986, бсіепсе 234:1372-1378).
Енхансерна послідовність може вводитись до вектора для підсилення транскрипції ДНК, що кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг, що містить анти-МОЕ антитіло за цим винаходом, вищими еукаріотами. Енхансери є "недіючими елементами ДНК, довжиною, як правило, приблизно 10-300 п.н., які діють на промотор для підсилення транскрипції. Енхансери є відносно орієнтаційно та позиційно незалежними, оскільки їх знаходили як у 5"-, так і у 3-положеннях відносно транскрипційної одиниці. Відомими є декілька енхансерних послідовностей, доступних із генів ссавців (наприклад, глобін, еластаза, альбумін, альфа-фетопротеїн та інсулін). За типовим варіантом, однак, застосовують енхансер із вірусу. Зразковими енхансерними елементами для активації еукаріотних промоторів є такі відомі у цій галузі, як енхансер ЗМ 40, енхансер раннього промотору вірусу цитомегалії людини, енхансер вірусу поліоми та енхансери аденовірусу. Незважаючи на те, що енхансер може займати у векторі 5'- або 3'і-"положення відносно кодувальної послідовності, він, як правило, розміщується на ділянці у зворотному напрямку (5)відносно промотора.
Експресійні вектори за цим винаходом можуть конструюватись із вихідного вектора, наприклад, комерційно доступного вектора. Такі вектори можуть містити або можуть не містити усі бажані фланкуючі послідовності. У разі, якщо у згаданому векторі немає однієї або декількох фланкуючих послідовностей, опис яких наведено, вони можуть бути одержані у індивідуальному порядку і ліговані до вектора. Методи, що застосовуються для одержання кожної зі згаданих фланкуючих послідовностей, є добре відомими фахівцю у цій галузі.
Після завершення конструювання вектора і введення нуклеїновокислотної молекули, що кодує легкий ланцюг, важкий ланцюг або легкий ланцюг і важкий ланцюг, що містить анти-МаЕ антитіло, на відповідну ділянку вектора, готовий вектор може вводитись до відповідної клітини- хазяїна для ампліфікації та/або експресії поліпептиду. Трансформація експресійного вектора для анти-МОЕ антитіла у вибраній клітині-хазяїні може здійснюватись добре відомими методами, у тому числі шляхом трансфекції, інфекції, копреципітації фосфатом кальцію, електропорації, мікроін'єкції, ліпофекції, трансфекції, опосередкованої ДЕАЕ-декстраном або інших відомих методів. Вибраний метод буде частково залежати від типу застосованої клітини- хазяїна. Ці методи та інші придатні методи є добре відомими досвідченому фахівцю і наведені, наприклад, у довіднику Сембрук (Затрбгоок) та інших (дивись вище).
Клітина-хазяїн, культивована за відповідних умов, синтезує анти-МОЕ антитіло, яке у подальшому може виділятись із культурального середовища (якщо клітина-хазяїн секретує його до живильного середовища) або безпосередньо з клітини-хазяїна, що його продукує (якщо воно не секретується). Вибір придатної клітини-хазяїна буде залежати від різних факторі, у тому числі бажаних рівнів експресії, модифікацій поліпептиду, що є бажаними або необхідними для активності (наприклад, глікозилування або фосфорилування) та легкості укладання у біологічно активну молекулу.
Лінії клітин ссавців, доступні як хазяї для експресії є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) імморталізовані лінії клітин, доступні від Американської колекції типових культур (АТСС), у тому числі (але без обмеження), клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини Нега, клітини нирок хом'ячка (ВНК), клітини нирок мавпи (СО5), клітини злоякісної гепатоми людини (наприклад, Нер (2) та ряд інших клітинних ліній. За певними варіантами здійснення лінії клітин можуть бути вибрані шляхом визначення, яка з клітинних ліній має високі рівні експресії і конститутивно продукує антитіла з МагЕ-зв'язувальними властивостями. За іншими варіантами здійснення може бути вибрана лінія клітин В-клітинної лінії диференціювання, яка не продукує свого власного антитіла, але є здатною до продукування та секреції гетерологічного антитіла.
Зо Антитіла за цим винаходом є придатними для виявлення МОРЕ у біологічних пробах та ідентифікації клітин або тканин, що продукують МОРЕ білок. Антитіла за цим винаходом, які специфічно зв'язуються з МОРЕ, можуть бути придатними для лікування МО Е-опосередкованих захворювань. Згадані антитіла можуть застосовуватись у реакціях зв'язування для виявлення
МОЕ та пригнічення утворення комплексу МОЕ із рецепторами МОРЕ. Згадані антитіла, що зв'язуються з МОГ і блокують взаємодію з іншими зв'язувальними сполуками, можуть мати терапевтичне застосування при модулюванні М(Е-опосередкованих захворювань. За варіантами, яким віддають перевагу, антитіла проти МСЕ можуть блокувати зв'язування МО з його рецептором, наслідком чого може бути руйнування шляху трансдукції МОеР-індукованого сигналу.
Цей винахід має також відношення до застосування одного або декількох антитіл за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування болісного розладу або стану, що спричинюється підвищеною експресією МСЕ або підвищеною чутливістю до МСЕ у хворого, наприклад, будь-якого з розладів або станів, розкритих у цьому описі.
За варіантами, яким віддають перевагу, цей винахід пропонує фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість одного або декількох антитіл за цим винаходом разом із фармацевтично прийнятним розріджувачем, носієм, солюбілізатором, емульгатором, консервантом та/або ад'ювантом. За варіантом, якому віддають перевагу, матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях. За варіантами, яким віддають перевагу, пропонуються фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість анти-МОЕ антитіл.
За певними варіантами здійснення матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях.
За певними варіантами здійснення фармацевтична композиція може містити матеріали для модифікування, підтримання або збереження, наприклад, рН, осмотичного тиску, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або виділення, поглинання або проникнення згаданої композиції. За такими варіантами здійснення до придатних для одержання композицій матеріалів належать (але ними не обмежуються) амінокислоти (наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин); протимікробні засоби; антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідросульфіт натрію); 60 буфери (наприклад, борат, бікарбонат, трис-НСЇ, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти);
наповнювачі (наприклад, маніт або гліцин); хелатоутворювачі (наприклад, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА)); комплексоутворювачі (наприклад, кофеїн, полівінілпіролідон, бета-циклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин); заповнювачі; моносахариди; дисахариди; та інші вуглеводи (наприклад, глюкоза, маноза або декстрини); білки (наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни); барвники, коригенти та розріджувачі; емульгатори; гідрофільні полімери (наприклад, полівінілпіролідон); поліпептиди низької молекулярної маси; солетворні протиіїони (наприклад, натрій); консерванти (наприклад, бензалконію хлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тімеросаль, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або пероксид водню); розчинники (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); спирти з цукру (наприклад, маніт або сорбіт); суспендувальні засоби; поверхнево-активні або змочувальні речовини (наприклад, плуроніки, поліетиленгліколь, складні ефіри сорбітану, полісорбати, наприклад, полісорбат 20, полісорбат 80, тритон, трометамін, лецитин, холестерин, тилоксапал); речовини, що сприяють підвищенню стійкості (наприклад, цукроза або сорбіт); засоби, що сприяють підвищенню ізотонічності (наприклад, галогеніди лужних металів, за варіантом, якому віддають перевагу, хлорид натрію або калію, маніт, сорбіт); носії; розчинники; наповнювачі та/або фармацевтичні ад'юванти. Дивись ВНЕМІМЕВТОМ'Є РНАВМАСЕШТІСАЇ.
ЗСІЕМСЕ5, 18 видання, (редактор А.Р. Геннаро (А.ЩА. Сеппаго)), 1990, Маск Рибіївпіпа
Сотрапу.
За певними варіантами здійснення оптимальна фармацевтична композиція буде визначатись фахівцем у цій галузі залежно від, наприклад, передбачуваного шляху введення, формату доставки та бажаної дози. Дивись, наприклад, ВЕМІМЕАТОМ'Є РНАВМАСЕШТІСАЇ.
ЗСІЕМСЕЗ5 (дивись вище). За певними варіантами здійснення такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стійкість, швидкість виділення іп мімо та швидкість виведення іп міо антитіл за цим винаходом.
За певними варіантами здійснення головний розчинник або носій фармацевтичної композиції може бути за своєю природою водним або неводним. Наприклад, прийнятним розчинником або носієм може бути вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин або штучна цереброспінальна рідина, можливо, доповнена іншими матеріалами, що традиційно
Зо застосовуються у композиціях для парентерального введення. Додатковими зразковими носіями є нейтральний буферний розчин або фізіологічний розчин у суміші із сироватковим альбуміном. За варіантами, яким віддають перевагу, фармацевтичні композиції за цим винаходом містять трис-буфер із приблизним рн 7,0-8,5 або ацетатний буфер із приблизним рН 4,0-5,5 і можуть додатково містити сорбіт, цукрозу, твін-20 та/або їхні придатні замісники. За певними варіантами здійснення цього винаходу композиції анти-МОЕ антитіла можуть готуватись для збереження шляхом змішування вибраної композиції, що має бажаний ступінь чистоти, з факультативними речовинами для виготовлення композицій (ВЕМІМСНТОМ'Є
РНАВМАСЕШТІСАЇ ЗСІЕМСЕ5 (дивись вище)) у вигляді ліофілізованого брикету або водного розчину. На додаток до цього, за певними варіантами здійснення анти-МОСЕ антитіло може вводитись до складу композиції як ліофілізат із застосуванням придатних наповнювачів, наприклад, цукрози.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вибиратись для парентерального введення. За альтернативним варіантом, композиції можуть вибиратись для інгаляції або доставки через травний тракт, наприклад, пероральним шляхом. Виготовлення таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться у межах можливостей цієї галузі.
Компоненти композиції, за варіантом, якому віддають перевагу, надаються у концентраціях, які є прийнятними для місця введення. За певними варіантами здійснення буфери застосовуються для підтримання композиції у межах фізіологічного або дещо нижчого рнН, як правило, у діапазоні рН від приблизно 5 до приблизно 8.
У разі, коли передбачається парентеральне введення, терапевтичні композиції для застосування за цим винаходом можуть надаватись у формі апірогенного, парентерально прийнятного водного розчину, що містить бажане анти-МОСЯЕ антитіло у фармацевтично прийнятному розчиннику. Особливо прийнятним розчинником для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, до якої анти-МОЕ антитіло вводять у вигляді стерильного, відповідним чином консервованого ізотонічного розчину. За певними варіантами здійснення виготовлення композиції може включати введення до її складу бажаної молекули з агентом, наприклад, придатними для ін'єкцій мікросферами, частинками, що піддаються біорозкладу, полімерними сполуками (наприклад, полімером молочної кислоти або полігліколевою кислотою), кульками або ліпосомами, який може забезпечити пролонговане вивільнення бо згаданого продукту, який може доставлятись шляхом ін'єкції речовин уповільненого всмоктування. За певними варіантами здійснення може застосовуватись також гіалуронова кислота, що має ефект збільшення часу перебування у системі кровообігу. За певними варіантами здійснення для введення бажаної молекули антитіла можуть застосовуватись засоби доставки лікарського препарату, що імплантуються.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть виготовлятись у формі, придатній для інгаляції. За цими варіантами здійснення композиціям, до складу яких входять анти-Маєг антитіла, надається форма сухого порошку для інгаляцій. За варіантами, яким віддають перевагу, до складу інгаляційних розчинів анти-МОЕ антитіла може вводитись пропелент для аерозольної доставки. За певними варіантами здійснення розчини можуть розпилюватись.
Внутрішньолегеневе введення і способи одержання таких композицій додатково описані у міжнародній заявці РСТ/О594/001875, яка включена до цього опису шляхом посилання і описує внутрішньолегеневу доставку хімічно модифікованих білків.
Передбачається також, що композиції можуть вводитись пероральним шляхом. Анти-МОаЕ антитіла, що вводяться подібним чином, можуть вводитись до складу композицій з носіями або без носіїв, які традиційно застосовуються при виготовленні твердих лікарських форм, наприклад, таблеток та капсул. За певними варіантами здійснення капсула може конструюватись таким чином, щоб вивільнення активної складової композиції відбувалось на ділянці шлунково-кишкового тракту, коли біодоступність є максимальною, а передсистемний розклад є мінімальним. Для полегшення поглинання анти-МОаг антитіла можуть включатись додаткові агенти. Можуть застосовуватись також розріджувачі, коригенти, смоли з низькою температурою розплавлення, рослинні олії, змащувальні речовини, суспендувальні речовини, речовини, що сприяють розпаду таблетки, і в'яжучі речовини.
Фармацевтична композиція за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, надається таким чином, щоб вона містила ефективну кількість одного або декількох анти-Має антитіл у суміші з нетоксичними наповнювачами, придатними для виготовлення таблеток.
Шляхом розчинення таблеток у стерильній воді або іншому прийнятному носії можуть бути одержані розчини у однодозовій формі. До прийнятних наповнювачів належать (але без обмеження) інертні розріджувачі, наприклад, карбонат кальцію, карбонат або бікарбонат натрію, лактоза або фосфат кальцію; або зв'язувальні речовини, наприклад, крохмаль, желатин або
Зо аравійська камедь; або змащувальні речовини, наприклад, стеарат магнію, стеаринова кислота або тальк.
Фахівцям у цій галузі будуть очевидними додаткові фармацевтичні композиції, у тому числі композиції, що містять анти-М3!Е антитіла для пролонгованого вивільнення. Фахівцям у цій галузі відомі також інші способи виготовлення різноманітних інших засобів доставки пролонгованої дії, наприклад, ліпосомних носіїв, мікрочастинок або пористих кульок, що піддаються біорозкладу і ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування. Дивись, наприклад, міжнародну заявку РСТ/О593/00829, яку включено до цього опису шляхом посилання і яка описує пролонговане вивільнення пористих полімерних мікрочастинок для доставки фармацевтичних композицій. Препарати пролонгованої дії можуть включати напівпроникні полімерні матриці у формі виробів певної форми, наприклад, плівок або мікрокапсул. Матриці пролонгованої дії можуть включати складні поліефіри, гідрогелі, полімери молочної кислоти (як розкривається у патенті США Мо 3,773,919 та публікації заявки на європатент ЕР 058481, які включено до цього опису шляхом посилання), співполімери І-глутамінової кислоти та гамма- етил-ІЇ -глутамату (Сідмен (бЗідтап) та інші, 1983, Віороїутег5 22:547-556), полі-(2- гідроксіетилметакрилат) (Лангер (І аподег) та інші, 1981, /. Віотеа. Маїег. Нев. 15:167-277, Лангер (Іапдег), 1982, Спет. Теси. 12:98-105), етиленвінілацетат (Лангер (апдеї) та інші (дивись вище)) або полі-(0)-(-)-3-гідроксимасляну кислоту (публікація заявки на європатент ЕР 133,988).
Композиції пролонгованої дії можуть включати також ліпосоми, які можуть бути одержані за будь-яким із декількох способів, відомих у цій галузі. Дивись, наприклад, Еппстейн (Еррзівїп) та
БО інші, 1985, Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 82:3688-3692; публікація заявок на європатент ЕР 036,676;
ЕР 088,046 та ЕР 143,949, які включено до цього опису шляхом посилання.
Фармацевтичні композиції, що застосовуються для введення іп мімо. надаються, як правило, у вигляді стерильних препаратів. Стерилізація може здійснюватись шляхом фільтрації через стерильні фільтраційні мембрани. Коли композиція ліофілізується, стерилізація за цим способом може здійснюватись перед або після ліофілізації та відновлення. Композиції для парентерального введення можуть зберігатись у ліофілізованій формі або у вигляді розчину.
Парентеральні композиції, як правило, вміщують до контейнера, що має отвір для стерильного доступу, наприклад, до мішечка для зберігання внутрішньовенних розчинів або до флакона з пробкою, яка може проколюватись голкою шприца для ін'єкцій.
Після виготовлення фармацевтичної композиції, вона може зберігатись у стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини або зневодненого чи ліофілізованого порошку. Такі композиції можуть зберігатись у готовій до застосування формі або у формі (наприклад, ліофілізованій), що відновлюється перед введенням.
Цей винахід пропонує також набори для введення разової дози. Кожен зі згаданих наборів за цим винаходом може включати перший контейнер, що містить сухий білок, і другий контейнер, що містить водну композицію. За певними варіантами здійснення цього винаходу пропонуються набори, що включають одно- та багатокамерні попередньо заповнені шприци (наприклад, шприци для рідини та шприци для введення ліофілізованої речовини).
Ефективна кількість фармацевтичної композиції, що містить анти-МаЕ антитіло, призначеної для терапевтичного застосування, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту та цілей. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що придатна доза для лікування буде залежати, частково, від молекули, що доставляється, показання, за яким застосовується анти-МагЕ антитіло, шляху введення і розміру (маса тіла, поверхня тіла або розмір органа) та/або стану (вік та загальний стан здоров'я) хворого. За певними варіантами здійснення лікар може титрувати дозу і модифікувати шлях введення для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типова доза може коливатись у межах від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг або більше, залежно від згаданих вище факторів. За варіантами, яким віддають перевагу, доза може коливатись у межах від 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від 1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, від 5 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг.
Частота введення доз буде залежати від фармакокінетичних параметрів конкретного анти-
МО антитіла, що застосовується у композиції. За типовим варіантом, лікар вводить композицію до досягнення дози, що забезпечує одержання бажаного ефекту. Згадана композиція може, таким чином, вводитись разовою дозою або двома чи більше дозами (які можуть містити або можуть не містити однакову кількість бажаної речовини) впродовж певного періоду часу або шляхом безперервного вливання через імплантований засіб або катетер. Додаткове точніше визначення придатної дози здійснюється фахівцями у цій галузі звичайним шляхом і входить до обсягу завдань, які традиційно здійснюються ними. Прийнятність дози може підтверджуватись за допомогою відповідних даних залежності реакції від дози. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть вводитись хворим впродовж тривалих періодів часу.
Постійне введення антитіла за цим винаходом зводить до мінімального рівня негативні імунні та алергічні реакції, які традиційно пов'язують з антитілами, які одержують проти людського антигену у тваринах, окрім людини, наприклад, із неповним людським антитілом, одержаним у видах, окрім людини.
Спосіб введення фармацевтичної композиції відповідає відомим методам, наприклад, пероральним шляхом, шляхом ін'єкцій внутрішньовенним, внутрішньоочеревинним, інтрацеребральним (внутрішньопаренхіматозним), інтрацеребровентрикулярним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочним, внутрішньоартеріальним, інтрапортальним шляхами або шляхом введення до середини місця ураження; системами пролонгованого вивільнення або засобами, що імплантуються. За певними варіантами здійснення композиції можуть вводитись шляхом ін'єкції болюса або безперервно шляхом вливання чи засобом, що імплантується.
Композиція може також вводитись місцево шляхом імплантування мембрани, губки або іншого відповідного матеріалу, яким бажана молекула була абсорбована або до якого її було включено. За певними варіантами здійснення у разі застосування засобу, що імплантується, засіб може бути імплантованим до будь-якої відповідної тканини або органа, і доставка бажаної молекули може здійснюватись шляхом дифузії, шляхом застосування болюса пролонгованої дії або шляхом безперервного введення.
Бажаним може також бути ех мімо застосування фармацевтичних композицій, що містять анти-МСЕ антитіло за цим винаходом. У подібних випадках, клітини, тканини або органи, видалені у хворого, обробляють фармацевтичними композиціями, що містять анти-МаЕ антитіло, після чого згадані клітини, тканини та/або органи знову імплантують хворому.
Зокрема, анти-МОЕ антитіла можуть доставлятись шляхом імплантування певних клітин, які були піддані генно-інженерним маніпуляціям із застосуванням таких, наприклад, способів, які наводяться у цьому описі, для експресії та секреції поліпептиду. За певними варіантами здійснення такими клітинами можуть бути клітини тварин або людей, і ці клітини можуть бути автологічними, гетерологічними або ксеногенними. За певними варіантами здійснення згадані клітини можуть бути імморталізовані. За певними варіантами здійснення для зменшення бо ймовірності імунологічної реакції, клітини можуть бути включені до капсул для запобігання інфільтрації навколишніх тканин. За додатковими варіантами здійснення матеріали для виготовлення згаданих капсул є, як правило, біосумісними, напівпроникними полімерними матеріалами або мембранами, які забезпечують можливість вивільнення білка(-ів), але запобігають знищенню клітин імунною системою хворого або іншими шкідливими факторами з навколишніх тканин.
ПРИКЛАДИ
Наведені нижче приклади, що включають проведені експерименти і одержані результати, подані виключно з ілюстративною метою і не повинні розглядатись як такі, що обмежують цей винахід.
Приклад 1
Одержання людського МО білка з клітин Е. соїї
Клонування г"Ни-МаЕ (1-120)
Нуклеотидну послідовність, що кодує людський МСЕ, ампліфікували з кКДНК за допомогою олігонуклеотидних праймерів із послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 27 та
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 28, і стандартної полімеразної ланцюгової реакції (РСВ). 5'-праймер утворює Маеє! сайт рестрикції та метіоніновий ініціювальний кодон, що безпосередньо передує кодону 1 (серин) зрілої послідовності. 3-праймер утворює Ватні сайт рестрикції, який безпосередньо розміщується за стоп-кюдоном. Одержаний РСВ продукт піддавали очищенню у лунках із гелем, розщеплювали рестриктазами Має! ії Ватні, після чого лігували до вектора
РСЕМ1656, який також розщеплювали за допомогою Маєї і Ватні. Ліговану ДНК трансформували у компетентних клітинах-хазяях Е. сої штам 657. Клони перевіряли на здатність до продукування рекомбінантного білкового продукту і на присутність плазміди, що має відповідну нуклеотидну послідовність (наприклад, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 29). Амінокислотна послідовність рекомбінантного людського МО 1-120 представлена як ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 30.
Експресійний вектор рСЕМ1656 (АТС Мо 69576) одержали з експресійної векторної системи, описаної у патенті США Мо 4,710,473. Плазміду РСЕМ1656 можна одержати з описаної плазміди рРСЕМ836 (патент Мо 4,710,473) таким чином: (а) руйнуванням двох ендогенних Мабв сайтів рестрикції шляхом доповнення кінців ферментом 74 полімеразою з подальшим лігуванням по "тупих" кінцях; (б) заміною послідовності ДНК між специфічними Аайі і Сіаї
Зо сайтами рестрикції, що містить синтетичний промотор Рі, на подібний фрагмент, одержаний з рРСЕМб636 (патент Мо 4,710,473), що містить промотор РІ, із подальшою (с) заміною невеликої послідовності ДНК між специфічними Сіа! і Кри! сайтами рестрикції на олігонуклеотид, який одержали шляхом ренатурації двох зондів, що мають нуклеотидні послідовності, представлені
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 31 ії ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 32.
Штам-хазяїн К12 БЕ. соїї (штам 657, фірма Атдеп) є похідною Е. соїї М/1485 (штам К12), культуру якої одержали з центру Е. соїї Сепеїїс 5іосК Сепівг, Має Опімегейу, Мем Намеп, штат
Конектикут (0050 штам 6159).
Експресія "Ни-Ма (1-120)
Клітини Е. соїї, що містять генно-інженерну конструкцію для експресії МОРЕ (як описано вище), піддавали ферментації у збагаченому середовищі у режимі підживлювання культури одного виробничого циклу. Клітини вирощували при температурі 30 "С до оптичної густини 49 при 600 нм, після чого індукували температурним зсувом до 42 "С. Клітини збирали шляхом центрифугування впродовж 4 год. після індукування. Кінцева оптична густина становила 75.
Вихід продукту експресії, за визначенням, становив приблизно 0,15 г/л.
Повторне укладання і очищення г"Ни-МаЕ (1-120)
Клітинну масу піддавали лізису у Містойцідіг2егї, центрифугували при 10000 худ впродовж 30 хв, осад промивали 1 95 дезоксихолевою кислотою, центрифугували, як вказано вище, після чого одержаний осад промивали холодною водою і піддавали повторному центрифугуванню.
Одержаний осад ((М/ІВ5 - промиті тільця включення) ресуспендували у денатурованому 8 М розчині гуанідину-НСІ, 50 мМ розчині трис-буфера (рН 8,5), що містив 10 мМ розчин ОТТ (дитіотреїтол), і солюбілізували при кімнатній температурі впродовж 1 год., центрифугували при 10000 худ впродовж 30 хв, супернатант обережно зливали, після чого піддавали 25-кратному розведенню водним буферним розчином, що містив окислювально-відновну пару при температурі 4 "С впродовж 5 днів. Одержаний повторно укладений продукт після цього титрували до рН 3,0 і фільтрували через 0,45 мкМ фільтр. Згаданий повторно укладений продукт очищали на колонці 5р-б5ернагозе тазі Пом/ із застосуванням стандартного градієнта
Масі. Пул із катіонообмінної колонки у подальшому концентрували, і аліквоти заморожували при температурі -80 "С. Чистоту білка визначали шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (505-РАСЕ) і аналізували забарвлюванням кумасі 60 синім. Головну смугу за цим способом більше ніж на 90 95 становив очищений білок.
Приклад 2
Одержання людських моноклональних антитіл проти фактора росту нервової тканини (МСЕ)
Трансгенні НиМаб і КМ миші
Повністю людські моноклональні антитіла проти МСЕ одержали за допомогою трансгенних мишей ліній НСо7, НСо12, НСо7 -НСо12 і КМ, кожна з яких експресує гени людського антитіла.
У кожної з цих ліній мишей ендогенний ген мишачого легкого ланцюга типу каппа гомозиготно руйнували, як описано у Чен (Спеп) та інших (1993, ЕМВО .4). 12:811-820), а ендогенний ген мишачого важкого ланцюга гомозиготно руйнували, як описано у Прикладі 1 публікації міжнародної заявки УУХО 01/09187 (яку включено до цього опису шляхом посилання). Кожна з цих мишачих ліній несе людський трансген легкого ланцюга типа каппа, КСо5, як описано у
Фішвайлд (Рібзпм/а) та інших (1996, Маїшге Віоїесппоіоду 14:845-851). Лінія НСо7 несе трансген
НСо7 людського важкого ланцюга, як описано у патентах США Мо 5,545,806, Мо 5,625,825 і Мо 5,545,807 (які включено до цього опису шляхом посилання). Лінія НСо12 несе трансген НСо12 людського важкого ланцюга, як описано у Прикладі 2 публікації міжнародної заявки УМО 01/09187 (яку включено до цього опису шляхом посилання). Лінія НСо7 «НСо12 несе обидва трансгени НСо?7 і НСо12 важкого ланцюга і є гемізиготною по кожному трансгену. Миші лінії КМ містять трансген 5020 важкого ланцюга, як описано у Томізука (ТотігиКа) та інших (1997,
Маїшцге Сепеї. 16, 133-143 і 2000, Ргос. Маї!. Асад. 5сі, 97, 722-727). Цей трансген не інтегрується до мишачої хромосоми, але замість цього розмножується як незалежний хромосомний фрагмент. Цей фрагмент включає приблизно 15 МВ людської хромосоми 14. Він містить повний локус людського важкого ланцюга, у тому числі усі сегменти генів МН, О ї УН та усі ізотипи константної ділянки важкого ланцюга. Усі ці лінії позначаються у цьому описі як Нимаб миші.
Імунізація НиМаб:
Для одержання повністю людських моноклональних антитіл проти МСЕ, НиМар мишей імунізували очищеним рекомбінантним МСЕ, який одержали з клітин Е. соїї, який відігравав роль антигену (Приклад 1). Загальні схеми імунізації НиМмар мишей описані у Лонберг (І опрего) та інших (1994, Маїйге 368:856-859; Фішвайлд (РівзНм/ййа) та інших (дивись вище) і у публікації міжнародної заявки УУО 98/24884; усі згадані матеріали включено до цього опису шляхом посилання). Під час першого вливання антигену вік мишей становив 6-16 тижнів. Для імунізації
Зо НиМабв мишей внутрішньоочеревинним (ІР) та підшкірним (50) шляхами застосовували очищений рекомбінантний препарат (25-100 мкг) МСЕ антигену.
Імунізацію Нимарб трансгенних мишей здійснювали шляхом введення антигену у повному ад'юванті Фрейнда і двома ін'єкціями антигену у неповному ад'юванті Фрейнда через 2-4 тижні після імунізації внутрішньоочеревинним шляхом (у загальній кількості до 9 імунізацій). Кожним антигеном імунізували декілька десятків мишей. У загальній кількості МОЄ антигеном імунізували 118 мишей ліній НСо7, НСо12, НСо7 -НСо12 ї КМ. Імунну реакцію контролювали шляхом відбирання проб крові на ретроорбітальній ділянці.
Для того, щоб вибрати НиМаб мишей, що продукують антитіла, які зв'язують людський МО, проби сироватки імунізованих мишей піддавали ЕГІБА (твердофазний імуноферментний аналіз) як описано у Фішвайлд (РібПпУулІЯ) та інших (дивись вище). Стисло, титраційні мікропланшети сенсибілізували очищеним рекомбінантним МО від Е. соїї (Приклад 1) (1-2 мкг/мл у РВ5 (забуферений фосфатом фізіологічний розчин)/50 мкл/лунку), інкубували при температурі 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 200 мкл/лунку 5 95 розчину курячої сироватки у РВБ/Твін (0,05 95). До кожної лунки додавали розведення плазми від МОаЕ- імунізованих мишей, і інкубували впродовж 1-2 год. при температурі навколишнього середовища. Планшети промивали РВ5/ТІвін, після чого інкубували з козячим антилюдським Ідс
Ес-специфічним поліклональним реактивом, кон'югованим із пероксидазою з хрону (НАР) впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Планшети промивали РВ5Б/Івін і інкубували з козячим антилюдським дСі Ес-специфічним поліклональним реактивом, кон'югованим із пероксидазою з хрону (НАР) впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після промивання планшети проявляли субстратом АВТО (фірма бідта СПпетіса! Со., 5. І оці5, штат Міссурі, номер за каталогом А-1888, 0,22 мг/мл), і піддавали спектрофотометричному аналізу шляхом визначення оптичної густини (00) при довжині хвилі 415-495 нм. Мишей з достатніми титрами людського імуноглобуліну проти МО застосовували для продукування моноклональних антитіл, як описано нижче.
Одержання гібридом, що продукують людські моноклональні антитіла проти МСЕ
Мишей готували для продукування моноклональних антитіл шляхом внутрішньовенної реїімунізації антигеном за 2 дні до умертвіння з подальшим видаленням селезінок. Мишачі спленоцити виділяли з НиМар мишей і за стандартними методиками, за допомогою поліетиленгліколю, зливали з лінією клітин мишачої мієломи. За типовим варіантом, здійснили 10-20 зливань для кожного антигену.
Стисло, суспензії окремих клітин лімфоцитів селезінки імунізованих мишей зливали з однією четвертою кількості несекретуючих клітин мишачої мієломи РЗХб3-А98.653 (АТОС, номер депонування СВІ 1580) з 5095 розчином поліетиленгліколю (РЕС) (фірма БЗідта). Клітини висівали (приблизно 1х105/лунку) на титраційні мікропланшети з плоским дном із подальшим приблизно двотижневим інкубуванням у селективному середовищі, що містило 10 95 сироватки зародка великої рогатої худоби, 10 95 кондиціонованого живильного середовища РЗ8801 (АТСС, номер депонування СВІ ТІВ-63), 3-595 розчин оригену (фірма ІЗЕМ) у ОМЕМ (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла) (фірма Меадіаїесн, номер за каталогом
СВІ 10013, їз високим вмістом глюкози, І-глутаміну і пірувату натрію) плюс 5 мМ розчин
ГЕПЕС-буфера, 0,055 мМ розчин 2-меркаптоетанолу, 50 мг/мл гентаміцину і ЯхХНАТ (гіпоксантин-аміноптеринтимідинове середовище) (фірма бідта, номер за каталогом СВІ Рр- 7185). Через 1-2 тижні клітини культивували у середовищі, у якому НАТ замінили на НТ (гіпоксантин-тимідинове "проміжне" середовище).
Одержані гібридоми перевіряли на продукування антигенспецифічних антитіл. Окремі лунки перевіряли за допомогою ЕГІЗБА (описано вище) на людські анти-МО!Е моноклональні Ідс антитіла. Після екстенсивного росту гібридом, середовище контролювали, як правило, через 10- 14 днів. Гібридоми, що секретували антитіла, пересівали, знову перевіряли, і у разі, якщо вони все ще залишались позитивними на людський /|дс, анти-МОаг моноклональні антитіла субклонували щонайменше двічі шляхом обмежувального розведення. Після цього стабільні субклони культивували іп мімо з одержанням невеликої кількості антитіла у середовищі для культивування тканин для визначення характеристик.
Добір людських моноклональних антитіл, що зв'язуються з МСЕ
Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕПІЗА), як описано вище, застосовували для добору гібридом, які продемонстрували позитивну реактивність із МОРЕ імуногеном. Гібридоми, які секретують моноклональне антитіло, що з високою спорідненістю зв'язується з Ма, субклонували і піддавали подальшому визначенню характеристик. Один клон кожної гибридоми, який зберігав реактивність батьківських клітин (за результатами визначення за допомогою ЕГІБА), вибирали для одержання банку клітин (5-10 флаконів), який зберігали у рідкому азоті.
Для визначення ізотипу моноклональних антитіл, які продукуються за наведеним описом, вдавались до проведення ізотипоспецифічного ЕГІ5А. Під час проведення цих експериментів, лунки титраційних мікропланшетів сенсибілізували 50 мкл/лунку розчину 1 мкг/мл мишачого антилюдського легкого ланцюга типу каппа у РВ5 та інкубували при температурі 4" С впродовж ночі. Після блокування 5 95 розчином курячої сироватки, на планшет наносили супернатант кожного експериментального моноклонального антитіла і очищений контрольний ізотип.
Планшети інкубували при температурі навколишнього середовища впродовж 1-2 год. Після цього до лунок вносили різні людські Ід(і-специфічні, кон'юговані з пероксидазою з хрону козячі антилюдські поліклональні антисироватки, планшети проявляли і аналізували, як описувалось вище.
Моноклональні антитіла, очищені із супернатантів гібридом, які продемонстрували значний рівень зв'язування з МСЕ (за результатами ЕГІЗА) додатково перевіряли на біологічну активність за допомогою різноманітних біоаналізів, як описано нижче.
Приклад З
Добір та клонування анти-МОЕ антитіл із сильною МОЕ-нейтралізуючою активністю
Ефективність антитіл, які початково були ідентифіковані у Прикладі 2, як інгібітори активності МСЕ (тобто МОаг-"нейтралізація"), оцінювали шляхом визначення здатності кожного модифікованого пептиду блокувати викликану МО індукцію експресії ванілоїдного рецептора- 1 (МА).
Культури нейронів гангліїв заднього корінця головного мозку
Ганглії заднього корінця (ОВС) головного мозку відрізали один за одним за асептичних умов від усіх спінальних сегментів 19-добових зародків пацюків (Е19), хірургічним шляхом видалених із маток термінально анестезованих на певному періоді вагітності пацюків лінії хргадие-Оамієу (фірма Спапез Вімег, УМіІтіпдіоп, штат Массачусетс). ОВО збирали до середовища 1-15 (фірма сірсовВВІ, Сгапа Івіапа, штат Нью-Йорк), що мало температуру танення льоду і містило 5 95 інактивованої теплом конячої сироватки (фірма СірбсоВвА!), з видаленням будь-якої зайвої сполучної тканини і кровоносних судин. ОВС двічі промивали фізіологічним розчином, забуференим фосфатом Дульбекко (ОРВО) без Са і Мде (рН 7,4) (фірма СсСірсоВвнпІ). Після бо цього з ОВО, за допомогою папаїнової дисоціаційної системи (фірма Ууоппіпдіоп Віоспетіса!
Согр., ЕгеепоЇїд, штат Нью-Джерсі), одержували суспензію поодиноких клітин. Стисло, ОВС інкубували у гідролітичному розчині, що містив 20 Од/мл папаїну у збалансованому сольовому розчині Ерла (ЕВ55) при температурі 37 "С впродовж 50 хв. Клітини відділяли шляхом продавлювання через відполіровані оплавленням пастерівські піпетки у дисоціативному середовищі, що містило МЕМ (мінімальне підтримувальне середовище)/Нат'8 Е12 (неоднорідне штучне живильне середовище Е12) (1:1), 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,005 95 дезоксирибонуклеази І (ДНКаза).
Відділені клітини осаджували при 200 хд впродовж 5 хв і ресуспендували у ЕВ55, що містив 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,005 95 ДНКази. Суспензію клітин центрифугували у градієнтному розчині, що містив 10 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 10 мг/мл овальбуміну при 200 худ впродовж 6 хв для видалення дебрісу, після чого фільтрували через 88- мкм нейлонову сітку (фірма Різпег Зсієпійіс, Рінвригой, штат Пенсільванія) для видалення будь- яких скупчень. Кількість клітин визначали за допомогою гемоцитометра, і клітини висівали (10х103 клітин/лунку) на 96-лункові планшети, сенсибілізовані поліорнітином (100 мкг/мл) (фірма
Зідта, 5. І оціз, штат Міссурі) та мишачим ламініном (1 мкг/мл) (фірма СсСібсоВвВІ) у повному живильному середовищі. Повне живильне середовище містило мінімальне підтримувальне середовище (МЕМ) і Напт'5 Е12 (1:1), пеніцилін (100 Од/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) ї 10 95 активованої теплом конячої сироватки (фірма (СірсовВА!). Культури витримували при температурі 37 "С, 595 СО»; і 100 95 вологості. Для контролювання росту ненейронних клітин, до складу живильного середовища включали 5-флуоро-2'-дезоксиуридин (75 мкМ) і уридин (180
МКМ).
Обробка МОБ і анти- Ма
Через 2 год. після висівання клітини обробляли рекомбінантним людським Д-МОЕ (фірма
Атдеп) або рекомбінантним щурячим Д-МОЕ (фірма НУО БЗузієтв, Міппеароїї5, штат Міннесота) з концентрацією 10 нг/мл (0,38 нМ). До кожного культурального планшета додавали позитивні контролі, що містили серійно розведене анти-МОЕ антитіло (фірма НО бБузіетв).
Експериментальні антитіла додавали у десяти розведеннях із застосуванням 3,16-кратних серійних розведень. Усі проби перед доданням до культур розбавляли у повному живильному середовищі. Перед визначенням експресії УНІ, планшети інкубували впродовж 40 год.
Зо Визначення експресії УВ1 у нейронах ОВС
Культури фіксували 4 95 розчином параформальдегіду у збалансованому сольовому розчині
Хенкса впродовж 15 хв, блокували за допомогою бирегріоскК (фірма Ріегсе, Воскога, штат
Іллінойс) і підвищували коефіцієнт проникності за допомогою 0,25 95 розчину Мопідеї Р-40 (фірма Зідта) у фізіологічному розчині, забуференому трис-НСІ (фірма бідта) (ТВ5) впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Культури один раз промивали ТВ5, що містив 0,1 95 Твін-20 (фірма Бідта) і інкубували з кролячим анти-МА1 Ід впродовж 1,5 год. при кімнатній температурі з подальшим інкубуванням з Еи-міченим антикролячим "другим" антитілом (фірма
МУаїас Оу, Тижи, Фінляндія) впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після інкубування з кожним антитілом, культури промивали ТВ5 (3 х 5 хв із повільним струшуванням). До культур додавали підсилювальний розчин (150 мкл/лунку, фірма У/аїїас Су). Після цього за допомогою флуориметра з часовим розділенням (фірма УМайас Оу) вимірювали інтенсивність флуоресценції. Експресію МАТ у зразках, які були оброблені модифікованими пептидами, визначали шляхом порівняння зі стандартною кривою титрування МОЄ від 0-1000 нг/мл.
Відсоток (порівняно з максимальним можливим пригніченням) пригнічувального ефекту МО на експресію МАТ у нейронах ОВС визначали шляхом порівняння з контролями, які обробці МСЕ не піддавались. Результати наведені у Таблицях 2 і 5.
Клітинні лінії були позначені Мо 110-129. Антитіла клітинних ліній Мо 119, Мо 124 і Мо 125 демонстрували надзвичайно сильну МО Е-нейтралізуючу активність (Фіг. 1). Клітинна лінія Мо 124 являла собою батьківську клітинну лінію, на яку також посилаються, як на лінію 404.
Клітинні лінії Мо 119 і Мо 125 були субклонами батьківської лінії 404. З вихідного флакона, що містив гібридому Мо 124 (404), виростили додатковий зразок, який помітили Мо 167 (404).
Антитіла, продуковані гібридомою Мо 167 (404), піддавали такому самому аналізу нейтралізації МСЕ на основі нейронів ОВС, що і попередні зразки. Антитіло Мо 167 (404) демонструвало сильну анти-МОЕ активність з ІСво на рівні 0,50 нМ (Фіг. 2), що відповідало активності зразків Мо 119, Мо 124 і Мо 125. Рівні активності 4 зразків наведені у Таблиці 2.
Таблиця 2
Секвенування М-кінця і мас-спектрометрія
Зразки очищених анти-Ма гібридомних антитіл були підготовлені для секвенування білків та рідинно-хроматографічного і мас-спектрометричного (І С/М5) аналізів. Антитіла очищали з кондиціонованих середовищ шляхом концентрування згаданих середовищ за допомогою препаративної центрифуги Атісоп сепігіргер-30 доти, доки їх об'єм не ставав меншим за 15 мл.
Порцію смоли гРгоА (фірма Ріаптасіа) промивали (4х) РВ5; після останнього промивання одержали 50 95 суспензію у РВ5. До зразка антитіл додавали відповідну кількість смоли гРгоА (приблизно 5 мкг антитіла/мкл смоли, однак застосовувати слід не менше за 50 мкл смоли) та інкубували впродовж ночі при температурі 4 "С. Суміш смоли з антитілами центрифугували, і збирали незв'язану фракцію. Після додання 0,5 мл РВ5 і перенесення до 0,45 мкл центрифугальної пробірки бріп-Х (фірма Собіа), зразок центрифугували при 10000 об/хв впродовж З хв. Після цього смолу промивали щонайменше тричі 0,5 мл РВ5, після чого до 1,5х об'єму смоли додавали 0,1 М гліцину (рН 2,7) та інкубували впродовж 10 хв при кімнатній температурі з подальшим додатковим центрифугуванням впродовж З хв при 10000 об/хв і збиранням супернатанту. Цю стадію елюювання повторювали ще двічі, після чого об'єднаний супернатант нейтралізували 1/25-ою об'єму 1,0 М розчину трис-буфера (рн 9,2).
Після завершувальної стадії фільтрування через нову пробірку 5ріп-х (0,2 мкм), антитіла піддавали кількісному визначенню за допомогою стандартного аналізу Бредфорда із застосуванням людського Ід(б:ї як стандарту або, за альтернативним варіантом, шляхом визначення оптичної густини при 280 нм для зразків більшого об'єму. Гель також піддавали аналізу із застосуванням 2 мкг кожного зразка разом із 2 мкг людського ІДС, К (фірма бідта).
Для мас-спектрометрії чотири мікрограми зразків деглікозилували, відновлювали (|і завантажували до хроматографічної колонки (НР 1090), зв'язаної у реальному масштабі часу з мас-спектрометром Ріпіпдап СО. Легкий ланцюг відділяли від важкого ланцюга шляхом високоефективного рідинного хроматографування з оберненою фазою. Легкі ланцюги і важкі ланцюги також збирали для секвенування М-кінцевих білків.
Обидві М-кінцеві послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга проби анти-МОЕ антитіла
Зо Мо 167 (404) відповідали обом М-кінцевим послідовностям проби анти-МОаЕ антитіла Мо 119 (404). На додаток до цього, визначена маса антитіл вказувала на те, що антитіла, виділені з гібридом Мо 167 і Мо 119, були однаковими. Визначена маса (23096) розгорнутого легкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Мо 167 відповідала визначеній масі (23096) легкого ланцюга анти-
МО антитіла Мо 119.
Клонування важкого і легкого ланцюгів анти-МСЕ антитіла
Гібридому, що експресує найсильніше МОагЕ-зв'язувальне моноклональне антитіло, 404.07, використовували як джерело для виділення тотальної РНК за допомогою реактиву ТВІ2оЇ? (фірма Іпмітодеп). кКДНК першої нитки синтезували за допомогою довільного праймеру з адаптером подовжувального сегменту (5-с54040 бас АТА спе СТО САМ МММ ММТ-3') (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 33); препаративний аналіз 5 ВАСЕ (швидка ампліфікація кінців кКДНК) здійснили за допомогою набору СепеВасе! М (фірма Іпмийгодеп) за інструкціями виробника.
Прямим праймером, застосованим для одержання кКДНК, що кодує повний легкий ланцюг, був праймер, що входив до складу набору СепеВасе! "М, у той час як зворотним праймером був 5'- ссоа сто Ас! Ста пАА Ста Асбоа-3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 34). Прямим праймером, застосованим для одержання кКДНК, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, був праймер, що входив до складу набору СепеВасе" М, у той час як зворотним праймером був 5'-
ТаАСОА СОС ТА ССА САС 0-3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 35). Продукти аналізу ВАСЕ клонували у РСВА-ТОРО (фірма Іпмітодеп) із визначенням послідовностей. Для конструювання праймерів для РОСА (полімеразна ланцюгова реакція) ампліфікації повномірних ланцюгів антитіла застосовували консенсусні послідовності.
Для одержання кДНК, що кодує легкий ланцюг типу каппа анти-МОЕ антитіла 404.07, 5 РСВ праймер кодував амінокінець сигнальної послідовності, сайт рестрикції Хбраї! і оптимізовану послідовність Козака (5'-САСсі САС АДС СТТ СТА САС САС САТ СА САТ час са асо бас
ТСА СТ ССТ Оса - 3; ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 36). 3'-праймер кодував карбоксильний кінець, стоп-кодон, а також сайт рестрикції Заї! (53-СТТ ТО БАС ТСА АСА СТО ТСС ОСТ ат САА
СТ 0-3; ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 37). Фрагмент, одержаний за допомогою РСВ, очищали, розщеплювали за допомогою Хваї і ЗаїЇ, після чого виділяли на лунках із гелем і лігували до експресійного вектора ро5Ног20 ссавців (дивись публікацію міжнародної заявки МО 90/14363, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. рОоЗНог20 одержали шляхом заміни нуклеотиду 2563 у роБНо19 (гуанозин на аденозин) сайт-спрямованим мутагенезом).
Для одержання кДНК, що кодує важкий ланцюг анти-МО антитіла 404.07, 5 РСВ праймер кодував амінокінець сигнальної послідовності, сайт рестрикції Хваї ії оптимізовану послідовність
Козака (5-САС СДС АС СТ СТА АС САС САТ асА СТ асо асСт ат, ста ат ост тат Т-3; ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 38). 3'-"праймер кодував карбоксильний кінець, стоп-кодон, а також сайт рестрикції Заї! (5-а4СА Та СОА СТО АТІ ТАС бба САС АСА СОЯ АСА О-3;
ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 39). Одержаний продукт очищали, розщеплювали за допомогою Хваї і ЗаїїЇ, виділяли на лунках із гелем і лігували до вектора РОЗНого.
Обчислена маса (23099) (яку визначили шляхом трансляції нуклеотидної послідовності на прогнозовані амінокислоти і підсумовуванням молекулярних мас амінокислот) послідовності
ДНК легкого ланцюга клону анти-МОЕ антитіла 404 відповідала масі, визначеній мас- спектрометричним шляхом. Визначена маса (49479) розгорнутого важкого ланцюга анти-МаЕ антитіла Мо 167 відповідала визначеній масі (49484) важкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Мо 119 і також відповідала теоретичній масі (49484) послідовності ДНК важкого ланцюга клону анти-
МО антитіла 404 (Таблиця 3) у межах відхилення вимірювального приладу.
Дані секвенування білків М-кінця і ЇС/М5 підтвердили, що гібридома Мо 119 експресувала таке саме антитіло, що і гібридома Мо 167. На додаток до цього, маса антитіл, обчислена на основі послідовності, додатково підтвердила наведене спостереження.
Таблиця З
Підсумок мас-спектрометричних даних антитіла Мо 167 антитіла Мо 119 послідовністю ДНК антитіла 404
Приклад 4
Зо Експресія анти-МОЕ антитіл у клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО)
Стабільну експресію моноклонального анти-МОЕ антитіла 404 забезпечували шляхом котрансфекції важким ланцюгом 404/рО5НАНсо9 Іда22 або важким ланцюгом 404/рОзНАс9 Ідс1 та
Маг-каппа/рО5АНсе19 плазмідами дегідрофолатредуктаза-дефіцитних (ОНЕРУ безсироваткових адаптованих клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) за допомогою кальційфосфатного методу. Трансфіковані клітини відбирали у середовищі, що містило діалізовану сироватку, але не містило гіпоксантину-тимідину, для забезпечення росту клітин, що експресують фермент
ОНЕВ. Трансфіковані клони піддавали перевірці за допомогою таких аналізів, як ЕГІ5А, для виявлення експресії моноклонального анти-МОЕ антитіла 404 у кондиціонованому середовищі.
Клони з найвищим рівнем експресії піддавали впливу підвищених концентрацій метотрексату (МТХ) для ампліфікації ОНЕН. Клони, ампліфіковані за допомогою МТУ, піддавали перевірці за допомогою таких аналізів як ЕЇІБА, для виявлення підвищеного рівня експресії моноклонального анти-МОЕ антитіла 404 у кондиціонованому середовищі. Клони з найвищими рівнями експресії піддавали субклонуванню для одержання гомогенної популяції та створення банків клітин.
Рекомбінантні анти-МОЕ антитіла за цим винаходом можуть бути одержані у ОНЕВ- дефіцитних клітинах яєчника китайського хом'ячка за тією самою методикою, що наведена вище для моноклонального анти-МСИЕ антитіла. Послідовності ДНК, які кодують повний важкий ланцюг або легкий ланцюг кожного анти-МОЕ антитіла за цим винаходом, клонують у експресійних векторах. ОНЕВ-дефіцитні клітини яєчника китайського хом'ячка котрансфікують експресійним вектором, здатним експресувати повний важкий ланцюг та експресійним вектором, що експресує повний легкий ланцюг відповідного анти-МОЕ антитіла. Наприклад, для одержання анти-МОЕ антитіла, клітини котрансфікують вектором, здатним експресувати повний важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 40 і вектором, здатним експресувати повний легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 44. Таблиця 4 підсумовує повні важкі і повні легкі ланцюги для 404 антитіл, що мають різні константні ділянки важкого ланцюга да.
Таблиця 4
Варіабельна ділянка важкого
Антитіло ланцюгажконстантна ділянка важкого Повний важкий ланцюг ланцюга
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо ниюшиІнннн?юннннннннншшш
Варіабельна ділянка важкого
Антитіло ланцюгажконстантна ділянка важкого Повний важкий ланцюг ланцюга
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
Приклад 5
Визначення активності анти-ЧОЕ антитіла 404
Тимчасово експресовані анти-МаИЕ антитіла 404, продуковані клітинами, що вирощуються за умов спін-культури (5) або ролерної культури (В), перевірялись для підтвердження їх здатності нейтралізувати МСЕ у реакції нейтралізації МСЕ на основі нейронів ОВС, яку ставили, як описувалось вище (Приклад 3).
Анти-Ма антитіла тимчасово експресувались у адаптованих до безсироваткової суспензії клітинах 293Т. Трансфекцію здійснювали на 500 мл або 1 л культурах. Стисло, клітинний інокулят (5,0х109 клітин/млхоб'єм культури) центрифугували при 2500 об/хв впродовж 10 хв при температурі 4"С для видалення кондиціонованого середовища. Клітини ресуспендували у безсироватковому ОМЕМ і знову центрифугували при 2500 об/хв впродовж 10 хв при температурі 4 "С. Після відсмоктування промивного розчину, клітини ресуспендували у середовищі для вирощування |(ОМЕМ/Е12 (3:1)41х додаток інсулін-трансферин-селенніх Реп зігер СіІш2 мМ розчин І -глутаміну«20 мМ розчин ГЕПЕС-буфератО,01 95 розчин плуроник Еб8)І у 1 лабо 3 л ролерній колбі. Культуру у ролерній колбі встановлювали на стіл магнітної мішалки (125 об/хв), яку вносили до вологої камери (37 "С, 5595 СО»). Плазмідну ДНК об'єднували з трансфекційним реактивом у 50 мл конічній колбі. Комплекс ДНК-трансфекційний реактив одержували у 5 95 кінцевого об'єму культури у безсироватковому ОМЕМ. До безсироваткового
ОМЕМ спочатку додавали 1 мкг плазмідної ДНК/мл культури, потім 1 мкл Х-Тгетебепе ВО- 1539/мл культури. Згадані комплекси інкубували при кімнатній температурі впродовж приблизно
ЗО хв, після чого додавали до клітин у ролерній колбі. Трансфекцію/експресію здійснювали впродовж 7 днів, після чого кондиціоноване середовище збирали шляхом центрифугування при 4000 об/хв впродовж 60 хв при температурі 4 "С.
Зо Для тимчасової трансфекції ролерних колб ми застосовували адгезивні клітини 293Т, які виросли і підтримувались у ОМЕМ, доповненому 595 ЕВ5-1Х замінних амінокислотніх Реп зігер СіІш--їх пірувату натрію. Приблизно 4-5х107 клітин 293Т висівали у ролерних колбах (850 см") впродовж ночі. Наступного дня попередньо висіяні клітини трансфікували за допомогою трансфекційного реактиву ЕРиСепеб. Суміш ДНК-трансфекційний реактив одержували у приблизно 6,75 мл безсироваткового ОМЕМ. Спочатку додавали 675 мкл трансфекційного реактиву ЕРибепеб, потім 112,5 мкг плазмідної ДНК. Одержаний комплекс інкубували при кімнатній температурі впродовж 30 хв. Після цього суміш у цілому вносили до ролер-флакона.
Ролер-флакон заповнювали газовою сумішшю (5 96 СО»), герметично закривали і вміщували до термостата (37 "С) на ролерний штатив, що обертався зі швидкістю 0,35 об/хв. Трансфекцію здійснювали впродовж 24 год., після чого згадане середовище замінювали 100 мл ОМЕМ--1х додаток інсулін-трансферин-селенніх Реп Бігер Сішінїх замінних амінокислотяіх пірувату натрію. За типовим варіантом, з кожного ролер-флакона одержали два 100 мл 48 год. врожаю.
Зібрані безсироваткові кондиціоновані середовища об'єднували, і центрифугували при 4000 об/хв впродовж 30 хв при температурі 4 "С.
Як 404.Ідас1, так і 4041922 продемонстрували високу активність проти людського МО зі значеннями ІСво від приблизно 0,14 нМ до приблизно 0,2 нМ (Фіг. 2). Результати аналізу активності підсумовані у Таблиці 5. Згадані антитіла продемонстрували низьку активність проти щурячого МОРЕ (Фіг. 3). Одержані результати нагадують активність антитіл, що перевірялись безпосредньо з гибридом, як описувалось вище.
Таблиця 5
НМСР-людський МИ, "Ма Р-щурячий МСЕ, В-ролерна культура, 5-спін-культура
Приклад 6
Продукування анти-МаОЕ антитіла
Анти-МаЕ антитіло продукують шляхом експресії у клональній лінії клітин СНО. Для кожного виробничого циклу клітини з одного флакона розморожують у безсироваткових культуральних середовищах. Клітини спочатку вирощують у Т-колбі, потім у ролерних колбах, потім у реакторах із нержавіючої сталі у зростаючих об'ємах до 2000 л біореактора. Продукування здійснюють у 2000 л біореакторі за методом підживлювання культури одного виробничого циклу, за яким концентровані поживні інгредієнти середовища додають для підтримання росту клітин та життєздатності культур. Виробничий цикл триває впродовж приблизно двох тижнів.
Впродовж цього періоду часу анти-МОаг антитіло конститутивно продукується клітинами і секретується до культурального середовища.
У виробничому реакторі підтримують визначений рН, температуру і рівень розчиненого кисню: рН регулюють шляхом додання газоподібного діоксиду вуглецю та карбонату натрію; рівень розчиненого кисню регулюють шляхом продування повітря, газоподібного азоту та кисню.
На кінець виробничого циклу клітинну масу вносять до тарілчастого сепаратора, і культуральний супернатант відділяють від клітин. Одержаний концентрат додатково просвітлюють спочатку за допомогою глибинного фільтра, потім за допомогою 0,2 мкм фільтра.
Просвітлене кондиціоноване середовище після цього концентрують шляхом ультрафільтрації з
Зо тангенціальним потоком. Кондиціоноване середовище піддають 15-30-кратній концентрації.
Після цього одержане концентроване кондиціоноване середовище піддають очищенню або заморожують для пізнішого очищення.
Приклад 7
Перехресна реактивність з іншими нейротрофінами
Антитіла 404 перевіряли на перехресну реактивність проти людського МТЗ або людського
ВОМЕ (фактор росту нервової тканини мозкового походження) різними біотестами, у тому числі аналізом виживаності нейронів ОВС для людського МТЗ ії аналізом поглинання БА (допамін) культивованими нейронами БА для людського ВОМЕ.
Обробка культур ОНИ МТЗ, анти-МТ3З ії анти-МаЕ антитілами
Через 2 год. після висівання клітини ЮНС (опис методики виділення наведено вище у
Прикладі 3) обробляли рекомбінантним пМТ-3 (100 нг/мл, 3,8 нМ). Серійно розведене анти-пМТЗ антитіло (фірма НУО) застосовували як позитивний контроль. Невідомі антитіла (проби анти-
МО антитіл) додавали у 10 концентраціях із застосуванням 3,16-кратних серійних розведень.
Усі проби перед доданням до культур розбавляли у повному живильному середовищі.
Визначення експресії МЛР2 у нейронах ОВС
Культури фіксували 4 95 розчином параформальдегіду у збалансованому сольовому розчині
Хенкса впродовж 15 хв, блокували за допомогою Зирегріоск (фірма Рієгсє) впродовж 1 год. і підвищували коефіцієнт проникності за допомогою 0,25 95 розчину Мопідеї Р-40 (фірма бідта) у фізіологічному розчині, забуференому трис-НСІ (фірма бідта) (ТВ5) впродовж 1 год. при кімнатній температурі (ВТ). Культури один раз промивали ТВ5, що містив 0,1 95 Твін-20 (фірма
Зідта) і інкубували з мишачим анти-МАР2 ІдСс (фірма Спетісоп, Тетесціа, штат Каліфорнія)
впродовж 1,5 год. при кімнатній температурі з подальшим інкубуванням з Еи-міченим антимишачим "другим" антитілом (фірма УМайас Оу, ТиМЖи, Фінляндія) впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після інкубування з кожним антитілом, культури промивали ТВ5 (З х 5 хв з обережним струшуванням). До культур додавали підсилювальний розчин (150 мкл/лунку, фірма У/аїІас Су). Після цього за допомогою флуориметра з часовим розділенням (фірма У/аїІас бу) вимірювали інтенсивність флуоресценції.
Культура клітин середнього мозку зародка
Застосовували 19-добові зародки (Е19) пацюків лінії Зргадие-Оаулеу (фірма даскзоп І ав).
Вентральну тканину середнього мозку, збагачену допамінергічними нейронами, видаляли і переносили до холодного фізіологічного розчину, забуференого фосфатом Дульбекко (ОРВ5) без Са-з і Му» (рН 7,4) (фірма Сірсо). За допомогою папаїнової дисоціаційної системи (фірма
Муоппіпаїп Віоспетіса! Согр., Егеепоїд, штат Нью-Джерсі) з фрагментів тканини одержали суспензію окремих клітин. Стисло, фрагменти тканин інкубували у гідролітичному розчині, що містив 20 Од/мл папаїну у збалансованому сольовому розчині Ерла (ЕВ55) при температурі 37"С впродовж 50 хв. Клітини відділлли шляхом продавлювання через відполіровані оплавленням пастерівські піпетки у дисоціативному середовищі, що містило МЕМ (мінімальне підтримувальне середовище)/Напт'5 Е12 (неоднорідне штучне живильне середовище Е12) (1.1), 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,005 95 дезоксирибонуклеази (ДНКаза). Відділені клітини осаджували при 200 ха впродовж 5 хв і ресуспендували у ЕВ55, що містив 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 17 мг/мл овальбуміну та 0,005 95 ДНКази. Суспензію клітин центрифугували у градієнтному розчині, що містив 10 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 10 мг/мл овальбуміну при 200 х д впродовж 6 хв для видалення дебрісу, після чого фільтрували через 25 мкг нейлонову сітку Міех (фірма Теїко, Іпс.) для видалення скупчень. Відділені клітини висівали (100000/см2) на планшети для культури тканин. Згадані планшети попередньо сенсибілізували поліорнітином (100 мкг/мл) (фірма бідта) та мишачим ламініном (1 мкг/мл) (фірма Сібсо ВРАЇ), як описувалось раніше (Луїс Дж.К. (І оців 9.0.) та інші, / Рнаптасої. Ехр. ТНег. 1992; 262:1274-1283). Культуральне середовище містило мінімальне підтримувальне середовище (МЕМ) і Напт'5 Е12 (1:1), 12 95 конячу сироватку (фірма Сірсо), трансферин (100 мкг/мл) та інсулін (2,5 мкг/мл) (фірма бідта). Культури витримували при температурі 37 "С, 5 95
Со» і 100 95 вологості впродовж 6 днів.
Обробка культур клітин середнього мозку ОВМЕ, анти-ВОМЕ або анти-МаЕ
Через 2 год. після висівання до клітин додавали спочатку ВОМЕ (10 нг/мл), потім серійні концентрації проб анти-МОЕ антитіл. Анти-ВОМЕ антитіло (фірма Атдеп) застосовували як позитивний контроль.
Поглинання СА нейронами середнього мозку
Аналіз поглинання допаміну здійснювали, як описували раніше (Фрідман Л. (Ргієдтап Г.),
Мітіліно К. (Муйіпеои С), Мецгозсієпсе І ейеге 1987: 79:65-72). На 6 день культури один раз промивали попередньо підігрітим фосфатним буфером Кребса-Рінгера (рН 7,4), що містив 5,6
ММ розчин глюкози, 1,3 мМ розчин ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) та 0,5 мМ розчин паргіліну (інгібітор моноаміноксидази). Культури інкубували у буфері для поглинання, що містив 50 НМ розчин (-НІСА (МЕМ), впродовж 60 хв при температурі 37 "С. Поглинання припиняли шляхом видалення буфера для поглинання і культури тричі промивали фосфатним буфером
Кребса-Рінгера. Клітини піддавали лізису для виділення (-НІСА шляхом безпосереднього додання до культур рідкої сцинтиляційної суміші Орііїсрназе зирептіх (фірма У/аїІас).
Радіоактивність клітинних лізатів визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника Містореїа-ріи5 (фірма УУ/аЇІас, Іпс.). Поглинання БА низького рівня спорідненості визначали шляхом додання 0,5 мМ розчину с2ВНА12909, специфічного інгібітора сайтів поглинання БА високого рівня спорідненості (Хіккіла Р.Е. (НеїКкКіїа А.Е.), Мазіно Л. (Ма?іпо Г.),
Егтореап доштаї ої Рнаптасоіоду 1984: 103:241-8), до буфера для поглинання з подальшим відніманням від загальної кількості поглинання з одержанням значення поглинання ОА з високим рівнем спорідненості.
Таблиця 6
Приклад 8
Ідентифікація антигенної детермінанти для анти-МОЕ антитіл
Картування антигенної детермінанти обмеженим протеолізом
П'ять мікрограмів (мкг) МСЕ інкубували з 404 (11 мкг) впродовж 30 хв при температурі 4 "С у 0,1 М розчині трис-буфера (рн 7,5). Після цього одержаний комплекс розщеплювали протеазою (субтилізин) (1 мкг) при температурі 37 "С впродовж 1 год. і 2 год. Пептидні карти (одержані шляхом високоефективного рідинного хроматографування (НРІС)) взаємно порівнювали для виявлення пептидів, які були захищені антитілами 404. Обмежений протеоліз МСЕ показав, що початково з МОРЕ виділились декілька головних пептидів. Особливий інтерес становить одержання пептидів 518.3, 518.5 та 534.4 і їх захист від протеолізу антитілом. Інші піки не були чітко сформованими або захищеними. У Таблиці 7 наведені захищені пептиди двох експериментів (розщеплення впродовж 1 год. і 2 год.).
Таблиця 7 впродовж 1 год. впродовж 2 год. 56.1 Щ|ОАА(96-98)..0 |Скнець/ | 7/7 -7777777177777171115721СС
ЕРЕТК (53-57) . .
З5ОЗНРІЕНЕ (1-9) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 46) . 518.5. | (Нуумеуу" (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме | М" Кінець 40 50 47
МОМЕКОУРЕРЕЕТК (46-57) . . заеа (послідовнстьмеяю (Дияналей 69138
Відсоток захисту обчислювали за висотою пептидного піка. 518.5 містив два пептиди, але лише один пептид (555НРІЕНА; ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 46) був захищений антитілом 404, оскільки пік іншого пептиду (НУ/М5М; ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 47), за результатами визначення оптичної густини при 280 нм, при доданні антитіл 404 залишився незмінним. Пептид 518.3 являв собою С-кінцеву частину 534.4; обидва пептиди походили з однієї ділянки петлі. М-кінцеві ділянки та центральні ділянки петлі також були можливими антигенними детермінантами.
Відділення розщеплених пептидів за допомогою мікроцентрифуги
Матеріал, розщеплений субтилізином (по З мкг кожного), інкубували з активними антитілами 404 та з неактивним моноклональним антитілом (Мо 162) впродовж 30 хв при температурі 4 "С у 0,1 М розчині трис-буфера (рН 7,5). Зв'язані/незв'язані пептиди відділяли на мікроцентрифузі
Містосоп 10 (фірма МійПіроге Согр., Вейїтога, штат Массачусетс), і обидві фракції (зв'язану і незв'язану) піддавали аналізу засобами НРІ С для виявлення пептидів, зв'язаних з антитілами.
Виявили два вичерпані піки, ідентифіковані шляхом порівняння засобами НРІ С незв'язаних фракцій після обробки антитілами 404 і Мо 162 та відділення за допомогою Місгосоп, які вказували на пептиди, зв'язані з антитілами. З антитілом 404 були зв'язані наведені нижче пептиди:
З1(4.4) ---- ЗВАКАМАВ (113-119) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 49), С-кінцевий; і
З2(28.3) --- ЕМММІ. (35-39) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 50), ділянка петлі.
Зо Пробу МОЕ за альтернативним варіантом розщеплювали за допомогою І увз-С (К) впродовж 24 год. Залишки цистеїну відновлювали і піддавали карбоксиметилуванню без денатурації.
Одержану пробу інкубували з моноклональними антитілами 404 і АМО2162 з подальшим відділенням на Містосоп 100. Зв'язані і незв'язані фракції аналізували засобами НРІС з оберненою фазою. Лише два пептиди були ідентифіковані як К-пептиди, що зв'язують антитіло, як показано нижче. Обчислені маси пептидів, визначені аналізом послідовностей і мас- спектрометрією згаданих пептидів, співпадали. Згадані пептиди, як показано нижче, були картовані на М-кінцевій та С-кінцевій ділянці.
К1(37.6) - (ББІНРІЕНВНИЕРЗУМСОБУБЗУММИОК (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 51)
Обчислена маса-2821; фактична маса-2828,2; М-кінцевий.
К2(39.5) --- ОААМ/ВРІВІОТАСМУСМІ 5АК (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 52)
Обчислена маса-2452; фактична маса-2459,5; С-кінцевий.
Попередні експерименти з картування антигенних детермінант показали, що щонайменше три ділянки були можливими антигенними детермінантами для антитіл 404, у тому числі М- кінець (1-9), внутрішня (46-57) та С-кінцева (96-98) ділянки. На додаток до цього, розщеплення
АврмМ показало, що фрагмент пептиду, який містив ---55НРІЕНВСЕЕ5ЗМО--- (ПОСЛІДОВНІСТЬ
Мо 53), був захищеним антитілом 404, у той час як розщеплення трипсином показало, що фрагмент пептиду, який містив --55НРІЕНАВ-- (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 54), не був захищеним антитілом 404. Таким чином, на М-кінці, послідовність СЕР5МОС (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 55) є найважливішою для зв'язування антитіл 404.
З метою точнішого встановлення антигенної детермінанти для анти-МОЕ антитіла 404.Іда1, за стандартними методами, виходячи з повної послідовності людського зрілого МСЕ (Ма), синтезували у загальній кількості 23 пептиди (Таблиця 8). Згадані пептиди мали у довжину 15 амінокислот, із взаємоперекриттям 10 амінокислот, і цистеїновий кінцевий сегмент на С-кінці для кон'югації з матрицею. Для проведення експерименту з картування застосовували людське анти-НМОЕ антитіло 404.ІдсІ1, описане вище.
Таблиця 8 о 33582-27-05 |МУСОКТТАТРІКОКЕС(21-35)..../.ЮКК(ХЙЮК(ШЙ Ї.77777777771С17с6о111ссСсСсСс2С о 33582-27-11 |ОУРРЕТКАВОРМРМОС(51-66)..-/:/Н/(: КИ |Ї7777777777сс/с66вбссСсСсСсСшС у о 33582-27-13 |РМРУО5САВОІЮЗКНО(61-75).:(/(;3|.:| ИМЙМ| | 68 г Щ о 33582-27-14 |5САВОІО5ЗКНУУМЗУСІ(66-80).С/|Ї777171717171717171717116911СсСс2СС
Фрагменти людського МОРЕ пептиду розбавляли у РВ5 з 595 розчином ОМ5О (диметилсульфоксид), 1 мМ розчином ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) (рн 6,23).
Кінцева концентрація пептиду була нормалізована до молярної концентрації, що відповідала 55
МКМ (приблизно 100 мкг/мл). Пептиди інкубували у 96-лункових титраційних мікропланшетах
Веасії-Віпа, активізованих малеїмідом (фірма Рієгсе, номер за каталогом 15150) (100 мкг/лунку) при кімнатній температурі впродовж 2 год., потім при температурі 4 "С впродовж ночі з перемішуванням. Людський МСЕ (100 мкг/мл) застосовували як позитивний контроль. Планшети промивали промивним буфером (КРІ) і блокували 0,2 95 знежиреним сухим молоком (у буфері
РВ5О-ЕОТА, рН 6,23) впродовж 2 год. при кімнатній температурі з подальшим додатковим блокування 5 95 ВБА впродовж 1 год. Після цього планшети інкубували з людським анти-Має антитілом у різних концентраціях (0 мкг/мл, З мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл), потім із козячим анти-НЕс антитілом, кон'югованим із НАР (пероксидазою з хрону) (КРІ) впродовж 2 год. Сигнал проявляли за допомогою субстрату ТМВ і зчитували при 450 нм після додання розчину для припинення реакції (КР).
З-посеред 23 людських МСЕ пептидів, спостерігали щонайменше 4 головні піки, що вказували на зв'язування 404. (Ці піки відповідали таким пептидам: пептид Мо 1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 56), Б55НРІЕНВНСЕЕЗМОС (1-15); пептид Мо 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 65),
МОМЕКОМЕРЕТКАНО (46-60); пептиди Мо 16-17 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 71-ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо
Зо 72), ММ5МАТТТНТЕМКАЇ ---(76-953; і пептиди Мо 18-21 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме /(73-
ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 76), ТТТНТ---І ЗАКО (100-115).
Чотири піки зв'язування 404 були картовані на М-кінці, С-кінці, внутрішніх ділянках, а також на петлях 12 і 14 МОБ, як описано у Вісман (М/іезтапп) та інших (1999, Маїйге 401:184-8). Ці результати узагальнені у Таблиці 9.
Таблиця 9
Антигенні Внутрішня Внутрішня детермінанти! М-кінець І? утр І 4 утр С-кінець ділянка ділянка
Має
Пептиди Мо
Пептид Ме 1 Пептид Ме17 20-21 (ПОСЛІ- Пептид Мо 10 | Пептид Мо 16 (ПОСЛІ- Пептид Мо 19| (ПОСЛІ-
ДОВНІСТЬ (ПОСЛІ- (ПОСЛІ- ДОВНІСТЬ (ПОСЛІ- ДОВНІСТЬ
Пептид Мо Ме 56) ДОВНІСТЬ МеІДОВНІСТЬ Ме Ме 72) ДОВНІСТЬ Ме |Ме75-ПОСЛІ- 595НРІ-- 65), МОМЕКО-1І71), М/ ММ А--- тМОоСКО-- 74), ммМрак---ї ДОВНІСТЬ 1-15 ' --, 46-60 «76-90 81-95 ;81-105 Мо 76),
ОСАДАДМУ/В---, 96-115
Сигнал зв'язування я ня млин млин я млин антитіла
Вісман (Міезтапгп) та інші встановили кристалічну структуру АМОЕ, зв'язаного з рецептором
ІИКА, і показали, що М-кінець (залишки 2-9) був важливим для зв'язування рецептора (Вісман (Мієзтапи) та інші, 1999, Маїште 401:184-188). Залишки цього сегменту у МСЕ є також важливими для специфічності до рецептора КА, порівняно з рецепторами КВ або ЖК.
Антитіло 404 є селективним відносно людського МСЕ, порівняно з мишачим/щурячим МОБ, а також ВОМЕ ї МТ-3, найбільш ймовірно, з причини М-кінцевих різниць між людським МО та іншими нейротрофінами.
Антитіло 404 зв'язується з пептидом Мо 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 65) (М5МЕК---, 46-60) і пептидом Мо 17 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 72) (ТПТ'ТНТЕУКАЇ ТМОСКС, 81-95), що відповідають петлям 1 2 та 1 4, відповідно, які представляють дві із семи різних ділянок із більш високою, аніж середня, різницею послідовностей серед нейротрофінів. Експерименти з обміном цих семи ділянок між МСЕ ії ВОМЕ показали, що І 2 і 14 були важливими для біологічної активності МОРЕ.
Окрім того, наслідком заміни п'яти залишків МТЗ у петлях 12 і 4 залишками МОРЕ була поява
Маг -подібної активності з одночасним збереженням активності МТЗ. Таким чином, І2 і 14 є можливими ділянками, де антитіло 404 селективно зв'язується з МОН, а не з ВОМЕ або МТ-3.
Антитіло 404 також зв'язується 3 пептидом Мо 16 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме (71) (М/М5УМАТТТНТЕМКАЇ,, 76-90), сполученим із внутрішнім доменом кристалічної структури МОРЕ.
Ця ділянка є 100 95 гомологічною у людського МСЕ і мишачого МО, але відрізняється від інших нейротрофінів. 404 показало набагато слабкішу активність проти щурячого/умишачого Ма, порівняно з активністю проти людського МОР. Таким чином, зв'язування з цією частиною МО, найбільш ймовірно, не є критичним для видової специфічності але є важливим для селективності серед нейротрофінів.
Антитіло 404 зв'язується також з С-кінцевою ділянкою МО (пептиди Мо 19-21 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 74-ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 76) ТМОрак--- І 5АКС, 91-115), що являє собою одну з ділянок людського МОРЕ, яка відрізняє МОЄ від інших нейротрофінів (ВОМЕ та МТЗ).
Зв'язування з цією ділянкою допомагає пояснити, чому 404 не є активним проти інших нейротрофінів. Окрім того, між людським МО і мишачим МО на С-кінці існує різниця у одну амінокислоту, що дозволяє висунути припущення про те, що ця одна амінокислота може бути однією з причин того, що 404 віддає перевагу людському МОЕ, порівняно з щурячим/мишачим
МОРЕ. Подібне припущення має відношення і до М-кінця, де спостерігаються видові різниці.
І, нарешті, 404 взаємодіє також із внутрішнім доменом, який описується пептидом Мо 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 65) (-КАВОС, 50-60) людського МОР, який являє собою важливу ділянку для переважного зв'язування МСЕ з КА, а не з КВ або їїКС, що додатково пояснює його вибіркову нейтралізуючу активність проти людського Ма.
Приклад 9
Визначення спорідненості моноклональних антитіл за допомогою КіпЕХА
Зв'язування антитіла 404 (38859-80) з Рима (29714-91) перевіряли за допомогою КіпЕХА.
Стисло, Веасії-сеє! бх (фірма Рієсе) попередньо сенсибілізували за допомогою НИМИ і блокували за допомогою ВБА. Проби антитіла 404 (10 пМ ї 30 пМ) інкубували з різними концентраціями им (фірма Атаєп) при кімнатній температурі впродовж 8 год. перед пропусканням через гранули, сенсибілізовані НИМИ. Кількість антитіла, зв'язану з гранулами, визначали за допомогою козячого антилюдського-Ідс: антитіла, міченого флуоресцентною міткою (Суб) (фірма дЧасКбзоп Іттипо Везеєатгсі). Сигнал зв'язування був пропорційним концентрації вільного антитіла у стані рівноваги. Константу дисоціації у стані рівноваги (Ко) визначали шляхом нелінійного регресійного аналізу кривих конкурентного зв'язування із застосуванням моделі гомогенного односайтового зв'язування з двома кривими (програма
КіпЕХ"М). Ко зв'язування антитіла 404 з пиМОЕ становила приблизно 4 пМ.
Приклад 10
Ідентифікація додаткових анти-МаИЕ антитіл
Додаткові анти-МОЕ антитіла (позначені як 14010, 629, 7Н2, 14Е11 і 46), які одержали та ідентифікували, як описано у наведених вище Прикладі 2 і Прикладі 3, були відібрані для додаткового дослідження. Стисло, кондиціоновані середовища перевіряли на зв'язувальну активність. Антитіла із середовищ очищали і секвенували. Прогнозовану масу порівнювали з мас-спектрометричними даними антитіл із кондиціонованих середовищ. Антитіла піддавали клонуванню. Два клони були експресовані у клітинах СНО і перевірені на активність, як описувалось вище. Результати наведено у Таблиці 10.
Таблиця 10
ІСво МО | ІСвот Ма . Молекулярний | ІСво АМС | ІСво "Ма 4010 | 03918 513 |клонований.// 34011 | 02803 520 |клонований.// (406 | 0414 | 510 |клонований./
Після цього послідовності варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів цих антитіл порівнювали з послідовністю антитіла 404, а також між собою (Фіг. 5 і Фіг. 6). Відсоток гомології варіабельних ділянок важкого ланцюга, визначений цими порівняннями, подано у Таблиці 11.
Відсоток гомології варіабельних ділянок легкого ланцюга подано у Таблиці 12. Окрім того, на
Фіг. 5-10 зображено відсоток гомології гіперваріабельних ділянок різних антитіл.
Таблиця 11 011111 4рамно | лартомн о | бнеоУН | 7нгмн | їа4ріл1ун | «е6УнН лартоМмн 17777771 177 лооов | 955396 | 8595 | 54395 | 8196 6бнеМн Її 77771771 лоз | 86696 | 54996 | ВТ о Янемн Її ї17777771717171717171717717171717171717171111лорзв | 5Тазь | 79855 о МНн Її 17111111 лоозе | 56855 і 4авбмн ЇЇ Г1111117111111111111111111111111 ось
Таблиця 12
Ура 119011 сват сасврі сасвсі с 11010 | вно с йсватсі7нгі с |. 4с6е
УК ІС ІС пок тон 4абацс! | ло з4авбріс!ї | 771 | л10095 4абсісЇ 17777117 Ї1771717171717717171717171 10096 111 ре внеісЇї 11171771 рлоо9о 4авацсї ГГ ро тнасї /1ОГ11Г11Г1111111111111рлооюї 4овбе|./ Її 77717111 рт
Слід розуміти, що у наведеному описі наведені певні конкретні варіанти здійснення цього винаходу і що усі модифікації або альтернативні варіанти, еквівалентні згаданим варіантам, входять до суті та обсягу цього винаходу, представлених у формулі винаходу, що додається.
ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105КеппетУ/їа
Тгеапог, датев
Ниапо, Наіспип
Іпоне, Неаїнег «папа, Тіє 9.
Мапіп, Егапк й «120» ЛЮДСЬКІ АНТИ-МОСР НЕЙТРАЛІЗУЮЧІ АНТИТІЛА ЯК СЕЛЕКТИВНІ ІНГІБІТОРИ
МЕТАБОЛІЧНИХ ШЛЯХІВ ФАКТОРА РОСТУ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ (МОРЕ) -130» 02-1240 -1505 5 60/487,431 -1515 2003-07-15 -160» 138 «170» Раїепінп мегвіоп 3.0 «21051 -2115» 990
Ко) «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «4005» 1
Честссасса ачодсссатс дахскЕсссс стаддсасссє ссстссазоза сасстстадо ва одсасадсуд ссссбоусті сстодтсаза дастасттсс ссдазссоде часодсоїсу 120 тадаасссад дсассссдас садсадсута сасасстксс сдоастатесЕ асадісстса 180 адастстаст сестсайсзо сесодедасс дсдссстсса дсадсесуда сасессадасе 240
ЗБ тасаєстаса асусуавтсса сапйдсссадс васассаацда тодасавдая вата ссс 300 заатсттату асавзастса сасасоєсся ссустосссад свсстозась сстододода 360 ссутсачістї Єсссскссс сссаааассс засдасассс їсабоасссс ссбдаєсеся А20 даддєсасає сусодечох ддасосвайс сасуаавдаєс стоваоадсесва дгесвастад ВО тасасочасо осасовадає осасаакасс задасаавос сосоддадда дсадтасаас 540 засасотаєс Чтосоцісад соїсстсасс дксстусаєс додастадсе даатадсазо ой дадсасзвох дсаадаєстс свясаваусс сгсссадссс ссаксдаоав аассаєстсє 660 завдссязао досадссссо аозассасво дтотасаєсс тассессатс ссоддаєола 720 скдассвада ассаудєсао єстдасссує ссудєсавад остсстатєсс садсувсаєс "ва
Чссакдозах додадауєва кддоасадссу озовасвасє асадозссає дссєсссоТа 840 стддастеса зсудстести СЕКесСЕСТакх арсазуєтса седкодасаа узусадуєоЗ 900 садсасодда асятстжскс абосстссуєо акасаєдчава сесєйсасва ссастасаєса 950 садававісс єстссстатс тссодутаав 990 «21052 «2115» 330 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 2 діа бег тпг уз ФІу Рго бек Уаї Ре рго ем АТа РгО бег бек Гу 1 5 10 15
Бег те Беб осіу єЄ1у тре АТа АТа сце СТу Сух Бен омаї Бу АБр тТуг ми | г | зо ши
Рів рго бій Бго Уаі їв омаї дес ттр о дбп Зев боту Ай Сей так 5ев 35 40 45
Ту маї нів Тіг о Райе Рг АТа уаії ву сів баг о беб ОТу Сец Туг 5ег 50 55 що цей его бек ма! Уа! ТВроуаї Рго бек бег бек ів сіу тб осій Тиг 55 70 75 80
Туг же сук дхп уд! Або ні ух РГО 56г АБО ТВгГ Гуз Маї дер кує 85 о 85
Сук ма! бій рго (у бек Сух Ар су Те ще тВг оСує вго Рго сСух що 405 що
Рго лія Рго біз ей меч ау 01У РгО бек уаї Рв реч РМЕ РГО РгО 120. 125 цу Рго муз Ар таб оїєм Мет їіе бег Ага Тйге вро бін маї ТВг Суз 330 135 І чо
Узі Уа! Уаї Ар Уві 5ег нія бій дер РгГо сім Уа! губ РНе Аза тор 145 150 155 160 стук Маї Ар су ма! бів уа!ї Ні Ап АТЯ Гуз Вгору бго дго су 165 170 175 сін сій тує дей бег ТР о туг Аго уаї Уа! бек ума! Бе так уд їв 180 185 190
Ні бій хр ти Мен Аяпобіу губ б1ю Туг оїух бує рує« ма! 5ес Ап 195 200 5. ух АТа гей РгО Аа Рго їТе сій Бу Те хе Бег гух Аа Гу су 210 215 220 бій веб Ага бі Рго бЄїп ма! туго Тйг Бей Рго Рго бег Аго Ар біо 225 230 235 240 ійем Тпг бух Ап обІй маї Бек сеи Тк оСуз гей Маї уз сїу РНе Туг 245 ай 255 рго его Ар тів АТа маї ої Тгробію бег Авп о б1у бій Рго Січ Авп 250 жв5 | 270
А Туг губ ТТГ ОТВг Рго го уаї Сен Ар бе Абр сі1у 5еб РН пе 275 280 285 іеи туг 5ег ув Бен тб о уді Азр Су б5ег Аго Тер бій ба сТу Або 250 295 300
Уа Ре чек Суб бек уаї Меб нія сій А1а ви мів деп ні туго тве 305 310 315 320 сій рух заг оїем Бег Пец б5ег Рго Су Кух і 325 330 «2105 З «2115» 978 «212» ДІЖ «213» Ното зарієп5 «400» З псестссасся аодфосссатс одтсттсссс стддсасссь дстссводво сасєстссоау Бо ацсасачецо сессайчсту сехауссаадЯ частасссес ссдаассод дасудкаєса 120 тадзастсва дсасжствдає саасодеяєч сасаєстьссс саостсдтсст асачесстса 180 пдаскстастї ссстсваосао сосодвдаєс дсассстсса дсаастєсод сасссадаєс 740 жкасасстоса асусзнаєся сазоєссадс васассаадцо тудасаачає зпттувосоє з0а авакассосо гсадвоєоссс ассдтоссса дсассасєсто кдодсладасс зксааестс 350 сесфєссссс сааавсссав. одасаєссто атовисьссо одчасссстаз дассасокає 420 атадтовсоЯ асасаауєся совабасссс дайосссває теаастався саходасвде 480:
п:дЧозо9кУє аїаатассай озсаазосса соодзоцацс абйзтсвасво сасотсесух За чбодісаосо їссЕсассої бобусассяо дасстостоя асодсавода дтасзавтдє 600 задосєстсся асавабуссє сссадсєссє ассозоваай ссахстссва аассанадоз 660 садссессцавб аассасадує обасасссто сссссаїссс ппдаодвоає дассазозає 720 садісадсс єуасстоссі одксазадоє Ксстасссса дсоасаксос соїоовоєою УВО здазасааті досауссоца Озасвзастяє аадаєсясаєс стсссасоєе йдастесвдає ва часксстесі сестстаясад сайдстсасс дбодасавча осаддтодся осзадоовдає що дЕстсСЕсВЕ дсессубоає дсакдадос сбосасаасс асіасасоса давдадестс 960 тсЕсСЕЧЕсте содотазва 978 «2105 4 «2115 326 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 4
Й Й
Аіа бек твг (уз сіу Рго бег Уа! Ріє рго без АЗа го Субз бег Аг 1 5 Ю їх сег тій зак в и бак пк АТа Аа цем су Суз сей узі цу ака тут
Ре Рго бі Рго МУаї їй Уаї бег о Тгр Ап бек біу Аїа (ей Тс 5ег 35 чо 45 сіу Уа нія те Ра Рг АТа Маї се сій бБег 5ег сту ай тує 5ег 50 35 650 іеи бер бег ма! Уа! Тс ма! Бго бак бегод5п РАВ біу Тв бій тат 63 п їЗ 50 тує отне суч ав Ууді Ахе ні 1уб РГо ЗР АБИ ТР ОСує мії дзрогух 55 90 95
Тиг Уа! біз дго ув Суз бух Ма! біш Сух Рго Рго Суз Вго Аа Рго 100 105 11 вро Ууаї аіа біу вго 5ег уа! РН сец Ре Рго Рг муз Ро ух АЗр 115 120 125
ТНК вец Меб І1є зег о Аго тВгобго бій Уа! тс о сСуз уаї маї Увї Азхр 130 135 140 уаї Бер нія сі Адяр о РГО сш Уаї бій РВЕ Ав тгротуєв Уа! Абр сту 145 150 155 160
Уа1 бу Уаї ніз ап Аз гук Тйгогує Ро Аго бів біч бій вве АБ 165 170 175
Бек отНе РН до узі уаі хеб Уа! цей тв оуаї Уаї нів бій Азрвотор ї50 185 190
Ге Аби оіу туз бій тує уз Суб (уз Маї бек Ап ув сіу гц Рго | 290 205
А1а Рг І16 б1ц фу тіг хі его гує Те туз су бій вро Ав бін 210 іх 20
Рго біп уаї туг так іви Бо Рго Бек Ага 10 бій Меж так ув дей ех 230. 235 240 ста маї 5ег вец тйг Суз зву маї бує Сіу Ре Туг Рго 5ег дхр їв 245 250 255
Аза маї СВ цк Ти Зег Авп сту бій Рго 91 дяп АБИ тує гук таг 260 265 м
Те го бго Меб сво дер 5ег дев с1у бег РНе еНе їеи ук бег осув - 25 280 285 мен тик Уа! Азр буз Хег Агу Тер обів бій сіу Абп Уяї РА 5ег Суз 290 шо 235 300 чего уаї Мет Ні СТИ Аіва сви ніз д5л о Міз тує тйг бій цує 5ег ву 3а5 310 315 320 заг Бей баг Рго с1у ух
З
«2105 5 «2115 981 «Р12» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 5 дсеаосасса яададссакс сеїсексссс ссодсусссю дсессадово сасстссдау 60 айсасадссЯ сессббоєто сстуотсаао дастассссс ссдлассоцє дасодстаєся 0120 тупаасьсва дсосестчас саосоосято сасасстксс судестатсс: асачЕссеса 188 дчастістасу сестсаасац сутадстдасс ятоссстсса дсазсєсаду сасдвадчасс 24 тасаєстиса асасацатса сазусєссадс аасассайаоЯ садасзайво адссцавссс 300 азасатдоаєс сессатоссс атсатдссса одсасстоачх сессовооч ассатсаайс ЗБ
ЄЕсстостсс ссссяазасс саводасасе стсагоастст сссддасссс созодєсасу 0420 тосукаосуа тобасутвад ссаоозадас сссоаоЧчесе аасссазсто асасигодах 488 песосадача тасатзасос савчасааач ссосоадуача адсаціссва садсасоває ЗАЙ сасоковеса усуїссксас собсссосас саодасьсос бдвасодсвя сдодаатасава 600 тосаводіст ссаасаавоу сстсссассо гссаксдада азассатстс Саавоссаай 66О пчачсвисссс азавоассаса дасастасаєс стрдсссссак сссвлодаодча датдассаво 720 зассасекся честодесто сстпуксава дустискасс севосдасає суссасвоаза 780 тзадзовася атоодсадсс договасває сасааозссв сасскессах аетовасесс 840 часадсьсст сссессіста садсароста ассубдгася адзосачуєа чсадоаааЧод Зоо авсртсткся сатасессоє цакосасово осіссосася зссастасас асапдлададє 960 стстсестох єсстоадсза а За «21056
«2115 327 «Р125 РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 6
АЇа зес ТВ уз Сім го хеб уйі Ре Рго Беу Аїа бго Сух баг АгО 1 5 10 15 5ег Тйг бек ої бевк отаг ліва Аа рез б1іу Суз мен маї Гу5 А5ротуг 20 25 30 вне Рго бій бо ма! тк оуа! баб тер АБа 5ег біу діа Бей ТВг о зег 15 0 45 сту уаї нів тс о РНе вго Аа Уаї цей бій бер бек сіу Гец тує Заг 50 55 БО їец о беб зас Уді уві Те уаі вго Зег баг бер ред оту тпг бух ТВсе 6з 70 ї5 | 80
Ту те Сує Ай уд дер нія цу Рго Зег Аби ТИ овух маї Ар гу 85 90 95
Ага Уа! бій бек гу Туг 1у Рго вго суб Рго 5ег Сух рго Аа гго миша мила ще в що ой вне їву сту біу ргб баб мі РВЕ гео вва Ре Рго ух РГО ув 15 | 120 125
Ар тТЬг бе Мей 16 бек Аг Тв оРго біб уві таб оєує у УК Уві 130 135 1
Азро ма заг сів їн дхр о рго пін ма? сій Ррбе АБИ т"Вотук Уа! др 145 15 155 і16й
Ту уаії бі маї Ні АВ АТа цу ТВгогуз Рго Аго сі бі бій Ре
То 170 75
Адп озЗег тре тук го ув! у бер Ууаі іео таб маї сей нія біо Авр 180 385 1
Тгр бен деп с1у ух б1ц туго гу сСуз цу Маї Заг Азп вуз сіу зву 195 0 205 го ек баг Іі біб ух твг ї16Є чего вух А1а. сує о1Уу сій рго Аго 210 214 220 сій Рго біп Ууаї туго тйг рез Рго Рго бег біп 610 бій Меє Тпг ув 225 230 235 240
АБИ біп Уаі бек геу ТНгоСує ен уаї ву Ту Ре Туг Рго 5ег Азр 245 250 255
ІТе Аїа уаї су ТгробіШ его дбп сіу б1Тй его ТИ дей дей тук ув 250 205 270
ТигОотас вбго во ув) Се Ахр бек Азв о сіу бег рРпе вва їец Туг баг 275. го 285
Ага їв Тигоуді Азов Суб баг Аго тгрооїа біз біу Ап Уа! вва бе 27590 о ж95 300 ! суб ем уаї Мет нія 10 Аїа їец Ні дяп Ні тує твг бій ух бек 305 310 315 Шк іей бег Ге Баг бе б1у Був 355
«-2105 7 «2115 321 «2125» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 7 судзастотоя стусассаєє кутстесакс ттсссоссат стозтдавса дссавааст во дазастасст стастоєоКа ссетастуаат аясссстатс ссадауачує саваадтасад 120 о Жоадааваєає асгаасодссся ссзассодає аасісссаду зоааодсотсає вдадслзааасє 1806 адсааодаса дсасссасау ссссадсаоцє асестдасоає Єдадсвазоєс адастясоза 240 азасасавад їстасоєсто соуйвассасс сатсадодсс тдадстсосс суєсасазад 300 адсексласа (дідадавта є 321 -2105 8 -2115107 «2125» РВТ «213 » Ното зарієп5 «400» 8 дго Те Уі Аза Аа ко 5егоуді Ре те Бпе рго Рго бек Ар и "ші 5 0 5 бій гео 15 хеєх о єїу ти діа зеб ма! 81 Суб гей вбо АБИ Аяй РНе - В 30 тТук РгО Ага біб Аза ух УВІ бів о терогув ма! дер Ав АТа це п у 40 45 аг БІУ дяй Бе бів сів бек узі тк обі їй Ар бе ух Абр 5ег 50 55 бо
Те Туг бег їес бек бек отйг о сеу Твг овен заг оїух Аа. Ар тує СТИ 65 70 75 Во уз ніх уз Маї Туг АЇа Суб бів Уа! Те Ні біп СТУ ви бег бек ! 85 90 85 го Маї тТИгогує ет РНе А" АКо Ту іш су що 405 20 «2105» 9 «2115» 369 «2125» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 9 чадасасадс Єовтозадес сододоаадс стдосасвоє ссддовавєс ссебовоасеє 60
ЖХссбосоусяо сесссочекЕ сассстазоя адетатаоса тозастводє ссоссадоєт 126 ссврадзяаде бдостодацта оутсесасас атбаотєсога дтадтсатає сататтстає ЗВ осадастстд казаодассяа асссассаєс тссададаса ятудссаваува тесастотає 240 стісазатод асадестдає зодасозабас асоостаєдх аєтастесос озозасатат 300 адсадтоцеє ддсасуєстс тозісаєсь дастастадо дссадудаає сстодксасс 360 дЕсссстса 369 «2105» 10 «2115 123 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 10 біц узі бій во чаї бій ес біу біу сім їеу уві бій Рго су бу ї 5 10 ке зег реч Аг ен век сух АТа дія бек бі РНЕ ТРК це Ага его туг
А | 5 30
Фен має Ай Тер Уві АР іп АТа Ре СТУ ух БІУ цей ст тер УЗ 35 40 45
Вег тує Ж1в бег Ага бБег Берг Ні тВк Хі Рбе Тук АТа Азрозеє хай 50 я бо вує біУ АР Ра Те жТе 5ег дгЯ Ахроаха діа туя АБИ его гей туб є 70 75 о їм б1й меб дер бек цец Аго Ар бій дер так АТа Меє Туг ту сув : 85 | 90 95
Аїа Аг Маї Туг за? баг оту тгр нів уд 5ег Авр тТуг Те дер ту що 105 що тер Ту сій У Х1е вец Уаї ТР Уа! бег бек 5 1290 «2105 11 «2115 321 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 11 дссатссаоє Тдасесайес хесаєестсс стотеєосає стдтадозда сазоаоксасс 60 аєсасєкасс дддсаауєса падсастсаоас адтастттао сстодтаєтса дсабаадсся 190 поадзазастс ставостсст даїстатоає дсссссавтї тодааацтоЗ деєсссаєса 180 адчстсаучсу дседтодаєс тдодасадає сбсастстса ссаєсалудсад сстасадссс 240 даздатссето саасстаєта ссоєсаасаєц тЕсазсадкст асссосєсає тЕссудсода 300 едассявоу бодадаєсав а вах 7 «210512 «2115107 «2125» РВТ «213 » Ното зарієп5 во
«400» 12
Ата х1е біп меу Те бів бек рго бек бег їви Бег Аїа бег Ма! сіу ї 5 Кі; ї5 дев Ага уаї Те її6є твг Суб Агд АТа бек сій бі їТе верх Бек дій 20 25 30 ївч діа тгротук сіп б1іловує Бго сту Буз АТЯ Рго Сує Сец ем Те 35 40 45
Ту Азр Аїа бек бер іїем бі Заг сіу Маї Рго 56 дгу РАВ 56 у
КІ ах БО: бег сі чек Фу тТнтг Абро Ра тб гей Тс о ї1іе бег бег бе) бів Рго бу | 70 75 | о бій др Ра АЇїа те тує туг сухє бій сій Рйе ДЕЙ Ба отув РГО ей 85 90 95
Тег Ре б1у т сЗіу тБе уз МА! сію ще Гуз
ОО і 105 «210513 «2115 42 «2125» ДНК «213» Ното зарієп5 «4005» 13 псасатааса оковсхоаса сабссетове бастксовех ас. 42 «210» 14 «2115 14 «2125» РВТ «213 » Ното зарієп5 «400» 14
Уа! тує Бек Бег ву тер нів Уаї баг або Тут РП Авр о туг «210515 «211527 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «4005» 15 зо свасацієтя агаоктаєсс дессаст 27 «210516 «21159 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 16 віп ста Ре дат Бег туг рго їеи Те
«2115 51 «212» ДНК «213» Ното зарієпо «4005 17 касаттазєс чпсаотавсса тассататкс тасасяпаст сстксааавоЗ Є 51 «2105 18 «211517 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 18 тус же 5Бег Аго бег 5еб ніз тТвг о т1е РМ тТуг АТЕ Ар Бак ді сує ї З 10 З5
Фу «2105 19 «2115 21 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «4005 19 захоєстсся пстооюзазо 21 «2105» 20
Зо «21157 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 20 дев Аїа Бех Бе рей бій зак
Х 5 «2105» 21 «211515 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «4005» 21 ачесатацса тазас кн «2105» 22 «-21155 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 22 зек Туг Бек Меї Ап 1 5 «210» 23 «2115» 33 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 23 сдддсаадіс аддосаєсад садтостєта дес З і ! «210» 24 «211511 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 24
Ага Аза чек біп біу 16 баг охег АТа Бей АТа
Ю я 10 «210» 25 «21151131 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 25 дсстссасса воаасссазїс чЧатесеессс стсвосясост десессачаза сасссстада 6О
Ччасасзоасяй сестопустя сссадесива дасбаєтсссє ссолассозс дасявсасєса 20 тадаасісвоа ососесстоає садсодсаєо сасассіїсе сах зсавссстса. 180 чаасЕстасе сесбсвосад сосодкоасс дсасссєсса дсацсттод99 сасссадаєс 240 тасяасстоса всогтозатся сааудсесаус засассява тдддасвасає адттчваєте з00 азайссєсасє сеічтчасає застьсасаса тасссасачє чаеесаЧацес савассстає зба дасасасстє ссссоабоссс асддкассся дадсссаває сссоїтвасає асстоссссо 420 тасесасаає бдсссадайсс сазасеєтат сасасаєстс ссссатасєс ясодсаєсся 0 ЯБ5О зсасстдаяає сссспдодача ассоїсацеє ссесЕсСЕЕсс ссксЯааЯсс сайодасасєс що сттасоавек сссддасссс Ководтсася тососоосоє кодасосоау ссасдазаояє 600 сесазадкесє адстсааєо чкасувазає одсаєацаво сосаєнакас сааозсвзай бо седедачаво аосаоєтеваа євосасоЧтис сусокавіса всетееєсас сотесеосас 720 сайдассуує бозасовдсай довотасаао босааоцєст ссавсвазис себсссадсс їво сессатсдада заассатеве сазайссвая бдасадесєс дадаассаса васотасасс що стпсесссаї ссспойлоза чаїдассзао авссадоєса дсскодассто сссддєсава 900 пастсстаєсс ссячедасат соссукцова содововося псовуєвоєє доаодзасаас ч60 тасаасасся сасстессає дстадасесс дасодстссє ссткестєва садсваавстс 1020 асскудаса ацадсаууво спсвосацодо аасатсттст сСасустссоє дабоусаєсово /ЛО50 устстосаса ассустесяс осадизовеє сесбсестоє сессоддутав й з «-2105» 26 «2115 376 «Р125 РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 26
АЗіа чего ївйг о їуз СТУ рго бег о уа! Рпе Риб їеч лів Ро Сух бБег Аго 1 5 10 15 дае ТР чего сту су те АЛа АТа 1ву біу Сук ей уаї уз Абр о Туг 20 25 ши 39 ве вго сті го уаі ТВгомаії беготгроабп Зек о с1у А1їа Сен твг бер 35 40 45 о1у Маї нів те РНе Рго АТа Маф ге біп бек Зег Є1У Мен тТук 5ег за 55 Бо іви бегобег маї маї ТК УТ РО бе" Бе баг цен сту тре б1потВе 65 то 75 5о
Тут Те Суб АбпоУяі1 Ап Ні уз Рго Бек Ап тТйгоїує уаї Аяр мух 5 90 5
Ага Уві біш їец їу5 ТНК бро їй бу др ОТВЕ тп ОНія Таб Су вго 100 105 мо ага Су ргГО бі Рго бух бег Сує Азр те вго бго бго Суз РгО Аго | 20 425
Су: рго бЇш Рго уз бек суб Аяр таб о РГО Рго РГО СУК РКО Ага Суб тах 150 7
Рга бі Рго бух Бег Сув Авроїйг Вго Рго Рго Суз Рго дра Сух рРго 150 155 160;
АївВ бго сій Бей гей с1іу сіу го бек маї пе ви Ре Рго РГО Гуз 165 7 175 бго гу Ар Тигри Ме Ї1е беє дого Те РКО ОТО Ма Тйг сСуз май
Ше: 1655 о маї Узі део Уаі Беб Ні бій АБ РРО бїм Уаї бій РВе їух теротує 195 200 205
Уа1ї Абр о біу маї бій узі Ніб Ап Аза Туз твгогух бро Ага То би мс 215 220 біп РНЯ АЗп бек тТаг оРпєе дгу маї маї бек уаї Бей тп Уа! цей НІЄ 225 ЯЗ 235 240
Філ АБИ о тТгроіео дей б1у ву5 610 туго бух Су Ту Маї Бек Аби ух 245 750 ВІ
Аїа гей РРО Аа Рго тів щі гу Те т1е бер цує Тіг о іуб біу сій 260 265 я тТго Ага біц вго бій Уаі тус Тагоїео его Рго Зеб дга іч 1 Меє 475 280 285
Тег ву Ап бій УВІ бек бец ТК Су Ген Уа! 1у5 б1у Ре тТук Рго
КЗ 295 Зо 5ег Ахр ше АТ Уа! 610 тгр 1 Баг бег 51 сб РГО бій дей АВ. вих: ма 31 з2О тус АБИ ТАЄ ТНг оРРОо РгО Мей 12 Ахр бе дер Б1у бег Біо рів ви 325 30 335
Туг бег ух їм ТВгоуді Абр вуз бек Агу тер б1п ба біу деп ї1е 340 м | 350 рйе Зег Су бек уаї Мет Ні5 Сі АЇТа ес ніз АБИ Аг пе ве сій 355 . 360 з6ї їу« Баг хви хег сем бер рго с1у
В/й 375 «2105» 27 «2115» 29 212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер для людського МСЕ «400» 27 асассасаєа таксясєсатє Ссатсссаї 2 «2105» 28 «2115» 40 212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер для людського МСЕ «400» 28 вссасзочат сессеттако саСсодсосає аудстутасоу Я. «2105» 29 «2115 375
Зо «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» Нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантний людський теЇ-МОаЕ «400» 29 саткаєдесає сСатессаєсе саїстіссасє асодоасєзаах соссваватЯ тдасазсєс 50 засоставодо стодуоаатаа дассассусс асацйсаїся подосаауда оатовсовся 020 ттаддазаво хогасатуай сзасадтата їтсазасаде астктктєода чассазатУє 80 спдзасссай ахессаєтох сзосодосос соддосатто асссавадса стдовастса, 240 тастотасся соасєсасає стббоїсаао осустбасса тодасоосва дсаодстасє 300 тадсадекса кссодасвоя Касодсстої отоакОсатос тсадссотая адстососох 360 сатдсасадя дассе 375 -2105 30 «2115121 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Амінокислотна послідовність рекомбінантного людського теї-Ма (1-120) «4005» 30
Ммек 5ег бег баг Ні рРго їв РНе Ні Агу б1у бу Ра 5ег Уаї Сух 1 5 хе: ВИ 15
Ахр о Зег ма! бег о мМаї Тер ді Є1у Айр огух ТВготТве АТа тТйг Ар їв 20 25 30 цу 91у ух 4Тй маї Мет Уаї іви біу біб мМаї ден їТе Азп Авт Зег 35 йо 45
Уа! Рйе уз біп тТуг Рпе Ра бій Тк вуз Суб Ага АБб РО АЗК РгО 50 55 5 уаї ар бек біу Сух Аго бу тїс Азр бег уз Ні Тер Аза бек Туг 55 70 Їй ВО
Суб те отТве тТБг нія твВе Рае Уаї ух АТа гей тб Меї аяр оту ух 55 0 25 сп АТа Ав, Тгр о Аге впе Х1е Агу тів А5роТпг АТа Сух Уаї сСух Уа! 00 ща о во бек Ага їуз АТа уаї Аг Аго Аа ж уч «2105» 31 «2115 55 «212» ДНК 213» Штучна «220» «223» Послідовність 5'-праймеру для одержання вектора експресії РСЕМІбЄ56 (АТССМо 69576) «400» 31 сдасєтдасєс ссадазоово озатаасата тоутїаасує дітадааєсс дотає 55. «2105 32
Зо «2115» 49 «212» ДНК
213» Штучна «223» Послідовність 3і'-праймеру для одержання вектора експресії РСЕМ1656 (АТС Мо 69576) «4005 32 тайастаада ССЕссстссЕ баїтоастатає савттосусв ассставоє ча «2105» 33 «2115» 24 «212» ДІЖ 213» Штучна «220» «223» РСВ праймер «220» «221» Непевно «222» (18)...23) «223» п-а, с, ї, або а «400» 33 пдссочаєво дсссссалпп ппле | 24 «2105» 34 «2115 21 «212» ДНК
Зо «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер «400» 34 чаудссавус кодгастово а ТЕ «2105» 35 «211519 «212» ДНК 213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер «400» 35 тззаадасоєсюь дассасвсу 19 «2105» 36 «2115 54 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер «400» 36 свосадавоє сссСтадасса ссатодасат оадчотассс осссвастсс со99 54 «2105» 37 «2115» 34 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер «4005» 37 сстаксцраст саасастстс ссстоєтозаа осіс 34 «210» 38 «2115 55 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСОВ праймер «400» 38 садсадаадс кїссадасса ссатодадіс додуєтокас тодоєттесс тсосх 55 «210» 39 «2115» 34 «212» ДНК «213» Штучна «220»
Зо «223» РСОВ праймер «400» 39 осакоксуає хсаїєтстассс дбарасацод 2939 34 «210» 40 «211» 449 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 40
Сі мМаї бїп бе Уа! сім бек біу біу сіу цео ма! біп Рго сі1у пу ії З 10 15 баг бец Ага Бе заг сСух Аї АТа 5ег сіу вай тег се зо Бек туг й 23 і 5ег Мет деп отгромаї Аго бій АТа Рго бі бух біу сей біц Тер Ма! 35 40 45 заг туг Хі 5ег дгу его 5ег Ні тб хе Рі г АТа Ар зве ма 50 5 б у 61У Агд Ре твгої1е бег Аг Авроабл Аа Гу Ап о бегогеи туг 65 70 75 80 їен бій Мет А5р бег рец Агу А5р осіб АЗротаг АТа мех тує тук сСує 85 | 90 95
А1а Ага ма! туг баг зегосіу Тер онія маї бег АзроТуг РПе А5р отут о 4105 ло і
Тер осїу сти б1у 16 бец уа! тнг Узі б5ег Бек Аїя зег о тг ух с1у 120 125 вго бег ма! Ріє Рго їем Дій Рго Сує бег дга БегоТвг бег бю баг 136 135 | 14 те Аїд АТа бе Ту сСуз їви уа1 уз АкВ тує те РО віц ргГо Уа 145 150 155 66
ТВгоМаї бег Тгр А5п бег єїу АТя зец так бЗег с1у Маї Ні та РВе 465 70 | 475
РгОо Аа уаї ви 10 бег беє 61Уу Бей тує 5ег їей бер бег уді Уаї з36а 385 190 явне ма! Рго бег бБег Абп рве ву твгобіп тТаготує Те Суз дяво уд 195 200 295
АБр о нів ух рго Бак дей Те Куб маї дер губ твгоуаі бі дго туз 210 215 220
Сух Сух уаї б1й Єму5 рРго РГО Суз Рго АТа Рго Рго Уа! Аа біу Рго 885 а 2135 240 бе ма1 РйЄ Гей Ре Рго его Туз РГО уз Ар о тТВе Сем Меб тів бес 245 | 250 255
Ага тйгоРго сти маї Те Су ма! ма! Маї Азр Уа! бег нів бій Ар і 260 255 270 вго біц мМаї бій ейе д5п Тер тує Уаї Аб5р су ма! бІ маї Ні деп 775 250 285
Аза був тТВг обу вго Агу бін біб сій бБе Аблобег о тіг Ре Аго ха 290 295 300
Уаї б5ей Маї ги ти Уді1 маї ніз сіп Ар о тррогей дп б1у уз би 305 310 315 328
Тут цує Суз Тух Уаї 5ег Ап іїуз Є1У тец Рго Аїа Рго І1е СТЦ ув 325 330 335
ТВеожів бек ору5 тТвге огуз б1у сій Рго Аг бі Рго бів уаї Туг Те 340 345 | 350 теп рго Рго Зег дго бі біц Ме Тіб о цСуз Ай біп Маї бек о їецй пе 355 360 365 сСух мен у! цу біу РМе Тує го 5ег Авр же діа Ма? 1 Тер обу 370 | 375 380 ' сег Ап Зіу біп Рго б10 Ап дей жук о їу5 ТВгОТйг РРО Бра Меж те 385 390 395 00
Акр Бег Ар обу Зве РН РМЄ їео Туг о бег Гух бе ТК Ома! Аз ух і 405 ше А15
Зег Ага Тгробїп бій бу Ап Уаї Ре 5ег Суб бЗег о уаі Меж Ні 01 я 425 430 а«ї1а їез нія Аза ні ту тйг бій руб бе веу хеб бе баг РКО СТУ 435 а 445 гу «2105» 41 «2115 453 «Р125 РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 41 сіц та сів їен Уві ста его бі 1у б1У без маї СІЙ РРО б1у Су 1 5 10 15
Баг цец Аго іеу его сух Аа Аза Бег б1у Ре тв іеч Агу бег о туг
ШИ 25 й
Ба" Мет деп тгромді АГу бі Аа го 61у ух с1у цей Січ тТгро Уві 35 що 4 бег Тук Же бек Аго бБег бег нів Те їт1е Рне тук АТа Ав бек Ущі 50 55 60
Гуз Ту Агу ве о тпг ті 5ег Або АБроАбл діа Гуз деп об5ег Беу тус 65 то 75 80 цей біп Меї Ад5ро бек Гец АгоЯ Авр о б1Ч Авр о ївг А1їа Меб Ту Туг Су 85 90 95
АТа Агу Ма! Тус бесг баг сту тер нія Маї баг Авр о тук РНе Ахротуг 100 5 о
Тгр Є1у сіп СТУ ї16 ей уаї твг ма! 5егобег АТа Зег Твг обу Су 120 125
РГО беї уді Рпе рРго ви Аїа Рго зегобеб бух 5ег о тйг 5еб о1у сту 130 135. 140
Те АТХ Аїа сей біу був сви ма! їух Ар тує ве рго бій Рго Уді 145 150 155 160
ЯВг о Ууді Зек ТрроАбп бек б1у Аїд Гез Так обег б1у уд) нів та Рене 165 і 170 175 ро АТа ма! Гец бій бег хег Ту 1ец Туг бег Ген 5ег бек уд! Уа 180 155 190
Тек Маї Рго 56г бек бер цен біу тиг обій тйг тує їте Ссує дкп ма 195 200 295 д5п нії ує рго бек Абп ТИР Суб муаї Азросує Був Уві ОО Рго Му 219 215 7220
Баг Суз АзроКуб ТК о Ні тс Су РКО Рго Сух Рго Аіа РгО січ гей 225 230 335 «40 і8ц СТУ БУ РРО Бер удії РАБ бо РНЄе РО РГО КУБ РРО ув АБО ТА зак 250 255 цез Меї те 5ег Ага тп оРго біш Уа! тТВгоСуз уаї Маї уаї Ар ма 260 255 КУ гяш че Ні бій Абр вро біц уаї ує Рв АБИ Тгроту" Уді Ар обі1у маї 75 й 5о шо 255 КУ б1ч Уа! Ні5 деп АТа су тв вух рго ага бю іч сів тув деп бек 290 295. 300 і твг о тТуг Ага уаї маї бем Улі ге ТНК Маї ее нів сій Авротрр о їеу 305 зій 315 320
Ази бі ух біЧ тує тує Сух мує уаї бек АБИ ув Аїд б ро Аа у 325 Й 330 335 во ї1е бій уз ТПг о їТе чего їух АТа Гу5 Єїу бій рРго Аго Би Рго
Зо | 345 З сій уд тує Те Бей ргГО РРО Зв оаКо Аж от Кей тик згух АБИ бів 355 3650 365 :
Уаї зер рем ївйг Сув ей Уа! ух сіу Ре тук Рго бег Азр Хв АТ
Б их 80.
Узі Їм тер б10 бег дєа сту бій Ро січ Аби Ай Туг суз Те тае 385 390 395 400
РРО РРО: Уа ви дер тег Авр ТУ Бег Ре Ре цей Туг зек бує ва 05 мо | 415
Же Улії Ахв тує Бог Аг теробів бій с1у дей уаї Ре 5ег Сує Баг 420 425 430
Уаї Мес ніз сіш АЇа цез нія Азп нія Туг їТвг бій ув бБес веб баг 415 зо 445 іеа бег рго б1у ує 5 «2105» 42 «2115» 450 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 42 сти маї біп бер уаї сій его біу с1у б1у їец уві біп Рго сіу біу ї З | 10 15 че ее Аг сво 5ег о сСух діа Аа бег с1у РМйе так бе АрЯ беготуг 270 25 30
Фег Меї доп ото уаї Аго біп діа бго (1у ух біу Сей січ тТгр уді
Баг тТук хів 5ег Ага бак бе ні те ї1е епестує Аа Авробег Уа! за 50 цуз СТУ Агу РНе таг Іі бег Аго Абр о АБИ АТа у5 А5а бег сей тут 7о : 75 8о
Мен сій Меї Ар 5ег цей Ага Ар біц АЗр Те АТа Меб Тус Туг сСув 85 що 95
АТа Ага Ма! Туг бЗег чЗег біу Тер Нія Уаї 5ег Ахр тТуг РПпе Ар туг
Мо 405 110
Тер Ф1у сіп с1у ї1є мез Маї Тис омаї 5егобег дія 5ег о тьгогух СУ 115 120 125
Рго бег ма! Ре рРго їец АТа Рго Суз Баг Ага бек Тиг бег Є бек 130 135 140 те АТа Аїд Бен біу Су5 шен Уа! ух Азр о Тук РН РО Ти Рго Уа 145 Ше; ' 155 160
Те ма1і бег о Тгр о д5йп бБег сім Аа гей твгоб5ег біу маї Ні Тр ее 165 47о0 175
Рго Аїа маї їец сіп 5ек о бег 61у бе) ту зер цей бек чего у! удї 180 185 190
Тв Уаї РгОо Бек Чер бек їец біу ТпКоГуя Тс оТує Тйг о Сух деп Уві 195 200 Мо !
АБр нія ух Рго ес АБИ ТИгОМуб Уаї Аброфух Аг Уаї Ти 5агогух
Ж 215 | 220 у тТук Ту РГО Рго Суз Рго бег Су Рго Аїа Рго ба Рйе геу сіу сту 225 230 235 шити
Рго Бег Уді Рів геш Ре РГО Ргб о Гує Рго ув Ар Оті Гео мет ї1е 245 250 255 зег о Аго Жйг оРГО Су Ма! таб оСух ма! Маї маї Азр уд! 5ег бій 1 250 255 270
Ар Рго бін Маї бТп Бе Ап ТгроТуг ма! Абросту уа!ї сін ма! ніз 275 260 285
Ап Аїа Сує тТгогу5 вро Ага бін СТЧ бій Ре А5позеє ТвгОТує го 290 235 з
Уа! мМаї бег уз! ей тпг УаЇ сей піз біп Ад5р тер огеп Азп су су 305 310 315 320 бі Туг губ суз ух ма! 5ег Азп Суз Біу їеи Рго 5ег бег Т1е СТ 325 330 335 іїу5 Тиг ожіе 5ве уз іа Су Б1У біп РгОо Ага СТ) Рго бій Уа! туг 340 | 345 350
Тс осей о вго го аб обіп 610 сі Мес тигогуз Ап біп Уа! 5ег їв 355 360 365
Таб оСуз Бей Уа! бух с1у Рйе Туг Ргб 5ег Абр сТе АТа Маї 019 Тер 370 375 380 бі 5ег деп обіу бЄїп вго сій Абп Азп туго су ТВг о тТВг Рго го Уа 385 390 І 395 400 цей дер бег д5р Єїу 5ег Ре Ре Мей Туг бек Ага Сен те ма А5р 405 410 415 бух бег Аго Тгр о біп сіш 61у А5п о Маї Ре 5ег Суб 5ег уаї Меї ні 420 425 430 ст АТа мец Ні Азп Ні тус Те бій Суз бег бе бег Кеш бег ге 435 440 445 с1у куз
А5о «210» 43 «2115» 499 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 43 іш маї «ій цеш узі сій 5е сіу Б1у І1У ей Уві бій бго 1у сіу ї 5 КК: 45
Бе" Сей Аго Бей Бег сСух Аа Аїа бек біу Ре Тс Сей дгу заг о туй
М і 25 Й 30 тек Меї дяй тт маї Агро бій Аа рго СТУ Суб бу цей біб тер Уві его тує Ж1є бег Аго бег заг Нія ТИг о їТо Ре тук Аїд Ар век ув 5О 55 50
Су біуУ го Ре ТК Кіе Бей лка дБр ОАЄ АТа губ АЙ Баг бе Туг 655 70. 75 0 ме «1лоМеб Ар 5ег цес Ага АБробіч Ар отйг Аа меж туго тур су 85 90 795
Аїа Аг Уді тує бе баг с1у тТгр Ні мМаї 5ек або Туг рве Авр о туг 100 105 мо
Тгтр е1у іп бу їЗ1е фей маї ТВе уаї Бегобеє АТа бек Те уз Фу 115 120 125
Рго Зек ума! Ре Рго це Аїд РСО Суб Бек Агу 5ег о Твробег СТУ оту 130 135 140
ТБг Аза АТа ге СУ Сух іеч уаї Суб Ар тує ве Рго б1у Рго Уві! 145 150 155 160 те оуаї Бер тгр дб бек с1у АТа без тре бег сіу ма! Ні те рве 165 | 170 175 рРго Аїа маії мец бій Зег хек С1У Кей тТуг зек беи 5ег бек Уа маї іа 385 190 твВгомаї Ро Зеє бег обер ген біу Тег бів Твготуб все Сук Ав Ма 200 мк
Ахп Ні Гу5 Рго бег Аза Тиг щує Ма! АБроух Аг ма! біз гей ух 210 215 22
ТНе рго рес с1у Ар оте тб нія Таб Суб рго Ага Су Рго їй рго 225 30 ех 240 іуз баг Сує Ар ОТ Вго Рго РгГо Сув Рго Аг Сух Рго бій Рго Гу 245 250 755. щег Сує АВ ОТИг Рго Рго вго був Рго Ага Суз Рго бій Рго Кух баг
Б ж; ке бух АБр оте БгО реа вро Су« РГО Ага Суз Рго АТа РГО 61 ей ей мий БО Кая у тах вго Бес Ууаі ве реп Рів Рго РгОо їу5 рго бу Авротпе ву
ШІ 295 300
Меї жі бег Аг тТвгорго сівши маї Тс Суб Уа! мМаї Ма! А5роуві 5ег 05 310 зії 320
Нія б АБроРго сін УТ бів Ре бує тТгр тує уаї Азр Ф1Уу Уа! С1ц 325 а 335
Уа1 нів АБ дій бух ТВ обук РРО Аго бід сім біп Ре Ап беготиг 340 с 330
Ре дгЯ ма! Уаї зег уві це) тйгомаї без ніх їй дер'теросец дей 355 3605-- 365 сім буз о10 туго їув Сув і у Маї бек Ази іух АТа їей РГО Аїд Рго ше; нн У" зво що
Се 1 дух те же беб вуз Тбг вух віу сій вго Ага ві РМ бій 385 90 395 400
Уві тТуг Тіт їви рго бго бек Агу бій бій Мес Тйг Гуз йкп 1 мд3 405 А1о 15
Бек цей тик су вен Уа! цух сіу Ре туг Рго 5ег Ар ті Аїй Уа 420 | 4275 430 іч Тер обій Зако обег су бій рго 614 Ав еп стує хи ТВе отв рго 435 Б 44х
Рго мек цен Ар бег Ар о сТіу бек рНе РКе сец Ту чего бує Цей Тнг
450 455 460
Уаі Ар уз бег Аго тТгробій Єїп Є1у деп їїе рРпе бег сСуз бе Ма! 465 420 475 4850
Ммебє ніх бій Аза ген нія Ахп Аго Ре те обіп ух бе? цей 56 гей 485 4390 495 «ег РГО б1у «210» 44 «2115 214 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 44
АТа її бій Мей ТВг о біп Бег бго его бег меч бег А1а его ма! су 1 о. 10 15
Ар Аг маї тп" г1е тн Сук Акоа А1а Бег сів біу ї1е бек бек Аа. 20 25 30. чем Аїа Тгр туго біп о біп гу5 Рго біу туз Аів Рго уз Сен во їв 35 40 45 туг дер Аїя 5ег 5ег ву сій бек сіу Уа! Рго 5Бг дга Рв 5ег о с1у 5а а. І 50 бег біу бег біу тп оджхр Ре ТВг цей Тіг ох) бек бег їв) бій бго 55 70 75 80 січ Ахр РНе АТа Те отусє туг суб б1й сбіп Рйе Аб5а его отук рго Бе 35 чо 35
Те Ре біу Су ву тн мух мі сіц ї12е Суб Аго тв" Уа! АЇа Аа що 1405 мо рРго 5ег оуді рве Іа РНе РРО Рго Зег дер бів бій сей їує заг оту 115 120 125 й
Тік АТа бек маї Уа! Су їац бен Азп Аєп РПе Туг Рго Аго бій Аїа 139 135 140 мує ма! бій тгрі вух маї АзроАБа Аїд сеу бій чек обіу Аби Бе ста 145 150 155 160 бій Зег ма! ТА" біш біп Азр бег Му5 Абр о Бег ТВгоТує бегогео 5вг 1655 178 175
Бек ТОР ме те вва сек вуз Аїд лев туг бід кує нів їує Узі туг 180 155 190
Аіа Суб бім Уа! твг ніх біти су ей ваг бек рго Ууаі тт Гуз бег 195 20 205 і
РНе Ап дго сту си Су
Ма гу «210» 45 «2115 5 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 45
Рпе вве сім тб Бу ї 5 «210» 46 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 46
Бек бег бБег Ніж Рго Ї1е Ріг Ніз Ага ї З «2105» 47 «2115 5 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 47 нів Тгр А5п о 5ег Туг 1 5 «210» 48 «2115 12 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 48
АБп Зег Уаї Сіу рух бій туг Рне РНе соти так вух 1 5 10
Зо «210» 49 «21157 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 49 дег Агоо ух Аїа маї АгЯ Ага 1 5 «210» 50 «2115 5 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 50 зі Уа! Мет ма! Тец 1 5 «2105» 51 «2115 25 «212» РВТ «213» Ното зарієп5
«4005» 51 его бег бег Ні Рго Ії Рпе Ні5 дгд сіу сТц Рае 5ег Уаї Суб д5р 1 5 10 15
Зег Уа! бег ма! Тер Уаї сТу Ар ув 20 25 «2105 52 «2115 20 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 52 піп Аза АТа Тер одга Ре хів Аго жхіе Ар так Аа Су У! Суз УЗ 1 5 10 ї5 сви Чак Ага сук 2 -2105 53 «2115 14 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 53
Бег 5ег ніх Рго хіє РНЄ Ні ла с1У 910 РаЄ 5ее маї Су 1 5 19 «2105» 54 «2115 8 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 54 бек шег Ні5 Бго 116 Ре Ні Аго
Зо 1 5 2105 55 «-211556 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 55 «1у бій Ра бек оуаї Су ї 5 -2105 56 «211515 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 56
5ег зег бег Ні Рго ї1а Ре Ні5 Аг с1у бій Ре бек Уа! Сух 1 5 10 15 «2105» 57 «211516 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 57
Те рпе Ні Аго с1у 61 Ре 5ев маї Аза А5р бег уаі бек уаї Су 1 5 10 15 «210» 58 «211516 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 58 сій РвВе бек маї АТа дер 5ег уаї бег узі Тер ма! Сіу А5р цу сСух 1 5 10 15 «210» 59 «211516 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 59
Ар Зек Уа! Бек ма! тТгрома! су Аброгу5 ТВг о тве АТа УвБе А5р су 1 5 70 15 «210» 60 «211516 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4.00» 60
Тероуаї С1Уу АБр уз Таг оте АТа твг одер хТе уз С1уУ Гуз сін сСув 1 5 10 13 «2105» 61 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 61 те оте АТа тТнг оАвр Хіє Туз сі уз Тв мі Межб маї (ви у сує ї | 5 30 15 «2105» 62 «211515 «212» РВТ
«213» Ното зарієп5 «400» 62
ІТе 1їу5 Б1У Муз сТи Уаї Меї Уаї Гец С1у бТи Ууа1ї деп їв Ап 1 5 10 15 «-2105 63 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 63
Ууді Межє уаії бе с1у бій Уа! Абп хів Аби Абп о Зег Уа! РБе гу сСух 1 З 10 15 «210» 64 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 64 сти ма? Адзп Хе Аби Абл бегомаї Ре іу5 біп тує РНе Рйе сти Суз 1 5 10 15 «2105 65 «211516 «212» РАТ «213» Ното заріеп5
Зо «400» 65
Авп бег уаі! рРйе їу5 бій Туг Рйе РНе сій тТпгоїуз5 Аа Агу Авр Су й 5 10 їх «2105» 66 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 66 вій туго РЕ ріе сін ТАБ губ АТа Аго Абр гро Аби рРго уаї Ар осух 1 К) 10 15 «2105» 67 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 67
Таг о їуз А1а Аго Ар орго дБпоРго Ма! А5р обег сім дТа аго А5р Су 1 ві 16 15
«-2105» 68 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4АОр» 68
Рго АБИ РгО Уаі дер озег біу АТа Аго Азр І1е дер бег гу НІ Су 1 5 Ю | 0075 «2105» 69 «211515 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 69 заг б1у Аа Агу др о ї1е А5робег Ту нів Тгр А5п 5ег о Тує Суб ї 5 хв 45 -2105 70 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 70
ІТе Ар 5ег їуз Ні ТгроАзп беготТув АТа о твготвг о тНе Нія Тг о сСух х 5 30 15 «2105 71
Зо «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 71
Тгр АБ бХеб Туг АТа тб те стае нія твг Ра уді Бук Аза гео сук і ше 30 15 «2105 72 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 72 те отв оте нів те вве ув) ух АТа ву те Мех Ар б1уУ Гує Сух ії 5 30 45 «210» 73 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 73
Ре УЗ мух Аа цец Тс Меї Ахр Сіу вух сіп АТа Аїа Тер Ага сСуз і 5 10 15 «210» 74 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 74
Те мет а5р о бту вує бій А1а Аїа тго Ага Рйе Т1е Агу ІТ дя Су 1 5 40 35 «2105» 75 «211515 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 75 бій АТа лій тгр Ага Ре хе Ага ї1е АзротвВг АТа Аа маї Суз 1 Кя 10 15 «210» 76 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 76
Рйе Хіе Адго ІТе Ар ТНг АТа АТа уа1ї АТа маї Сей бег Ага цу Суб 1 5 10 15 -210 77 «211516 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 77
Те Аїда АТя Ма! АТа уві мен 5вг Аг ух АТа ма! Аго Ага АТа Суб 1 5 о 15 «210» 78 «211515 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 78 су5 А1а дій Ууаї Аза маї сей зЗег АгО муз АТа уді дго дго Аа 1 5 Її 15 «210» 79 «2115 125 «2125» РАТ
«213» Ното зарієп5 «400» 79 іш маї сій без уа1ї си б5ег су Аїа сій Уаї ку5 Су рРГО СТУ СТУ 1 У 10 і 15
Зег їен їуз іє Зег Сух ух б1у бег сіу Туг Ахп РБа о тпг о твгс тує 20 25 30 ттр же біу треб узі АгЯ біб Мек рго сС1у ув 6ТУ тен сіб тер мех 35 до 25 сФіу 16 їїа тує го біу Аб5р 5ег АБр їйг ух тук бег рго Зег ре 5о У І бо бій сіу бій Уаї тне діє 56г Аа Аброгуз бек ожхТе 5еб оте АТа туг 655 7а 78 ВО їіви сп Тгр бег бег те Муз АЇа бег А5р Тйг АТа Мех Тут туг сСув 85 50 95
Аза Агу А5и туго тТуб сту заг осту тйРотуб ту" туго тує туг су мех 700 105 мо
Акп Маї Тер бтТу сій біу тик оте Уа! Те оМаї 5егобего у
М 120 195: -2105» 80 «2115107 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 80 дер хів біп меж тег обій бег о рро 5ег бек Уді баг Аїда бек уаї Ф1У 13 5 10 15
Дкр Ага маї тТвг діє Тв Суз Ага АТя 5ег бій біу 118 бек їТе ткр 7 20 25 30 ївп Аїа трротуг бій ніз Су5 Рго с1Уу ух АТя вго їу5 Кеи Бей їТе 35 40 45 "ук Аїа Аїа бе? чес цен бій бег сіу маї Рга беб Агу Рів зе сту 50 55 бо
Зег біу 5ег оту Те дер РМе тТйе о беб Те от1е Бег обек Ге) біп вро 655 7 т5 а
Бі дер рРпє АТа тає тує тує Суз с1й бій АТа Ай хеаг Рйе Рго Тер 35 чо 95 тТне ве сту бій сту тег о буз ма! 16 їв Кув 100 і 405 «210» 81 «2115 127 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 81
Фі маї сій Сей уді сій бег сіу б1у сбіу цец ма! сій Рго б1у дго ї КІ зо 15 его ген Ага ем бек Суз ТИг о АТа бек с1у Рйе тиг РНе сої д5р тус а | 25 30
А1їа Мет нія Тгр ма! Аго біп АТа Рго біу їуз СТу Гей сіц Тгр ма! 35 | | 40: 45 бек сту тів бек Тгр АБ Аго с1у те їТе біу тує АТа Ар б5ег Уа! 50 55 60 ух о1у Аг Ре Таб Удї 5ег Агуд Ар Ал АїТа у Ази бБег їву Ттуг 55 70 75 о ївч біл мет Ах бег о ген Аго АТа січ А5р ТпК АТа гео туго ту Суб 85 90 95
Аза ух ої о1у туг туго сі1у чего біу Агу рго 61у Тук рве туг Туг що 105 110 чаї Мет Ар маї ТРр осіу сіп біу їйг тбг уді тбе Маї бег Зег 115 120 125 «210» 82 «2115108 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 82 сім же ма? ву Твгобіп бег вбго біу ТВгоїец бек ви бег Бго СТУ ї 5 10 15
Фіз АгО АТа те вем бег сув Аг АТа бег сій бе ма! 5ег 5ег сту 20 23 30
Ре Теу Аїа тер вве біп бій ух бго біу бій Аїя Рго Аг бец 1 еу 35 зо 45
Хі тує сіу діа бег зак Аго дія тпг Аа те бго Ар де вна чес кі ши 55 650 біу бег сіх бек йіу тВгодхр рве тТвгс овен тТиг оїів беб Ага Кей бів 65 70 75 а
Рго сій Ахровйе Аза Уа! тус туго суб сіп сів туго с1у 5его5вг о Рго
РМ в УК ду ТУТ луг таг Ре су біп бі тТаг о гу5 Гей сі 16 гу 100 у 105 «210» 83 «2115 127 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 83 зіч Уві бїп їжи уаї сти бек о фіу є1у 61у сечо Уа! їй Рго б1у Аг ї. 5 10 15 чег Сен Ага ви бЗег суб діа Аа зак біу Ре ї16 Ре Ар Абр туг 20 25 30
АТа мек Ніє тгр Уйї дго сій АТа рРго сіу гуз сіу їв сій тгромаї 35 40 45 ек сіу жів бек Тгр Азп Аго сТу їІТе ї1Їє біу туг АТа Ф1у бек Уа! 50 55 60 їув СТУ АгаЯ Ре Таб ої1е бек Аг Ар А5п АТа Гуз АБИ 5его сен тус 65 79 "Й 50
Мем о бі1п Меб Ахп бек їву Аго Ай СТИ Абротав Аа зву Тук о туг Суб 85 90 35 уаї кує бїш біу тує туг бТу бек сіу Аго Рго сту туг Рйе тТуг туг
Мо 105 10 уві Ммеї аеро Уаі Тгр о сіу іп ом тТвгротвг ма! Тве Уа! бек заг 115 120 125 «210» 84 «8115 108 «Р125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 84 бів ї1е уаї їен тнг бій 5еб о вго біу тпгогеу 5ег о сец бек го бу ї 5 10 15
ФМ АгО Аа заг ей ек обу АКо АТа бек сій бег уаї б5ег бег Заг
Й 26 | ев 30 тує їец Аїа тоб Туг стй сп су Рго сту бій А18 Рго АгУ Бей цей 35 й 45 жів тує уві АТа баг бег Аг АТа Те о с1іу Хо рго АброАге Бра Бег 50 55 60 сіу чек біу бек біу тб Азр РйєЄ тйгосви Таб о х16 5ег Агу Кей сій 65 70 75 во вго бій Азр РН АТа маї ТУуг Туг Суб біп сіп Туг С1у бек бЗег Рго 85 | 90 95 туг тЕбг Ре сту біп бі тВЕ рух пеу січ Хе тує о 105 «2105» 85 «Р115 121 «Р125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 85
«ін Уаї їй Ген Ууді сіб бек сіу сту 1у ївм ма! біп вРго біу Акй
Я 5 іо 45
Бек ви Ага Кей зег Сух АЇя АТа бе су Ре хіє Ре Авр Ар туго 20 25 30
Аа мет нія Тгр Ук Ага бів Аа рго б1у су сту цез сій теру! 35 40 45
Бек осіу їі ТК о ТРО Ахп Зек б1іу ї11е Сей біу туг АТа Ар бег Уа 50 55 во їуз с1у Аго Ре Тс їТе 5ег АгО Азр Абр Аа кує Ап о бег івий тур 65 70 | в 80 цец сій Мет А5п Бей фей дгій АТа сії АБр отак діа гео стук Тук сСуз 85 90 45
АТа суз 1 бі сіу баб біу Аго тук о туг Абоп РБе дер туго Тгр Фу 100 5 10 сіа с1у тТвагб овеу Маї твг Уа! бек бег 115 120 «-2105» 86 «2115107 «212» РВАТ «213» Ното зарієп5 «400» 86 сі тіе маї сен таб сів 5ег о Рго сіу ТНгогей бек ей 582 Рго сіу 1 5 10 15 січ Ага АЗа тик оБен бег Су Аго Аїа 5ег о біп бег уаї бег бег бег 20 25 30
Р рей Аїа тгр ту сій сій руб рго сту Бій АТа рго Аге Бен овец
ТУ 35 40 45
Іа Туг сіу Аїа бег бег Агу Аїя тТиг су ї1е Рго Азр Агу Рйпе 5ег 50 | 38. | 60 сіу зег біу бек біу тТпг Абр оре твгоїей твг ї1е зе о АРЯ гей сій 55 70 75 о
Рго ЯТи Азр Рпе дія Уаї Туг туго Сух біп бій Туг ЄЇу баг бек Туг 655 | Фо 95
Тиг оеве сіу біп біу тасогу5 сей сій хв гу оо 105 е «210» 87 «2115 124 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 87 и ма! сій веи уаї сіц бек с1у сту сіу Уаї Уаї дго го с1у с1у 1 5 10 15
Бег Гем Ага їео бег Суб АТя АТй Баг сіу РНе ТНг ве Абр Ар туг 70 25 за сіу мес дб тгромаії АкО оїа АЇа Рго 61у Буз 1у мен об рр уд! 35 40 45 5ег Аяр їТе АзпоТрр Ап б1у сту зег оте сіу тук Аа Азб бек Уа 50 55 650
Му5 сіу Ага Ре твг о хТе бек АД оА5р Ав АТа гу Аб5пП о Бей о геу Туг 65 70 75 о меч бій Меб АБи бег оїечн АРоО Аіа бі Азр таг АЇа вец тує щу Сух 85 50 5
Аїа Аво бій бій тгроїец др орго туго туго туго туг Тук Ту маї Зо 100 105 110
Уаії Тер ву сіп бі тТйготве Уаї тб Ма! бек бег 11 120 «2105» 88 «2115107 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 88
Ар Х1іе сп Меї Трг сп бег Ро бек 5ег ес бег АТа 5ег уаї СТУ 1. 5 10 15
Азр Ага ма! ЦЯ Же те Суз АГгОо Ат бег сіп С1у Хв зег бек Тер це АТа тгротуб сіп ба губ вго біб тує Аа рРго Гу зег гей Ів 35. 40 4 туг Аа Аа Бек 5ег вец сіп 5ег сіу Маї рРго 5ег Ага Ре 5ег су 50 55 і 60 і зег біу бег біу так одер Ре тс обеи тигоїїє 5екоб5ев грец сій Рго 55 70 75 80 о1и Ар Ре АТа тре туго тує Суб сіп с1й туго А5п Бег туго Рго тро 85 90 95
Те Рне Є1у сій сіу тб ух маї сім ї11е їу5 у 100 у й 105 у «2105» 89 «2115107 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 89 сі т1іє Маї ей о твгосіп чего РКО Аза тагогец зав огеу 5ек о рго су 1 5 10 15 бТш Ак АТа Тис бе бег Сух Ага Аза бег біп ту маї бег бег туг 29. 25 30 мем АЗїа тер туго стй сТй Муз Рго єту сіп Аїа Рго АКб ей ге Те 35 40 45 тТуг Ар АТа его А5п Аго Аїа Твгосту 112 Рго Аа Аго РаЄ 5ег пу зо 55 60
Зег б1у Рго Сіу Тйг о АБр РМНе тбговец ТвготїТе 5ег бек бе) би го 65 70 75 80 бо Ар орРпе АТа ма! Туг туго Су С1п сій Аго Зег Аза Тгр нія АгО 85 | 90 95
Твгеовре б1у біп о с1у тйг обу маї сій те ух 100 і 105 -2105» 90 «2115108 «212» РВАТ «213» Ното зарієп5 «400» 90 біш жіе ма! їец тпг о біп бег Рго сіу тк огГез 5еб гей баг рго ФУ 1 5 10 15 со Ага АТЯ тйгогец бег Су дга АТа 5ег о біп бек ма! бег бег заг 20. І 25 30 туг цей АїТа тгротук бій бій Гуз Рго сїу біп Аа РгОо Аг вв ев 35 40 45
ІТе туг Ф1у АТа Зег бег Аго АТа тнг с1у ІТе рго Абр Аго Ре 5ег о 55 60 сіу б5ег сіу зег сіу тйгосіу Ре тйговец таб о с1е 5егобег ему сш 65 хо 75 50
Рго сій Авр Ре діа Ма1ї Туг туго Суб біп біп тус Ап о 5ег о Туг о Рго 85 90 95
Тер отйгоРНе с1іу бій сіу тк огу5 уді бій се г у5 о | 105 «2105» 91 «2115107 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 91 бій іє Уа! меш твгобіп 5егорго АТя ТВгосец 5егобец Зег о вго о1у ї 5 ' 10 15 сій Ага Аїд так оїен б5ег о Суз Абу Аїа 5егобіп 5ег о уаї бег о бес Туг 20 25 Зо
Сез АТа тер туго сій біп мух рРго сіу 10 Аза РГО Аг іви їей пе 35 ай | 45
Тук А5р АЇа бБег Ап Аго Аіа Те обі їТа Рго АТа Ага Ре 5ег о сту 50 55 со
Бек сбіу бБег бі1у ТПг д5р вп ТНг цем тиг о І16 бег бер обец си Рго 65 | 70 75 Бо и АБО Рв Аа ма! тує тук Сув біп сіп Агу 5ег дай Тгрорго Тер 855 чо 95 те ей сту біп бої ТВгоіуз маї стш Іо губ о | 105 Й «210» 92 «2115 5 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 92 тТНг туго тер жів ФУ 1 5 -2105» 93 «211517 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 93
Т1е т1е тує Рго сіу дер 5ег А5р о Тйг о груз тує об5ег рРго бег Рре с1п 1 5 10 15 ву «210» 94 «211516 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 94
Аз тук Тук СТУ ба? шіу тик тує туб тук Туг Тут біу Меї деп Уді ї ту у З у 15 у 15
Зо «2105» 95 «211511 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 95 дго АТа бек сій сту 112 Бек хів Тгр це9 Аа
Ж. У 10 «-2105» 96 «21157 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 96 ма АЗа бег баб ре іп бак й «210» 97 «21159 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 97 бів ЄТп АТА АЗИ Бег Рпе Рго тгр о тАг а -2105» 98 «2115 5 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 98
Азр тус Аїа Ме ніх 1 5 «210» 99 «211517 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 99
Су їЛе б5ег Тер А5п Ага сеіу Х1е їТе сіу туг АТа А5р бег уа1ї Гуз 1 5 10 15 о1у «2105100 «211517 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 100 сіу туг туб Є1у 5ег біу Агу Рго бу тТуг Рпе Туг Туг маї мет Азр 1 ша ИН 19 15 чаї
«2105 101 «2115 12 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 101
Ага Аа 5ег сій бег уаї Заг бек сіу РМ (во Аза х що Кі 19 «2105102 «21157 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 102
СТУ АТа бег бег Аг Аїа тТНг ї о -2105 103 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 103 вія сій тув с1у Бег Чак реа тує отаке «2105» 104 «-21155
Ко) «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 104
Авр оТуг Аа Меї нія 1 | Кк) «2105105 «211517 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 105
Фу па 5еготгр дп дго с1у ї1е у1е с1у туг АТа с1у 5ег ма! Гу ж 5 10 45 сту «2105 106 «211517 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 106 сіу туг туг с1у б5ег с1у Ага Рго С1у туй РНе туг туг Уа! мес А5р
Її | 5 ВК 15
Уа «2105» 107 «2115 12 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 107
Ага Аїа бек біп 5Бег ма! 5ег бек б5ег тТуг бец АТа ї 5 10 «2105» 108 «21157 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 108 уаї АТа зег 5ег Агу АЇа тег 1 5 «2105109 «21159 «212» РВТ «213 » Ното зарієп5 «4005» 109
Фіп сій туго с1у бек Зег рго туго тАг 1 5 «2105 110 «2115 5 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 110
АБр тує АТа меж Ні 1 5 «2105 111 «211517 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 111 б1у Ів Те тер Ап бек біу жів ве біу туг АТа Дер бег муаї Гуз й з 40 15
ФУ
«2105 112 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 112 сій Ф1у бег 01у Аго туго туг депо Рйе дер туг ї 5 40 «21055 113 «2115 12 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 113
Аго Аа бег біл бег уді Бег бек 5ег ту це Аа 1 Кі 10 «2105» 114 «21157 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 114 с1у Аїа 5ег баг Агу Аза Те 1 5 «2105 115 «2115 8 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 115 бів сій Тук о1у баг бег Туг ТВг ві «2105 116 «2115 5 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 116
Азр ТУуг б1У Мес дей. , 5 «2105117 «211517 «2125» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 117 дер т1е Ап Тер АБп С1у бу Бег твг о бТу тТуг АТа Ар олег уві вух ї ще | 10 | 15 пу «2105 118 «211515 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 118 сім сЇв тгробей дер рго туго Тук туго тує туго су Меб Ар Ма! 1 5 10 5 «2105» 119 «211511 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 119
Ага Ата Бег осій с1у тів бег бег тгробец Аїд «210» 120 «21157 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 120 мі діа бБег Бег цеч сій 5еаг
Ко) «2105» 121 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005» 121 сто іп туг Авп ее тТук вро тер отпг «2105 122 «211511 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «4005 122
Аг АТа б5ег сп Біу уаї бек баг тук ей Аа 1 5 10 «2105 123 «21157 «212» РАТ
«213» Ното зарієп5 «4010» 123 дер Аїа бЗег Ап Ага АТа Те 1 5 «2105» 124 «21159 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 124 сів сій Аго 5ег дп тер Ніз Ага тпг «2105» 125 «2115 12 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005» 125
Агу Аїа 5ег біп б5ег Уа! б5ег 5ег бег туг Геу Аїа ї 5 о ' «2105 126 «21157 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5
Зо «4005 126 с1у АТа 5ег 5ег дго Аа таг 1 З «2105» 127 «21159 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 127 сіп біта Тук Ап обег Туг вго Тер о Тог 1 5 «2105 128 «211511 «2125» РАТ «213 » Ното зарієп5 «4005» 128
Ага Аіа Заг бій бек уУді бег бег тук тей Аа 1 5 хо «2105» 129
«2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 129 сій Аїа 5ег Ап дя Аа тв ; «2105130 «21159 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 130 ста сій Аго бег г ТероРго Тгротне «2105 131 «2115108 «212»5РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 131 бій ї1іє ма! Бей тйгобіп чек РгО біу ТВгобва бек огрец бак рго у ї 5 10 ' 15 «1 АгФ Аа Тне о гец вег су Аг Аа хег б1б Зег ма! 5ег бог бег 259 «З ЗО туг Сем Аїа тер тує сів бій цує Рго біу біп віа вго Аг ви Се 35 чо 45 т1є туг Є1у АїТа век ек деш АТа Тнгодф1у 216 РгоО дер Ага Ре 50г 50 а | 60 сіу его б1у бег Сіу тйг Аяр Ре ТР Бец те жів Жов ака Без сі 55 то 75 Бо
Бго Січ Ар оРВе АТа Уві тує тує Су бій стй Тук сіу Бег бег Рго 5 90 | 95 ту тіг Рів с1у сп біу твг вуз ве) біц ІЇ1е кує
НК це «2105 132 «211511 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 132
Зо
Ага АТа за? сій сіу маї заг баб туго тей Аза 1 5 10 «2105» 133 «21157 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 133 су Та бог 5ег го АТа тік «210» 134 «21159 «212» РВТ «213» Ното зарієп5 «400» 134 біп бій Тук сіу бес б5ег Бго Туг Таг ї 5 «2105» 135 «2115 120 «212» РВТ «213» Ното зарієпо «400» 135
Заг 5аг бегонія Рго жів Ре ні Ко бі СТО РМ чего Уа! Суз дхр 1 5 10 15 «ег Уа! Зег ува! тгроуаї С1у Азр цу Тіготйг АТа тако Абр їв бує 23 зо су мує бТй ма! меж Уа! ів б1у бій мУа1 Абй 16 дей Аба бек Уаї 35 40 45 пе уз б тук РНе вве бі тб вуз сСуз АгЯ АБроБго Авп ого чаї 50 | 55 Й 60 дкр Зек бу Су АГРО сіу 116 АБ Зег гу нія тгродей 5аб тур сСує 65 70 75 во
ТвВготие с тТве ні5 Те Ре уаї їу5 АТа ге) те о Меж Ар бу Бу б1п 85 | 90 9
А1а Аа тгр Аг Ре їі дга Ле дор тне АТа суб маї Сух уві Кез 100 105 цо
Бек Агу вух Аїа Уаї Аго Аго АТа 45 120 20 «2105» 136 «2115 120 «212» РВТ «213» тивтивсшиШ5 «400» 136 бек 5ег ТВг Ніз Рго ма! Рйє нів Меб сіу бі Ре бег Уді су дер 1 ЮК) 10 15 век Уа! ба? Уа? тер оуаї сі1у Ар Гуз тТйг тТиг АТа тТиг Абр їв гу 20 25 30
С1у суз бі Ма! Тбг Маї ву АЗа бін Уа! Абп х1е Ап Ап Бег ма! о
РЕ Ага біп туго Ре ве сіц тиг огух Су Ага дій бек Аби Рго уд! 50 !
іш Зег сі Суз дга с1у 12 Азробес цу Ні Тер Або беб о Тугб Суб 65 70 75 80
Те те оте ні тб РВе маї уз АТа ей те тк Ар об ме вп що що 95.
АТа АТа тгр Ага Ре ї1е Агу їТе А5ротак АТа бух Уві Суб УВІ ви що 105 ло заг о дгЯа вуз Аїа так Ака Ага Аа 115 | 120 «2105» 137 «2115 126 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 137
Ніз б5ег Ар оРго АТа Аго АкКо ніх Бек Ар Рго АТа Аго Аго с1у 61 я 5 10 15
Гей бек Уа! Су Азр Бек їі 5ег сш тгрома! тис АТа АТа дбр о гух 29 25 зо ух Тік о АТа Маї А5р Меї чек бі б1у ТпгоУаї ТнНг о Маї Гени То у 35 3 45 ма1і ргбо уаї бБег уз сту біп гей ух бій Тук РНЄ Туг 61 Тпг гу 50 у у 55 й бо У у
Су А5пПорко Мебс біу Тук ТВг уз сі б1у Суз Ага сіу їТе дер Гуз бу 70 75 о аРЯ4 нів тер АБ чего бій Суб Ага твготве сти век ТУ Уа Аго Аа. 85 зо 95 ви тТвг Мех зер бак ух Ту Аго ї1е біу тер Ага Ре Х1е Агу Пе 100 о Що5 й мо дер те обБес Су уаї Суя тб огед твг їі уз лего о1у Ага 115 120 | 155 «2105» 138 «2115119 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 138 тус Аїа сії: Ніб Бує бер ніз Ага 61Їу сш Туг бек ув! Суб Ахр Бас ї 5 10 їх
Ін Бег оцео Тер ува! те Ар Гуз ще Бек АТа 16 АВ Хе Агу у
Й 2 зи ні сій маї Те ув! ве с1у біб Же бує таг обу Ав Берк Рго Уві!
муз біпотуг Ре туг біцш тТаг о Аго Суз груз січ Аа Аг го Уаї су з0 55 бо
Ап обіу Сух Ага с1у ї1е6 Абр А5р гу Ні Тер Ай 5егобіп Суб уз 65 ги! я 75 80.
Те бек обіп так отуг маї АгЯ АТа Без таг оЗес бій Ап АБИ Су кец 85. 90 95
Уаії б1у тгр Агро тер Т1е Агу Ж1е дер тйг бек осуб маї Су АТа Ге 100 105 110 бек Абу ух Жіе СТУ Агу п

Claims (12)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій і терапевтично ефективну кількість виділеного людського антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (МОР), що містить: а) легкий ланцюг, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОВІ ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 24), СОВ2 ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 20) та СОВЗ ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16); та Б) важкий ланцюг, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОВА ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 22), СОВ2 ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 18) та СОВЗ ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 14), причому важкий ланцюг вибраний з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Ме 40-43 та містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 10, і легсий ланцюг являє собою ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 44 та містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 12.
2. Спосіб лікування болісного стану, спричиненого підвищеною експресією МОРЕ або підвищеною чутливістю хворого до МСЕ, який включає введення хворому фармацевтичної композиції за п. 1.
3. Спосіб лікування болісного стану, спричиненого підвищеною експресією МОЕ або підвищеною чутливістю хворого до МСЕ, який включає введення хворому фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції за п. 1.
4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що згаданий болісний стан або є наслідком будь-чого з переліченого нижче, або є одним з перелічених нижче станів: гострий біль, зубний біль, біль, викликаний травмою, біль, викликаний хірургічним втручанням, біль унаслідок ампутації або абсцесу, каузалгія, демієлінізаційні захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, Зо синдром набутого імунодефіциту (СНІД), стан, спричинений токсинами, стан, спричинений хіміотерапією, головний біль у цілому, мігрень, сильний нападоподібний головний біль з періодичними рецидивами, змішані серцево-судинні та несерцево-судинні синдроми, головний біль, викликаний гіпер- або гіпотензією, запалення у цілому, артрит, ревматичні захворювання, вовчак, остеоартрит, фіброміалгія, запальні захворювання кишечнику, синдром подразненої товстої кишки, запальні захворювання очей, запальні розлади або нестабільність сечового міхура, псоріаз, скарги на шкірні захворювання із запальними складовими, сонячна еритема, кардит, дерматит, міозит, неврит, дифузна хвороба сполучної тканини судин, хронічні запальні стани, запальний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, невропатичний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, діабетичний невропатичний біль, біль унаслідок пошкодження симпатичних сенсорних нервів, синдроми деаферентації, астма, пошкодження або дисфункція епітеліальної тканини, простий герпес, порушення вісцеральної рухливості на респіраторних, статево-сечових, шлунково-кишкових або серцево-судинних ділянках, рани, опіки, алергічні шкірні реакції, свербіж, вітиліго, загальні захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, виразки шлунка, виразки дванадцятипалої кишки, вазомоторний або алергічний риніт, бронхіальні розлади, дисменорея, диспепсія, гастроезофагеальний рефлюкс, панкреатит або вісцералгія.
5. Спосіб виявлення МОБ у біологічній пробі, який включає: а) контактування згаданої проби з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом за умов, що надають можливість зв'язування згаданого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента з МОБ; де згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить: її легкий ланцюг, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОВІ ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 24), СОВ2 ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 20) та СОВЗ ділянку людського легкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16); та ії) важкий ланцюг, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОВА ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 22), СОВ2 ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 18) та СОВЗ ділянку людського важкого ланцюга (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 14); та р) визначення рівня зв'язаного зв'язувального агента у згаданій пробі, причому згаданий важкий ланцюг вибраний з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Ме 40-43 та містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 10, і легкий ланцюг являє собою ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 44 та містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 12.
6. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відділяється від людського МСЕ поліпептиду з Ко приблизно 1х109М або менше і нейтралізує біологічну активність людського МСЕ у стандартній іп мйко реакції з ІСво приблизно 1х109 М або менше.
7. Фармацевтична композиція за п. 6, яка відрізняється тим, що згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент у процесі дисоціації відділяється від людського Маг поліпептиду з Ко приблизно 1х1079 М або менше і нейтралізує біологічну активність людського МО у стандартній іп міо реакції з ІСво приблизно 1х109 М або менше.
8. Фармацевтична композиція за п. 7, яка відрізняється тим, що згадане антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент у процесі дисоціації відділяється від людського Маг поліпептиду з Ко приблизно 1х107! М або менше і нейтралізує біологічну активність людського МО у стандартній іп міо реакції з ІСво приблизно 0,2х109 М або менше.
9. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що згаданий болісний стан є наслідком раку.
10. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що згаданий болісний стан є наслідком остеоартриту.
11. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що згаданий болісний стан є діабетичним невропатичним болем.
12. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що згаданий болісний стан є невропатичним болем.
КОМІ расу сх Водво «и лорров тре я в ГШНИИ « м ща ки лю ШТ 5 В рю" ЗЮ «86 Ж вхо. Ше «з ще, «лев яї не . Шкх І Ге у ТО ння ДЕ епофрнленток, щі се Е ооо. - я квові оту що ев «у зажн» є 4 БВОФЮ- М ше да є З змо я Зоо Шок Вр БЬ я Б б, Зааоо Мову КО зюх є ОЗ Сл НО зснскню нава пом доповн вних знан т ЕЕ кара» мини пивних зомінпо він ше -й -4 що -Х - гу -4 «З «Х -4 Іовімкмі іовіме МІ 7 рибні ч ш Пе т ве ткею . ше 5 ВФУ да о о виююї «ії Зх да « ЧИЙ мет вою і " щи : 8-8 вою б ЕК тов ен ше ЕЕ В тою лиш ше ; юзові меч ш- воює иа : вн У, п дек шк що) ою У БОБ пвоооо чт ЩО яю ше; | Вб о й обу зн р Зою» я тя По зо») Ко я б в»
3 В. теки денними «нн зн: а по не полон, н 4 «З -3 -ї 5 - «й хі «В «й й ісві ме М Ісбімк МІ онук ром ал Мора ! ст 100060» гнк ШО кох» бе ЖАХ вою! сов Ж яю є Р Ї- ВІЖКК- , | - й КВ 79905 Княюртню ще Кк СТУ - 15 «КД вив Я ЯА Ж вжи сл ТОЖ вер ве щ б ММ Я ї В яоово- - ЩО ою Щоб ою В Щ. аю а АН РОБ лю Об зажим на ФУ ЗК енттттутттттетруевеетттттттттуттняну г нем вн: пнів пенні с я -й -ї ву і й г «4 - -2 4 г ісшМк МІ ісгімкМі вам -4 Ви Й і он пон й х пннна еч чї Ті дк ва» тк, «БК воща- з м 5 хко- . і ож Кт теж «пн СД плини нини пен пн сек: 8 а Я ГІ іс мем!
Фіг. 1
Нейтралізація активності МО Вилив активності ВМО на людським анти-МОР антитілом (у експресію УКІ зіставленні з В МО (035 НМ) ш- ВОК У КО І Гасй з я жк БОЙОВА тт я дою че В ао000У рай В «сою. х ї зі Ух ї ЗоБ0оо і х я Я ск 5. . «озаююя Ж, содюо- бе й чоосо- У МОЄ БО ЛО000- ж Й167Ч40) те о во рах Дурерютттртня т 0 - : перу яв АХ «а -ї го 1 Ж І й що -Е - 8) 1 Е З іони Мі іювімк МІ
Фіг. 2
Вилив активності МСЕ на Вплив активності ВМО на експресію УВІ у культурах ОВО експресію УКІ у культурах ВКО - 100000 тні 790000. тає же Ве Я ! оо тБооо- рн рин: ЕЕ й ее / - З вобою щ-щ ку 50000 4 БО що й ма й ка -й в й ГУД ра в ФО 2500 дн ве ЗБ дня еЕ ! нн пн дн пежллвкжажля ху сн сепія плттттттт т тд, ГЕЕБО рев | реве | один ПОН на он Фр нут мор ПОТ, вн ни ше ЕМ НИ ВЕ НЕ ІовімкМіі Ісвімк МІ лора 04743615 ша 13000004 «ло 100000 ро Ор твором же ми ни жи ши Ж. 75006 О " Ше я . ва і с. , Як ! я М з НЯ БОойою т М Борою 4 ж зв нм А їх за пий ви Б ОС Шан В ше и с 8. | ГЕЄК реле я Еози віріонів зорово зі нини званих маминим в пня ни нн пн нн «й -й й -3 й 1 З -й й -в ж о з Е Іс ме МІ ІмеЇмкМ 3п47лос2в 4р40744525 завю -- МИХ х я вд ших ие попа я дих ях р опепнннннож С що тооо ав " - що ие З хх ВЕ м Ж Ре Ще х - Б Водво- сей БОбоб- М : : шо ' до бамеваавАМ ОМ І «о йвОзВНМО МОБ ввоої а ВМОРОЗВНМ "ж й ОБО 2600 ж ВМОРОЗВЯМО жу МА 00 СЕК еН) 8, Шити ККИ що Где песни имя питне нан пенанннни нин снтх зання звана зонами мини змонниннннми поммннннннк -4 -х -й «З 5 З 2 -3 -8 «В -1 а з 2 ІокфімкМ | сем МІ
Фіг. З ше Ом А мА А Людський МОЖ сени ВКА ООН ЕУСОВ ЧЕМ ОКТТАТОЩЕКЕУМУССЕУМ Мишачий МОЖ сен БЯТНЕУЖНМСЕКВУСОВУНУНЧО ОКТТАТОІКОКЕУТУСАКЧМ ВОМЕ НЕПВРАККНЯВРАКЕОКОЗУСОВІЗЕНУТААОККТАУОНЕОСТУТУВЕКУ В «ка -етте ЙВАЙНКОННСсСКУВУСМсКВЦИУ В -ПЕВаЗАТОВІДОНОУТУТСКІК жк же ж жи ж Ж й жж Те Кі Мк Й 15 Же ам тод с зе даму, я й и шо С нин и АХ Людський МОВ ІМНМИБУРКОХЕТЕХКСВОРНРУВНОСНОСИОКННМЕТСІТІНТКУКАНВТМ Мишачий МОК ЖЕМЕУЕНОЖЕКЕТКСКАЄМРУКЗИОСВОХОБКНИКНУСТТИТВУКАЄТЕ ВрНЕ чВЕСОМКОХЕХЕТКСНРНОУТККОСВОХОКАНИМсОСАТТОвЖУКАТТИ Кт ТОМЕРУКОУКУКТАСККАКРУКНОСПЕИ ІННИ МЕОСКТВОТУУВМОТИ ж жа ож ож веж аажж вт жо жкжж - іл секр ж екикд б й ез й 7 М | би «а зір Людський МО ДОДО-ААНАКІКТОТАСТСУБНИКАУККА Мищшачній МО ПЕКО-АКНИРІВТОТАСУСУЬВЕКАТИКА, вовЕ МежКАХ ОНКО ОгВСУуЄтТьЬгІ Ка нку ЕМННКЬУСИННКНИХАТОТВСУСАНООМОВ Ж жжжжж жжж
Фіг. 4 Порівняльний аналіз/б ідентичності СЮОКІ важкого ланцюта МО 0318 часом Сов вами ! БНО НО СОЛІ Й) реАМИ ?7НО НС СОКИ) рами Аде Но СВ п) писоми ТМ НС СОВИ) тео Ам НОСОВІ () вхдми птн ПИВА НЕ СБНИ БМВ НС СБК ИН НС СО бЕ НЕ СБК НБН СА Яр НЕБА понос 000 0 ....-60. --29 В) сксев АЙ ВИАНННННН ПОС МО ПО 40) ланок тв : т, ловнесонІ тн нн ши с Еш ролики у М ВИШ птн 00 няневвй ОСТ ПІТ
Фіг. 5
Порівняльний аналізи ідентичності СЮКО важкого ланшюта МО ЗАВІВ СОВІ (п) ехвеквстхшУАВНУКО бБНІНерОко о) стажі кохав тКе їНиНесОю о); сттннаствочАВКе . 40 НС СОВІ () охниносзтахАВВУКа М НС СОВІ йрУХавиЗнеХЕХАВНИК 1ІЩМІНеССОНО (рдуувсрартвуввиков нн МО НО СОКУ ІБНВ Не СОВЕ ПЯСТ Не СЕК НСС МОБНССОЮ Не Не СО, ЯНВ В м панно тенти оті мімнєтвю ЗТ ТУ о ков ж: ЗИ НИМИ ПОН ПИКА: ПОХКОКВН НН КОЖНА УААН пенес ОТТО,
фіг. 6 Порівняльний аналіз/ ідентичності СІК важкого ланцюга МО нина КК 1АУНННС СОВЗ (З зетхсвовевУКухУнвУ бНО МС СОМ (і) сУхсвоввоУвУХУМУ У, МНС СОКІ 0) вужа емНУ Об НОСОВІ п) хе воюшвБовУх У Нох «пАНССОКУ (1) ха нови вруКах ТНІНЕСОМЗ 0) ее кововееУЖМяОХ несе ГОСТ вена НІ НИМ КИМ ПИВ Кн НИМИ Є: ПОДА ЯОЯ НО СОВА ШИ и я се ЛИ Ин ПИ «ИН МН ви ни
Фіг. 7
Порівняльний аналіз/б ідентичності СІЮКІ легкого данцюга МО о С нн МОБЕСКОМ у КАВОВУ А АІС СОВБІ ЗІЗ М) кАВОЄТаВНОКУ ОЗ СрВІ 3 вАВОВКИ ВАТА АС СОР ЯКО М) АВ УНВКВАя мошерм йряаазаунвесия, ас КОСОВІ ОЗ ООМ п) вв УЗВУвАх яса СОМ ОВУ () ква вувА НИ СОМ () катозчв ява ІННО СО (5 вазовеванУєх МО 4 СВІ ТОВ 2а3мя б влазаУвнвувх х ! ! щк | ЗНЯВ ос Ов сОвІ нн 2 ...НОМЯСОЮВИ офонєнно ІСФОЖ імхнеюе ПеМІССОКІ Зохюювю роМмшМсЄ НСОМ нриіссві Й В ШИ що в шо в С ШШШ: ве ОНМННИННИЙ ВИМИ НОВНИХ НИК Я Ж шише виш. шик шш: КО В ІЙ Що шт С ПО й 3-5 .--6 МЕС КОВІ 7 нш й ШЕ м В Щ В ТЕБ ЕК! ХНЕККВ птн п Шо т шк ! бї М Пияе пропо Поп полон Мол ном Пон он у пе МЕТО | | ! | | І -
Фіг. 8 Порівняльний аналіз/?» ідентичності СІЗКО легкого ланцюта МО Фр Низ сОво п) Аве ОЯ о СОМ МОЗКОМ М) лешньоя анІиссрв й) васвОи ОБ КОМУ ОБО ТЦВОЄ В ВАЗИВАЖ ЯОБІС СОКУ ННІ Й) БазквА» БНО Ср р чачикАя ОС СОНО І дАванАХ аів сок оз И ГО3. щь»аВкАя ТНІЕ СОН 1) БававАТ МЕ ОВ СОНо МНК ВЗКа у вана ІЙ пн и пиши и ши и п ЕЕ ДОБОВІ МОЄ МОВІСООКОЮЮВЮ 0 вною ово сови аю сю ! соніссово ромом сов Гономюв Глен Що ОКО дю; Коко МОМ фак х кульок хх крдандеьо: ль ї нок Ж тіж жі фею о пгальтьюлюьоКю ра -нн аз нінінінінію з ана з ввів кана прин аа кни ши шш ние тент мн; лі я м шк М шк. ШИ: МоБІССОК НО мл я ж 8 що їй вою ро ! Що ше щ В кв в секак и Й ПМ НИК їй й Я Що Я Й нвісвю ШЗШЗ- . АА--А--й - - - А :Щ. «5 юю СУМНИЙ ПИШНИХ ВИМИ НИ МН ПЕК НИК МН НИ НК ВИ ОСС ШИ п -- п ШИ БІ НИМИ КИМ ЯК миши --.9 Я ее ВИНИ ПОМННННН МОАНАНЮ МОНО НОНОНОННЯ МОНО ООКООВІ КОКОНОНОННЮ МНОЮ НОВО фіг. 9 !
щи і Й щ м й ц х Хек са- Б зна є , я Як які Порівняльний аналіз/б ідентичності СІЗКЗ легкого ланцюга МСЕ ГУД МО МО ОБНа ) соєва НІС СОКО п омкеванут ШнЯБе сом ох: я Ме СОКа ЗНОВ г) скав ве Я ЦО СОМ ОПТОВІ соски Не ТОП СОКУ (В осАНВЖ ЕН міс і вже» Я МО СОНУ За зонти аеБію ср юности увві ОКА КО СОН МИНА ПІ свух ев Й ГГ хо ВАСІ ИЩИ І НО ЧеНЕ заоіб УНІ цувне йо ов сова іюрта йо ямі вейвх ср юр (сова по пнекооонстогвсетесквоснсннК ВОНВДТВО ОСОБУ ПОПУ СОНЯ ОБ ООН ОБО, Е5ХВ ЗОбатОЕм ект ВИНА с: КАК: КК НК я. в в б ні зненоно ТКС сОою І . цк КЕ ки мм кп У Пи хв з сОом на Пп при шк шк К Що Кх Пе се ВИЙ ВИНИ ИН МИНЕ НИКА НН НИ ИНА НИННННИЄ НИКИ НИК ее ИН сетеветто С. ЩО . п ВИ МИ: те йо С Ко вв ЗМИ НИМИ НИМИ МИС НИНІ ЗОНИ ПОН ООН КОКОН НИКИ У ВОНО З СВАЕ: ЗМИЕ НИКИ ИН ДОННИХ ЗНАКННННАННИ ОМНОКННННННВНКН. АННИ ОКА ПАКНОНННОВНН КИОККНННН НИМИ с кое СОС НИЙ МЛИНИ МИМО ПОЛОН ЗОНИ ЗОВАННОКЯ ЗОООКВИКОННОЄ МАО ОКАНЯ ООАИ ВН ЗАКОН С
Фіг. 10 ч- т . г. їх н У Чі .. й 7 їй ще м , У ще Порівняльний аналіз варзабельних лілянок легкого ланшюга моноклональних антитіл Со, 7, 14010, 14011, бно, ра нина аа а а о кі Шу в ие ВЕ й рн ЙО оон сонна, МУК (В АхОВиКОКИВВВАЧУСОВМ УК АНВКІВ АСК ВКАРКВА Хр АНЧЬЕрИВИВЕ ВВ МОСК ОБ Кора ОЙ НОвх уУлдма І БІТВНОИ ВОК, сЕВАВ ВН АВИВИЗВЗУ ОО МАВКА КАТВІВОВККВОВо МОК НВ НС КЗОАЮ еутевня ПІ КЛУВТНа ВВР ОКВАТЬВОВА НОВИНУ АН РОКИ ВЕОрБАНИВАТВКО ВИК ЗОН МОЄ Б КИХНЮВО екв 0 МОВИ аа ЗОВ КОЖ ВВА МОВО ВКА Кр АВНЮ МИРНЕ - МОЕ ЯК С МОУ НОВУ тенся НІ ВОНВИВЬеВо ВВАЖАВ АВОВТВВ У ВНОСИВ Вр АВНКАТНІВАХР СВ МРІЯ ОМ ВОНА ВИМИ ву і ХУБоОЗВАТОУ КВ ИВААНИ ВАНІ ЯН ВИ КАРАВАН ВАЧНІ ВАВ УВО КОР ЯКОЮ АККАУНТ вді (5 ВХ УСЕ ТВЕН ВАК ИН ВАЗОНИ КОКО ТрАВЯ НАСІРОВ ВВ, МЕ МОГИ Из ехтввя (М дхоМеоав УАНМ И ВАЗИ ВО У НК ВКА ВВ КК АВІА ВО МОР БУ МУ Баня м зносі до хо ДЯК СИ вузов ноьНЕ Ева ВАВОВУТИ КО ВИСОКА вВкаМКаВІВАЧНІКОВКХВО МОРЯНІНІ карра ДОМОВ и жеанниє і З) ВІУЛТОЗееВТЬсьОВОВнАтУ ВАННИ АТО евАВВ КАВА КО ВЕК МТ ЕТО ТТ т У ТТ ет тт есттстес Кперкух З ' ВВВЯ но Й пн пннрстотннн В. «МУК БІ) кЗеВкТиУХ внесе кАТ ХК ца иМВх В МОР ЯК керда ДЮЗ НИ НОЙ Утеціюв ДВ; ветавтоухавренЕрвАУКУ КЮХНИК и КИКХ В МОВ НС ХВ агутемов ЩО) ВОТрЕТМРІВАПиКЕпЕАуУ УВУ ОекрвІК МК БІС КНЕУ КО вата то вХВзора р КАТОК ВУу КОМ МОЖ ЗОБІ ЯН ВМО ігетедсп ДО Мити ТЬТЕВаИИИ КАК АЗНВИКОИ ВО КМИХИ МК ЦО НВ СОНЯ вСрА МОВНУ мен ЩО) яатпетьтханьвнипвуУУ кювлнвр уче КЧихх. МОБ НОЇ ЖИМ ттедна ВІ пОотИЕтЬ НІНА НвКАНУ КУ ИН УВК хЕ МУР Я ЛОЗОВА ства ФО) неви В ВІ ЕВ г кун ет кВт нхх МЕ ВНУ НУ норма У гоувт во ЗВ ЖЖ ЩО, еохпетеотхваоекЕикАуки Кусто КькІх БУКЕТІ Не кирра ли ювеу шамеви у Ж ЗПУВК ТЕМА ОКеКеКАТ о ри еКИХ тевКНнІ З ДІЛЯН Ка; Ккарра - КАП ! Фіг. 11 ще « «а а Со х ї че жк при се не тк г сля Порівняльний наці варіаоельних длянокК важкого ланцюга маноклональних ж а і Кк г: її антитіл 404, 406, 14210, 14111, 782, НУ дяк пи пистстти дпттстесте А сегмент пня СІ сн в ТІ я ддннтячнтнннняй Ко в НН Овен: й Й ЯМУ (ЩЕ Усика врУЦИя ВН фЕсААВИ КОВО У ОАЕ ствКиаНить кА. со МОН ДЮ В евдівн 4) ух ов ов А ХК ВО АННИ ВАМИ ВУКОАРЕ КОНЯХ ВУ ЖОЕ ОТ АОЯИ КИ МКЗЕ БНО М Най ЛОВОКЮВЯ АналУ пнів 0) ВУС осені в АВР ЦО КАМИ УТА КЕН ИроВ ЗНИК Два ЗК ВОК УНЕ Ноя ВІОЗВЛЕЖК ВІ 43 Яся У мів (кусок коексовси овес лАСР ТРЦ АННИЧКОАВОКОКН УВК ВНИМ ВсКАРІ КО ЯР СИН МО лах ЯКИМ ем недін Й) НОВЕ ККР ОВУ БАКІСКІННИНИ Ву Ме КОМЕВКОмНИМ ККУ СЮ Ота МОБ ЯСЕН ВСВеТОРО ЖОЗНУВМОВ діє Й) ВТоЕ УЮ КО КВУ А АВЕР КН ОМ ЧУ пОА ик еК вро кине вазау лок ше ши ки Шон? Й НМУ Бл аку зВВВАКИ ВІ МЕ НУВАННЯ УХИЛУ ЮК» ДН Х ря ок МК НОЮ НО МКУ ню БИ) ВУСУККЮНАКВЗОтвОМх ІЛ АКОТАКУТСАКТСИИ СВУ КУ Монети НОКВНО НЄ Не оя ЯКОВА оз юдін БУ) ЕСЕ ЗАОКАКНИ ТОНЯ А АННИ АЮ Кот сВроУ Ки ит : МОКТНЯ Кона ЩОБ УЮ Я йнагу оці ФО) ВЕЖІ ЗАВОАККУЦУ В НМ ПВАХ ТТ АЮ ОВК хх КТ КУВИЕ ЛЯ в Ен НЕ гась КОМІ ки жен ЩИЗ хчту ЗАРКНЕ ВАХ ЕВЕКАВОТАНУСАНІ- УКОСУ У У МИ ВОв тота МОБ ЯВНО ВСНЗТОРО ЗХО ПОВЕ тодюв 5) БРТХЗВОНАКНО КТ ВОМНЯ АНІ ТА СУ ЖСАНІ ВОМУ МО ЦЗО КВ тевіоп 7 ділянка; Карра т канта
Фіг. 12
UAA201109302A 2003-07-15 2004-07-15 Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf) UA115960C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48743103P 2003-07-15 2003-07-15
UAA200601428A UA97086C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA115960C2 true UA115960C2 (uk) 2018-01-25

Family

ID=34215825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200601428A UA97086C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)
UAA201109302A UA115960C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200601428A UA97086C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)

Country Status (31)

Country Link
US (7) US7601818B2 (uk)
EP (2) EP1648509B8 (uk)
JP (8) JP4489077B2 (uk)
CN (3) CN1849138B (uk)
AR (2) AR045056A1 (uk)
AU (2) AU2004267030B2 (uk)
BR (1) BRPI0412567B1 (uk)
CA (1) CA2534585C (uk)
CY (1) CY1113167T1 (uk)
DK (1) DK1648509T3 (uk)
EA (2) EA013614B1 (uk)
ES (1) ES2392954T3 (uk)
GE (3) GEP20146050B (uk)
HK (2) HK1088534A1 (uk)
HR (2) HRP20060033B1 (uk)
IL (5) IL173076A (uk)
MA (1) MA27952A1 (uk)
ME (2) MEP31508A (uk)
MX (2) MXPA06000583A (uk)
NO (1) NO20060381L (uk)
NZ (3) NZ599196A (uk)
PL (1) PL1648509T3 (uk)
PT (1) PT1648509E (uk)
RS (2) RS20100555A (uk)
SG (1) SG10201404744RA (uk)
SI (1) SI1648509T1 (uk)
TN (1) TNSN06010A1 (uk)
TW (4) TWI635096B (uk)
UA (2) UA97086C2 (uk)
WO (1) WO2005019266A2 (uk)
ZA (1) ZA200600847B (uk)

Families Citing this family (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0367170A (ja) * 1989-08-04 1991-03-22 Nippon Steel Corp 金属試料中の微量炭素，硫黄，燐の分析方法
WO2005000194A2 (en) * 2002-10-08 2005-01-06 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody and compositions containing the same
UA80447C2 (en) * 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
SI1575517T1 (sl) 2002-12-24 2012-06-29 Rinat Neuroscience Corp Protitelesa proti ĺ˝iväśnemu rastnemu dejavniku in metode njihove uporabe
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
ATE491444T1 (de) 2003-02-19 2011-01-15 Rinat Neuroscience Corp Verfahren zur behandlung von schmerzen durch verabreichung eines nervenwachstumsfaktor- antagonisten und eines nsaid und diese enthaltende zusammensetzung
MXPA06000583A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Amgen Inc Anticuerpos neutralizantes anti-ngf humano como inhibidores selectivos de la via del ngf.
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
ES2338344T3 (es) * 2004-04-07 2010-05-06 Rinat Neuroscience Corporation Procedimiento de tratamiento del dolor de cancer de hueso mediante la administracion de una antagonista del factor de crecimiento neuronal.
US7725178B2 (en) 2004-06-30 2010-05-25 Cedars-Sinai Medical Center Method and system for the prediction of cardiac arrhythmias, myocardial ischemia, and other diseased condition of the heart associated with elevated sympathetic neural discharges
ME00226B (me) 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
TWI306862B (en) * 2005-01-03 2009-03-01 Hoffmann La Roche Antibodies against il-13 receptor alpha 1 and uses thereof
BRPI0606933B8 (pt) 2005-01-24 2021-05-25 Cambridge Antibody Tech Limited membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
EP1909838A2 (en) * 2005-07-29 2008-04-16 Amgen Inc. Formulations that inhibit protein aggregation
CN101360759A (zh) 2005-11-07 2009-02-04 哥本哈根大学 神经营养因子衍生的肽序列
US7822474B2 (en) * 2005-11-30 2010-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Methods for the prediction of arrhythmias and prevention of sudden cardiac death
US8207304B2 (en) * 2006-10-19 2012-06-26 Csl Limited Antibody antagonists of interleukin-13 receptor α1
KR20090088891A (ko) * 2006-11-15 2009-08-20 메다렉스, 인코포레이티드 비티엘에이에 대한 인간 단일클론 항체 및 이용 방법
CA2790018C (en) * 2006-12-21 2015-02-03 Amgen Inc. Formulations
WO2008103474A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Anaptysbio, Inc. Methods of generating libraries and uses thereof
SI2187964T1 (sl) 2007-08-10 2015-01-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Visokoafinitetna humana protitelesa proti humanemu živčnemu rastnemu faktorju
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
AU2012216653B2 (en) * 2007-08-10 2013-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
AU2008304111B2 (en) 2007-09-27 2014-04-24 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
KR20130087632A (ko) * 2007-12-17 2013-08-06 화이자 리미티드 간질성 방광염의 치료
MX2010012031A (es) 2008-05-13 2011-01-20 Novimmune Sa Anticuerpos anti-il-6/il-6r y metodos de uso de los mismos.
WO2009150623A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Pfizer Inc Treatment of chronic prostatitis
EP2297203A1 (en) * 2008-06-30 2011-03-23 Novo Nordisk A/S Anti-human interleukin-20 antibodies
RU2518278C2 (ru) * 2008-09-19 2014-06-10 Пфайзер Инк. Стабильный жидкий препарат антитела
US8450322B2 (en) 2008-09-22 2013-05-28 Array Biopharma Inc. Substituted imidazo[1,2b]pyridazine compounds as Trk kinase inhibitors
AR074052A1 (es) 2008-10-22 2010-12-22 Array Biopharma Inc Compuestos pirazolo{1,5-a}pirimidina sustituida como inhibidores de trk cinasa
WO2010077680A2 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Vm Discovery Inc. Compositions of protein receptor tyrosine kinase inhibitors
SG175436A1 (en) 2009-05-04 2011-12-29 Abbott Res Bv Antibodies against nerve growth factor (ngf) with enhanced in vivo stability
WO2010146511A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Pfizer Limited Treatment of overactive bladder
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
US9597458B2 (en) 2009-10-29 2017-03-21 W. L. Gore & Associates, Inc. Fluoropolymer barrier materials for containers
US10471212B2 (en) * 2009-10-29 2019-11-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Silicone free drug delivery devices
TWI609698B (zh) 2010-01-20 2018-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 穩定化的含抗體溶液製劑
RS61082B1 (sr) 2010-02-26 2020-12-31 Novo Nordisk As Stabilno antitelo koje sadrži kompozicije
EP2542257B1 (en) 2010-03-01 2017-07-05 Bayer Healthcare LLC Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
SG10201504808XA (en) 2010-03-17 2015-07-30 Abbott Res Bv Anti-Nerve Growth Factor (NGF) Antibody Compositions
CR20170098A (es) 2010-05-20 2017-07-17 Array Biopharma Inc Compuestos macrociclicos como inhibidores de quinasa trk
RU2012153786A (ru) 2010-05-28 2014-07-10 Ново Нордиск А/С Стабильные многодозовые композиции, содержащие антитело и консервант
WO2011156373A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device
ES2665954T3 (es) 2010-08-19 2018-04-30 Zoetis Belgium S.A. Anticuerpos anti-NGF y su uso
US11612697B2 (en) 2010-10-29 2023-03-28 W. L. Gore & Associates, Inc. Non-fluoropolymer tie layer and fluoropolymer barrier layer
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9783602B2 (en) * 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2699293B8 (en) 2011-04-20 2022-07-20 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EP2731439A4 (en) 2011-07-12 2014-12-03 Merck Sharp & Dohme TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS CONTAINING SAME, AND ASSOCIATED METHODS
BR112014002576B1 (pt) 2011-08-11 2022-08-23 Astellas Pharma Inc. Fragmento fab de anticorpo anti-ngf humano, método para produzir o mesmo e vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o dito fragmento fab'
HUE043691T2 (hu) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc Befecskendezõ eszköz és összeszerelési eljárás
US8926978B2 (en) 2011-10-25 2015-01-06 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against nerve growth factor (NGF)
SI2852615T1 (sl) 2012-05-22 2019-02-28 Bristol-Myers Squibb Company IL-17A/F IL-23 bispecifična protitelesa in njihova uporaba
US9181261B2 (en) 2012-05-22 2015-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA kinase inhibitors, compositions and methods thereof
WO2013184871A1 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Zoetis Llc Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
EP4234694A3 (en) 2012-11-21 2023-09-06 Amgen Inc. Drug delivery device
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
AU2014318017B2 (en) 2013-09-05 2020-02-06 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
WO2015039334A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015039333A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
AU2014340171B2 (en) 2013-10-24 2019-05-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
EP4071177A1 (en) 2013-12-30 2022-10-12 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
KR101723997B1 (ko) 2014-02-05 2017-04-06 브이엠 온콜로지 엘엘씨 화합물의 조성물 및 이의 용도
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015143652A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143653A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143654A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
MX2016014561A (es) 2014-05-07 2017-06-21 Amgen Inc Autoinyetor con elementos reductores del shock.
AU2015259053B2 (en) 2014-05-16 2020-12-24 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
MX2016015854A (es) 2014-06-03 2017-07-19 Amgen Inc Sistema de suministro de farmacos controlable y metodo de uso.
WO2016035052A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies for treating itching
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
JP6914834B2 (ja) 2014-11-16 2021-08-04 アレイ バイオファーマ インコーポレイテッド （Ｓ）−Ｎ−（５−（（Ｒ）−２−（２，５−ジフルオロフェニル）−ピロリジン−１−イル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキサミド硫酸水素塩の結晶形
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CN104774265B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体11f1及其杂交瘤细胞株
CN104910274B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
JP2018512184A (ja) 2015-02-27 2018-05-17 アムジエン・インコーポレーテツド 針ガードの移動に対する抵抗力の閾値が調整可能な針ガード機構を備えた薬物送達装置
WO2016146730A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Neuheart S.R.L. PEPTIDES HAVING TrkA-RECEPTOR-AGONISTIC ACTIVITY OR HAVING NGF-ANTAGONISTIC ACTIVITY
MA41842A (fr) 2015-03-31 2018-02-06 Oblique Therapeutics Ab Nouveaux procédés de sélection d'épitope
WO2016161572A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
JP6700620B2 (ja) 2015-05-22 2020-05-27 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
US10450367B2 (en) 2015-08-13 2019-10-22 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
WO2017027861A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
AU2016344058A1 (en) 2015-10-26 2018-05-17 Array Biopharma Inc. Point mutations in Trk inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3402465B1 (en) * 2016-01-13 2024-03-13 Genmab A/S Formulation for antibody and drug conjugate thereof
JOP20170013B1 (ar) 2016-01-22 2021-08-17 Merck Sharp & Dohme أجسام xi مضادة لعامل مضاد للتجلط
TWI738713B (zh) 2016-02-06 2021-09-11 開曼群島商岸邁生物科技有限公司 Fabs串聯免疫球蛋白及其用途
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
RU2751767C2 (ru) 2016-04-04 2021-07-16 Локсо Онколоджи, Инк. Жидкие составы (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-дифторфенил)пирролидин-1-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксамида
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
KR102566858B1 (ko) 2016-05-18 2023-08-11 어레이 바이오파마 인크. (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-디플루오로페닐)피롤리딘-1-일)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복사미드의 제조 방법
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
IL315266A (en) 2016-06-14 2024-10-01 Merck Sharp ַ& Dohme Llc Antibodies to coagulation factor XI
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
BR112019002039A2 (pt) 2016-08-05 2019-05-07 Medimmune, Llc anticorpos anti-o2 e uso dos mesmos
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
GB201614884D0 (en) * 2016-09-01 2016-10-19 Oblique Therapeutics Ab Method
GB201617002D0 (en) * 2016-10-06 2016-11-23 Oblique Therapeutics Ab Multi-protease method
AU2017346488A1 (en) 2016-10-19 2019-05-30 Humabs Biomed Sa Anti-O1 antibodies and uses thereof
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
AU2018230546B2 (en) 2017-03-07 2024-03-21 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
US11986624B2 (en) 2017-03-09 2024-05-21 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP2020513813A (ja) 2017-03-14 2020-05-21 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
DK3600491T3 (da) 2017-03-28 2023-10-23 Amgen Inc Stempelstang og sprøjtekonstruktionssystem samt fremgangsmåde
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
WO2018236619A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. REDUCING THE IMPACTS / IMPACTS OF ACTIVATION OF A DEVICE
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
US11305026B2 (en) 2017-11-03 2022-04-19 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MA50903A (fr) 2017-11-16 2021-05-12 Amgen Inc Auto-injecteur avec détection de décrochage et de point d'extrémité
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
AR114110A1 (es) 2018-02-28 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-trka
BR112020017701A2 (pt) 2018-03-12 2020-12-29 Zoetis Services Llc Anticorpos anti-ngf e métodos dos mesmos
JP2021519068A (ja) 2018-03-26 2021-08-10 アムジェン インコーポレイテッド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォーム
CN108623687A (zh) * 2018-04-17 2018-10-09 中山康方生物医药有限公司 神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用
WO2019210848A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. High affinity antibodies to pd-1 and lag-3 and bispecific binding proteins made therefrom
EP3795176A4 (en) 2018-05-15 2022-01-12 Astellas Pharma Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR SUPPRESSION OF ATRIAL FIBRILLATION WITH ANTI-HUMAN NGF ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AS AN ACTIVE SUBSTANCE
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US20210260279A1 (en) 2018-07-24 2021-08-26 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Assembling a memory alloy ejector activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
MA53818A (fr) 2018-10-05 2022-01-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament ayant un indicateur de dose
IT201800009384A1 (it) 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
AR116704A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con mecanismo de amortiguación
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20220349898A1 (en) 2019-09-26 2022-11-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN117003868B (zh) * 2020-04-17 2024-04-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
CN117050175B (zh) * 2020-04-17 2024-07-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
EP4157881A4 (en) * 2020-05-27 2024-10-09 Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY RECOGNIZE NERVE GROWTH FACTOR AND THEIR USES
AR122141A1 (es) 2020-05-28 2022-08-17 Lilly Co Eli Inhibidor de trka
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023111153A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Intervet International B.V. Caninized antibodies to human ngf
US20240002491A1 (en) 2022-04-27 2024-01-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230691A (en) * 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
GB2077573A (en) 1980-06-10 1981-12-23 Kangol Magnet Ltd Vehicle seat belt connection device
US4786593A (en) * 1985-04-16 1988-11-22 Wistar Institute Of Anatomy And Biology Diagnostic method for detection of neural crest disease
JP2969647B2 (ja) 1988-09-14 1999-11-02 東ソー株式会社 モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法
SE465573B (sv) 1989-03-14 1991-09-30 Lope Medicine Ab Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor
JPH03163095A (ja) 1989-08-28 1991-07-15 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子の部分ペプチド、抗体およびその用途
DE69031726T2 (de) 1989-08-28 1998-03-12 Takeda Chemical Industries Ltd Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
US5656435A (en) * 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP3232415B2 (ja) 1990-08-29 2001-11-26 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体，その製造法および用途
JPH06317587A (ja) 1990-08-31 1994-11-15 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
US5147294A (en) * 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
JPH0576384A (ja) 1991-09-20 1993-03-30 Hitachi Ltd 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体
JP3519096B2 (ja) 1992-07-02 2004-04-12 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
US5844092A (en) * 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) * 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
GB9616105D0 (en) * 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
US7322122B2 (en) 1997-01-15 2008-01-29 Draka Comteq B.V. Method and apparatus for curing a fiber having at least two fiber coating curing stages
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
PL202369B1 (pl) * 1999-08-27 2009-06-30 Genentech Inc Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz zestaw zawierający to przeciwciało
US6548062B2 (en) 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
FR2807660A1 (fr) * 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
WO2002096458A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders
CA2491864C (en) * 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
KR20050036852A (ko) 2001-10-15 2005-04-20 기린 비루 가부시키가이샤 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체
JP2005516965A (ja) * 2001-12-28 2005-06-09 アブジェニックス・インコーポレーテッド 抗ｍｕｃ１８抗体を使用する方法
US6919426B2 (en) * 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
BR0315164A (pt) 2002-10-08 2005-08-23 Rinat Neuroscience Corp Métodos para tratar dor pós-cirúrgica administrando um antagonista de fator de crescimento nervoso e composições contendo o mesmo
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
SI1575517T1 (sl) * 2002-12-24 2012-06-29 Rinat Neuroscience Corp Protitelesa proti ĺ˝iväśnemu rastnemu dejavniku in metode njihove uporabe
EP1468999A1 (en) * 2003-03-20 2004-10-20 MyoContract Ltd. Substituted piperidine and piperazine derivatives as melanocortin-4 receptor modulators
MXPA06000583A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Amgen Inc Anticuerpos neutralizantes anti-ngf humano como inhibidores selectivos de la via del ngf.
BRPI0606933B8 (pt) 2005-01-24 2021-05-25 Cambridge Antibody Tech Limited membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico

Also Published As

Publication number Publication date
MEP31508A (en) 2010-10-10
AR075790A2 (es) 2011-04-27
JP2010006812A (ja) 2010-01-14
IL206823A0 (en) 2011-08-01
PT1648509E (pt) 2012-10-18
NO20060381L (no) 2006-03-22
IL214280A0 (en) 2011-08-31
MX341869B (es) 2016-09-06
CA2534585C (en) 2012-02-21
AU2004267030B2 (en) 2010-06-17
HRP20060033A2 (en) 2007-04-30
ZA200600847B (en) 2007-01-31
EP2364728A1 (en) 2011-09-14
TW201534621A (zh) 2015-09-16
JP2012161316A (ja) 2012-08-30
US20160237147A1 (en) 2016-08-18
NZ599196A (en) 2014-01-31
EA030259B1 (ru) 2018-07-31
WO2005019266A2 (en) 2005-03-03
TWI385180B (zh) 2013-02-11
EP1648509A2 (en) 2006-04-26
MXPA06000583A (es) 2006-03-30
BRPI0412567B1 (pt) 2017-03-21
CN102358903B (zh) 2017-04-26
EA200600254A1 (ru) 2006-12-29
JP2010162028A (ja) 2010-07-29
US7795413B2 (en) 2010-09-14
HK1096310A1 (en) 2007-06-01
RS20100555A (en) 2011-08-31
JP2015042670A (ja) 2015-03-05
EP1648509B8 (en) 2012-10-24
DK1648509T3 (da) 2013-01-07
TWI382031B (zh) 2013-01-11
AU2004267030A1 (en) 2005-03-03
JP2017079782A (ja) 2017-05-18
BRPI0412567A (pt) 2006-09-19
ME02785B (me) 2012-12-31
US20110040076A1 (en) 2011-02-17
RS52332B (en) 2012-12-31
TWI635096B (zh) 2018-09-11
ES2392954T3 (es) 2012-12-17
AR045056A1 (es) 2005-10-12
JP2012250986A (ja) 2012-12-20
SI1648509T1 (sl) 2012-12-31
NZ588527A (en) 2012-06-29
EA030259B8 (ru) 2018-09-28
AU2010202177B2 (en) 2013-12-12
IL173076A (en) 2015-10-29
TWI503328B (zh) 2015-10-11
IL214281A (en) 2016-07-31
SG10201404744RA (en) 2014-10-30
US20050074821A1 (en) 2005-04-07
IL214281A0 (en) 2011-08-31
GEP20146050B (en) 2014-03-10
CN1849138B (zh) 2011-11-30
RS20060022A (en) 2008-06-05
EA013614B1 (ru) 2010-06-30
TW200513468A (en) 2005-04-16
UA97086C2 (uk) 2012-01-10
GEP20196963B (en) 2019-04-10
GEP20104887B (en) 2010-02-10
TNSN06010A1 (en) 2007-10-03
US20160304596A1 (en) 2016-10-20
HRP20060033B1 (hr) 2014-02-28
US8106167B2 (en) 2012-01-31
HRP20120882T1 (hr) 2013-02-28
CY1113167T1 (el) 2016-04-13
EA201000245A1 (ru) 2010-12-30
JP2007537703A (ja) 2007-12-27
IL241874A0 (en) 2015-11-30
JP2015155413A (ja) 2015-08-27
IL173076A0 (en) 2006-06-11
NZ544751A (en) 2009-05-31
US20110091476A1 (en) 2011-04-21
JP5264798B2 (ja) 2013-08-14
US20090155274A1 (en) 2009-06-18
AU2010202177A1 (en) 2010-06-17
JP5965964B2 (ja) 2016-08-10
CA2534585A1 (en) 2005-03-03
CN1849138A (zh) 2006-10-18
TW201311721A (zh) 2013-03-16
CN102408483A (zh) 2012-04-11
US20080033157A1 (en) 2008-02-07
EP1648509B1 (en) 2012-09-12
HK1088534A1 (en) 2006-11-10
PL1648509T3 (pl) 2013-02-28
MA27952A1 (fr) 2006-06-01
WO2005019266A3 (en) 2005-04-28
CN102358903A (zh) 2012-02-22
US7601818B2 (en) 2009-10-13
CN102408483B (zh) 2016-06-08
JP4489077B2 (ja) 2010-06-23
US8198410B2 (en) 2012-06-12
TW200911833A (en) 2009-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA115960C2 (uk) Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf)
KR101528393B1 (ko) 선택적인 ngf 경로 억제제로서의 인간 항-ngf 중화 항체
CN105121467B (zh) 抗cd47抗体及其使用方法
KR100816124B1 (ko) 선택적인 ＩＦＮ-γ 경로 저해제로서의 인체 항-ＩＦＮ-γ 중화항체 및 이 항체를 포함하는 조성물
US8394378B2 (en) Antibodies binding human collagen II
US20120156725A1 (en) Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors
CN107847591A (zh) 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用
AU2013260740A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors