BRPI0412567B1

BRPI0412567B1 - anticorpo isolado, ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, medicamento para tratar um distúrbio doloroso ou uma condição associada com a expressão aumentada de ngf ou a sensibilidade aumentada ao ngf, e, uso de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo

Info

Publication number: BRPI0412567B1
Application number: BRPI0412567A
Authority: BR
Inventors: Martin Frank; Huang Haichun; Inoue Heather; J S Treanor James; D Wild Kenneth Jr; J Zhang Tie
Original assignee: Amgen Inc; Medarex Inc; Medarex Llc
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2017-03-21
Also published as: WO2005019266A3; TWI385180B; AU2010202177A1; PT1648509E; CN1849138B; MXPA06000583A; CY1113167T1; AU2004267030B2; SG10201404744RA; JP5264798B2; EP1648509B1; IL173076A; AU2010202177B2; RS20100555A; EA030259B1; JP2012161316A; US7601818B2; NZ599196A; EA013614B1; TWI635096B

Abstract

"anticorpo humano isolado, método de tratamento de uma condição causada pela expressão aumentada de ngf ou pela sensibilidade aumentada ao ngf em um paciente, composição farmacêutica, método para detectar ngf em uma amostra biológica, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, linhagem celular isolada, agente de ligação específica em ngf , anticorpo humano isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou um ligante de antígeno do mesmo, polinucleotídeo, vetor de expressão, medicamento para tratar um distúrbio doloroso ou uma condição associada com a expressão aumentada de ngf ou a sensibilidade aumentada ao ngf, e, uso de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de anticorpo". esta invenção refere-se aos anticorpos que interagem com ou se ligam em fator de crescimento de nervo (ngf) e neutralizam deste modo a função de ngf. a invenção também proporciona composições farmacêuticas de citados anticorpos e métodos para neutralizar a função de ngf, e particularmente para tratar distúrbios relacionados com ngf (por exemplo, dor crônica) por administração de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de anticorpos anti-ngf. métodos de detecção da quantidade de ngf em uma amostra usando anticorpos anti-ngf também são proporcionados.

Description

“ANTICORPO ISOLADO, OU FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA IMUNOLOGICAMENTE FUNCIONAL OU LIGANTE DE ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, MEDICAMENTO PARA TRATAR UM DISTÚRBIO DOLOROSO OU UMA CONDIÇÃO ASSOCIADA COM A EXPRESSÃO AUMENTADA DE NGF OU A SENSIBILIDADE AUMENTADA AO NGF, E, USO DE UMA QUANTIDADE FARMACEUTICAMENTE EFETIVA DE ANTICORPO OU FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA IMUNOLOGICAMENTE FUNCIONAL OU LIGANTE DE ANTÍGENO DO MESMO”.

Este pedido está relacionado com, e reivindica prioridade relativamente ao pedido provisional U.S. n° 60/487,431, depositado em 15 de julho de 2003, cuja divulgação é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanos que se ligam a fator de crescimento de nervos (NGF). Descreve-se também composições e métodos para tratar dor e distúrbios relacionados com dor. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A cada dia mais de dois milhões de pessoas nos Estados Unidos são incapacitadas por dor crônica (Jessell e Kelly, 1991, "Pain and Analgesia” em PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3a Ed., (Kandel, Schwartz, e Jessell, ed.), Elsevier, New York). Infelizmente, tratamentos correntes para dor são apenas parcialmente efetivos, e muitos destes tratamentos causam, eles próprios, efeitos secundários debilitantes ou perigosos. Por exemplo, embora drogas antiinflamatórias não-esteróides ("NSAIDs, non-steroidal anti-inflammatory drugs"), como aspirina, ibuprofeno, e indometacina são moderadamente efetivos contra dor inflamatória, elas também são toxinas renais, e altas doses tendem a causar irritação gastrintestinal, ulceração, sangramento, e confusão mental. Freqüentemente, pacientes tratados com opióides também experimentam confusão, e o uso prolongado de opióides é associado com tolerância e dependência. Anestésicos locais, como lidocaína e mexiletina, inibem simultaneamente dor e causa perda de sensação normal.

Dor é uma percepção baseada em sinais recebidos do ambiente e transmitidos e interpretados pelo sistema nervoso (para uma revisão, ver Millan, 1999, Prog. Neurobiol. 57:1-164). Estímulos nocivos, como calor e toque, ocasionam que receptores sensoriais especializados na pele enviem sinais para o sistema nervoso central ("CNS, central nervous system"). Este processo é denominado nocicepção, e os neurônios sensoriais periféricos que o mediam são nociceptores. Dependendo da intensidade do sinal do(s) nociceptor(es) e da abstração e elaboração do sinal pelo CNS, uma pessoa pode ou não experimentar um estímulo nocivo como sendo doloroso. Quando a percepção de dor de uma pessoa é adequadamente calibrada para a intensidade do estímulo, a dor serve a sua função protetora intencionada. No entanto, determinados tipos de danos aos tecidos causam um fenômeno, conhecido como hiperalgesia ou pronocicepção, em que estímulos relativamente inócuos são percebidos como intensamente dolorosos porque os limiares de dor de uma pessoa foram reduzidos. Tanto inflamação como também danos aos nervos podem induzir hiperalgesia. Pessoas afligidas com condições inflamatórias, como queimadura solar, osteoartrite, colite, cardite, dermatite, miosite, neurite, doenças vasculares do colágeno (que incluem artrite reumatóide e lúpus) e análogos, freqüentemente experimentam sensações incrementadas de dor. De forma análoga, trauma, cirurgia, amputação, abscesso, causalgia, doenças vasculares do colágeno, doenças desmielinadoras, neuralgia trigeminal, câncer, alcoolismo crônico, acidente vascular, síndrome de dor talâmica, diabetes, infecções de herpes, síndrome da deficiência imunológica adquirida ("AIDS", acquired immune deficiency syndrome), toxinas e quimioterapia causam lesões nos nervos que resultam em dor excessiva.

Como os mecanismos com os quais nociceptores transduzem sinais externos em condições normais e hiperálgicas tomam-se melhor compreendidos, processos implicados na hiperalgesia podem ser objetivados para inibir a redução do limiar de dor e, com isso, diminuir a quantidade de dor experimentada.

Mostrou-se que fatores neurotróficos desempenham papéis significativos na transmissão de dor fisiológica e patológica. Fator de crescimento dos nervos (NGF) parece ser particularmente importante (para uma revisão, ver McMahon, 1996, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351:431-40; e Apfel, 2000, The Clinicai Journal of Pain 16:S7-S11). Tanto administração local como também sistêmica de NGF mostraram elicitar hiperalgesia e alodinia (Lewin et al., 1994, Eur. J Neurosci. 6:1903-1912). Infusão intravenosa de NGF em humanos produz uma míalgia de corpo inteiro, enquanto que administração local evoca alodinia e hiperalgesia no sítio de injeção adicionalmente aos efeitos sistêmicos (Apfel et al, 1998, Neurology 51:695-702). Também há evidência considerável que implica NGF endógeno em condições em que dor é uma característica proeminente. Por exemplo, NGF é regulado para cima em células de Schwann do gânglio de raiz dorsal (DRG, dorsal root ganglion) durante pelo menos 2 meses após lesão de nervos periféricos e níveis incrementados foram reportados nas juntas de animais que sofrem de uma variedade de modelos de artrite (por exemplo, Aloe et al, 1993, Growth Factors 9:149-155). Em humanos, níveis de NGF são elevados em fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóide ou outros tipos de artrite (por exemplo, Aloe et aí, 1992, Arthritis and Rheumatism 35:351355). Além disso, demonstrou-se que antagonismo da função de NGF previne hiperalgesia e alodinia em modelos de dor inflamatória crônica e neuropática. Por exemplo, em modelos animais de dor neuropática (por exemplo ligação de nervos espinhais ou tronco nervoso) a injeção sistêmica de anticorpos neutralizadores do NGF previne tanto alodinia como também hiperalgesia (Ramer et al, 1999, Eur. J. Neurosci. 11:837-846; e Ro et al, 1999, Pain 79:265-274). Exemplos de anticorpos anti-NGF conhecidos na técnica incluem, por exemplo, Publicações PCT nums. WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458, e WO 2004/032870; patentes U.S. nums. 5,844,092, 5,877,016, e 6,153,189; Hongo et al., 2000, Hybridoma 19:215-227; Hongo et al., 1993, Cell. Mol. Biol. 13:559-568; e números de acesso GenBank U39608, U39609, L17078, ou L17077.

Claramente, há uma necessidade de tratamentos novos seguros e efetivos para dor, particularmente objetivando-se mediadores de moléculas pequenas ou exacerbadores de dor, como NGF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona anticorpos monoclonais humanos inéditos que são terapeuticamente úteis para administrar dor. Particularmente, a invenção proporciona anticorpos monoclonais que se ligam a fator de crescimento dos nervos (NGF). De preferência, os anticorpos monoclonais são anticorpos monoclonais humanos e neutralizam atividades biológicas de respostas à dor que são mediadas pelo NGF. A invenção também proporciona células que produzem, e, da forma mais preferível, secretam em meio de cultura de células os anticorpos monoclonais da invenção. Adicionalmente a seu uso para tratar e administrar dor, os anticorpos da invenção são úteis para tratar respostas neuropáticas e inflamatórias relacionadas com dor. A invenção proporciona adicionalmente proteínas de choque por calor de fusão compreendendo a seqüência de uma região de anticorpo Fc e uma ou mais seqüências identificadas como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NOs: 79-130. Referidas moléculas podem ser preparadas usando-se métodos como descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação n° WO 00/24782, que é incorporada aqui por referência. Referidas moléculas podem ser expressas, por exemplo, em células mamíferas (por exemplo células de ovário de hamster chinês) ou células bacterianas (por exemplo células de E. coli).

Em determinados aspectos, a invenção proporciona anticorpos, de preferência, anticorpos monoclonais, sendo o mais preferível anticorpos humanos e anticorpos humanos monoclonais, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma e a região variável da cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. De preferência, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 4.

Em determinados aspectos, a invenção proporciona anticorpos, de preferência, anticorpos humanos, e, mais preferivelmente, anticorpos monoclonais, sendo o mais preferível anticorpos humanos monoclonais, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de regiões constantes de cadeia pesada de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE ou ou qualquer variação alélica das mesmas (como discutido em Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinto edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), incluído aqui por referência, e a região variável da cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. De preferência, um anticoipo da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de IgG2 como apresentado na SEQ ID NO: 4 ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinados aspectos, a invenção proporciona anticorpos, de preferência, anticorpos humanos, e, mais preferivelmente, anticorpos monoclonais, sendo o mais preferível anticorpos humanos monoclonais, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 8 ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma e a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 12, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinados aspectos, anticorpos da invenção compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a região variável da cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. Em outros aspectos, a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 12, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. Em aspectos adicionais, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 20, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. Em outros aspectos adicionais, a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma de SEQ ID NO: 16, 20, 24, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. A invenção também proporciona anticorpos que se ligam especificamente ao NGF, sendo que a cadeia pesada compreende uma região variável compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e a cadeia leve compreende uma região variável compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 12, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. A invenção proporciona adicionalmente anticorpos humanos isolados que se ligam especifícamente ao NGF, sendo que os anticorpos compreendem: (a) uma cadeia pesada apresentando uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 79, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve apresentando uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 80, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; (b) uma cadeia pesada apresentando uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 81, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve apresentando uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 82, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; (c) uma cadeia pesada apresentando uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 83, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve apresentando uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO; 84, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou (d) uma cadeia pesada apresentando uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 86, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve apresentando uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 87, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinados aspectos, a invenção também proporciona anticorpos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada, e sendo que a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência que apresenta pelo menos 75%, de preferência, 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e, o mais preferivelmente, cerca de 99%, de identidade com a seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, e sendo que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, e sendo que a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência que apresenta pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e, o mais preferivelmente, cerca de 99%, de identidade com a seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQID NO: 12, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao NGF. A invenção também proporciona anticorpos que se ligam especificamente ao NGF, sendo que a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 14 ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 16, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinados aspectos, a invenção proporciona anticorpos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada, e sendo que a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência que apresenta pelo menos 75%, de preferência, 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e, o mais preferivelmente, cerca de 99%, de identidade com a seqüência de aminoácidos, como apresentado em qualquer uma de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 22, e sendo que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve, e sendo que a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que apresenta pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e, o mais preferivelmente, cerca de 99%, de identidade com a seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 16, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao NGF. A invenção também proporciona anticorpos de cadeia simples, anticorpos Fv de cadeia simples, anticorpos F(ab), anticorpos F(ab)' e anticorpos (Fab1^.

Em aspectos particular, a invenção proporciona a cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado na SEQID NO: 16, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Adicionalmente, a invenção proporciona uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado em qualquer uma de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 22, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. A invenção também se refere a anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a NGF, sendo que o anticorpo compreende: (a) regiões de estrutura de cadeia pesada humanas, uma região CDR1 de cadeia pesada humanas, uma região CDR2 de cadeia pesada humana, e uma região CDR3 de cadeia pesada humana; e (b) regiões de estrutura de cadeia leve humanas, uma região CDR1 de cadeia leve humana, uma região CDR2 de cadeia leve humana, e uma região CDR3 de cadeia leve humana. Em determinados aspectos, a região CDR1 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR1 de cadeia pesada do anticorpo monoclonal (mAb) denominada 4D4 como mostrado na SEQ ID NO:22 e a região CDR1 de cadeia leve humana pode ser a região de cadeia leve CDR1 do mAb 4D4 como mostrado na SEQ ID NO:24. Em outros aspectos, a região CDR2 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR2 de cadeia pesada de mAb 4D4 como mostrado na SEQ ID NO: 18 e a região CDR2 de cadeia leve humana pode ser a região CDR2 de cadeia leve mAb 4D4 como mostrado na SEQ ID NO:20. Em outros aspectos adicionais, a região CDR3 de cadeia pesada humana é a região CDR3 de cadeia pesada de mAb 4D4 como mostrado na SEQID NO: 14, e a região CDR3 de cadeia leve humana é a região CDR3 de cadeia leve de mAb 4D4 como mostrado na SEQ ID NO: 16. A invenção também proporciona anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a fator de crescimento dos nervos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, ou SEQ ID NO: 87, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma. A invenção proporciona adicionalmente anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a NGF, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO; 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, ou SEQ ID NO: 131, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Os anticorpos da invenção são caracterizados pela capacidade de antagonizarem pelo menos uma atividade in vitro e/ou in vivo associada com polipeptídeos de NGF. De preferência, a invenção proporciona anticorpos humanos de NGF anti-humano isolados com ligação de alta afinidade com polipeptídeos de NGF, sendo que os anticorpos ligam-se a um polipeptídeo de NGF humano e dissociam-se do polipeptídeo de NGF humano com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 50 x 10'12 M ou menos, conforme determinado usando KinExA, ou que apresentam sobrevida induzida com NGF em um ensaio de neutralização in vitro com uma IC50 de 0 cerca de 1 x 10' M ou menos.

Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo humano de NGF anti-humano isolado que apresenta as seguintes características: a) inibe sobrevida induzida com NGF em um ensaio de neutralização in vitro com uma IC50 de cerca de 1 x 10'9 M ou menos; b) apresenta uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14; e c) apresenta uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. A invenção também proporciona anticorpos humanos isolados ou um fragmentos de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma que se liga especificamente ao NGF com alta afinidade, sendo que referidos anticorpos ou fragmentos dissociam-se de um polipeptídeo de NGF humano com uma KD de cerca de 1 x 10'9 ou menos e neutraliza bioatividade de NGF humano em um ensaio in vitro Q convencional com uma IC5o de cerca de 1 x 10' M ou menos, e sendo que os anticorpos ou fragmentos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo: a) uma região CDRI compreendendo uma seqüência de aminoácidos da fórmula: em que: a1 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; a2 é um radical de aminoácido aromático; a3 é um radical de aminoácido aromático, hidrofóbico polar, alifático; a4 é um radical de aminoácido alifático ou hidrofóbico neutro; e a5 é um radical de aminoácido hidrofílico polar ou alifático; b) uma região CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da fórmula: em que: b1 é um radical de aminoácido aromático, hidrofílico polar, η O alifático; b é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático; b é um radical de aminoácido aromático ou hidrofílico polar; b4 é um radical de aminoácido aromático, hidrofóbico ou hidrofílico polar; b -b são independentemente radicais de aminoácídos alifáticos ou hidrofílicos polares; b10 é um radical de aminoácido alifático, aromático ou hidrofílico polar; b11 é um radical de 1 Λ aminoácido hidrofóbico ou aromático; b é um radical de aminoácido hidrofílico polar ou hidrofóbico alifático; b13 é um radical de aminoácido hidrofílico polar, hidrofóbico alifático; b!4 e b16 são índependentemente radicais de aminoácídos hidrofílicos polares; b15 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou alifático; e b17 é um radical de aminoácido ácido alifático; e c) uma região CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da fórmula: em que: 1 c está ausente ou [é] um radical de aminoácido alifático; c está ausente ou [é] um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou hidrofílico polar; c3 e c4 são independentemente ausentes ou um radicais de aminoácidos alifáticos, hidrofóbicos aromáticos ou hidrofílicos polares; c5 está ausente ou [é] um radical de aminoácido alifático ou hidrofílico polar; c6 está ausente ou [é] um radical de aminoácido alifático ou hidrofílico polar; c7 é um radical de aminoácido alifático ou hidrofílico polar; c8 é um radical de aminoácido hidrofóbico, hidrofílico polar; c9 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou um alifático, hidrofílico; c10 um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou um hidrofóbico alifático, hidrofílico polar; c11 - c13 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofóbicos aromáticos ou hidrofílicos polares; c14 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou alifático; c15 é um radical de amínoácido hidrofóbico neutro ou hidrofílico polar; c16 está ausente ou [é] um radical de aminoácido hidrofílico polar; e c17 é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático ou hidrofóbico aromático.

Em um aspecto, a1 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; a é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático; a é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático; a4 é um hidrofóbico neutro; a5 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; b1 é um radical de aminoácido aromático ou alifático; b2 é Ile; b3 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; b4 é um radical de aminoácido aromático ou hidrofílico polar; b5-b9 são independentemente radicais de aminoácidos alifáticos ou hidrofílicos polares; b10 é um radical de aminoácido alifático; b11 é Tyr; b12 é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático; b13 é um radical de aminoácido hidrofílico polar ou alifático; b14 e b16 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofílicos polares; e b15 é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático; b17 é um radical de aminoácido ácido alifático; c1 está ausente ou [é] um radical de aminoácido alifático; c2 está ausente ou [é] um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou hidrofílico polar; c3 e c4 são independentemente ausentes ou um radicais de aminoácidos alifáticos, hidrofóbicos aromáticos ou hidrofílicos polares; c está ausente ou [é] um radical de aminoácido hidrofílico polar; c6 está ausente ou [é] um radical de n aminoácido alifático ou hidrofílico polar; c é um radical de aminoácido alifático ou hidrofílico polar; cs é um radical de aminoácido hidrofóbico, hidrofílico polar; c9 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou um alifático, hidrofílico; c10 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou um hidrofóbico alifático, hidrofílico polar; c - c são independentemente radicais de aminoácidos hidrofóbicos aromáticos ou hidrofílicos polares; c14 é um radical de aminoácido hidrofóbico aromático ou alifático; c15 é um radical de aminoácido hidrofóbico neutro ou hidrofílico polar; c16 está ausente ou [é] ura radical de aminoácído hidrofilico polar; e c17 é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático ou hidrofóbico aromático.

Em um aspecto particular, a1 é Ser, Asp, ou Thr; a2 é Tyr; a3 é Ala, Ser, Trp, ou Gly; a4 é Met ou Ile; a5 é His, Gly, ou Asn; b1 é Tyr, Gly, Ile, ou Asp; b2 é Ile; b3 é Ser, Thr, Tyr, ou Asn; b4 é Trp, Arg, ou Pro; b5 é Ser, Asn, ou Gly; b6 é Ser, Arg, Asp, ou Gly; b7 é Ser, His, ou Gly; b8 é Ser, Ile, Asp, ou Thr; b9 é Leu, Ile, ou Thr; b10 é Gly, Lys, ou Phe; b11 é Tyr; b12 é Ala ou Ser; b13 é Asp, Gly, ou Pro; b14 é Ser; b15 é Vai ou Phe; b16 e Lys ou Gin; b17 é Gly; c1 está ausente ou [é] um radical de aminoácido alifático; c2 está ausente ou [é] Tyr; c3 e c4 estão independentemente ausentes, Tyr, Asn, Vai, ou Glu; c5 está ausente, é Ser, Gly, ou Trp; c6 está ausente, é Ser, Gly, Glu, ou Leu; c7 é Gly, Arg, ou Asp; c8 é Trp, Pro, Ser, ou Thr; c9 é His, Gly, ou Tyr; c10 é Vai, Tyr, ou Arg; c11 - c13 são independentemente Ser, Phe, Tyr, Asp, ou Asn; c14 é Phe, Vai, ou Gly; cts é Met ou Asp;; c16 está ausente é Asp, ou Asn; e c17 é Tyr ou Vai.

Em outro aspecto particular, a é Ser ou Asp; a é Tyr; a é Ala ou Ser; a4 é Met ou Ile; a5 é His ou Asn; b1 é Tyr ou Gly; b2 é Ile; b3 é Ser, Thr, Tyr, ou Asn; b4 é Trp, Arg, ou Pro; b5 é Ser ou Asn; b5 é Ser ou Arg; b7 é His ou Gly; bs é Ile ou Thr; b9 é Leu, Ile, ou Thr; b10 é Gly ou Phe; b11 é Tyr; b12 é Ala ou Ser; b13 é Asp ou Gly; b14 é Ser; b15 é Vai ou Phe; b16 é Lys ou Gin; b17 é Gly; c1 está ausente ou é Gly; c2 está ausente ou é Tyr; c3 e c4 estão independentemente ausentes, ou são Tyr, Gly, ou Vai; c5 está ausente ou é Ser; c6 é Ser ou Gly; c7 é Gly ou Arg; c8 é Trp ou Pro; c9 é His, Gly, ou Tyr; c10 é Vai ou Tyr; c11 - c13 são independentemente Ser, Tyr, Phe, ou Asp; c14 é Phe ou Vai; c15 é Met ou Asp; c16 está ausente ou é Asp; e c17 é Tyr ou Vai.

Em outros aspectos particulares: a) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQID NO: 22, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 18, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQID NO: 14; b) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 92, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 93, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 94; c) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 98, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 99, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 100; d) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 104, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 105, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 106; e) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 110, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 111, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 112; e f) a CDR1 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO:l 16, a CDR2 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de comprimento pleno tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 118. A invenção também proporciona um anticorpo humano isolado ou um fragmento de imunoglobulína de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma que se liga especificamente ao NGF, sendo que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo: a) uma região CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: em que: a1 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; a2, a11 e a12 são independentemente radicais de aminoácidos hídrofóbicos ou alifáticos; a3, a , a e a são independentemente radicais de aminoácidos hídrofóbicos, hidrofilícos polares, alifáticos; a4 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; a6 é um radical de aminoácido hidrofóbico ou alifático; a9 está ausente, ou é um radical de aminoácido hidrofílico polar ou alifático; e a10 é um radical de aminoácido hidrofóbico, aromático ou alifático; b) uma região CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: em que: b1 é um radical de aminoácido hidrofóbico, hidrofóbico polar ou alifático; b2 é um radical de aminoácido hidrofóbico ou alifático; b3 e b4 são independentemente radicais de aminoácidos hídrofóbicos, alifáticos ou hidrofilícos polares; b5 é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático ou hidrofílico polar; b6 é radical de aminoácido hidrofóbico alifático ou hidrofílico polar; e b7 é um radical de aminoácido hidrofílico polar; e c) uma região CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: em que: c1 e c2 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofílicos polares; c3 é um radical de aminoácido hidrofóbico, alifático ou hidrofílico polar; c4, c5 e é são independentemente radicais de aminoácidos hidrofóbicos, hidrofílicos polares, alifáticos; c está ausente ou é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático ou hidrofílico polar; c8 é um radical de aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico polar; e c9 é um radical de aminoácido hidrofílico polar, e sendo que referido anticorpo ou fragmento dissocia-se de um polipeptídeo de NGF humano com uma KD de cerca de 1 x 10'9 ou menos e neutraliza bioatividade de NGF humana em um ensaio in viiro convencional com uma Ic50 de cerca de 1 x 10'8 M ou menos.

Em um aspecto, a1, a3, a4, a7 e a8 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofílicos polares; a2, a6, a11 e a12 são independentemente radical de aminoácido hidrofóbico alifáticos; a5 é um radical de aminoácido alifático ou hidrofílico polar; a9 está ausente, ou é um radical de aminoácido hidrofílico polar ou alifático; a10 é um radical de aminoácido aromático ou alifático; b1 é um radical de aminoácido λ hidrofóbico, hidrofóbico polar ou alifático; b é um radical de aminoácido hidrofóbico alifático; b3, b4 e b7 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofílicos polares; b e b são independentemente radicais de aminoácidos hidrofóbicos alifáticos ou hidrofílicos polares; c1 e c2 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofílicos polares; c3 é um radical de aminoácido hidrofóbico, alifático ou hidrofílico polar; c4, c5, e c6 são independentemente radicais de aminoácidos hidrofóbicos, hidrofílicos polares, alifáticos; c está ausente ou é um radical de aminoácido hidrofóbico Ο Λ alifático; c é um radical de aminoácido hidrofóbico; e c é um radical de aminoácido hidrofílico polar.

Em um aspecto particular, a1, a3, a4, e a7 são Arg, Ser, Gin, e Ser, respectivamente; a2 é Ala; a5 é Gly ou Ser; a8 é Ser ou Ile; a9 está ausente, é Ser, ou Gly; a50 é Ala, Tyr, Trp ou Phe; b1 é Asp, Gly, Ala, ou Vai; b2 e b3 são Ala e Ser, respectivamente; b4 é Ser ou Asn; b5 é Leu ou Arg; b6 é Glu, Ala, ou Gin; b7 é Ser ou Thr; c1 e c2 são Gin; c3 é Phe, Tyr, Arg, ou Ala; c4 é Asn, Gly, ou Ser; c5 é Ser ou Asn; c6 é Tyr, Ser, Trp, ou Phe; c7 está ausente, é Pro, ou His; cs é Leu, Trp, Tyr, ou Arg; e c9 é Thr.

Em outro aspecto particular, a1, a2, a3, a4, e a7 são Arg, Ala, Ser, Gin, e Ser, respectivamente; a5 é Gly ou Ser; a8 é Ser ou Ile; a9 está ausente, é Ser, ou Gly; a é Ala ou Tyr; b é Asp ou Gly; b e b são Ala e Ser, respectivamente; b4 é Ser ou Asn; b5 é Leu ou Arg; b6 é Glu, Ala, ou Gin; b7 é Ser ou Thr; c1 e c2 are Gin; c3 é Phe, Tyr, Arg, ou Ala; c4 é Asn, Gly, ou Ser; c5 é Ser ou Asn; c6 é Tyr, Ser, Tip, ou Phe; c7 é absent, Pro, ou His; cs é Leu, Trp, Tyr, ou Arg; e c9 é Thr.

Em outros aspectos particulares: a) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 24, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 20, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 16; b) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 95, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 96, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 97; c) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 101, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 102, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 103; d) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 107, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 108, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 109; e) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 113, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 114, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 115; f) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 119, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 120, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 121; g) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 122, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 123, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 124; h) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 125, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 126, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 127; i) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 128, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 129, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ IDNO: 130; e j) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 132, a CDR2 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQID NO: 133, e a CDR3 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 134.

Também fazem parte da invenção seqüências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos humanos de NGF anti-humano inéditos, vetores compreendendo as seqüências de polinucleotídeos que codificam anticorpos humanos de NGF anti-humano, células hospedeiras transformadas com vetores que incorporam polinucleotídeos que codificar os anticorpos humanos de NGF anti-humano, formulações compreendendo anticorpos humanos de NGF anti-humano e métodos de preparar e usar os mesmos. A invenção também proporciona métodos de detectar o nível de NGF numa amostra biológica, compreendendo a etapa de contatar a amostra com um anticorpo da invenção ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Um anticorpo anti-NGF da invenção pode ser empregado em qualquer método de análise conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios tipo sandwich diretos e indiretos, ensaios de imunoprecipitação e ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA) (ver, Sola, 19S7, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. pp. 147-158, CRC Press, Inc.) para a detecção e quantificação de NGF. Os anticorpos podem ligar-se a NGF com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio que está sendo empregado.

Adicionalmente, a invenção proporciona métodos de tratar uma doença associada com produção incrementada de NGF, ou maior sensibilidade ao NGF compreendendo a etapa de administrar a um indivíduo que disto necessita uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo da invenção ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional do mesmo.

Concretizações específicas preferidas da invenção se tomarão evidentes a partir da descrição mais detalhada a seguir, e de determinadas concretizações preferidas, e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra gráficos que demonstram neutralização da atividade de NGF no bioensaio de neutralização baseado em neurônios DRG com anticorpos monoclonais 4D4 purificados do meio condicionado com hibridoma.

Figura 2 mostra gráficos que demonstram expressão de VR1 estimulada por atividade de NGF humano e neutralização da atividade de NGF nos bioensaios de neutralização baseados em neurônios do DRG com um anticorpo monoclonal anti-NGF (4D4) purificado do meio condicionado com hibridoma.

Figura 3 mostra gráficos que demonstram neutralização da atividade de NGF em bioensaios de neutralização baseados em neurônios de DRG com anticorpos monoclonais 4D4 anti-NGF recombinantes expressos transientemente quando expressos como IgGl ou IgG2 e em células desenvolvidas em uma cultura de frasco giratório (R) ou em frascos de centrifugação (S).

Figura 4 ilustra alinhamentos de seqüências de neurotrofinas. A numeração e elementos estruturais secundários acima da seqüência referem-se ao NGF humano maduro. Radicais conservados são marcados com uma esteia, e regiões com baixa homologia de seqüências são sombreadas. NGF humano é SEQID NO: 135; NGF de camundongo é SEQ ID NO: 136; BDNF é SEQ ID NO: 137; NT3 é SEQ ID NO: 138.

Figura 5 mostta alinhamento de cadeia pesada de CDR1 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 98), 6H9 (SEQ ID NO: 104), 7H2 (SEQ ID NO: 110), 4G6 (SEQ ID NO: 116), 14D11 (SEQ ID NO: 92), e 4D4 (SEQ ID NO: 22) anticorpos.

Figura 6 mostra alinhamento de cadeia pesada de CDR2 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 99), 6H9 (SEQ ID NO: 105), 7H2 (SEQ ID NO: 111), 4G6 (SEQ ID NO: 117), 14D 11 (SEQ ID NO: 93), e 4D4 (SEQ ID NO: 18).

Figura 7 mostra alinhamento de cadeia pesada de CDR3 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 100), 6H9 (SEQ ID NO: 106), 7112 (SEQ ID NO: 112), 4G6 (SEQ ID NO: 118), 14D11 (SEQ ID NO: 94), e 4D4 (SEQ ID NO: 14).

Figura 8 mostra alinhamento de cadeia leve de CDR1 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 95), 6H9 (SEQ ID NO: 107), 7H2 (SEQ ID NO: 113), 4G6a (SEQ ID NO: 119), 4G6b (SEQ ID NO: 122), 4G6c (SEQ ID NO: 125), 4Gód (SEQ ID NO: 128), 4G6e (SEQ ID NO: 132), 14D11 (SEQ ID NO: 95), e 4D4 (SEQ ID NO: 24) anticorpos (4G6a é referido em várias Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em várias Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em várias Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em várias Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em várias Figuras como 20031000528).

Figura 9 mostra alinhamento de cadeia leve de CDR2 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 96), 6H9 (SEQ ID NO: 108), 7112 (SEQ ID NO: 114), 4G6a (SEQ ID NO: 120), 4G6b (SEQ ID NO: 123), 4G6c (SEQ ID NO: 126), 4G6d (SEQ ID NO: 129), 4G6e (SEQ ID NO: 133), 14D11 (SEQ ID NO: 96), e 4D4 (SEQ ID NO: 20) (4G6a é referido em várias Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em várias Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em várias Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em várias Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em várias Figuras como 20031000528).

Figura 10 mostra alinhamento de cadeia leve de CDR3 anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 97), 6119 (SEQ ID NO: 109), 7H2 (SEQ ID NO: 115), 4G6a (SEQ ID NO: 121), 4G6b (SEQID NO: 124), 4G6c (SEQID NO: 127), 4Gód (SEQID NO: 130), 4G6e (SEQ ID NO: 134), 14D11 (SEQ ID NO: 97), e 4D4 (SEQ ID NO: 16) (4G6a é referido em várias Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em várias Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em várias Figuras como 20031071526; 4Gód é referido em várias Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em várias Figuras como 20031000528).

Figura 11 mostra alinhamento de cadeia leve anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 14D10 (SEQ ID NO: 82),6H9 (SEQ ID NO: 84),7H2 (SEQ ID NO: 86), 4G6a (SEQ ID NO: 88), 4G6b (SEQ ID NO: 89), 4G6c (SEQ ID NO: 90), 4G6d (SEQ ID NO: 91), 4G6e (SEQ ID NO: 131), 14D11 (SEQ ID NO: 80), e 4D4 (SEQ ID NO: 12) anticorpos (4G6a é referido em várias Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em várias Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em várias Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em várias Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em várias Figuras como 20031000528).

Figura 12 mostra alinhamento de cadeia pesada anti-NGF e percentual de identidade para os anticorpos 4D4 (SEQ ID NO: 10), 4G6 (SEQ ID NO: 87), 14D 10 (SEQ ID NO: 81), 14D11 (SEQ ID NO: 79), 7H2 (SEQ IDNO: 85), e 6H9 (SEQ ID NO: 83), DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS CONCRETIZAÇÕES

Os cabeçalhos da seção usados aqui são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o objeto descrito. Todas as referências indicadas neste pedidos são incorporadas aqui expressamente por referência para qualquer fim.

Definições É possível usar técnicas convencionais para síntese de oligonucleotídeos, DNA recombinante, e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). É possível usar técnicas de purificação e reações enzimáticas de acordo com especificações do fabricante, ou de forma comumente realizada na técnica, ou como descrito aqui. As técnicas e procedimentos precedentes podem ser realizados geralmente de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são indicadas e discutidas na presente descrição. Ver por exemplo, Sambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que é incorporado aqui por referência para qualquer fim. A não ser que sejam fornecidas definições específicas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintéticas, e química medicinal e farmacêutica descrita aqui são todos bem conhecidos e comumente usados na técnica. De maneira análoga, é possível usar técnicas convencionais para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação, e fornecimento farmacêutico, e tratamento de pacientes.

Como utilizado de acordo com a presente descrição, os termos a seguir, exceto se indicados de outra forma, devem ser compreendidos como apresentando os significados a seguir: As expressões "propriedade biológica", "característica biológica", e o termo "atividade" com referência a um anticorpo da presente invenção são usados intercambiavelmente aqui e incluem, embora sem limitação, especificidade e afinidade por epítopo (por exemplo, ligação de anticorpo humano de NGF anti-humano com NGF humano), capacidade de antagonizar a atividade do polipeptídeo objetivado (por exemplo, atividade de NGF), a estabilidade in vivo do anticorpo, e as propriedades imunogênicas do anticorpo. Outras propriedades ou características biológicas identificáveis de um anticorpo reconhecido na técnica incluem, por exemplo, reatividade cruzada, (isto é, com homólogos não-humanos do polipeptídeo objetivado, ou com outras proteínas ou tecidos, geralmente), e capacidade de conservar altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas. As propriedades ou características previamente indicadas podem ser observadas ou medidas usando-se técnicas reconhecidas na técnica incluindo, embora sem limitação, ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo (por exemplo, Exemplo 2), e imuno-histoquímica com seções de tecidos de fontes diferentes, incluindo humano, de primata, ou qualquer outra fonte, conforme necessário. Atividades particulares e propriedades biológicas de anticorpos humanos de NGF anti-humano são descritos mais detalhadamente nos Exemplos abaixo. O termo "polinucleotídeo isolado" como usado aqui deve significar um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA, ou origem sintética ou alguma combinação destas, sendo que, em virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado (1) não é associado com todo um polinucleotídeo, ou com uma porção do mesmo, em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é ligado a um polinucleotídeo ao qual o mesmo não é ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. O termo "proteína isolada" como referido aqui significa que uma proteína objeto (1) é isenta de pelo menos algumas outras proteínas com que ela poderia ser encontrada normalmente, (2) é essencialmente isenta de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros materiais com os quais é associado na natureza, (5) não é associada (por meio de interação covalente ou não-covalente) com porções de uma proteína com que a "proteína isolada" encontra-se associada na natureza, (6) é associada operacionalmente (por meio de interação covalente ou não-covalente) com um polipeptídeo com que não é associada na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Uma proteína isolada do tipo referido pode ser codificada por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação destes. De preferência, a proteína isolada é substancialmente isenta de proteínas ou polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural e que poderíam interferir com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, de pesquisa ou de outro tipo).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderíam interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso de anticorpo, como determinado por meio do método de Lowry, e, o mais preferivelmente, a mais de 99% em peso, (2) em um grau suficiente para se obter pelo menos 15 radicais de seqüência de aminoácido N-terminal ou interno por meio do uso de um seqüenciador de recipiente giratório, ou (3) até a homogeneidade por meio de SDS-PAGE em condições de redução ou não-redução usando azul de Coomassie ou, de preferência, manchamento com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes porque pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente.

Os termos "polipeptídeo" ou "proteína" significa moléculas apresentando a seqüência de proteínas nativas, ou seja, proteínas produzidas por meio de células naturalmente ocorrentes e, especificamente, não-recombinantes, ou células manipuladas geneticamente ou recombinantes, e compreendem moléculas apresentando a seqüência de aminoácidos da proteína nativa, ou moléculas apresentando deleções de, adições a, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da seqüência nativa. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" abrangem especificamente anticorpos anti-NGF, ou seqüências que apresentam deleções de, adições a, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-NGF. O termo "fragmento de polipeptídeo" refere-se a um polipeptídeo que apresenta uma deleção amino-terminal, uma deleção carboxila-terminal, e/ou uma deleção interna. Em determinadas concretizações, fragmentos têm comprimentos de pelo menos 5 a cerca de 500 aminoácidos. Deve-se considerar que, em determinadas concretizações, fragmentos têm comprimentos de pelo menos 5,6, 8, 10, 14, 20, 50, 70,100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos. Fragmentos de polipeptídeos particularmente úteis incluem domínios funcionais, incluindo domínios de ligação. No caso de ,um anticorpo anti-NGF, fragmentos úteis incluem, embora sem limitação, uma região CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, uma porção de uma cadeia de anticorpo ou apenas sua região variável incluindo duas CDRs, e análogos. O termo "agente de ligação específica" refere-se a uma molécula natural ou não-natural que se liga especificamente a um alvo. Exemplos de agentes de ligação específicos incluem, embora sem limitação, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, e lipídeos. Em determinadas concretizações, um agente de ligação específicos é um anticorpo. O termo "agente de ligação específico ao NGF" refere-se a um agente de ligação específico que se liga especificamente a qualquer porção do NGF. Em determinadas concretizações, um agente de ligação específica ao NGF é um anticorpo que se liga especificamente ao NGF. O termo "fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional" como usado aqui refere-se a um fragmento de polipeptídeo que contém pelo menos as CDRs das cadeias pesada e leve da imunoglobulina. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção é capaz de ligar-se a um antígeno. Em concretizações preferidas, o antígeno é um ligante que se liga especificamente a um receptor. Nestas concretizações, a ligação de um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção previne a ligação do ligante a seu receptor, interrompendo a resposta biológica resultante de ligação de ligante ao receptor. De preferência, um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção liga-se especificamente ao NGF. Da forma mais preferível, o fragmento liga-se especificamente a NGF humano. O termo "naturalmente ocorrente" como usado aqui e aplicada a um objeto refere-se ao fato de que o objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não modificado intencionalmente pelo Homem é naturalmente ocorrente. O termo "ligado operacionalmente" significa que os componentes aos quais o termo é aplicado encontram-se numa relação que lhes permite realizar suas funções inerentes em condições vantajosas. Por exemplo, uma seqüência de controle seqüência "ligada operacionalmente" a uma seqüência codificante de proteína é ligada à mesma de tal forma que a expressão da seqüência codificante de proteína é obtida em condições compatíveis com a atividade transcricional das seqüências de controle. O termo "seqüência de controle" como usado aqui refere-se a seqüências de polinucleotídeos que podem efetuar expressão, processamento ou localização intracelular de seqüências codificantes às quais estão ligadas. A natureza de seqüências de controle do tipo referido pode depender do organismo hospedeiro. Em concretizações particulares, seqüências de controle para procariontes podem incluir um promotor, sítio de ligação ribossômico, e seqüência de terminação de transcrição. Em outras concretizações particulares, seqüências de controle para eucariontes podem incluir promotores compreendendo um ou uma pluralidade de sítios de reconhecimento para fatores de transcrição, seqüências incrementadoras de transcrição, seqüências de terminação de transcrição e seqüências de poliadenilação. Em determinadas concretizações, "seqüências de controle" podem incluir seqüências líderes e/ou seqüências de parceiro de fusão. O termo "polinucleotídeo" como referido aqui significa polímeros de ácido nucleico de filamento simples ou de filamento duplo com um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos. Em determinadas concretizações, os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Referidas modificações incluem modificações de base, como bromuridina, modificações de ribose, como arabinoside e 2',3'-dídesoxírríbose e modificações de ligação de intemucleotídeos, como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilídato e fosforoamidato. O termo "polinucleotídeo" inclui especificamente formas de DNA de filamento simples e duplo. O termo "oligonucleotídeo" referido aqui inclui nucleotídeos naturalmente ocorrentes, e modificados, ligados entre si por meio de ligações de oligonucleotídeos naturalmente ocorrentes e/ou não-naturalmente ocorrentes. Oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeos compreendendo membros que são geralmente de filamento simples e que apresentam um comprimento de 200 nucleotídeos ou menos. Em determinadas concretizações, oligonucleotídeos apresentam comprimentos de 10 a 60 nucleotídeos, Em determinadas concretizações, oligonucleotídeos têm comprimentos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou de 20 a 40 nucleotídeos. Oligonucleotídeos podem ser de filamento simples ou de filamento duplo, por exemplo para uso na construção de um mutante genético. Oligonucleotídeos da invenção podem ser oligonucleotídeos de sentido ou anti-sentido com referência à seqüêncía codificante de proteína. O termo "nucleotídeos naturalmente ocorrentes" inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" inclui nucleotídeos com grupos açúcar modificados ou substituídos e análogos. O termo "ligações de oligonucleotídeos" inclui ligações de oligonucleotídeos, como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato, e análogos. Ver, por exemplo, LaPlanche et al, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al, 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al, patente U.S. n° 5,151,510; Uhlmann e Peyman, 1990, Chemical Revíews, 90:543, cujas revelações são incorporadas aqui por referência para quaisquer fins. Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador detectável para permitir detecção do oligonucleotídeo ou hibridação do mesmo. O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico com o qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que é possível ligar segmentos de DNA adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor viral, onde segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos apresentando uma origem de replicação bacteriana e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não-epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira, e, com isso, são replicadas juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais são ligados operacionalmente. Referidos vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes encontram-se ffeqüentemente em forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção destina-se a incluir referidas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus defectivos para replicação, adenovírus e víms adeno-associados), que servem a funções equivalentes. A expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") inclui uma célula em que se introduziu um vetor de expressão recombinante. Aqueles com prática na técnica haverão de compreender que referidos termos destinam-se a referir não só à célula objeto particular, mas à progênie de uma célula do tipo referido. Porque determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutação ou a influências ambientais, referida progênie pode, efetivamente, não ser idêntica à célula parental. mas ainda assim são incluídas na r abrangência do termo "célula hospedeira" como usado aqui. E possível usar uma ampla variedade de sistemas de expressão de hospedeiro para expressar os anticorpos da presente invenção, incluindo sistemas bacterianos, de levedura, baculovirais e mamíferos (e também sistemas de expressão de apresentação de fago). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano vantajoso é pUC 19. Para expressar um anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinante portando fragmentos de DNA que codificam as cadeias leve e pesada de imunoglobulina do anticorpo, de tal forma que as cadeias são expressas na célula hospedeira e, de preferência, secretadas no meio em que as células hospedeiras são cultivadas, de cujo meio os anticorpos podem ser recuperados. Usa-se metodologias convencionais de DNA recombinante para se obter genes de cadeia pesada e leve de anticorpo, incorporando-se estes genes em vetores de expressão recombinantes e introduzindo-se os vetores em células hospedeiras, como descrito em Sambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, FM. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) e na patente U.S. n° 4,816,397 para Boss et al. O termo "célula hospedeira" é usado para referir a uma célula que foi transformada, ou que pode ser transformada com uma sequência de ácido nucleico e, depois, expressar um gene de interesse selecionado. O termo inclui a progênie da célula parental, quer ou não a progênie tenha morfologia idêntica ou constituição genética idêntica ao parental original, desde que o gene selecionado esteja presente, O termo "transdução" é usado para se referir à transferência de genes de uma bactéria para outra, usualmente por meio de um fago. "Transdução" também se refere à aquisição e transferência de seqüências celulares eucarióticas por retrovírus. O termo "transfecção" é usado para referir à absorção de DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno foi introduzido no interior da membrana da célula. Diversas técnicas de transfecção são conhecidas na técnica e divulgadas aqui. Ver, por exemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene 13:197. Referidas técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógenas em células hospedeiras vantajosas. O termo "transformação" como usado aqui refere-se a uma alteração nas características genéticas da célula, e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um DNA inédito. Por exemplo, uma célula é transformada onde é modificada geneticamente de seu estado nativo. Após transfecção ou transdução, o DNA transformante pode recombinar-se com aquele da célula mediante integração física em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido transientemente como um elemento epissômico sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada como tendo sido transformada de forma estável quando o DNA é replicado com a divisão da célula. O termo "naturalmente ocorrente" ou "nativo" quando usado em conexão com materiais biológicos, como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras, e análogos, refere-se a materiais que são encontrados na natureza e que não são manipulados pelo Homem. De maneira análoga, "não-naturalmente ocorrente" ou "não-nativos", como usado aqui, refere-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi modificada estruturalmente ou sintetizada pelo Homem. O termo "antígeno" refere-se a uma molécula ou a uma porção de um molécula que pode ser ligada por meio de um agente de ligação seletivo, como um anticorpo, e que também pode ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação com um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode possuir um ou mais epítopos. O termo "identidade" como conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as seqüências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, conforme determinado por meio de comparação dessas seqüências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de seqüências entre moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, conforme o caso, como determinado pela equiparação entre filamentos de dois ou mais nucleotídeos ou de duas ou mais seqüências de aminoácidos. "Identidade" mede o percentual de equiparações idênticas entre a menor das duas ou mais seqüências com alinhamentos de gap (se houver) processado com um modelo matemático particular ou um programa de computador (isto é, "algoritmos"). O termo "similaridade" é usado na técnica com relação ao conceito relacionado, porém, em contraste com "identidade", "similaridade" refere-se a uma medida de relacionamento, que inclui equiparações idênticas e também equiparações de substituição conservativas. Se duas sequências de polipeptídeos apresentarem, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos, e todo o restante consiste de substituições não-conservativas, então ambos os percentuais de identidade e de similaridade poderíam ser de 50%. Se, no mesmo exemplo, houverem mais cinco posições em que há substituições conservativas, então o percentual de identidade permanece em 50%, porém o percentual de similaridade seria de 75% (15/20). Portanto, em casos em que há substituições conservativas, o percentual de similaridade entre dois polipeptídeos será maior do que o percentual de identidade entre aqueles dois polipeptídeos.

Identidade e similaridade de ácidos nucleicos e polipeptídeos relacionados podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos. Referidos métodos incluem, embora sem limitação, aqueles descritos em COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Parte 1, (Griffm, A.M., e Griffm, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G, SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS INICIADOR, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J, Applied Math., 48:1073; e Durbin et al, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press. Métodos preferidos para determinar identidade são projetados para proporcionar a maior equiparação entre as seqüências testadas. Métodos para determinar identidade encontram-se descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programas de computador preferidos para se determinar a identidade entre duas seqüências incluem, porém não se limitam, ao pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al, 1984, Nucl. Acíd. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). O programa BLASTX é obtenível publicamente do National Center for Biotechnology Information (NCBÍ) e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, 1990, supra). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser usado para se determinar identidade.

Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas seqüências de aminoácidos podem resultar em equiparação de apenas uma pequena região das duas seqüências, e esta pequena região alinhada pode apresentar identidade muito alta de seqüências, embora ainda não haja relação significativa entre as duas seqüências de comprimento pleno. Assim, em determinadas concretizações, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) resultará num alinhamento que abrange pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo-alvo.

Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipeptídeos para os quais o percentual de identidade de seqüências deve ser determinado são alinhados para equiparação ótima de seus aminoácidos respectivos (a ''abrangência equiparada" [matched span], conforme determinado pelo algoritmo). Em determinadas concretizações, um gap opening penalty (que é calculado como três vezes a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação que está sendo usada; a "diagonal" é a classificação ou o número atribuído a cada equiparação perfeita de aminoácidos por meio da matriz de comparação particular) e um gap extension penalty (que é, usualmente, um décimo do gap opening penalty), e também como uma matriz de comparação, como PAM250 ou BLOSUM 62, são usados em conjunto com o algoritmo. Em determinadas concretizações, uma matriz de comparação convencional (ver Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al, 1992, Proc. Natl. Acad Sei USA, 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.

Em determinadas concretizações, os parâmetros para uma comparação de seqüências de polipeptídeos incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453; Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al, 1992, supra;

Penalidade de Intervalo: 12 Penalidade de Comprimento de Intervalo: 4 Limiar de similaridade: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em determinadas concretizações, os parâmetros previamente indicados são os parâmetros default para comparações de polipeptídeos (juntamente com nenhuma penalidade para intervalos de extremidade) usando o algoritmo GAP. O termo "homologia" refere-se ao grau de similaridade entre seqüências de proteína ou ácido nucleico. Informação de homologia é útil para a compreensão da relação genética de determinadas espécies de proteína ou ácido nucleico. É possível determinar a homologia alinhando e comparando seqüências, Tipicamente, para determinar homologia de aminoácidos, compara-se uma seqüência de proteína com um banco de dados de seqüências de proteína conhecidas. Seqüências homólogas compartilham identidades funcionais comuns em algum lugar ao longo de suas seqüências.

Usualmente, um alto grau de similaridade ou de identidade é indicativo de homologia, embora um baixo grau de similaridade ou identidade não indique necessariamente falta de homologia. É possível usar várias abordagens para comparar aminoácidos de uma seqüência com aminoácidos de outra seqüência para determinar homologia. Geralmente, as abordagens se enquadrarão em duas categorias: (1) comparação de características físicas, como polaridade, carga, e volume de Van der Waals, para gerar uma matriz de similaridade; e (2) comparação de substituição provável de um aminoácido numa seqüência por qualquer outro aminoácido, com base na observação de muitas seqüências de proteínas de proteínas homólogas conhecidas e para gerar uma Point Accepted Mutation Matrix (PAM). O percentual de identidade também pode ser calculado com o uso do programa needle (pacote EMBOSS) ou stretcher (pacote EMBOSS) ou o programa align X, como um módulo do pacote de programas vector NTI suite 9.0.0, usando os parâmetros default (por exemplo, Penalidade de Intervalo 5, Penalidade de Abertura de Intervalo 15, Penalidade de Extensão de Intervalo 6,6).

Como usado aqui, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Ver IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS, 2a edição, (E. S. Golub e D. R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991, incorporado aqui por referência para qualquer fim. Estereoisômeros (por exemplo, aminoácidos D) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não-naturais, como aminoácidos a-, a-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido láctico, e outros aminoácidos não-convencionais também podem ser componentes vantajosos para polipeptídeos da invenção. Exemplos de aminoácidos não-convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetil lisina, ε-Ν-acetil lisina, Ofosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na indicação de polipeptídeo usada aqui, a direção à mão esquerda é a direção amino-terminal e a direção à mão direita é a direção carboxila terminal, de acordo com o uso comum e a convenção.

Radicais naturalmente ocorrentes podem ser divididos em classes baseadas em propriedades comuns de cadeia lateral: 1) hidrofóbicos: norleucina (Nor), Met, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; 2) hidrofílicos polares: Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, His, Lys, Ser, Thr; 3) alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Vai, Pro; 4) hidrofóbicos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Vai, Pro; 5) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 6) ácidos: Asp, Glu; 7) básicos: His, Lys, Arg; 8) radicais que influenciam orientação da cadeia: Gly, Pro; 9) aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; e 10) hidrofóbicos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.

Substituições de aminoácidos conservativas podem envolver troca de um membro de uma destas classes por outro membro da mesma classe. Substituições conservativas de aminoácidos podem abranger radicais de aminoácidos não-naturalmente ocorrentes, que são incorporados tipicamente por meio de síntese química de peptídeos ao invés de por meio de síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de porções de aminoácidos.

Substituições não-conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Referidos radicais substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo humano que são homólogas com anticorpos não-humanos, ou nas regiões não- homólogas da molécula.

Na preparação de referidas alterações, de acordo com determinadas concretizações, pode-se considerar o índice hidropático de aminoácidos. Cada aminoácido recebeu um índice hidropático com base em suas características de hidrofobicidade e carga. São eles: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanína (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e argínina (-4,5). A importância do índice de aminoácido hidropático na conferência da função biológica interativa em uma proteína é compreendida na técnica (ver, por exemplo, Kyte et ai, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). É de conhecimento geral que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos apresentando uma classificação ou índice hidropático similar e ainda conservar uma atividade biológica similar. Na preparação de alterações baseadas no índice hidropático índice hidropático, em determinadas concretizações, inclui-se a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos se encontram dentro de ± 2. Em determinadas concretizações inclui-se aqueles que se encontram dentro de ± 1, e, em determinadas concretizações, inclui-se aqueles dentro de ± 0,5, Também se compreende na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser realizada efetívamente com base em hidrofilicidade, particularmente onde o peptídeo ou proteína biologicamente funcional criada dessa forma se destina a uso em concretizações imunológicas, como divulgado aqui. Em determinadas concretizações, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme determinada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína.

Os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos aos seguintes radicais de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4), Na preparação de alterações com base em valores de hidrofilicidade similares, em determinadas concretizações, inclui-se a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade se encontram dentro de ± 2, em determinadas concretizações, inclui-se aqueles que se encontram dentro de ± 1, e em determinadas concretizações, inclui-se aqueles que se encontram dentro de ± 0,5. Também é possível identificar epítopos de sequências de aminoácidos primários com base em hidrofilicidade. Estas regiões também são referidas como "regiões de núcleo epitópicas".

Substituições de aminoácidos exemplares são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1 Substituições de aminoácidos Um artesão versado será capaz de determinar variantes vantajosas do polipeptídeo como apresentado aqui usando-se técnicas bem conhecidas. Em determinadas concretizações, alguém versado na técnica poderá identificar áreas vantajosas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a atividade por regiões de objetivação que se acredita não serem importantes para a atividade. Em outras concretizações, a pessoa versada na técnica pode identificar radicais e porções das moléculas que são conservadas entre polipeptídeos similares. Em concretizações adicionais, mesmo áreas que podem ser importantes para atividade biológica ou para a estrutura podem ser submetidas a substituições conservativas de aminoácidos sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura do polipeptídeo.

Adicionalmente, alguém versado na técnica é capaz de rever estudos de estrutura-função identificando radicais em polipeptídeos similares que são importantes para atividade ou estrutura. Considerando uma comparação do tipo referido, a pessoa versada na técnica poderá predizer a importância de radicais de aminoácidos em uma proteína que correspondem aos radicais de aminoácidos importantes para atividade ou estrutura em proteínas similares. Alguém versado na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente similares para referidos radicais de aminoácidos preditos como importantes.

Alguém versado na técnica também poderá analisar a estrutura tridimensional e seqüência de aminoácidos com relação àquela estrutura em polipeptídeos similares, Considerando informação do tipo referido, alguém versado na técnica pode predizer o alinhamento de radicais de aminoácidos de um anticorpo com respeito a sua estrutura tridimensional. Em determinadas concretizações, alguém versado na técnica poderá selecionar não realizar alterações incisivas nos radicais de aminoácidos preditos como se encontrando na superfície da proteína, porque referidos radicais podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, alguém versado na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma substituição de aminoácido simples em cada radical de aminoácido desejado. As variantes de teste podem então ser selecionadas usando-se ensaios de atividade conhecidos por aqueles versados na técnica. Referidas variantes poderíam ser usadas para coletar informação acerca de variantes vantajosas. Por exemplo, se alguém descobrir que uma alteração em um radical de aminoácido particular resultou em atividade destruída, indesejavelmente reduzida, ou inadequada, é possível evitar uma alteração do tipo referido. Em outras palavras, com base na informação coletada de referidos experimentos de rotina alguém versado na técnica poderá determinar com facilidade os aminoácidos onde substituições adicionais poderíam ser evitadas sozinhas ou em combinação com outras mutações.

Devotou-se uma quantidade de publicações científicas à predição de estrutura secundária. Ver Moult, 1996, Curr, Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al, 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry U3:211-222; Chou et al, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol 47:45-148; Chou et al, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; e Chou et al, 1979, Biophys. J. 26:367-384, Além disso, há correntemente programas de computador disponíveis para auxiliar na predição de estrutura secundária. Um método de predizer estrutura secundária baseia-se em modelagem de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que apresentam uma identidade de sequências superior a 30%, ou similaridade superior a 40% frequentemente apresentam topologias estruturais similares. O crescimento recente do banco de dados estrutural de proteínas (sigla em inglês: PDB) proporcionou maior previsibilidade de estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras na estrutura de um polipeptídeo ou proteína. Ver Hohn et al, 1999, Nucl. Acid, Res. 27:244-247. Sugeriu-se (Brenner et al, 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que há um número limitado de dobras em um dado polipeptídeo ou proteína e que, uma vez determinado um número crítico de estruturas, a predição estrutural se tomará drasticamente mais precisa. Métodos adicionais de predizer estrutura secundária incluem "threading [enfiamento]" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al, 1996, Structure 4:15-19), "análise do perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159: Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. 84:4355-4358), e "evolutionary íinkage/ligação evolucionária" (Ver Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).

Em determinadas concretizações, variantes de anticorpo incluem variantes de variantes de glicosilação em que o número e/ou tipo de sítio de glicosilação foi alterado em comparação com as sequências de aminoácidos do polipeptídeo parental. Em determinadas concretizações, variantes de proteína compreendem um número maior ou menor de sítios de glicosilação ligados com N do que a proteína nativa. Um sítio de glicosilação ligado com N é caracterizado pela seqüência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, sendo que o radical de aminoácido designado como X pode ser qualquer radical de aminoácido exceto prolina. A substituição de radicais de aminoácidos para criar esta seqüência proporciona um sítio novo potencial para a adição de uma cadeia de carboidrato ligada com N. Altemativamente, substituições que eliminam esta seqüência removerão uma cadeia de carboidrato ligada com N existente. Proporciona-se também um rearranjo de cadeias de carboidrato ligadas com N sendo que um ou mais sítios de glicosilação ligados com N (tipicamente aqueles que são naturalmente ocorrentes) são eliminados, e cria-se um ou mais sítios ligados com N novos. Variantes de anticorpo preferidas adicionais incluem variantes de cisteína em que um mais radicais cisteína são deletados de, ou substituídos por, outro aminoácido (por exemplo, serina) em comparação com a seqüência de aminoácidos parental. Variantes de cisteína podem ser úteis quando anticorpos precisam ser redobradas em um conformação biologicamente ativa, como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Variantes de cisteína apresentam geralmente menos radicais cisteína do que a proteína nativa, e apresentam tipicamente um número par para minimizar interações que resultam de cisteínas não-pareadas.

Em concretizações adicionais, variantes de anticorpo podem incluir anticorpos compreendendo um fragmento Fc modificado ou uma região constante de cadeia pesada modificada. Um fragmento Fc, que representa "fragmento que cristaliza", ou uma região constante de cadeia pesada pode ser modificada por meio de mutação para conferir em um anticorpo características de ligação alteradas. Ver, por exemplo, Burton e Woof, 1992, Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch e Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol, 19: 275-90; Shields et al, 2001, Journal of Biol. Chem. 276: 6591-6604; Telleman e Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; todo estes incorporados aqui por referência). Referidas mutações podem incluir substituições, adições, deleções, ou qualquer combinação destas, e são produzidas tipicamente por meio de mutagênese direcionada para sítio usando-se um ou mais oligonucleotídeo(s) mutagênicos de acordo com métodos aqui descritos, e também de acordo com métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, 3a Ed„ 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. e Berger e Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA., que são incorporados aqui por referência).

De acordo com determinadas concretizações, substituições de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem suscetibilidade a proteólise, (2) reduzem suscetibilidade à oxidação, (3) alteram afinidade de ligação por complexos de proteína em formação, (4) alteram afinidades de ligação, e/ou (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais em polipeptídeos do tipo referido. De acordo com determinadas concretizações, é possível realizar substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas concretizações, substituições conservatívas de aminoácidos) na seqüência naturalmente ocorrente (em determinadas concretizações, na porção do polipeptídeo fora do(s) domínío(s) formando contatos intermoleculares). Em concretizações preferidas, tipicamente uma substituição de aminoácidos conservativa não altera substancialmente as características estruturais da seqüência parental (por exemplo, um aminoácido de substituição não deveria tender a quebrar uma hélice que ocorre na seqüência parental, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência parental). Exemplos estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidas na técnica encontram descritas em PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman e Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden e J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; e Thomton ei al, 1991, Nature 354:105, cada um destes são incorporados aqui por referência.

Análogos de peptídeos são usados comumente na indústria farmacêutica como drogas não-peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo-modelo. Estes tipos de composto não-peptídico são denominados "miméticos de peptídeos" ou "peptidomiméticos". Ver Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392; e Evans et al,. 1987, J. Med. Chem. 30:1229, que são incorporados aqui por referência para qualquer fim. Referidos compostos são freqüentemente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. É possível usar miméticos de peptídeos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar. Geralmente peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo de paradigma (isto é, um polipeptídeo que apresenta propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), como anticorpo humano, mas apresentam uma ou mais ligações de peptídeos opcíonalmente substituídos por uma ligação selecionada de: - CHrNH-, -CH2-S-, -CHrCHr, -CH=CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Substituição esquemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consensus com um aminoácido D do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) pode ser usada em determinadas concretizações para gerar peptídeos mais estáveis. Adicionalmente, peptídeos constrangidos compreendendo uma seqüência de consensus ou uma variação de seqüência de consensus substancialmente idêntica podem ser gerados por meio de métodos conhecidos na técnica (Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387, incorporado aqui por referência para qualquer fim); por exemplo, por meio de adição de radicais cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que ciclízaem o peptídeo. "Anticorpo" ou "peptídeo(s) de anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação do mesmo que compete com o anticorpo intacto por ligação específica. Em determinadas concretizações, fragmentos de ligação são produzidos por meio de técnicas de DNA recombinante. Em concretizações adicionais, fragmentos de ligação são produzidos por meio de divagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Fragmentos de ligação incluem, embora sem limitação aos mesmos, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, e anticorpos de cadeia simples. O termo "cadeia pesada" inclui qualquer polipeptídeo de imunoglobulina apresentando suficiente seqüência de região variável para conferir especificidade para NGF. O termo "cadeia leve" inclui qualquer polipeptídeo de imunoglobulina apresentando suficiente seqüência de região variável para conferir especificidade para NGF. Uma cadeia pesada de comprimento pleno inclui uma domínio de região variável, VH, e três domínios de região constante, CH1, CH2, e Ch3. O domínio Vh encontra-se na ponta amino do polipeptídeo, e o domínio CH3 encontra-se na ponta carboxila. O termo "cadeia pesada", como usado aqui, compreende uma cadeia pesada de comprimento pleno de fragmentos da mesma. Uma cadeia leve de comprimento pleno inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. Como a cadeia pesada, o domínio de região variável da cadeia leve encontra-se na ponta amino do polipeptídeo. O termo "cadeia leve", como usado aqui, compreende uma cadeia leve de comprimento pleno e fragmentos da mesma. Um fragmento F(ab) constitui-se de uma cadeia leve e o ChI e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula de F(ab) não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada. Um fragmento F(ab') contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CHI e CH2, de tal forma que é possível formar uma ligação dissulfeto intercadeias entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula de F(ab')2. A região Fv compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, porém não apresenta as regiões constantes. Anticorpos de cadeia simples são moléculas de Fv em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada foram conectadas por meio de um ligante flexível formando uma única cadeia de polipeptídeo, que forma uma região de ligação de antígeno. Anticorpos de cadeia simples são discutidos detalhadamente na Publicação de Patente Internacional n° WO 88/01649 e patentes U.S. nums. 4,946,778 e 5,260,203.

Em determinadas concretizações compreende-se que um anticorpo divalente, diferentemente de um anticorpo "multiespecífico" ou "multifuncional", compreende sítios de ligação apresentando especificidade antigênica idêntica.

Na avaliação da ligação e especificidade de anticorpo de acordo com a invenção, um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um ligante a um receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de ligante ligada ao receptor em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, ou mais (conforme medido, inter alia, usando-se um ensaio de ligação competitiva in vitro).

Por "anticorpo neutralizador" compreende-se uma molécula de anticorpo que é capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma função efetuadora de um antígeno-alvo ao qual se liga. Assim, um anticorpo "neutralizador" anti NGF é capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma função efetuadora, como ligação de receptor e/ou elicitação de uma resposta celular, de NGF. "Reduzir substancialmente" deve significar uma redução de pelo menos cerca de 60%, de preferência, pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85%, sendo o mais preferível pelo menos cerca de 90% de uma função efetuadora do antígeno-alvo (por exemplo, NGF humano). O termo "epítopo" inclui qualquer determinante, de preferência, um determinantes de polipeptídeo, capaz de ligação específica com uma imunoglobulina ou receptor de células T. Em determinadas concretizações, determinantes de epítopo incluem grupamentos de moléculas com superfície quimicamente ativa of moléculas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila, ou grupos sulfonila, e, em determinadas concretizações, podem apresentar características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específica. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Em determinadas concretizações, diz-se que um anticorpo liga-se especifícamente a um antígeno quando ele reconhece preferencialmente seu antígeno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em concretizações preferidas, diz-se que um anticorpo liga-se especifícamente a um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio é de <10's M, mais preferivelmente quando a constante de dissociação de equilíbrio é de <10'9 M, e, o mais preferivelmente, quando a constante de dissociação é de <10'10 M.

Um anticorpo liga-se "essencialmente ao mesmo epítopo" como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou que se superpõem estericamente. Os métodos mais amplamente usados e rápidos para determinação de se dois anticorpos se ligam a epítopos idênticos ou que superpõem estericamente são ensaios de competição, que podem ser configurados em qualquer número de formatos diferentes, usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Usualmente, o antígeno é imobilizado sobre um substrato, e a capacidade de anticorpos não-marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados é medida usando-se marcadores radioativos ou de enzima. O termo "agente" é usado aqui para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato preparado de materiais biológicos.

Como usado aqui, os termos "marcador" ou "marcado" referem-se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, por meio de incorporação de um aminoácido rádio-marcado ou ligação a um polipeptídeo de porções biotina que pode ser detectado por meio de avidina marcada (por exemplo, estreptavidina compreendendo, de preferência, um marcador detectável, como um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente ou uma atividade enzimática que pode ser detectada por meio de métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas concretizações, o marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de marcar polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados vantajosamente nos métodos aqui divulgados. Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, embora sem limitação aos mesmos, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99mTC, H1In, l25I 131I), marcadores fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína ou FITC, rodamina, ou fósforos de lantanídeo), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rabanete, B-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, marcadores de hapteno, como grupos biotinila, e epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par em zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, ou marcadores de epítopo). Em determinadas concretizações, marcadores são ligados por meio de braços espaçadores [spacer] (como (CH2)n, em que n < cerca de 20) com vários comprimentos, para produzir obstrução estérica potencial. O termo "amostra biológica", como usado aqui, inclui, embora sem limitação, qualquer quantidade de uma substância de um ser vivo ou de ser que já viveu. Referidos seres vivos incluem, embora sem limitação, humanos, camundongos, macacos, ratos, coelhos, e outros animais. Referidas substâncias incluem, embora sem limitação aos listados, sangue, soro, urina, células, órgãos, tecidos, osso, medula óssea, nódulos linfáticos, e pele. O termo "droga ou agente farmacêutico" como usado aqui refere-se a uma composição ou composto químico capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado apropriadamente a um paciente. A expressão "quantidade farmaceuticamente efetiva" com referência a uma composição farmacêutica compreendendo um ou uma pluralidade dos anticorpos da invenção é compreendida como significando, de acordo com a invenção, uma quantidade da referida composição farmacêutica que é capaz de eliminar, no paciente considerado, a diminuição do limiar de sensibilidade a estímulos externos, com um retomo deste limiar de sensibilidade a um nível comparável àquele observado em sujeitos saudáveis. XJm "distúrbio" é qualquer condição que podería beneficiar-se de tratamento de acordo com a presente invenção. "Distúrbio" e "condição" são usados aqui de forma intercambiável e incluem distúrbios mediados com NGF ou doenças mediadas com NGF, tanto crônicas como agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

Os termos "doença mediada com NGF" e "condição mediada com NGF" compreendem qualquer condição ou distúrbio clínico associado com níveis incrementados de NGF ou sensibilidade incrementada ao NGF incluindo, embora sem limitação, dor aguda, dor dental, dor de trauma, dor cirúrgica, dor resultante de amputação ou abscesso, causalgia, doenças desmielinadoras, neuralgia trigeminal, câncer, alcoolismo crônico, acidente vascular, síndrome de dor talâmica, diabetes, síndrome da deficiência imunológica adquirida ("AIDS"), toxinas e quimioterapia, cefaléia geral, enxaqueca, cefaléia de aglomerado, síndromes não-vasculares e vasculares mistas, cefaléia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, distúrbios do intestino inflamatório, síndrome do intestino inflamatório, distúrbios inflamatórios do olho, distúrbios inflamatórios ou instáveis da bexiga, psoríase, problemas de pele com componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, neurite, doenças vasculares do colágeno, condições inflamatórias crônicas, dor inflamatória e alodinia e hiperalgesia associada, dor neuropática e alodinia e hiperalgesia associada, dor de neuropatia diabética, causalgia, dor mantida simpaticamente, síndromes de desaferenciação, asma, disfunção ou dano ao tecido epítelial, herpes símplex, perturbações da moíilidade viceral em regiões respiratórias, genitourinárias, gastrintestínais ou vasculares, ulcerações, queimaduras, reações alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrintestínais gerais, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica, ou distúrbios bronquiais, dismenorréia, dispepsia, refluxo gastroesofagal, pancreatite, e visceralgia.

Como usados aqui, os termos "quantidade efetiva" e "quantidade terapeuticamente efetiva" quando usados com referência a um veículo ou um composição farmacêutica compreendendo um ou mais anticorpos humanos anti-NGF humano referem-se a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado desejado (isto é, onde para terapia com o veículo ou anticorpos humanos de NGF anti-humano da presente invenção, o resultado desejado é a desejada redução de inflamação e/ou dor, por exemplo) ou para corroborar uma diminuição observável do nível de uma ou mais atividades biológicas de NGF. Mais específicamente, uma quantidade terapeuticamente efetiva é uma quantidade do(s) anticorpo(s) humano anti-NGF humano suficiente para inibir, durante algum tempo, um ou mais dos processos patológicos definidos clinicamente associados com a condição em questão, por exemplo, inflamação ou dor, em um sujeito tratado in vivo com o agente. Na presente invenção, uma "quantidade efetiva" de um anticorpo anti-NGF pode prevenir, interromper, controlar, ou reduzir a percepção de dor associada com qualquer condição clínica dolorosa. Nos métodos da presente invenção, o termo "controle” e variantes gramaticais do mesmo são usados para referir à prevenção, inibição parcial ou completa, redução, retardo ou desaceleração de um evento indesejado, por exemplo, dor. A quantidade efetiva pode variar dependendo do(s) anticorpo(s) humano(s) anti-NGF humano ou veículo específico(s) selecionado(s), e também depende de uma variedade de fatores e condições relacionadas com o sujeito a ser tratado e da gravidade do distúrbio. Por exemplo, se o(s) anticorpo(s) humano(s) anti-NGF humano ou veículo deve(m) ser administrado(s) in vivo, deve-se considerar fatores, como a idade, peso e saúde do paciente, e também as curvas dose-resposta e os dados de toxicidade obtidos em trabalho pré-clínico em animais. Pretendendo-se contatar o agente com as células in vitro, também seria possível projetar uma variedade de estudos pré-clínicos in vitro para avaliar parâmetros, como absorção, meia-vida, dose, toxicicidade, etc. A determinação de uma quantidade efetiva ou de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um dado agente encontra-se bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

Como usado aqui, os termos "fator de crescimento dos nervos" e "NGF" são definidos como todas as espécies mamíferas de NGF de sequência nativa, incluindo NGF humano recombinante 1-120, mostrado na SEQID NO:30.

Como usado aqui, "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" significa um composto ou espécie que é a espécie predominante presente (isto é, numa base molar, ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em determinadas concretizações, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie compreende pelo menos cerca de 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em determinadas concretizações, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de todas as espécies macromolares na composição. Em determinadas concretizações, a espécie é purificada até uma homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por meio de métodos de detecção convencionais) sendo que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular, O termo "paciente" inclui sujeitos humanos e animais. "Tratamento" ou "tratar" refere-se a tratamento terapêutico e também a tratamento profilático ou a medidas preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já apresentam o distúrbio e também aqueles propensos a apresentarem o distúrbio, ou aqueles em que se pretende prevenir o distúrbio.

Exceto se o contexto o exigir de outra forma, termos singulares devem incluir pluralidades, e termos plurais devem incluir o singular.

De acordo com determinadas concretizações da invenção, anticorpos direcionados ao NGF podem ser usados para tratar dor neuropática e dor inflamaíória e doenças mediadas com NGF, incluindo, embora sem limitação, aquelas indicadas acima.

Em um aspecto da invenção proporciona-se anticoipos humanos monoclonais plenamente desenvolvidos contra, e apresentando especificidade biológica e imunológica para, ligação a NGF humano. Em outro aspecto, a invenção proporciona ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos codificando seqüências de aminoácidos para moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente seqüências correspondentes às regiões variáveis das mesmas. Concretizações particulares deste aspecto da invenção são seqüências correspondentes às regiões determinadoras de complementaridade (CDRs, complementarity determining regions), especificamente de CDR1 até CDR3, das cadeias pesada e leve proporcionadas pela invenção. Em outro aspecto adicional, a invenção proporciona células de hibridoma e linhagens de células que expressam anticorpos e moléculas de imunoglobulina, de preferência, anticorpos monoclonais da invenção. A invenção também proporciona preparações biologicamente e imunologicamente purificadas de anticorpos, de preferência, anticorpos monoclonais desenvolvidos contra, e apresentando especificidade biológica e imunológica para, ligação ao NGF humano. A capacidade de clonar e reconstruir loci humanos com tamanhos medidos em megabases em cromossomos artificiais de levedura (YACs, yeast artificial chromosomes) e introduzir os mesmos na linha germinativa de camundongo proporciona uma abordagem vantajosa para elucidar os componentes funcionais de loci muito grandes ou grosseiramente mapeados, e também de gerar modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização de tecnologia do tipo refendo para substituição de loci de camundongo por seus equivalentes humanos proporciona compreensão únicas acerca da expressão e regulação de produtos gênicos humanos durante o desenvolvimento, de sua comunicação com outros sistemas, e de seu envolvimento na indução e progressão de doença.

Uma aplicação prática de uma estratégia do tipo referido é a "humanização" do sistema imunológico humoral de camundongo. Introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana (Ig) em camundongos em que os genes de Ig endógena foram inativados oferece a oportunidade de estudar mecanismos subjacentes à expressão programada e montagem de anticorpos e também seu papel no desenvolvimento de células B. Além disso, uma estratégia do tipo referido proporciona uma fonte de produção de anticorpos monoclonais (MAbs) totalmente humanos. O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos apresentando regiões variáveis e constantes que correspondem substancialmente a seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em determinadas concretizações, anticorpos humanos são produzidos em mamíferos não-humanos, incluindo, embora sem limitação, roedores, como camundongos e ratos, e lagomorfos, como os coelhos. Em determinadas concretizações, anticorpos humanos são produzidos em células de hibridoma. Em determinadas concretizações, anticorpos humanos são produzidos recombinantemente. O termo "recombinante" com referência a um anticorpo inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. Exemplos representativos incluem anticorpos expressos usando-se um vetor de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatoriais, recombinantes, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver por exemplo, Taylor, L.D., et ai, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295,(1992); ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer meios que envolvem recomposição de seqüências de genes de imunoglobulina humana a outras seqüências de DNA. Referidos anticorpos humanos recombinantes apresentam regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana.

Anticorpos humanos apresentam pelo menos três vantagens sobre anticorpos não-humanos e quiméricos para uso na terapia humana: 1) porque a porção efetuadora do anticorpo é humana, ela pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunológico humano (por exemplo, destruir as células-alvo mais eficientemente por meio de citotoxícidade dependente de complemento (CDC, complement-dependent cytotoxicity) ou citotoxícidade celular dependente de anticorpo (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity)); 2) o sistema imunológico humano não deveria reconhecer o anticorpo humano como estranho, e, portanto, a resposta do anticorpo contra um anticorpo injetado do tipo referido deveria ser menor do que contra um anticorpo não-humano totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho; 3) anticorpos não-humanos injetados foram descritos como apresentando uma meia-vida na circulação humana muito menor do que a meia-vida de anticorpos humanos. Anticorpos humanos injetados apresentarão uma meia-vida essencialmente idêntica à de anticorpos humanos naturalmente ocorrentes, permitindo a administração de doses menores e menos freqüentes.

Assim, espera-se que anticorpos plenamente humanos minimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas para MAbs de camundongo ou derivatizados de camundongo, e que, com isto, aumentem a eficácia e a segurança dos anticorpos administrados. Portanto, anticorpos plenamente humanos da invenção podem ser usados no tratamento de dor crônica e recorrente, sendo que o tratamento dos mesmos requer administração repetida de anticorpos. Assim, uma vantagem particular dos anticorpos anti-NGF da invenção é que os anticorpos são plenamente humanos e que podem ser administrados a pacientes de uma maneira não-aguda, ao mesmo tempo que minimizam reações adversas comumente associadas com anticorpos anti-camundongo humanos ou outros anticorpos não-plenamente humanos previamente descritos de espécies não-humanas.

Alguém versado na técnica poderá manipular cepas de camundongo deficientes de produção de anticorpo de camundongo com grandes fragmentos dos loci de Ig humana, de modo que referidos camundongos venham a produzir anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camundongo. Grandes fragmentos de Ig humana podem preservar a grande diversidade de genes variáveis e também a regulação apropriada de produção e expressão de anticorpo. Mediante exploração do maquinário celular de camundongo para diversificação e seleção de anticorpo, e a falta de tolerância imunológica para proteínas humanas, o repertório de anticorpos humanos produzidos nestas cepas de camundongo proporciona anticorpos com alta afinidade contra qualquer antígeno de interesse, incluindo antígenos humanos. Usando-se a tecnologia de hibridoma é possível produzir e selecionar MAbs humanos específicos para antígeno com a especificidade desejada. É possível empregar animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório pleno de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglublina endógena. Transferência do conjunto de gene de imunoglobulina de linha germinativa humana em referidos camundongos mutantes de linha germinativa do tipo referido resultará na produção de anticorpos humanos mediante exposição a antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551-2555, (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258, (1993; Bruggemann et al, Year in Immun., 7:33 (1993); Nature 148:1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross, J.A., et al, Nature, 404:995-999 (2000); e Patams 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016,5,633,425, 5,625,126, 5,569,825, e 5,545,806 (sendo que cada uma é incorporada aqui por referência integralmente por referência para todos os fins)). Anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de apresentação de fago (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Bíol., 227:381 (1992); Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). As técnicas de Cole et al e Boemer et al também se encontram disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais (Cole et al, Monoclonal Antibodíes and Câncer Therapy, Alan R. Liss,p. 77 (1985) e Boemer etal.,l. Immunol., 147(1):86-95 (1991)).

Anticorpos humanos recombinantes também podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando se usa um animal transgênico para sequências de íg humana, mutagênese somática in vivo) e, assim, as seqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas daquelas relacionadas com seqüências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vivo.

Em determinadas concretizações, a pessoa versada na técnica pode usar regiões constantes de espécies diferentes da humana, juntamente com a região variável ou as regiões variáveis em camundongos do tipo referido para produzir anticorpos quiméricos.

Estrutura de anticorpo naturalmente ocorrente Unidades estruturais de anticorpo naturalmente ocorrente compreendem tipicamente um tetrâmero. Cada tetrâmero do tipo referido constitui-se tipicamente de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, sendo que cada par apresenta uma cadeia "leve" de comprimento pleno (apresentando tipicamente um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento pleno (apresentando tipicamente um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada inclui tipicamente uma região variável com cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é responsável tipicamente por reconhecimento de antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define tipicamente uma região constante responsável por função efetuadora. Cadeias leves humanas são classificadas tipicamente como cadeias leves capa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas tipicamente como mu, delta, gama, alfa, ou epsílon, e definem o isótopo do anticorpo, como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente, IgG apresenta várias subclasses, incluindo, embora sem limitação, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. IgM apresenta subclasses incluindo, embora sem limitação, IgMl e IgM2. IgA é subdividido de maneira similar em subclasses incluindo, embora sem limitação, IgAl e IgA2. Nas cadeias leve e pesada de comprimento pleno, as regiões variável e constante são conjugadas tipicamente por meio de uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, sendo que a cadeia pesada também inclui uma região "D” com cerca de 10 mais aminoácidos. Ver, por exemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, capítulo 7,2a ed., (Paul, W., ed.), 1989, Raven Press, N.Y. (incorporado integralmente por referência para todos os fins). As regiões variáveis de cada par de cadeia pesada/leve formam tipicamente o sítio de ligação de antígeno.

As regiões variáveis apresentam tipicamente a mesma estrutura geral de regiões de estrutura (FR, framework regions) relativamente conservada conjugadas por três regiões hipervariáveís, também denominadas regiões determinadoras de complementaridade ou CDRs. Tipicamente, as CDRs das duas cadeias de cada par encontram-se alinhadas pelas regiões de estrutura, que podem permitir ligação com um epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, ambas as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada compreendem, tipicamente, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos a cada domínio está, tipicamente, de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342:878-883.

Anticorpos biespecíficos ou bifuncionais Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial apresentando dois pares diferentes de cadeia pesada/cadeia leve e dois sítios de ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por meio de uma variedade de métodos que incluem, embora sem limitação, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos F(ab'). Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.

Preparação de anticorpos A invenção proporciona anticorpos que se ligam a NGF humano. Estes anticorpos podem ser produzidos por meio de imunização com NGF de comprimento pleno ou fragmentos dos mesmos. Os anticorpos da invenção podem ser policlonais ou monoclonaís, e/ou podem ser anticorpos recombinantes. Em concretizações preferidas, anticorpos da invenção são anticorpos humanos preparados, por exemplo, por meio de imunização de animais transgênicos capazes de produzir anticorpos humanos (ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional, publicação WO 93/12227).

As regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos anti-NGF da invenção podem ser enxertadas em regiões de estrutura (FRs) da mesma ou de outra espécie. Em determinadas concretizações, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo anti-NGF podem ser enxertadas em FRs humanas consensus. Para criar FRs humanas consensus, FRs de várias sequências humanas de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve são alinhadas para se identificar uma seqüência de aminoácidos consensus. As FRs da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo anti-NGF podem ser substituídas pelas FRs de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Tipicamente, aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesada e leve de anticorpo anti-NGF não são substituídos, embora o resto dos aminoácidos da FR possa ser substituído. Aminoácidos raros são aminoácidos específicos que se encontram em posições em que eles usualmente não são encontrados em FRs. As regiões variáveis enxertadas de anticorpos anti-NGF da invenção podem ser usadas com uma região constante que é diferente da região constante do anticorpo anti-NGF. Altemativamente, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia simples. Enxerto de CDR encontra-se descrito, por exemplo, nas patentes U.S. nums. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, e 5,530,101, que são incorporadas aqui por referência para qualquer fim.

Anticorpos da invenção são preparados, de preferência, usando-se camundongos transgênicos que apresentam uma porção substancial do lócus produtor de anticorpo humano inserido em células produtoras de anticorpo dos camundongos, e que são manipuladas adicionalmente para serem deficientes na produção de anticorpos endógenos, murinos. Referidos camundongos são capazes de produzir anticorpos e moléculas de imunoglobulina humana que não produzem ou que só produzem quantidades substancialmente reduzidas de anticorpos e moléculas de imunoglobulina murina. Tecnologias utilizadas para se obter este resultado encontram-se divulgadas nas patentes, pedidos e referências divulgadas na presente descrição. Em concretizações preferidas, a pessoa versada na técnica pode empregar métodos como divulgados na Publicação de Patente Internacional n° WO 98/24893, que é incorporada aqui por referência para qualquer fim. Ver também Mendez et aí, 1997, Nature Genetics 15:146-156, que é incorporado aqui por referência para qualquer fim.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da invenção podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos convencionais, por exemplo, a técnica de hibridação convencional de células somáticas de Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495). Embora, em princípio, procedimentos de hibridação somática sejam preferidos, é possível empregar outras técnicas de produção de anticorpos monoclonais, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. O sistema animal preferido para preparar hibridomas é o camundongo. Produção de hibridoma no camundongo é muito bem estabelecida, e protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são bem conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

Em uma concretização preferida, anticorpos humanos monoclonais dirigidos contra NGF podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos que portam partes do sistema imunológico humano ao invés de o sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos, referidos aqui como camundongos "HuMab", contêm um minilócus de gene de imunoglobulina humana que codifica seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e de cadeia leve κ humana que não foi rearrumada, juntamente com mutações objetivadas que inativam os loci de cadeia μ e κ endógena (Lonberg et al, 1994, Nature 368:856-859). Assim, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo em resposta à imunização, os transgenes humanos introduzidos de cadeia pesada e cadeia leve sofrem troca de classe e mutação somática gerando anticorpos monoclonais de IgG κ humana com alta afinidade (Lonberg et al., acima; Lonberg e Huszar, 1995, Intem. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad, Sei. 764:536-546). A preparação de camundongos HuMab é descrita em detalhe em Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen et al, 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al, 1994, L Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al, 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 1J3:49-101; Taylor et ai, 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intem. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. NY. Acad. Sei 764:536-546; Fishwild et al, 1996, Nature Biotechnology 14:845-851, cujos teores são incorporados aqui integralmente por referência. Ver patentes U.S. nums. adicionais 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; e 5,770,429; todas para Lonberg e Kay, e também patente U.S. n° 5,545,807 para Surani et ai; Publicação de Pedido de Patente Internacional nums. WQ 93/1227, publicado em 24 de junho de 1993; WO 92/22646, publicado em 23 de dezembro de 1992; e WO 92/03918, publicado em 19 de março de 1992, sendo que os teores de todas estas referências são incorporados aqui integralmente por referência. Altemativamente, as cepas de camundongos transgênicos HCo7, HCo 12, e KM descritas nos Exemplos abaixo podem ser usadas para gerar anticorpos anti-NGF humano. A presente invenção proporciona anticorpos humanos monoclonais que são específicos para, e que neutralizam polipeptídeos de NGF humano bioativos. Proporciona-se também seqüências de aminoácidos de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo que são altamente específicas para, e que neutralizam, polipeptídeos de NGF quando são ligadas aos mesmos. Esta alta especificidade permite que os anticorpos humanos de NGF anti-humano, e anticorpos humanos monoclonais com especificidade análoga, constituam imunoterapia efetiva para doenças associadas com NGF.

Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpos humanos isolados que se ligam ao mesmo ou essencialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo 4D4 aqui proporcionado.

Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpos humanos isolados compreendendo pelo menos uma das seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQID NOS: 10,12,14,16,18,20,22, 24, e de 79-130 que se liga com alta afinidade a epítopo de polipeptídeo de NGF e que apresenta a capacidade de antagonizar atividade de polipeptídeo de NGF. De preferência, estes anticorpos ligam-se ao mesmo, ou essencialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo 4D4 proporcionado aqui.

Em concretizações preferidas, os anticorpos humanos isolados ligam-se ao polipeptídeo de NGF com uma constante de dissociação (KD) de 1 x 10'9 M ou menos e inibem sobrevida induzida com NGF em um ensaio de 'j neutralização in vitro com uma IC50 de 1 x 10' M ou menos. Em concretizações mais preferidas, os anticorpos humanos isolados ligam-se ao NGF polipeptídeo com uma constante de dissociação (KD) de 1 x IO'10 M ou menos e inibem sobrevida induzida com NGF em um ensaio de neutralização o in vitro com uma IC50 de 1 x 10' M ou menos. Em uma concretização ainda mais preferida, os anticorpos anti-NGF humanos isolados ligam-se ao polipeptídeo de NGF humano com uma constante de dissociação (KD) de 1 x 10"11 M ou menos e inibem sobrevida induzida com NGF em um ensaio in vitro com uma IC5o de 1 x 10'9 M ou menos. Proporciona-se aqui exemplos de anticorpos humanos de NGF anti-humano que atendem aos critérios de ligação e neutralização previamente indicados. O anticorpo humano anti-NGF humano mais preferido da presente invenção é referido aqui como 4D4 e apresenta seqüências de polipeptídeo VL e VH como mostrado na SEQID NO: 12 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. A seqüência de polinucleotídeos que codifica as VL e VH de 4D4 é mostrada na SEQ ID NO: 11 e SEQ ÍD NO: 9, respectivamente. As propriedades dos anticorpos humanos de NGF anti-humano da presente invenção são divulgadas especificamente nos Exemplos. É particularmente digna de nota a alta afinidade para polipeptídeo de NGF e a alta capacidade de antagonizar atividade de polipeptídeo de NGF demonstrada aqui. A constante de dissociação (KD) de um anticorpo humano anti-NGF humano pode ser determinada por meio de ressonância de plasmon de superfície, como descrito geralmente no Exemplo 9. De uma maneira geral, análise de ressonância de plasmon de superfície mede interações de ligação em tempo real entre ligante (polipeptídeo de NGF recombinante imobilizado numa matriz de biossensor) e composto a ser analisado (anticorpos em solução) por meio de ressonância de plasmon de superfície (SPR, surface plasmon resonance) usando-se o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Análise de plasmon de superfície também pode ser realizada imobilizando-se o composto a ser analisado (anticorpos em uma matriz de biossensor) e apresentando o ligante (V recombinante em solução). A constante de dissociação (KD) de um anticorpo humano anti-NGF humano também pode ser determinada por meio do uso de metodologia KinExA. Em determinadas concretizações da invenção, os anticorpos ligam-se ao NGF com uma KD entre aproximadamente 10‘8 M e ΙΟ'12 Μ. O termo "KD", como usado aqui, destina-se a referir à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Para os fins da presente invenção determinou-se KD como mostrado no Exemplo 9.

Em concretizações preferidas, os anticorpos da invenção são do isótipo IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. De preferência, os anticorpos são do tipo IgG3. Mais preferivelmente, os anticorpos são do tipo IgGl. Da forma mais preferível, os anticorpos são do tipo IgG2. Em outras concretizações, os anticorpos da invenção são de isótipo IgM, IgA, IgE, ou IgD. Em concretizações preferidas da invenção, os anticorpos compreendem uma cadeia leve κ humana e uma cadeia pesada IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 humana. Expressão de anticorpos da invenção compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgGl ou de IgG2 é descrita nos Exemplos abaixo. Em concretizações particulares, as regiões variáveis dos anticorpos são ligadas a uma região constante diferente da região constante para o isótipo IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. Em determinadas concretizações, os anticorpos da invenção foram clonados para expressão em células mamíferas.

Em determinadas concretizações, modificações conservativas nas cadeias pesada e leve de anticorpos anti-NGF (e modificações correspondentes aos nucleotídeos codificantes) produzirão anticorpos anti-NGF apresentando características funcionais e químicas similares àquelas dos anticorpos anti-NGF aqui divulgados. Em contraste, modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas de anticorpos anti-NGF podem ser realizadas selecionando-se substituições na seqüência de aminoácidos das cadeias pesada e leve que diferem significativamente, no que se refere a seu efeito, quanto à manutenção (a) da estrutura da espinha dorsal molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em lâmina ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral.

Por exemplo, uma ''substituição conservativa de aminoácidos’' pode envolver uma substituição de um radical de aminoácido nativo por um radical não-nativo de tal forma que há pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou a carga do radical de aminoácido naquela posição. Além disso, qualquer radical nativo no polipeptídeo também pode ser substituído por alanina, como já foi previamente descrito para "mutagênese de varredura de alanina".

Substituições de aminoácidos desejados (quer sejam conservativas ou não-conservativas) podem ser determinadas por aqueles com prática na técnica, no momento em que se deseja substituições do tipo referido. Em determinadas concretizações é possível usar substituições de aminoácidos para identificar radicais importantes de anticorpo anti-NGF, ou para incrementar ou diminuir a afinidade dos anticorpos anti-NGF aqui descritos.

Como é de conhecimento geral, alterações menores numa seqüência de aminoácidos, como deleção, adição ou substituição de um, de alguns, ou mesmo de vários aminoácidos, pode levar a uma forma alélica da proteína original que apresenta propriedades substancialmente idênticas. Portanto, adicionalmente aos anticorpos especificamente descritos aqui, outros anticorpos "substancialmente homólogos" podem ser facilmente projetados e fabricados utilizando-se várias técnicas de DNA recombinante bem conhecidas por aqueles com prática na técnica. Em geral, é possível realizar facilmente modificações dos genes por meio de uma variedade de técnicas bem conhecidas, como mutagênese direcionada para sítio. Portanto, a presente invenção considera anticorpos anti-NGF "variantes" ou "mutantes" apresentando características substancialmente similares às dos anticorpos anti-NGF humanos divulgados aqui (ver, por exemplo, WO 00/56772, cujo teor integral é incorporado aqui por referência). Assim, com o termo "variante" ou "mutante", com referência a um anticorpo anti-NGF humano, compreende-se qualquer molécula de ligação (molécula X) (i) em que as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, ou as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, consideradas como um todo, são pelo menos 80% homólogas, de preferência, pelo menos 90% homólogas, mais preferivelmente pelo menos 95% homólogas às regiões hipervariáveis, como mostrado nas SEQ ID NOS: 14, 18, e 22 ou SEQ ID NOS: 16, 20, e 24, respectivamente, e (ii) sendo que a variante ou mutante é capaz de inibir a atividade de NGF humano no mesmo grau que um anticorpo humano anti-NGF de referência apresentando regiões de estrutura idênticas àquelas da molécula X.

Ordinariamente, uma variante de anticorpo anti-NGF humano apresentará CDRs de cadeia leve e/ou de cadeia pesada, quando considerado como um todo, que apresentam identidade de pelo menos cerca de 80% de seqüências de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com relação às seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 14, 18, e 22 e/ou SEQ ID NOS: 16,20, e 24, respectivamente.

Mais preferivelmente, uma variante de anticorpo anti-NGF humano apresentará uma região variável de cadeia leve, quando considerado como um todo, que apresenta pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 81% identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NOS: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90, ou 91 e/ou uma região variável de cadeia pesada, quando considerado como um todo, que apresenta pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüências de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 81% identidade de seqüências; ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüências, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com as seqüências de aminoácidos como mostrado na SEQID NOS:10,81,83,85, ou 87.

Uma "variante" com referência a um polinucleotídeo deve indicar uma molécula de ácido nucleico apresentando pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüências de ácido nucleico com uma sequência de polinucleotídeo da presente invenção. Ordinariamente, uma variante de polinucleotídeo apresentará pelo menos cerca de 75% identidade de seqüências de ácido nucleico, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 81% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% identidade de seqüências de ácido nucleico, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüências de ácido nucleico com uma sequência inédita de ácido nucleico divulgada aqui.

Em concretizações particulares, a invenção proporciona anticorpos que apresentam um percentual de identidade com um anticorpo da invenção, ou um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região CDR1, CDR2, ou CDR3 que apresenta um percentual de identidade com uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região CDR1, CDR2, ou CDR3 da invenção, como mostrado no Exemplo 10 aqui e nas Figuras 510.

Em determinadas concretizações, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70% ou 75% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQID NO: 10, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma, pelo menos 70%, 80%, 85%, ou 95% homólogo com a seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 81, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 80%, 85%, ou 95% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 83, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente íimcional da mesma; pelo menos 75%, 80%, ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQID NO: 85, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos, 70%, 75%, ou 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 87, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 56% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 79, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinadas concretizações, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a um fator de crescimento dos nervos e que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, sendo que cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70%, 75%, 80%, ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 12 ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 85%, ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 80, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 74%, 90%, ou 94% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 88, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 80%, 85%, ou 87% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 89, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 85%, 90%, ou 94% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 90, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 91, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, ou 96% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 82, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 84, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 86, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em determinadas outras concretizações, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende uma CDR1 humana de cadeia pesada, sendo que a CDR1 de cadeia pesada é uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 40% ou 60% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, ou SEQ ID NO: 22, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em outras concretizações, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende uma CDR2 humana de cadeia pesada, sendo que a CDR2 de cadeia pesada é uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70%, 82%, ou 94% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 99, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 76% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 106, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 59% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 18, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 117, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou pelo menos 70%, 75% ou 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 111, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em outras concretizações adicionais, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga específicamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende uma CDR1 humana de cadeia leve, sendo que a CDR1 é uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70% ou 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 101, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70%, 75%, 80% ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 95, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 75%, 80%, ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 119, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 75%, 80%, ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 122, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 125, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 75%, 80%, ou 90% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 24, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional; pelo menos 70% ou 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 107, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou pelo menos 70% ou 80% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 113, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em concretizações adicionais, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especifícamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende a human cadeia leve CDR2, em que a CDR2 é uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 102, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 96, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 120, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 123, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 126, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 129, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 20, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 108, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 133, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 114, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

Em outras concretizações, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado que se liga especificamente a fator de crescimento dos nervos e que compreende uma CDR3 humana de cadeia leve, sendo que a CDR3 é uma seqüência de aminoácidos que é: pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 103, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 97, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 78% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 121, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 78% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 127, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 78% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 130, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 78% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 16, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 70% ou 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 109, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; pelo menos 78% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 134, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ou pelo menos 85% idêntica à seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 115, ou um fragmento de imunoglobulina de ligação de antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

As seqüências das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 4D4 são mostradas nas SEQ ID NOS: 10 e 12, respectivamente. No entanto, muitos dos radicais de contato CDR potenciais são passíveis de substituição por outros aminoácidos e ainda permitem que o anticorpo conserve afinidade substancial pelo antígeno. Da mesma forma, muitos dos radicais de estrutura que não contatam com as CDRs nas cadeias pesada e leve podem acomodar substituições de aminoácidos das posições correspondentes de outros anticorpos humanos, por meio de aminoácidos humanos consensus, ou de outros anticorpos de camundongo, sem perda significativa da afinidade ou não-imunogenicidade do anticorpo humano. Seleção de vários aminoácidos alternativos pode ser usada para produzir versões dos anticorpos anti-NGF divulgados e de seus fragmentos que apresentam combinações variáveis de afinidade, especificidade, não-imunogenicidade, facilidade de preparação, e outras propriedades desejáveis.

Em concretizações alternativas, anticorpos da invenção podem ser expressas em linhagens de células diferentes de linhagens de células de hibridoma. Nestas concretizações, seqüências que codificam anticorpos particulares podem ser usadas para transformação de uma célula hospedeira mamífera vantajosa. De acordo com estas concretizações, transformação pode ser obtida usando-se qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotamento do polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por meio de procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado pelas patentes U.S. nums. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, e 4,959,455 (todas incorporadas aqui por referência para qualquer fim). Geralmente, o procedimento de transformação usado pode depender do hospedeiro a ser transformado. Métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células mamíferas são bem conhecidos na técnica e incluem, embora sem limitação aos listados, transfecção mediada com dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada com polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, e microinjeção direta do DNA nos núcleos.

Uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada, uma região variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve, ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo de NGF da invenção é inserida em um vetor de expressão apropriado mediante o uso de técnicas de ligação convencionais. Em uma concretização preferida, a região constante de cadeia pesada ou leve de anticorpo anti-NGF é anexada na ponta C da região variável apropriada e é ligada em um vetor de expressão. O vetor é selecionado tipicamente para ser funcional na célula hospedeira particular empregada (isto é, o vetor é compatível com o maquinário da célula hospedeira, de tal forma que possa ocorrer amplificação do gene e/ou expressão do gene). Para uma revisão de vetores de expressão, ver METH. ENZ. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press.

Tipicamente, vetores de expressão usados em quaisquer das células hospedeiras conterão seqüências para manutenção de plasmídeo e para clonagem e expressão de seqüências de nucleotídeos exógenas. Referias seqüências, referidas coletivamente como "seqüências de flanqueamento" incluirão tipicamente, em determinadas concretizações, uma ou mais das seguintes seqüências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais seqüências acentuadoras, uma origem de replicação, uma seqüência de terminação transcricional, uma seqüência de íntron completa contendo um sítio de recomposição de receptor e doador, uma seqüência que codifica uma seqüência líder para secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação de ribossoma, uma seqüência de poliadenilação, uma região de poliligante para inserir o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo a ser expresso, e um elementos marcador selecionável. Cada uma destas seqüências é discutida abaixo.

Opcionalmente, o vetor pode conter uma seqüência codificadora de "tag", isto é, uma molécula de oligonucleotídeo localizada na ponta 5' ou 3' da seqüência codificante do polipeptídeo de anticorpo anti-NGF; a seqüência de oligonucleotídeo codifica polyHis (como hexaHis), ou outro "tag", como FLAG, HA (vírus da influenza hemaglutinina), ou myc para o qual existem anticorpos comercialmente obteníveis. Este marcador é fundido tipicamente com o polipeptídeo mediante expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para purificação por afinidade ou detecção do anticorpo de NGF da célula hospedeira. Purificação por afinidade pode ser realizada, por exemplo, por meio de cromatografia de coluna usando-se anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o marcador pode ser removido subseqüentemente do polipeptídeo de anticorpo anti-NGF purificado por vários meios, como usando determinadas peptidases para divagem.

Seqüências de flanqueamento podem ser homólogas (isto é, da mesma espécie d ou cepa que a célula hospedeira), heterólogas (isto é, de uma espécie diferente da espécie ou cepa da célula hospedeira), híbridas (isto é, uma combinação de seqüências de flanqueamento de mais de uma fonte), sintéticas ou nativas. Assim, a fonte de uma seqüência de flanqueamento pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a seqüência de flanqueamento seja funcional no maquinário da célula hospedeira e possa ser ativado pela mesma.

Seqüências de flanqueamento úteis nos vetores desta invenção podem ser obtidas por meio de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, seqüências de flanqueamento úteis aqui foram identificadas previamente por meio de mapeamento e/ou por meio de digestão com endunuclease de restrição e, assim, podem ser isoladas da fonte de tecido apropriada usando-se as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a seqüência de nucleotídeos plena de uma seqüência de flanqueamento pode ser conhecida. Aqui, a seqüência de flanqueamento pode ser sintetizada usando-se os métodos descritos aqui para síntese ou clonagem de ácido nucleico.

Se toda ou apenas uma porção da seqüência de flanqueamento é conhecida, isto pode ser obtido usando-se reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou por meio de seleção de uma biblioteca genômica com uma sonda vantajosa, como um oligonucleotídeo e/ou fragmento de seqüência de flanqueamento da mesma espécie ou de outra. Onde a seqüência de flanqueamento não é conhecida, é possível isolar um fragmento de DNA contendo uma seqüência de flanqueamento a partir de um pedaço maior de DNA que pode conter, por exemplo, uma seqüência codificante ou mesmo outro gene ou genes. Isolamento pode ser realizado por meio de digestão com endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNA apropriado, seguido de isolamento empregando purificação com gel de agarose, cromatografia de coluna Qiagen® (Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. A seleção de enzimas vantajosas para se realizar esta finalidade será facilmente perceptível para alguém com prática ordinária na técnica, Uma origem de replicação é tipicamente uma parte daqueles vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e a origem auxilia na amplificação do vetor numa célula hospedeira. Se o vetor de escol não contiver uma origem de sítio de replicação, é possível sintetizar um com base numa seqüência conhecida, e ligá-lo no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR.322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é vantajosa para a maior parte das bactérias gram-negativas, e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSY, vesicular stomatitus virus), ou papilomavírus, como HPY ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células mamíferas. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é usada frequentemente apenas porque também contém o promotor precoce de vírus).

Uma seqüência de terminação de transcrição encontra-se localizada tipicamente a 3' na ponta de uma região codificante de polipeptídeo e serve para terminar transcrição. Usualmente, uma seqüência de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, seguido de uma seqüência poli-T. Embora a seqüência seja facilmente clonada de uma biblioteca ou mesmo adquirida comercialmente como parte de um vetor, ela também pode ser facilmente sintetizada usando-se métodos para síntese de ácido nucleico, como aqueles descritos aqui.

Um gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevida e o crescimento de uma célula hospedeira desenvolvida em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores típicos para seleção codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina, ou canamicina, para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos ou definidos. Marcadores selecionáveis preferidos são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina, e o gene de resistência à tetraciclina. De maneira vantajosa, também é possível usar um gene de resistência à neomicina para seleção em células hospedeiras procarióticas e também em eucarióticas. É possível usar genes selecionáveis para amplificar o gene que será expresso. Amplificação é o processo em que genes que são necessários para produção de uma proteína crítica para crescimento ou sobrevida da célula são reiterados em tandem dentro dos cromossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis vantajosos para células mamíferas incluem genes de diidrofolato redutase (DHFR) e de timidina quinase isento de promotor. Transformantes de células mamíferas são colocados sob pressão de seleção apenas onde os transformantes são unicamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. Pressão de seleção é imposta por meio de cultura das células transformadas em condições em que a concentração de agente de seleção no meio é aumentada sucessivamente, levando com isso à amplificação, tanto do gene selecionável como do DNA que codifica outro gene, como um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de NGF. Como um resultado, quantidades maiores de um polipeptídeo, como um anticorpo anti-NGF, são sintetizadas do DNA amplificado.

Um sítios de ligação de ribossoma é usualmente necessário para iniciação de tradução de mRNA e é caracterizado por uma seqüência Shine-Dalgamo (procariótica) ou uma seqüência Kozak (eucariótica). O elemento encontra-se localizado tipicamente a 3' do promotor e a 5' da seqüência codificante do polipeptídeo a ser expresso.

Em alguns casos, em que se deseja glicosilação em um sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, é possível manipular as várias seqüências pré- ou pró- de forma a incrementar a glicosilação ou o rendimento. Por exemplo, é possível alterar o sítio de divagem de peptidase de um peptídeo-sinal particular, ou adicionar seqüências pró, que também podem afetar glicosilação. O produto de proteína final pode apresentar, na posição 1 (relativamente ao primeiro aminoácido da proteína madura) um ou mais aminoácidos adicionais incidentes na expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode apresentar um ou dois radicais de aminoácidos encontrados no sítio de divagem de peptidase, ligados à ponta amino. Altemativamente, o uso de alguns sítios de divagem de enzima resulta em uma forma ligeiramente truncada do polipeptídeo desejado, se a enzima cortar numa área do tipo referido dentro do polipeptídeo maduro.

Vetores de expressão e de clonagem da invenção conterão tipicamente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e ligado operacionalmente à molécula que codifica o anticorpo anti-NGF. Promotores são seqüências não-transcritas localizadas a montante (isto é, a 5') relativamente ao códon start de um gene estrutural (geralmente no intervalo de cerca de 100 a 1000 bp) que controlam transcrição do gene estrutural. Promotores são agrupados convencionalmente em uma de duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Promotores induzíveis iniciam níveis incrementados de transcrição de DNA sob seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, como a presença ou ausência de um nutrientes ou uma alteração de temperatura. Promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem uniformemente gene a que estão ligados operacionalmente, ou seja, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão do gene. É de conhecimento geral um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. Um promotor vantajosos é ligado operacionalmente ao DNA codificando cadeia pesada ou cadeia leve compreendendo um anticorpo anti-NGF da invenção mediante remoção do promotor do DNA-fonte por meio de digestão com enzima de restrição e inserindo-se a seqüência promotora desejada no vetor.

Promotores vantajosos para uso com hospedeiros de levedura também são bem conhecidos na técnica. Acentuadores de levedura são usados de maneira vantajosa com promotores de levedura. Promotores vantajosos para uso com células hospedeiras mamíferas são bem conhecidos e incluem, ■embora sem limitação aos listados, aqueles obtidos dos genomas de vírus, como polioma vírus, vírus da varíola das aves, adenovírus (como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus avícola, citomegalovírus, retrovirus, víms da hepatite-B e, o mais preferivelmente, vírus símio 40 (SV40). Outros promotores mamíferos vantajosos incluem promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, promotores de choque com calor e o promotor de actina.

Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, embora sem limitação aos listados: promotor precoce de SV40 (Bemoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-10); promotor de CMV (Thomsen et al, 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); o promotor contido na repetição terminal longa a 3' do víms do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al, 1980, Cell 22:787-97); promotor da timidina quinase do herpes (Wagner et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:1444-45); seqüências promotora e reguladora do gene de metalotionina (Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42); e promotores procarióticos, como o promotor da beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75:3727-31); ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:21-25). Também são interessantes as seguintes regiões de controle transcricional de animais, que apresentam especificidade para tecido e que foram utilizadas em animais transgênicos: a região de controle do gene da elastase I que é ativo em células acinar pancreáticas (Swift et al, 1984, Cell 38:639-46; Orrntz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); a região de controle do gene de insulina é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); a região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa em células linfóides (Grosschedl et al, 1984, Cell 38:647-58; Adames et al, 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al, 1987, Mol. Cell, Biol,, 7:1436-44); a região de controle do vírus do tumor mamário de camundongo que é ativa em células testiculares, da mama, linfóides e mastócitos (Leder et al, 1986, Cell 45:485-95); a região de controle do gene da albumina que é ativa no fígado (Pinkert et al, 1987, Genes and Devei. 1:268-76); a região de controle do gene da alfa-feto-proteína que é ativa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol, 5:1639-48; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58); a região de controle do gene de alfa 1 -antitripsina que é ativa no fígado (Kelsey et al, 1987, Genes and Devei. 1:161-71); a região de controle do gene de beta-globina que é ativa em células mielóides (Mogram et al, 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al, 1986, Cell 46:89-94); a região de controle do gene da proteína básica mielina que é ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al, 1987, Cell 48:703-12); a região de controle do gene da cadeia leve 2 da miosina que é ativa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); e a região de controle do gene do hormônio liberador gonadotrópico que é ativa no hipotálamo (Mason et al, 1986, Science 234:1372-78). É possível inserir uma seqüência acentuadora no vetor para incrementar a transcrição de DNA codificando cadeia leve ou cadeia pesada compreendendo um anticorpo anti-NGF da invenção com eucariontes superiores. Acentuadores são elementos de ação cis do DNA, usualmente com um comprimento de cerca de 10-300 bp, que atuam no promotor de forma a incrementar a transcrição. Acentuadores são relativamente independentes de orientação e transcrição, tendo sido encontrados em posições, tanto a 5' como a 3' da unidade de transcrição. São de conhecimento geral várias seqüências acentuadoras obteníveis de genes mamíferos (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Contudo usa-se tipicamente um acentuadora de um vírus. O acentuador SV40, o acentuador do promotor precoce do citomegalovírus, o acentuador de polioma, e acentuadores de adenovírus conhecidos na técnica são elementos acentuadores exemplares para a ativação de promotores eucariótícos. Embora um acentuador possa ser posicionado no vetor, quer a 5' ou 3' da sequência codificante, ele encontra-se localizado tipicamente em um sítio a 5’ do promotor.

Vetores de expressão da invenção podem ser construídos de um vetor de partida, como um vetor comercialmente obtenível. Referidos vetores podem ou não conter todas as seqüências de flanqueamento desejadas. ' Onde uma ou mais das seqüências de flanqueamento aqui descritas não estão presentes no vetor, elas podem ser obtidas individualmente e ligadas no vetor. Métodos usados para se obter cada uma das seqüências de flanqueamento são bem conhecidos por alguém versado na técnica.

Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico codificando cadeia leve, uma cadeia pesada, ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo um anticorpo anti-NGF ter sido inserido no sítio apropriado do vetor, o vetor completado pode ser inserido em uma célula hospedeira vantajosa para amplificação e/ou expressão de polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão para um anticorpo anti-NGF a uma célula hospedeira selecionada pode ser realizada por meio de métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, co-precipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada com DEAE-dextrano, ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada. Estes métodos e outros métodos vantajosos são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica, e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al, acima.

Uma célula hospedeira, quando cultivada em condições apropriadas, sintetiza um anticorpo anti-NGF que pode ser coletado subsequentemente do meio de cultura (se a célula hospedeira secretar o mesmo no meio) ou diretamente da célula hospedeira que o produz (se não for secretado). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, como níveis desejados de expressão, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para atividade (como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de dobragem a uma molécula biologicamente ativa.

Linhagens de células mamíferas obteníveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidos na técnica e incluem, embora sem limitação aos listados, linhagens de células imortalizadas obteníveis junto à American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, embora sem limitação, células de ovário de hamster chinês (CHO, Chinese Hamster Ovary), células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK, baby hamster kidney), células de rim de macaco (COS, monkey kidney cells), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e uma quantidade de outras linhagens de células. Em determinadas concretizações, linhagens de células podem ser selecionadas determinando-se quais linhagens de células apresentam níveis de expressão altos e produzem constitutivamente anticorpos com propriedades de ligação de NGF. Em outra concretização, é possível selecionar uma linhagem de células da linhagem de células B que não gera seu próprio anticorpo, mas que apresenta uma capacidade de gerar e secretar um anticorpo heterólogo.

Anticorpos da invenção são úteis para detectar NGF em amostras biológicas e para identificação de células ou tecidos que produzem proteína de NGF. Anticorpos da invenção que se ligam especificamente ao NGF podem ser úteis no tratamento de doenças mediadas com NGF.

Referidos anticorpos podem ser usados em ensaios de ligação para detectar NGF e para inibir NGF de formar um complexo com receptores de NGF. Referidos anticorpos que se ligam ao NGF e bloqueiam interação com outros compostos de ligação podem ter uso terapêutico na modulação de doenças mediadas com NGF. Em concretizações preferidas, anticorpos para NGF podem bloquear ligação do NGF com seu receptor, o que pode resultar em disrupção da cascata de transdução de sinal induzida com NGF. A presente invenção também se refere ao uso de um ou mais anticorpos da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição ou distúrbio doloroso mediante expressão incrementada de NGF ou por sensibilidade incrementada ao NGF em um paciente, como qualquer um dos distúrbios ou condições aqui divulgadas.

Em concretizações preferidas, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ou uma pluralidade dos anticorpos da invenção em conjunto com um veículo, diluente, solubilizador, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. De preferência, materiais de formulação aceitáveis são não-tóxicos para recipientes nas dosagens de concentrações empregadas. Em concretizações preferidas, proporciona-se composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de anticorpos anti-NGF.

Em determinadas concretizações, materiais de formulação aceitáveis são, de preferência, não-tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas.

Em determinadas concretizações, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em concretizações do tipo referido, materiais de formulação vantajosos incluem, embora sem limitação aos listados, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogênio sulfito de sódio); tamponantes (como borato, bicarbonato, Tris-HC1, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes avolumadores (como manitol ou glicina); agentes queladores (como ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA)); agentes complexadores (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsifícantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos com baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (como sódio); conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool de fenetila, metilparabeno, propilparabeno, cloroexidina, ácido ascórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); alcoóis de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes (como pluronics, PEG, ésteres de sorbitol, polissorbatos, como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes incrementadores de estabilidade (como sacarose ou sorbitol); agentes incrementadores de tonicidade (como halogenetos de metal de álcali, de preferência, cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de fornecimento; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edição, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Em determinadas concretizações, a composição farmacêutica ótima será determinada por alguém versado na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração desejada, do formato de fornecimento e da dosagem desejada. Ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em determinadas concretizações, referidas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de eliminação in vivo dos anticorpos da invenção.

Em determinadas concretizações, o veículo ou suporte primário em uma composição farmacêutica pode ser aquoso ou não-aquoso. Por exemplo, um veículo ou suporte vantajoso pode ser água para injetáveis, solução salina fisiológica ou fluido cerebroespinhal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro são veículos exemplares adicionais. Em concretizações preferidas, composições farmacêuticas da presente invenção compreendem tamponante Tris com pH de cerca de pH 7,0-8,5, ou tamponante de acetato com pH de cerca de pH 4,0-5,5, e podem incluir adicionalmente sorbitol, sacarose, Tween-20 e/ou um substituinte vantajosos para os mesmos. Em determinadas concretizações da invenção, é possível preparar composições de anticorpo anti-NGF para armazenamento por meio de mistura da composição selecionada apresentando o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, acima) na forma de uma torta liofilizada ou de uma solução aquosa. Adicionalmente, em determinadas concretizações, o produto de anticorpo anti-NGF pode ser formulado como um liofílizado usando-se excípientes apropriados, como sacarose.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser selecionadas para fornecimento parenteral. Altemativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para fornecimento através do trato digestivo, como oralmente. A preparação de referidas composições farmaceuticamente aceitáveis encontra-se dentro da prática da técnica.

Os componentes de formulação estão presentes, de preferência, em concentrações que são aceitáveis no sítio de administração. Em determinadas concretizações, emprega-se tamponantes para manter a composição em um pH fisiológico ou em um pH ligeiramente inferior, tipicamente numa faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

Quando se considera administração parenteral, as composições para uso nesta invenção podem ser proporcionadas em forma de uma solução aquosa isenta de pirógeno, parenteralmente aceitável, compreendendo o anticorpo anti-NGF desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente vantajoso para injeção parenteral é água destilada estéril em que o anticorpo anti-NGF é formulado como uma solução isotônica estéril, adequadamente conservada. Em determinadas concretizações, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), pérolas ou lipossomas, que podem proporcionar liberação controlada ou sustentada do produto que pode ser fornecido via injeção de depósito. Em determinadas concretizações, também é possível usar ácido hialurônico, apresentando o efeito de promover duração prolongada na circulação. Em determinadas concretizações, é possível usar dispositivos de fornecimento de drogas implantáveis para introduzir a molécula de anticorpo desejada.

Composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para inalação. Nestas concretizações, anticorpos anti-NGF são formuladas de maneira vantajosa como um pó seco, inalável. Em concretizações preferidas, também é possível usar formulações de inalação de anticorpo anti-NGF com um propelente para fornecimento por aerossol. Em determinadas concretizações, soluções podem ser nebulizadas. Administração pulmonar e métodos de formulação para a mesma são descrito adicionalmente no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US94/001875, que é incorporado por referência e descreve fornecimento pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Considera-se também que formulações podem ser administradas oralmente. Anticorpos anti-NGF que são administrados desta maneira podem ser formulados com ou sem veículos comumente usados na compostação de formas de dosagem sólidas, como tabletes e cápsulas. Em determinadas concretizações, é possível projetar uma cápsula para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrintestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. É possível incluir agentes adicionais para facilitar absorção do anticorpo anti-NGF. Também é possível empregar diluentes, aromatizantes, ceras com baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de tabletes, e ligantes.

De preferência, proporciona-se uma composição farmacêutica da invenção de forma a compreender uma quantidade efetiva de um ou uma pluralidade de anticorpos anti-NGF em uma mistura com excipientes não-tóxicos que são vantajosos para a fabricação de tabletes. Dissolvendo-se os tabletes em água estéril, ou outro veículo apropriado, é possível preparar soluções em forma de dosagem unitária. Excipientes vantajosos incluem, embora sem limitação aos listados, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato de sódio ou bicarbonatò, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.

Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para aqueles com prática na técnica, incluindo formulações envolvendo anticorpos anti-NGF em formulações de fornecimento sustentado ou controlado. Técnicas para formular uma variedade de outros meios de fornecimento sustentado ou controlado, como veículos de lipossoma, micropartículas bio-erodíveis ou pérolas porosas e injeções de depósito, também são conhecidos por aqueles com prática na técnica. Ver, por exemplo, Patente Internacional n° PCT/US93/00829, que é incorporada por referência e descreve liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para fornecimento de composições farmacêuticas. Preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis em forma de artigos modelados, por exemplo películas, ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (como divulgado na patente U.S. n° 3,773,919 e Publicação de Pedido de Patente Européia n° EP 058481, sendo que cada uma é incorporada por referência), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al, 1983, Biopolymers 22:547-556), poli(2-hidroxietü-metacrilato) (Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetato de vinil etileno (Langer et al, acima) ou ácido poli-D(-)-3 -hidroxibutírico (Publicação de Pedido de Patente Européia No. EP 133,988). Composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por meio de vários métodos conhecidos na técnica. Ver por exemplo, Eppstein et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688-3692; Publicação de Pedido de Patente Européia nums. EP 036,676; EP 088,046 e EP 143,949, incorporadas por referência.

Composições farmacêuticas usadas para administração in vivo são proporcionadas tipicamente como preparações estéreis. A esterilização pode ser realizada por meio de filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, é possível realizar esterilização usando-se este método, quer seja antes ou após liofílização e reconstituição. Composições para administração parenteral podem ser armazenadas em forma liofilizada ou em uma solução. De uma maneira geral, composições parenterais são colocadas em um recipiente apresentando abertura de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa apresentando um fecho perfurável com uma agulha de injeção hipodérmica.

Uma vez formulada a composição farmacêutica, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Referidas formulações podem ser armazenadas em forma de pronto-emprego ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração. A invenção também proporciona kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Cada um dos kits da invenção pode conter ambos, um primeiro recipiente apresentando uma proteína seca e um segundo recipiente apresentando uma formulação aquosa. Em determinadas concretizações desta invenção proporciona-se kits contendo seringas simples e câmaras múltiplas previamente enchidas (por exemplo, seringas líquidas e lio-seringas). A quantidade efetiva de uma composição farmacêutica contendo anticorpo anti-NGF a ser empregado terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto terapêutico e dos objetivos. Alguém versado na técnica perceberá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula fornecida, da indicação para a qual o anticorpo anti-NGF está sendo usado, da via de administração, e do tamanho (peso corporal, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e/ou da condição (a idade e estado geral) do paciente. Em determinadas concretizações, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para se obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem típica pode compreender de cerca de 0,1 pg/kg até cerca de 30 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em concretizações preferidas, a dosagem pode compreender de 0,1 pg/kg até cerca de 30 mg/kg; mais preferivelmente de 1 pg/kg até cerca de 30 mg/kg; ou ainda mais preferivelmente de 5 pg/kg até cerca de 30 mg/kg.

Freqüência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do anticorpo anti-NGF particular na formulação usada. Tipicamente, um médico administra a composição até atingir uma dosagem que proporciona o efeito desejado. Assim, a composição pode ser administrada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que pode ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua via um dispositivo de implantação ou cateter. Refinamento adicional da dosagem apropriada é realizado de forma rotineira por aqueles com prática ordinária na técnica e situa-se dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas pelos mesmos. É possível determinar dosagens apropriadas por meio do uso de dados dose-resposta apropriados. Em determinadas concretizações, os anticorpos da invenção podem ser administrados a pacientes durante um período prolongado. Administração crônica de um anticorpo da invenção minimiza a resposta imunológica ou alérgica adversa comumente associada com anticoipos que são desenvolvidos contra um antígeno humano em um animal não-humano, por exemplo, um anticorpo não-completamente humano em uma espécie não-humana. A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo oralmente, por meio de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, ou intralesional; por meio de sistemas de liberação sustentada ou com dispositivos de implante. Em determinadas concretizações, as composições podem ser administradas por meio de injeção de bolus ou continuamente, por meio de infusão, ou com dispositivo de implantação. A composição também pode ser administrada localmente via implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em determinadas concretizações, onde se utiliza um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em um órgão ou tecido apropriado, e o fornecimento da molécula desejada pode ser via difusão, bolus de liberação prolongada ao longo do tempo, ou administração contínua.

Também pode ser desejável usar composições farmacologicamente aceitáveis de anticorpo anti-NGF de acordo com a invenção ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que foram removidos do paciente são expostos a composições farmacêuticas de anticorpo anti-NGF após o que as células, tecidos e/ou órgãos são implantados subseqüentemente de volta no paciente.

Em particular, anticorpos anti-NGF podem ser fornecidos por meio de implante de determinadas células que foram manipuladas geneticamente usando-se métodos, como aqueles descritos aqui, para expressar e secretar o polipeptídeo. Em determinadas concretizações, referidas células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas, ou xenogênicas. Em determinadas concretizações, as células podem ser imortalizadas. Em outras concretizações, visando diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar infiltração de tecidos circundantes. Em concretizações adicionais, os materiais de encapsulação são tipicamente membranas ou invólucros poliméricos semi-permeáveis biocompatíveis que permitem a liberação do(s) produto(s) de proteína mas que impedem a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidos e resultados obtidos são proporcionados apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados de forma a limitar a invenção.

Exemplo 1 Geração de proteína de NGF humano de células a partir de E. coli Clonagem de rHu-NGF (1-120) A seqüência de nucleotídeos que codifica NGF humano foi amplificada de cDNA usando-se os iniciadores de oligonucleotídeo com sequências como mostrado na SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28 e tecnologia de PCR convencional. O iniciador a 5’ cria um sítio de restrição Ndel e códon de iniciação de metionina que precede imediatamente o códon 1 (serina) da sequência madura. O iniciador a 3' cria um sítio de restrição BamHI imediatamente após o códon de terminação códon de terminação. O produto de PCR resultante foi purificado com gel, digerido com endonucleases de restrição Ndel e BamHI, e, depois, ligado no vetor pCFM1656, também digerido com Ndel e BamHI. DNA ligado foi transformado em células hospedeiras competentes da cepa 657 de E. coli. Clones foram selecionados quanto à capacidade de produzir o produto de proteína recombinante e de possuírem um plasmídeo apresentando a seqüência de nucleotídeos correta (isto é, SEQ ID NO:29). A seqüência de aminoácidos 1-120 do NGF humano recombinante é mostrada como SEQ ID NO: 30: O vetor de expressão pCFM1656 (ATCC #69576) foi derivado do sistema de vetor de expressão descrito na patente U.S. n° 4,710,473. O plasmídeo pCFM1656 pode ser derivado do plasmídeo pCFM836 descrito (Patente n° 4,710,473) por meio de: (a) destruição dos dois sítios de restrição de Ndel endógenos por meio de preenchimento da ponta com enzima T4 polimerase seguido de liga-se de ponta rombuda; (b) substituição da seqüência de DNA entre os sítios de restrição únicos Aatll e Ciai contendo o promotor PL sintético com um fragmento similar obtido de pCFM636 (patente n° 4,710,473) contendo o promotor PL e, depois, (c) substituir a seqüência pequena de DNA entre os sítios de restrição únicos Ciai e Kpnl com oligonucleotídeo resultante de recombinação de duas sondas apresentam seqüências de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO:32. A cepa hospedeira K12 de E. coli (cepa Amgen 657) é um derivado de E, coli W1485 (uma cepa K12), obtida do Centro de Estoque Genético de E. coli, Yale University, New Haven, CT (CGSC cepa 6159).

Expressão derHu-NGF 1-120) Células de E. coli contendo a construção de expressão de NGF (como descrito acima) foram fermentadas em meio rico, em modo batelada alimentada. Células foram desenvolvidas a 30°C a uma OD [densidade óptica] a 600 nm de 49, e, depois, induzidas com desvio de temperatura a 42°C. Células foram colhidas por meio de centrifugação quatro horas após a indução. OD final foi de 75, Rendimento da expressão foi determinado como sendo de aproximadamente 0,15 g/1. .

Redobragem e purificação de rHu-NGF(l-120) Pasta de células foi lisada em um Microfluidizer, centrifugada a 10.000 X g durante 30 minutos, o pellet foi lavado com ácido desoxicólico a 1%, centrifugado como acima, e o pellet resultante foi então lavado com água fria e recentrifugado. O pellet resultante (WIBs - washed inclusion bodies [corpos de inclusão lavados]) foi ressuspenso em desnaturador, 8M de guanidina HC1, 50 mM de Tris pH 8,5, contendo 10 mM de DTT, e solubilizado à temperatura ambiente durante 1 hora, centrifugado a 10.000 x g durante 30 minutos, e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado e depois diluído 25 vezes em um tamponante aquoso contendo um par redox a 4°C, durante 5 dias. A redobragem resultante foi então titulada a pH 3,0, filtrada através de um filtro de 0,45 uM. A redobragem foi purificada usando-se uma coluna Sp-Sepharose fast flow empregando um gradiente de NaCl padrão. O combinado da coluna de troca de cátion foi concentrado subseqüentemente e frações foram congeladas a -80°C. A pureza da proteína foi avaliada por meio de eletroforese de gel de SDS-poliacrilamída (SDS-PAGE) e analisada com manchamento de azul de Coomassie. A proteína purificada consistia em mais de 90% da banda principal, segundo este método.

Exemplo 2 Produção de anticorpos monoclonais humanos contra Fator de Crescimento dos Nervos (NGF) Camundongos KM e HuMab transgênicos Anticorpos monoclonais totalmente humanos para o NGF foram preparados usando cepas HCo7, HCol2, HCo7+HCol2, e KM de camundongos transgênicos, sendo que cada um expressa genes de anticorpo humana. Em cada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógeno foi disrompido homozigoticamente como descrito em Chen et al (1993, EMBO J. 12:811-820), e o gene de cadeia pesada endógeno de camundongo foi disrompido homozigoticamente como descrito no Exemplo 1 da Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 01/09187 (incorporado por referência). Cada uma destas cepas de camundongo porta um transgene de cadeia leve capa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14:845-851). A cepa HCo7 porta o transgene de cadeia pesada humana HCo7 como descrito nas patentes U.S. nums. 5,545,806, 5,625,825, e 5,545,807 (incorporada por referência). A cepa HCol2 porta o transgene de cadeia pesada humana HCol2 como descrito no Exemplo 2 da Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 01/09187 (incorporado por referência). A cepa HCo7+HCol2 porta ambos os transgenes de cadeia pesada HCo7 e HCol2 e é semizigótico para cada transgene. Os camundongos KM compreendem o transgene de cadeia pesada Sc20 como descrito em Tomizuka et al. (1997, Nature Genet. 16, 133-143 e 2000, Proc. Natl. Acad. Sei., 97, 722-727). Este transgene não é integrado em um cromossomo de camundongo, mas, ao invés, é propagado como um fragmento de cromossomo independente. O fragmento inclui aproximadamente 15 MB de cromossomo humano 14. Ele contém todo o lócus de cadeia pesada humana incluindo todos os segmentos de gene VH, D e JH e todos os isótipos de região constante de cadeia pesada. Todas estas cepas são referidas aqui como camundongos HuMab.

Imunizações HuMab: Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para o NGF, camundongos HuMab foram imunizados com NGF recombinante purificado derivado de células de E. coli como antígeno (Exemplo 1). Esquemas de imunização geral para camundongos HuMab são descritos em Lonberg et al (1994, Nature 368:856-859; Fishwild et al, acima, e Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 98/24884, cujos ensinamentos são incorporados por referência). Camundongos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante purificada (25-100 pg) de antígeno de NGF foi usado para imunizar os camundongos HuMab intraperitonealmente (IP) ou subcutaneamente (SC).

Imunizações de camundongos transgênicos HuMab foram obtidos usando-se antígeno em adjuvante de Freund completo e duas injeções, seguido de 2-4 semanas de imunização IP (até um total de 9 imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund incompleto. Várias dúzias de camundongos foram imunizadas para cada antígeno. Um total de 118 camundongos das cepas HCo7, HCol2, HCo7+HCol2, e KM foi imunizado com antígeno de NGF. A resposta imunológica foi monitorada por meio de sangramentos retroorbitais.

Para selecionar camundongos HuMab produtores de anticorpos que ligam NGF humano, soros de camundongos imunizados foram testados com ELISA como descrito por Fishwild et al acima. Em resumo, placas de mícrotitulação foram revestidas com NGF recombinante purificado de E. coli (Exemplo 1) a 1-2 pg/ml em PBS e 50 μΐ/poço incubado a 4°C de um dia para o outro, depois bloqueadas com 200 μΐ/poço de soro de frango a 5% em PBS/Tween (0,05%). Adicionou-se diluição de plasma de camundongos imunizados com NGF em cada poço e isto foi incubado durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e, depois, incubadas com um reagente policlonal específico para Fc de IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Placas foram lavadas com PBS/Tween e incubadas com um reagente policlonal específico para Fc de IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, número de catálogo A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas espectrofotometricamente por meio de determinação da densidade óptica (OD, optical density) a comprimentos de onda de 415-495 nm. Camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina anti-NGF humano foram usados para produzir anticorpos monoclonais como descrito abaixo.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos humanos monoclonais para NGF

Camundongos foram preparados para produção de anticorpos monoclonais por meio de reforço com antígeno intravenosamente 2 dias antes do sacrifício, e baços foram removidos em seguida. Os esplenócitos de camundongo foram isolados dos camundongos HuMab e fundidos com PEG a uma linhagem de células de mieloma de camundongo usando-se protocolos convencionais. Tipicamente, realizou-se de 10-20 fusões para cada antígeno.

Em resumo, suspensões de células simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados foram fundidas a um quarto do número de P3X63-Ag8.653 células de mieloma de camundongo não-secretoras (ATCC, Número de acesso CRL 1580) com 50% de PEG (Sigma). Células foram plaqueadas a aproximadamente 1 x 105/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de uma incubação de cerca de duas semanas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% de P388D1-(ATCC, número de acesso CRL TIB-63) meio condicionado, 3-5% de origem (IGEN) em DMEM (Mediatech, número de catálogo CRL 10013, com alto teor de glucose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e lx HAT (Sigma, número de catálogo CRL P-7185). Após de 1-2 semanas, células foram cultivadas em meio em que o HAT foi substituído por HT.

Os hibridomas resultantes foram selecionados quanto à produção de anticorpos específicos para antígeno, Poços individuais foram selecionados por meio de ELISA (descrito acima) quanto a anticorpos de IgG monoclonais anti-NGF humanos. Uma vez ocorrido crescimento extensivo de hibridoma, meio foi monitorado usualmente após de 10-14 dias. Hibridomas que secretam anticorpo foram replaqueados, novamente selecionados e, se positivos para IgG humana, anticorpos monoclonais anti-NGF foram subclonados pelo menos duas vezes com diluição limitante. Em seguida, os subclones estáveis foram cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Seleção de anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao NGF

Um ensaio ELISA como descrito acima foi usado para selecionar hibridomas que apresentaram reatividade positiva com imunogene de NGF. Hibridomas que secretam um anticorpo monoclonal que se ligaram com alta avidez ao NGF foram subclonados e caracterizados adicionalmente. Um clone de cada hibridoma, que conservava a reatividade de células parentais (como determinado por meio de ELISA), foi selecionado para a preparação de um banco de células em 5-10 frascos armazenados em nitrogênio líquido.

Realizou-se um ELISA específico para isótipo para determinar o isótipo dos anticorpos monoclonais produzidos como divulgado aqui. Nestes experimentos, poços de placas de microtitulação foram revestidos com 50 μΐ/poço de uma solução de 1 pg/ml de cadeia leve capa anti-humano de camundongo em PBS e isto foi incubado a 4°C de um dia para o outro. Após bloquear com soro de frango a 5%, as placas foram reagidas com sobrenadante de cada anticorpo monoclonal testado e um controle de isótipo purificado. Placas foram incubadas à temperatura ambiente durante de 1-2 horas. Em seguida, os poços foram reagidos com vários anti-soros policlonais anti-humanos de cabra conjugados com peroxidase de rabanete específicos para IgG humana e placas foram reveladas e analisadas como descrito acima.

Anticorpos monoclonais purificados dos sobrenadantes de hibridoma que apresentaram significativa ligação com NGF, conforme detectado com ELISA, foram testados adicionalmente quanto à atividade biológica empregando-se uma variedade de bioensaios como descrito abaixo. Exemplo 3 Seleção e clonagem de anticorpos anti-NGF com potente atividade neutralizadora de NGF A efetividade dos anticorpos inicialmente identificados no Exemplo 2 como inibidores de atividade de NGF (isto é, "neutralização" de NGF) foi avaliada medindo-se a capacidade de cada peptídeo modificado em bloquear a indução, com NGF, da expressão de receptor vanilóide-1 (VR1). Culturas neuronais de gânglio de raiz dorsal Gânglios de raiz dorsal (DRG, dorsal root ganglia) foram dissecados um a um, em condições assépticas, de todos os segmentos espinhais de ratos embrionários com 19 dias de vida (El 9) que foram removidos cirurgicamente do útero de ratos Sprague-Dawley prenhes, anestesiados terminalmente (Charles River, Wilmington, MA). DRG foram recolhidos em meio L-15 resfriado com gelo (GibcoBRL, Grand Island, NY) contendo 5% de soro de cavalo inativado com calor (GibcoBRL), e removeu-se qualquer tecido conectivo solto e vasos sanguíneos. Os DRG foram enxaguados duas vezes em solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco isenta de Ca2+- e Mg2+ (DPBS), pH 7,4 (GibcoBRL). Em seguida, os DRG foram dissociados em suspensão de células simples usando-se um sistema de dissociação de papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Em resumo, DRG foram incubados em uma solução de digestão contendo 20 U/ml de papaína em solução salina balanceada de Earle (EBSS, Earle's Balanced Salt Solução) a 37°C durante cinqüenta minutos. Células foram dissociadas por meio de trituração através de pipetas Pasteur polidas com fogo em um meio de dissociação que consiste de MEM/Hanfs F12, 1:1, 1 mg/ml de inibidor ovomucóide e 1 mg/ml de ovalbumina, e 0,005% de desoxirribonuclease I (DNase).

As células dissociadas foram pelotizadas a 200 x g durante cinco minutos e ressuspensas em EBSS contendo 1 mg/ml de inibidor de ovomucóide, 1 mg/ml de ovalbumina e 0,005% de DNase. Suspensão de células foi centrifugada por meio de uma solução de gradiente contendo 10 mg/ml de inibidor de ovomucóide, 10 mg/ml de ovalbumina a 200 x g durante seis minutos para remover fragmentos de células, e, depois, filtrada através de uma tela de nylon de 88 pm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) para remover quaisquer grumos. O número de células foi determinado com um hemocitômetro, e células foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com poli-omitina a 100 pg/ml (Sigma, St. Louis, MO) e laminina de camundongo a 1 pg/ml (GibcoBRL), a 10 x 103 células/poço em meio completo. O meio completo consistia de meio essencial mínimo (MEM, minimal essential médium) e Ham's F12, 1:1, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), e 10% de soro de cavalo inativado com calor (GibcoBRL). As culturas foram mantidas a 37°C, 5% de C02 e 100% de umidade. Para controlar o crescimento de células não-neuroniais incluiu-se no meio 5-fluoro-2'-desoxiuridina (75 μΜ) e uridina (180 μΜ).

Tratamento com NGF e anti-NGF

Duas horas após o plaqueamento, células foram tratadas com β-NGF humano recombinante (Amgen) ou β-NGF de rato recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) a uma concentração de 10 ng/ml (0,38 nM). Controles positivos compreendendo anti-corpo anti-NGF diluído serialmente (R&D Systems) foram aplicados em cada placa de cultura. Anticorpos de teste foram adicionados numa base de dez concentrações usando-se diluições seriais de 3,16 vezes. Todas as amostras foram diluídas em meio completo antes de serem adicionadas nas culturas. O tempo de incubação foi de 40 horas antes da medição da expressão de VR1.

Medição da expressão de VR1 em neurônios do DRG

Culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeído em solução balanceada de Hank durante quinze minutos, bloqueadas com Superblock (Pierce, Rockford, IL), e permeabilizadas com 0,25% de Nonidet P-40 (Sigma) em solução salina tamponada com Tris-HCl (Sigma) (TBS) durante uma hora à temperatura ambiente. Culturas foram enxaguadas uma vez com TBS contendo 0,1% de Tween 20 (Sigma) e incubadas com IgG anti-VR1 de coelho durante uma hora e meia à temperatura ambiente, seguido de incubação de segundo anticorpo anti-coelho marcado com Eu (Wallac Oy, Turku, Finlândia) durante uma hora à temperatura ambiente. Aplicou-se lavagens com (3 x cinco minutos com lenta agitação reciprocante) após cada incubação de anticorpo. Adicionou-se solução acentuadora (150 μΐ/poço, Wallac Oy) às culturas. Em seguida, o sinal de fluorescência foi medido em um fluorômetro com intervalo de tempo (Wallac Oy). Expressão de VR1 em amostras tratadas com os peptídeos modificados, como determinado por meio de comparação com uma curva padrão de titulação de NGF de 0-1000 ng/ml. O percentual de inibição (comparado com a inibição máxima possível) do efeito do NGF sobre a expressão de VR1 em neurônios do DRG foi determinado por meio de comparação com controles que não foram tratados com NGF. Resultados são dados nas Tabelas 2 e 5.

As linhagens de células foram marcadas de #110-#129. Anticorpos das linhagens de células #119, #124, e #125 demonstraram atividade extremamente potente de neutralização de NGF (Figura 1). A linhagem de células #124 era uma linhagem de células parental, também referida como 4D4. As linhagem de células #119 e #125 eram subclones da parental 4D4. Uma amostra adicional do frasco original compreendendo hibridoma #124 (4D4) foi desenvolvida e marcada como #167 (4D4).

Anticorpos gerados com hibridoma #167 (4D4) foram submetidos ao mesmo ensaio de neutralização com NGF baseado em neurônios de DRG como as amostras precedentes. Anticorpo #167 (4D4) demonstrou forte atividade anti-NGF com uma IC50 de 0,50 nM (Figura 2), que foi consistente com a atividade das amostras #119, #124, e #125. As atividades das 4 amostras são mostradas na Tabela 2.

Tabela 2 Seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa Amostras de anticorpos de hibridoma anti-NGF purificadas foram preparadas para seqüenciamento de proteína e análise de LC/MS. Anticorpos foram purificados de meio condicionado mediante concentração do meio usando Amicon centriprep-30 até que 0 volume fosse inferior a 15 ml. Uma batelada de resina rProA (Pharmacia) foi lavada 4x com PBS e preparou-se uma calda a 50% em PBS após a última lavagem. Uma quantidade apropriada de resina rProA (aproximadamente 5 ug de anticorpo/ul de resina mas usar não menos de 50 ul de resina) foi adicionada à amostra de anticorpo e incubada de um dia para 0 outro a 4°C. A mistura Ab-resina foi centrifugada e a fração não-ligada foi recolhida. Após adição de 0,5 ml de PBS e transferência para um tubo Spin-X de 0,45 um (CoStar) a amostra foi centrifugada a 10000 rpm durante 3 min. Em seguida, a resina foi lavada pelo menos 3 vezes com 0,5 ml de PBS e, depois, adicionou-se 0,1 M de glicina (pH 2,7) a 1,5 x volume de resina e incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de centrifúgação adicional durante 3 minutos a 10000 rpm, recolhendo-se 0 sobrenadante. Esta etapa de eluição foi repetida mais duas vezes e, depois, 0 sobrenadante combinado foi neutralizado com 1/25 do volume de 1,0 M de Tris (pH 9,2).

Após uma etapa final de filtração através de um novo tubo Spin-x (0,2 um) o anticorpo foi quantificado usando-se um ensaio Bradford convencional usando IgG humana como o padrão ou, altemativamente, absorbância a 280 para amostras maiores. Um gel também foi processado usando-se 2 ug de cada amostra, juntamente com 2 ug de IgGl.k humana (Sigma). Para espectrometria de massa, quatro mícrogramas das amostras foram desglicosilados, reduzidos, e carregados numa HPLC (HP 1090) online ligada com um espectrômetro de massa Finingan LCQ. A cadeia leve foi separada da cadeia pesada por meio de HPLC de fase invertida. As cadeias leves e cadeias pesadas também foram recolhidas para análise de seqüenciamento de proteína N-terminal.

Ambas as seqüências N-terminais da cadeia pesada e cadeia leve da amostra de anticorpo anti-NGF #167 (4D4) equipararam-se com ambas as seqüências N-terminais da amostra de anticorpo anti-NGF #119 (4D4). Adicionalmente, a massa medida dos anticorpos indicou que os anticorpos isolados dos hibridomas #167 e #119 eram os mesmos. A massa medida, desenrolada (23096) da cadeia leve de anti-NGF #167 equiparou-se com a massa medida (23096) da cadeia leve de anti NGF Ab #119.

Clonagem das cadeias pesada e leve do anticorpo anti-NGF O hibridoma expressando o anticorpo monoclonal de ligação de NGF mais potente, 4D4.D7, foi usado como fontes para isolar RNA total usando reagente TRIzol® (Invitrogen). cDNA de primeiro filamento foi sintetizado usando-se um iniciador randômico com um adaptador de extensão (5-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3') (SEQ ID NO: 33) e realizou-se um ensaio 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) preparativo usando-se o kit GeneRacer™ (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Para preparação cDNA codificando cadeia leve completa, o iniciador forward foi o iniciador embutido [nested] GeneRacer™, e o iniciador invertido foi o 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3' (SEQ ID NO: 34). Para a preparação de cDNA codificando a região variável da cadeia pesada, o iniciador forward foi o iniciador embutido GeneRacer™ e o iniciador invertido foi 5'-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3’ (SEQ ID NO 35). Produtos de RACE foram clonados em pCR4-TOPO (Invitrogen) e as seqüências foram determinadas. Usou-se seqüências de consensus para projetar iniciadores para amplificação com PCR de cadeia de anticorpo de comprimento pleno.

Para preparar cDNA codificando cadeia leve capa antí-NGF 4D4.D7, o iniciador de PCR a 5' codificou a ponta amino da seqüência sinal, um sítio de enzima de restrição Xbal, e uma seqüência Kozak otimizada (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3'; SEQ ID NO: 36). O iniciador a 3’ codificou a ponta carboxila e o códon de terminação, e também um sítio de restrição Sall (5-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3'; SEQ ID NO: 37). O fragmento de produto de PCR resultante foi purificado, digerido com Xbal e Sall, e, depois, isolado em gel e ligado no vetor de expressão mamífero pDSRa20 (ver Pedido Internacional, publicação n° WO 90/14363, que é incorporado aqui por referência para qualquer fim. pDSRax20 foi produzido alterando-se nucleotídeo 2563 em pDSRa09 de uma "Guanosina11 para uma "Adenosina" por meio de mutagênese direcionada para sítio).

Para preparação de cDNA codificando cadeia pesada anti-NGF 4D4.D7, o iniciador de PCR a 5' codificou a ponta amino da seqüência-sinal, um sítio de enzima de restrição Xbal, e uma seqüência Kozak otimizada (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3'; SEQ ID NO: 38). O iniciador a 3' codificou a ponta carboxila e códon de terminação, e também um sítio de restrição Sall (5'-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3'; SEQ ID NO: 39). O produto resultante foi purificado, digerido com Xbal e Sall, isolado em gel e ligado no vetor pDSRa20. A massa calculada (23099), como determinada traduzindo-se a seqüência de nucleotídeos para aminoácidos preditos e adição conjunta dos pesos moleculares dos aminoácidos, da seqüência de DNA da cadeia leve de clone 4D4 de Ab anti-NGF, equiparou-se com a massa medida como determinado por meio de espectrometria de massa. A massa desenrolada medida (49479) da cadeia pesada de Ab anti-NGF #167 equiparou-se com a massa medida (49484) da cadeia pesada de Ab anti-NGF #119 e também equiparou com a massa teórica (49484) da seqüência de DNA da cadeia pesada do clone de Ab anti-NGF 4D4 (Tabela 3) dentro do desvio instrumental.

Os dados de seqüência de proteína N-terminal e LC/MS confirmaram que hibridoma #119 expressou o mesmo anticorpo que o hibridoma #167. Adicionalmente, a massa calculada dos anticorpos baseada na seqüência confirmou adicionalmente a observação.

Tabela 3 - Sumário de verificações de espectrometria de massa Exemplo 4 Expressão de anticorpos anti-NGF em células de ovário de hâmster chinês ÍCHO) Obteve-se expressão estável de mAb anti-NGF 4D4 por meio de co-transfecção de cadeia pesada de 4D4/pDSRcri9 IgG2 ou cadeia pesada de 4D4/pDSRal9 IgGl e plasmídeos de NGF-capa/pDSRal9 em células de ovário de hâmster chinês (CHO) adaptadas isentas de soro com deficiência de diidrofolato redutase (DHFR') usando-se um método de fosfato de cálcio. Células transfectadas foram selecionadas em meio contendo soro dialisado, porém não contendo hipoxantina-timidina, para assegurar o crescimento de células expressando a enzima DHFR. Clones transfectados foram selecionados usando-se ensaios, como ELISA, para detectar a expressão de mAb antí-NGF 4D4 no meio condicionado. Os clones com maior expressão foram submetidos a concentrações crescentes de metotrexato (MTX) para amplificação com DHFR. Clones amplificados com MTX foram selecionados usando-se ensaios, como ELISA, para detectar maior expressão de mAb anti-NGF 4D4 no meio condicionado. Os clones com maior expressão foram submetidos a subclonagem para se obter uma população homogênea e criação de bancos de células.

Anticorpos anti-NGF recombinantes da invenção podem ser gerados em ovário de hâmster chinês com deficiência de DHFR usando-se o mesmo protocolo como descrito acima para o anticorpo monoclonal anti-NGF. As seqüências de DNA codificando a cadeia pesada ou cadeia leve completa de cada anticorpo anti-NGF da invenção são clonadas em vetores de expressão. Células CHOd são co-transfectadas com um vetor de expressão capaz de expressar uma cadeia pesada completa e um vetor de expressão expressando a cadeia leve completa do anticorpo anti-NGF apropriado. Por exemplo, para gerar o anticorpo anti-NGF, células são co-transfectadas com um vetor capaz de expressar uma complete cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 40 e um vetor capaz de expressar uma cadeia leve completa compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 44. Tabela 4 resume cadeias pesada completas e cadeias leves completas para os anticorpos 4D4 apresentando várias regiões constantes de cadeia pesada de IgG.

Tabela 4 Exemplo 5 Caracterização da atividade de anticorpos antí-NGF 4D4 Anticorpos anti-NGF 4D4 expressos transientemente, gerados em células desenvolvidas em condições de rotação (S, spinner) ou rolagem (R, roller) foram testados para confirmar sua capacidade de neutralizar NGF em um bioensaio de neutralização de NGF à base de neurônios de DRG, realizado como descrito acima (Exemplo 3).

Os anticorpos de NGF foram expressos transientemente em células 293T adaptadas em suspensão isenta de soro. Transfecções foram realizadas como culturas de 500 ml ou 11. Em resumo, o inóculo de células (5,0 X 105 células/ml X volume de cultura) foi centrifugado a 2.500 rpm durante 10 minutos a 4°C para remover o meio condicionado. As células foram ressuspensas em DMEM isento de soro e centrifugadas novamente a 2.500 rpm durante 10 minutos a 4°C. Após aspiração da solução de lavagem, as células foram ressuspensas em meio de crescimento [DMEM/F12 (3:1) + IX suplemento de Insulma-Transferrina-Selênio + IX Pen Strep Glut + 2 mM de L-Glutamina + 20 mM de HEPES + 0,01% de Pluronic F68] em uma cultura de frasco giratório de 1 1 ou 3 1. A cultura em frasco giratório foi mantida sobre placa de agitação magnética a 125 rpm que foi colocada em uma incubadora umidificada mantida a 37°C e 5% C02. O DNA plasmídeo foi complexado com o reagente de transfecção em um tubo cônico de 50 ml. O complexo DNA-reagente de transfecção foi preparado em 5% do volume de cultura final em DMEM isento de soro. Adicionou-se primeiramente 1 pg de DNA plasmídeo/ml de cultura em DMEM isento de soro, seguido de 1 μΐ de X-TremeGene RO-1539/ml de cultura. Os complexos foram incubados à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos e, depois, adicionados às células no frasco giratório. A transfecção/ expressão foi realizada durante 7 dias, após o que o meio condicionado foi colhido por meio de centrifugação a 4.000 rpm durante 60 minutos a 4°C.

Para transfecções transientes em frasco de rolamento nós usamos células aderentes 293T desenvolvidas e mantidas em DMEM suplementado com 5% de FBS + IX aminoácidos não-essenciais + IX Pen Strep Glut + IX piruvato de sódio. Aproximadamente 4-5 X 107 293T células foram semeadas em um frascos de rolamento de 850 cm de um dia para o outro. As células semeadas previamente foram transfectadas depois, no dia seguinte, usando reagente de transfecção FuGeneó. A mistura de DNA -reagente de transfecção foi preparada em aproximadamente 6,75 ml de DMEM isento de soro. Adicionou-se primeiramente 675 μΐ de reagente de transfecção FuGeneó, seguido de 112,5 pg de DNA plasmídeo. O complexo foi incubado à temperatura ambiente durante 30 minutos. Toda a mistura foi então adicionada em um frasco de rolamento. O frasco de rolamento foi gaseificado com uma mistura de gás de CO2 a 5%, tampado hermeticamente e colocado em uma incubadora a 37°C em um suporte de rolamento girando a 0,35 rpm. A transfecção foi realizada durante 24 horas após 0 que 0 meio foi substituído por 100 ml de DMEM + IX de suplemento de Insuhna-Transferrina-Selênio + IX Pen Strep Glu + IX aminoácidos não-essenciais + IX piruvato de sódio. Tipicamente, obteve-se, após 48 horas, duas colheitas de 100 ml de cada frasco de rolamento. O meio condicionado isento de soro que foi colhido foi combinado em conjunto e centrifugado a 4.000 rpm durante 30 minutos a 4°C.

Ambos, 4D4.IgGl e 4D4.IgG2 apresentaram atividade potente com valores de IC50 de cerca de 0,14 nM a cerca de 0,2 nM contra NGF humano (Figura 2). Os resultados do ensaio de atividade encontram-se resumidos na Tabela 5. Os anticorpos apresentaram pouca atividade contra NGF de rato (Figura 3). Os resultados assemelham-se com os da atividade dos anticorpos testados diretamente de hibridomas descritos acima.

Tabela 5 hNGF = NGF humano, rNGF - NGF de rato, R = cultura de rolamento, S = cultura giratória Exemplo 6 Produção de anticorpo anti-NGF

Anticorpo anti-NGF é produzido por meio de expressão em uma linha clonal de células de CHO. Para cada operação de produção, células de uma único frasco são descongeladas em meio de cultura de células isento de soro. As células são desenvolvidas inicialmente em um frasco T, seguido de frascos giratórios e, depois, desenvolvidas em reatores de aço inoxidável com ampliação da escala até um biorreator de 20001. A produção é realizada em um biorreator de 20001 usando-se uma cultura de batelada alimentada, em que se adiciona uma alimentação de nutrientes contendo componentes de meio concentrado para manter crescimento de células e viabilidade da cultura. A produção se estende durante aproximadamente duas semanas, sendo que durante este tempo anticorpo anti-NGF é produzido constitutivamente pelas células e secretado no meio de cultura de células. O reator de produção é controlado em um pH, temperatura, e nível de oxigênio dissolvido predeterminados: o pH é controlado por meio de gás de dióxido de carbono e de adição de carbonato de sódio; oxigênio dissolvido é controlado por fluxos gasosos de ar, nitrogênio, e oxigênio.

Ao término da produção, o caldo de células é introduzido em uma centrífuga de discos empilhados e o sobrenadante de cultura é separado das células. O concentrar é ainda mais clarificado por meio de um filtro de profundidade, seguido de um filtro de 0,2 pm. Em seguida, o meio condicionado clarificado é concentrado por meio de ultrafiltração de fluxo tangencial. O meio condicionado é concentrado de 15 a 30 vezes. O meio condicionado concentrado resultante é então processado por meio de purificação ou congelado para purificação em um momento posterior. Exemplo 7 Reatividade cmzada com outras neurotrofmas Os anticorpos 4D4 foram testados quanto a sua reatividade cruzada contra NT3 humano ou BDNF humano em diferentes bioensaios, incluindo o ensaio de sobrevida de neurônios de DRG para NT3 humano, e o ensaio de absorção de DA em neurônios de DA cultivados para BDNF humano.

Tratamento de culturas de DRG com NT3, anticorpos anti-NT3 e anti-NGF Duas horas após o plaqueamento, células de DRG (procedimento de isolamento descrito acima, no Exemplo 3) foram tratados comhNT-3 recombinante a 100 ng/ml (3,8 nM). Usou-se anticorpo anti-hNT3 (R&D) diluído serialmente como um controle positivo. Adicionou-se desconhecidos (amostras de Ab anti-NGF) em diversas concentrações, com diluições seriais de 3,16 vezes, 10 pontos. Todas as amostras foram diluídas em meio completo antes de serem adicionadas nas culturas.

Medição da expressão de MAP2 em neurônios de DRG

Culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeído em solução balanceada de Hank durante 15 min., bloqueadas com Superblock (Pierce) durante 1 hora e permeabilizadas com 0,25% de Nonidet P-40 (Sigma) em solução salina tamponada com Tris-HCl (Sigma) (TBS) durante 1 hora à temperatura ambiente (RT, room temperature). Culturas foram enxaguadas uma vez com TBS contendo 0,1% de Tween20 (Sigma) e incubadas com IgG anti-MAP2 de camundongo (Chemicon, Temecula, CA) durante 1,5 hora à temperatura ambiente, seguido de incubação de anticorpo secundário anti-camundongo marcado com Eu (Wallac Oy, Turku, Finlândia) durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavagens com TBS (3x5 min. com agitação cuidadosa) foram aplicadas após cada incubação de anticorpo. Adicionou-se solução acentuadora (150 ml/poço, Wallac Oy) nas culturas e mediu-se então o sinal de fluorescência em um fluorômetro com intervalo de tempo (Wallac Oy).

Cultura mesenfâlica embriônica Usou-se ratos Sprague-Dawley embrionários com 19 dias de vida (El9) (Jackson Labs). Tecido ventral da parte mediana do cérebro enriquecido para neurônios dopaminérgicos foi removido e transferido para solução salina tamponada com fosfato Dulbecco (DPBS) fria, pH 7,4, sem Ca++ e Mg++ (Gibco). Os fragmentos de tecido foram dissociados em suspensão de células simples usando um sistema de dissociação de papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Em resumo, fragmentos de tecido foram incubados em uma solução de digestão contendo 20 unidades/ml de papaína em solução salina balanceada de Earle (EBSS) a 37°C durante 50 min. Células foram dissociadas por meio de trituração através de pipetas Pasteur polidas com fogo em um meio de dissociação que consiste de MEM/Ham's F12 1:1, 1 mg/ml de inibidor de ovomucóide e 1 mg/ml de ovalbumina e 0,005% de desoxirribonuclease I (DNase). As células dissociadas foram pelotizadas a 200 x g durante 5 min. e ressuspensas em EBSS contendo 1 mg/ml de inibidor de ovomucóide, 1 mg/ml de ovalbumina e 0,005% de DNase. Suspensão de células foi centrifugada através de uma solução de gradiente contendo 10 mg/ml de inibidor de ovomucóide, 10 mg/ml de ovalbumina a 200 x g durante 6 min. para remover os fragmentos de células; e filtrados através de uma tela de nylon Nitex de 25 pg (Tetko, Inc.) para remover os grumos. As células dissociadas foram plaqueadas em placas de cultura de tecido a uma densidade de 100.000/cm . As placas foram pré-revestidas com poli-omitina a 100 pg/ml (Sigma) e laminina de camundongo a 1 pg/ml (Gibco BRL) como descrito previamente (Louis JC et ai, J Pharmacol. Exp. Ther. 1992; 262:1274-1283). O meio de cultura consistia de meio essencial mínimo (MEM)/Ham's F12, 1:1, 12% de soro de cavalo (Gibco), 100 pg/ml de transferrina e 2,5 pg/ml de insulina (Sigma). As culturas foram mantidas a 37°C, 5% de C02 e 100% de umidade durante 6 dias.

Tratamento de culturas mesenfàlicas com BDNF e anti-BDNF ou anti-NGF Adicionou-se BDNF a 10 ng/ml às células 2 horas após o plaqueamento, seguido de concentrações seriais de amostras de Ab anti-NGF. Anticorpo anti-BDNF (gerado na Amgen) foi usado como um controle positivo.

Absorção de DA em neurônios mesenfálicos Ensaio de absorção de dopamina foram realizados como descrito previamente (Friedman, L. e Mytilineou, C., Neuroscience Letters 1987; 79:65-72). No dia 6, culturas foram lavadas uma vez com tamponante de fosfato de Krebs-Ringer previamente aquecido (pH 7,4) contendo 5,6 mM de glucose, 1,3 mM de EDTA e 0,5 mM de pargilina, um inibidor de monoamina oxidase. As culturas foram incubadas em tamponante de absorção contendo 50 nM [3H]DA (NEN) durante 60 minutos a 37°C. A absorção foi interrompida por meio de remoção do tamponante de absorção, e as culturas foram lavadas três vezes com tamponante de fosfato de Krebs-Ringer. Células foram lisadas para liberarem [3H]DA mediante adição de um coquetel de cintilação líquido, opticphase supermix (Wallac), diretamente nas culturas. Depois, os lisados de células tiveram a radioatividade contada em um contador de cintilação líquido microbeta-plus (Wallac, Inc.). Avaliou-se a absorção de DA com baixa afinidade mediante adição de 0,5 mM de GBR12909, um inibidor específico dos sítios de absorção de DA com alta afinidade (Heikkila RE e Mazino L, European Journal of Pharmacology 1984; 103:241-8) ao tamponante de absorção, e subtração da quantidade de absorção total para se obter o valor de absorção de DA com alta afinidade. Tabela 6 Exemplo 8 Identificação de um epítopo para anticorpos anti-NGF Mapeamento de epítopo por meio deproteólise limitada Cinco microgramas (pg) de NGF foram incubados com 4D4 (Π μg) durante 30 minutos a 4°C em 0,1 M de tamponante Tris, pH 7,5. Em o seguida, o complexo foi digerido com 1 pg de protease (subtilisina) a 37 C durante 1 e 2 horas. Comparou-se mapas de peptídeos de HPLC para ensinar a outros como encontrar os peptídeos que foram protegidos pelos anticorpos 4D4. Proteólise limitada de NGF indicou que vários peptídeos principais foram liberados inicialmente de NGF. De interesse particular, peptídeos S18.3, S18.5, e S34.4 foram gerados e protegidos com anticorpo da proteólise. Outros picos não foram formados ou protegidos significativamente. Os peptídeos protegidos de dois experimentos (digestão de 1 hora e 2 horas) são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7 O percentual de proteção foi calculado a partir da altura do pico de peptídeo. SI8.5 continha dois peptídeos, porém apenas um peptídeo (SSSHPIFHR; SEQID NO: 46) foi protegido com o anticorpo 4D4, por que o outro pico de peptídeo (HWNSY; SEQ ID NO: 47) se manteve inalterado com a adição de anticorpos 4D4, conforme detectado a 280 nm de absorbância. Peptídeo SI8.3 era uma parte C-terminal de S34.4, ambas da mesma região de alça. Regiões de alça N-terminal e central também eram epítopos possíveis.

Separação de microcon de peptídeos digeridos O material digerido com subtilisina (3 pg cada) foi incubado com anticorpos 4D4 ativos e com um anticorpo monoclonal inativo (#162) (8 pg) durante 30 minutos a 4°C em tamponante de 0,1 M de Tris, pH 7,5. Os peptídeos ligados/não-ligados foram separados com Microcon 10 (Millipore Corp., Bedford, Mass) e ambas as frações (ligada e não-ligada) foram analisadas com HPLC para se investigar peptídeos ligados a anticorpos. Dois picos depletados identificados por meio de comparação com HPLC das frações não-ligadas após tratamento com anticorpos 4D4 e #162 e separação com Microcon foram recuperados, indicando peptídeos ligados a anticorpo. Os peptídeos ligados a 4D4 foram os seguintes: SI(4,4) --SRKAVRR(113-119) (SEQID NO: 49), C-terminal; e S2(28,3) —-EVMVL (35-39) (SEQ ID NO: 50), região de alça.

Uma amostra de NGF foi digerida altemativamente com Lys-C (K) durante 24 horas. Radicais cisteína foram reduzidos e carboximetilados sem desnaturador. A amostra foi incubada com anticorpos monoclonais 4D4 e AMG162, seguido de separação com Microcon 100. Frações ligadas e não-ligadas foram analisadas por meio de HPLC de fase invertida. Apenas dois peptídeos foram identificados como peptídeos K de ligação com anticorpo como indicado abaixo. A massa calculada para os peptídeos, determinada por meio de análise de seqüências, e a espectrometria de massa dos peptídeos foram consistentes. Os peptídeos, como indicado abaixo, foram mapeados para a região N-terminal e C-terminal, Kl(37,6) —SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK (SEQ ID NO: 51) Massa calculada = 2821; Massa observada = 2828,2; N-terminal K2(39,5) ~~ QAAWRFIRIDTACVCVLSRK (SEQ ID NO: 52) Massa calculada = 2452; Massa observada = 2459,5; C-terminal Os experimentos precedentes de mapeamento de epítopo indicaram que pelo menos três regiões consistiam de epítopos possíveis para os anticorpos 4D4, incluindo regiões N-terminal (1-9), interna (46-57), e C-terminal (96-98). Adicionalmente, uma digestão AspN revelou que um fragmento de peptídeo que consiste de — SSHPIFHRGEFSVC— (SEQ ID NO: 53) foi protegido pelo anticorpo 4D4, enquanto que uma digestão com tripsina mostrou que um fragmento de peptídeo consistindo de ---SSHPIFHR-— (SEQ ID NO: 54) não foi protegido pelo anticorpo 4D4. Assim, na ponta N, a sequência GEFSVC (SEQ ID NO: 55) é mais importante para ligação com anticorpos 4D4.

Para definir mais claramente o epítopo para o anticorpo anti-NGF 4D4.IgGl, um total de 23 peptídeos foram gerados sinteticamente usando-se técnicas convencionais baseadas em toda a seqüência de NGF madura humana (hNGF) (Tabela S). Os peptídeos apresentavam comprimentos de 15 aminoácidos, superposição de 10 aminoácidos, e com cauda cisteína nas pontas C de forma a permitir conjugação com a matriz. O Ab anti-hNGF humano 4D4.IgGl descrito acima foi usado para o experimento de mapeamento.

Tabela 8 Os fragmentos de peptídeo de NGF humano foram diluídos em PBS com 5% de DMSO, 1 mM de EDTA, pH 6,23. A concentração final de peptídeos foi normalizada à mesma concentração molar, a 55 μΜ (cerca de 100 pg/ml). Peptídeos foram incubados em placas de microtitulação de 96 poços ativadas com Reacti-Bind Maleimide (Pierce, n° de catálogo 15150), o 100 μΐ/poço, à temperatura ambiente durante 2 horas e, depois, a 4 C de um dia para o outro com agitação. NGF humano (100 pg/ml) foi usado como controle positivo. As placas foram lavadas com tamponante de lavagem (KPL) e bloqueadas com 0,2% de leite em pó desnatado (em tamponante PBS-EDTA, pH 6,23) durante 2 horas à temperatura ambiente e, depois, bloqueados adicionalmente com 5% de BSA durante 1 hora. Em seguida, placas foram incubadas com o anticorpo anti-NGF humano a diversas concentrações (0, 3, 10, 30 pg/ml), seguido de Ab-HRP anti-hEc de cabra (KPL) durante 2 horas. Sinal foi revelado com substrato TMB e lido a 450 nm após adição de solução de interrupção (KPL).

Nos 23 peptídeos de NGF humano, observou-se pelo menos 4 picos principais, indicando ligação de 4D4. Estes picos corresponderam aos seguintes peptídeos: peptídeo n° 1 (SEQ ID NO: 56), SSSHPIFHRGEFSVC (1-15); Peptídeo n° 10 (SEQ ID NO: 65), NSVFKQYFFETKARD (46-60); Peptídeos n° 16 - 17 (SEQ ID NO: 71-SEQ ID NO: 72), WNSYATTTHTFVKAL— (76-95); e Peptídeos n° IS - 21 (SEQ ID NO: 73 -SEQ ID NO: 76), TTTHT— LSRKC (100-115).

Os quatro picos de ligação de 4D4 mapeados na ponta N, ponta C, domínios internos, e também alças L2 e L4 em NGF como descrito por Weismann et ai (1999, Nature 401:184-8). Estes resultados encontram-se resumidos na Tabela 9.

Tabela 9 Wiesmann et al resolveu a estrutura cristalina do hNGF ligado ao receptor trkA, mostrando que a ponta N (radicais 2-9) era importante para ligação de receptor (Wiesmann et ai, 1999, Nature 401:184-8). Os radicais deste segmento em NGF também são importantes para especificidade para trkA relativamente a receptores trkB ou trkC. Anticorpo 4D4 é seletivo para NGF relativamente a NGF de camundongo/rato, e também BDNF e NT-3, o mais provavelmente devido a diferenças N-terminais entre NGF humano e outras neurotrofinas.

Anticorpo 4D4 liga-se a peptídeo n° 10 (SEQ ID NO: 65) (NSVFK—, 46-60) e peptídeo n° 17 (SEQ ID NO: 72) (TTTHTFVKALTMDGKC, 81-95), correspondendo respectivamente às alças L2 e L4, que representam duas de sete regiões distintas com diversidade maior do que a média entre as neurotrofinas. Experimentos de troca entre NGF e BDNF destas sete regiões mostraram que L2 e L4 foram importantes para a atividade biológica de NGF. Além disso, a substituição de cinco radicais NT3 nas alças L2 e L4 por aqueles de NGF introduziu atividade similar à do NGF, ao mesmo tempo em que se mantinha atividade de NT3. Assim, L2 e L4 são provavelmente regiões em que anticorpo 4D4 liga-se seletivamente ao NGF ao invés de ao BDNF ou NT-3.

Anticorpo 4D4 também se liga ao peptídeo n° 16 (SEQ ID NO: 71) (WNSYATTTHTFVKAL, 76-90), equiparando-se com um domínio interno da estrutura cristalina do NGF. Esta região é 100% homóloga entre NGF humano e NGF de camundongo, porém distinta de outras neurotrofinas. 4D4 apresentou atividade muito menor contra NGF de rato/camundongo quando comparado com sua atividade contra NGF humano. Assim, ligação a esta parte do NGF mui provavelmente não é crítica com relação à especificidade para espécies, porém é importante para seletividade entre neurotrofinas.

Anticorpo 4D4 também se liga à região C-terminal do NGF (peptídeos n° 19-21 (SEQID NO: 74 - SEQ ID NO: 76) TMDGK—LSRKC, 91-115), que é uma das regiões do NGF humano que distingue NGF de outras neurotrofmas (BDNF e NT3). A ligação a esta região auxilia a explicar porque 4D4 não é ativo contra outras neurotrofmas. Além disso, há uma única diferença de aminoácidos entre NGF humano e NGF de camundongo na ponta C, sugerindo que este único aminoácido pode ser uma das razões porque 4D4 é seletivo para NGF humano relativamente a NGF de rato/camundongo, de forma similar à ponta N onde se observa diferenças entre espécies.

Finalmente, 4D4 também interage com um domínio interno descrito pelo peptídeo n° 10 (SEQ ID NO: 65) (—KARDC, 50-60) do NGF humano, que é uma região importante para ligação de NGF preferencialmente a trkA, ao invés de trkB ou trkC, explicando adicionalmente sua atividade de neutralização seletiva contra NGF humano.

Exemplo 9 Medição de afinidade de anticorpos monoclonais por meio de KinExA A ligação de Ab 4D4 (38859-80) a huNGF (29714-e91) foi testada em KinExA. Em resumo, Reacti-Gel 6x (Pierce) foram previamente revestidos com huNGF e bloqueados com BSA. 10 pM e 30 pM de amostras de Ab 4D4 foram inoculados com várias concentrações de huNGF (Amgen) à temperatura ambiente durante 8 horas antes da operação através das pérolas revestidas com huNGF. A quantidade do anticorpo ligado a pérolas foi quantificada por meio de anticorpo de IgG anti-humano de cabra marcado de forma fluorescente (Cy5) (Jackson Immuno Research). O sinal de ligação foi proporcional à concentração do anticorpo livre no equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi obtida de regressão não-linear das curvas de competição usando-se um modelo homogêneo de curva dupla no próprio local (programa KinEx™). A KD foi de cerca de 4 pM para ligação de Ab 4D4 ao huNGF.

Exemplo 10 Identificação de anticorpos anti-NGF adicionais Anticorpos anti-NGF adicionais (denominados 14D10, 6G9, 7H2, 14F11, e 4G6), gerados e identificados como descrito nos Exemplos 2 e 3 acima, foram selecionados para estudo adicional. Em resumo, meio condicionado foi testado quanto à atividade de ligação. Anticorpos do meio foram purificados e seqüenciados. A massa predita foi comparada com dados de espectrometria de massa de anticorpos do meio condicionado. Os anticorpos foram clonados. Dois dos clones foram expressos em células de CHO e testados quanto à atividade como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10 As seqüências das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada destes anticorpos foram comparadas depois com a seqüência de anticorpo 4D4, e também entre si (Figuras 5 e 6). Os percentuais de homologias das regiões variáveis de cadeia pesada, como identificadas a partir destas comparações, são mostradas na Tabela 11. Os percentuais de homologias da regiões variáveis de cadeia leve são mostrados na Tabela 12. Adicionalmente, os percentuais de homologia das regiões CDR dos vários anticorpos são mostrados nas Figuras de 5-10.

Tabelall________ ___ ____________________________________ Tabela 12 Deve-se compreender que a descrição precedente enfatiza determinadas concretizações específicas da invenção e que todas as modificações ou alternativas equivalentes às mesmas encontram-se dentro do espírito e da abrangência da invenção, como apresentado nas reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Anticorpo isolado, ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo, que se liga especificamente em NGF, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada possuindo uma região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve possuindo uma região variável de cadeia leve na qual a região variável de cadeia pesada compreende: a) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:22, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 18, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 14; b) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:92, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:93, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:94; c) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:98, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:99, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 100; d) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 104, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 105, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 106; e) a CDRI de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:l 10, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 111, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:l 12; ou 0 a CDRI de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118.

2. Anticorpo, ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende: a) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:24, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:20, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 16; b) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:95, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:96, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:97; c) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 101, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 102, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 103; d) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 107, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 108, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 109; e) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 113, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 114, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 115; f) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 119, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 120, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 121; g) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 122, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 123, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 124; h) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 125, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 126, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 127; i) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 128, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 129, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 130; ou j) a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 132, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 133, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 134.

3. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende: a) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:22, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 18, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 14; e a a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:24, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:20, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 16; b) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:92, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:93, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:94; e a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:95, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:96, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:97; c) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:98, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:99, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 100; e a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 101, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 102, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 103; d) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 104, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 105, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 106; e a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 107, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 108, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 109; e) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 110, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 111, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 112; a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 113, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 114, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 115; f) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118; e a a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 119, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 120, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 121; g) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118; e a a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 122, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 123, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 124; h) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118; e a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 125, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 126, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 127; i) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118; e a a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 128, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 129, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 130; ou j) a CDR1 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 116, a CDR2 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 117, e a CDR3 de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 118; e a CDR1 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 132, a CDR2 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 133, e a CDR3 de cadeia leve possui uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 134.

4. Anticorpo isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo, que se liga especificamente em fator de crescimento de nervo, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, ou SEQ ID NO:87, ou um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou um ligante de antígeno do mesmo.

5. Anticorpo isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, ou SEQ ID NO: 131, ou um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou um ligante de antígeno do mesmo.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve compreendendo: a) SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; b) SEQ ID NO:79 e SEQ ID NO:80; c) SEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:82; d) SEQ ID NO:83 e SEQ ID NO:84; e) SEQ ID NO:85 e SEQ ID NO:86; f) SEQ ID NO:87 e SEQ ID NO:88; g) SEQ ID NO: 87 e SEQ ID NO:89; h) SEQ ID NO:87 e SEQ ID NO:90; i) SEQ ID NO:87 e SEQ ID NO:91; ou SEQ ID NO:87 e SEQ ID NO: 131.

7. Anticorpo isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo que se liga especificamente em fator de crescimento de nervo, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequeência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:43, ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo.

8. Anticorpo isolado ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma cadeia leve possuindo uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:44.

9. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se dissocia de um polipeptídeo de NGF humano com uma Kd de cerca de 1 x 10'9 ou menor e neutraliza a bioatividade de NGF humano em um ensaio padrão in vitro com uma IC50 de cerca de 1 x 10'8 M ou menor.

10. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se dissocia de um polipeptídeo de NGF humano com uma Kd de cerca de 1 x IO'10 ou menor e neutraliza a bioatividade de NGF humano em um ensaio padrão in vitro com uma IC50 de cerca de 1 x 10'9 M ou menor.

11. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se dissocia de um polipeptídeo de NGF humano com uma Kd de cerca de 1 x 10'11 ou menor e neutraliza a bioatividade de NGF humano em um ensaio padrão in vitro com uma IC50 de cerca de 0,2 x 10'9 M ou menor.

12. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve são conectadas por um ligando flexível para formar um anticorpo de cadeia única.

13. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo Fv de cadeia única.

14. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo Fab.

15. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo Fab'.

16. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo (Fab')2-

17. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo totalmente humano.

18. Anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de inibir a sinalização de NGF.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente efetiva de anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8 ou 9-18.

20. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8.

21. Medicamento para tratar um distúrbio doloroso ou uma condição associada com a expressão aumentada de NGF ou a sensibilidade aumentada ao NGF, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade farmaceuticamente efetiva um anticorpo monoclonal ou de um seu fragmento dc imunoglobulina imunologicamente funcional, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do anticorpo monoclonal ou do fragmento, no qual o citado anticorpo monoclonal é pelo menos um do citado anticorpo monoclonal ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8 ou 9-18, e um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

22. Uso de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de anticorpo ou fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional ou ligante de antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8 ou 9-18, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento adequado para tratar um distúrbio doloroso ou uma condição associada com a expressão aumentada de NGF ou a sensibilidade aumentada ao NGF.

23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o distúrbio doloroso ou a condição é selecionado do grupo consistindo de dor aguda, dor de dente, dor de trauma, dor cirúrgica, dor resultante de amputação ou abscesso, causalgia, doenças de desmielinação, neuralgia trigeminal, câncer, alcoolismo crônico, derrame cerebral, síndrome de dor talâmica, diabetes, síndrome de deficiência imune adquirida ("AIDS"), toxinas, quimioterapia, cefaléia geral, enxaqueca, cefaléia em cachos, síndrome não-vasculares ou vasculares-mistas, cefaléia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, fibromialgia,doenças inflamatórias do intestino, síndrome do intestino irritável, distúrbios infiamatórios oculares, distúrbios infiamatórios de bexiga ou de bexiga instável, psoríase, distúrbios de pele com componentes infiamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, neurite, doenças vasculares de colágeno, condições inflamatórias crônicas, dor inflamatória e alodinia e hiperalgia associadas, dor neuropática e alodinia e hiperalgia associadas, dor neuropática diabética, causalgia, dor simpateticamcnte mantida, síndromes de bios de motilidade visceral em regiões respiratória, genitourinária, •intestinal ou vascular, ferimentos, queimaduras, reações alérgicas da prurido, vitiligo, distúrbios gastrointestinais gerais, colite, ulceração za, úlceras duodenais, rinite alérgica ou vasomotora, ou distúrbios uiais, dismenorréia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite, ou algia. desaferenciação, asma, disfunção ou dano de tecido epitelial, herpes simples, distúrbios de motilidade visceral em regiões respiratória, genitourinária, gastrointestinal ou vascular, ferimentos, queimaduras, reações alérgicas da pele, prurido, vitiligo, distúrbios gastrointestinais gerais, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite alérgica ou vasomotora, ou distúrbios bronquiais, dismenorréia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite, ou visceralgia.