JP2010162028A - 選択的ｎｇｆ経路インヒビターとしてのヒト抗ｎｇｆ中和抗体 - Google Patents

選択的ｎｇｆ経路インヒビターとしてのヒト抗ｎｇｆ中和抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】ＮＧＦのような、疼痛の低分子のメディエーター（媒介因子）または悪化因子（
ｅｘａｃｅｒｂａｔｏｒ）を標的にすることによる、疼痛の新規な安全かつ有効な治療の
必要性が存在する。
【解決手段】上記課題は、ヒト神経成長系（ＮＧＦ）と相互作用するか、またはそれに結
合して、それによって、ＮＧＦの機能を中和する抗体を提供することによって解決された
。本発明はまた、このような抗体の薬学的組成物、および抗ＮＧＦ抗体の薬学的に有効な
量を投与することによってＮＧＦ機能を中和するため、そして特にＮＧＦ関連障害（例え
ば、慢性疼痛）を治療するための方法を提供する。抗ＮＧＦ抗体を用いてサンプル中のＮ
ＧＦの量を決定する方法もまた提供される。
【選択図】なし

Description

本出願は、その開示が本明細書に参照として援用される、２００３年７月１５日出願、
米国仮出願第６０／４８７，４３１号に関しており、それに対する優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するヒトモノクローナル抗体に関する。疼痛
および疼痛関連障害を処置するための組成物および方法も記載される。
（発明の背景）
毎日、米国では２００万を超える人々が慢性疼痛に苛まれている（Ｊｅｓｓｅｌｌおよ
びＫｅｌｌｙ，１９９１「Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ」ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ
Ｓ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，第３版，（Ｋａｎｄｅｌ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ
，およびＪｅｓｓｅｌｌ（編）），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（非特許文献１
））。不幸にも、疼痛の現行の治療は、部分的にしか有効ではなく、多くのこれらの治療
自体が衰弱または有害な副作用を引き起こす。例えば、非ステロイド系抗炎症薬（「ＮＳ
ＡＩＤｓ」）、例えばアスピリン、イブプロフェンおよびインドメタシンは、炎症性疼痛
に対してほどほどに有効であるが、それらはまた腎毒性でもあり、高用量では胃腸の刺激
作用、潰瘍、出血および精神の錯乱を引き起こす傾向がある。オピオイドで治療された患
者はまた、高頻度に錯乱を経験し、そして長期のオピオイドの使用は、耐性および依存性
を伴う。リドカインおよびメキシレチンのような局所麻酔薬は、同時に、疼痛を阻害して
正常な感覚の喪失を引き起こす。
疼痛は、環境から受けたシグナルに基づく知覚であり、そして神経系によって伝達およ
び解釈される（概説に関しては、Ｍｉｌｌａｎ，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ
ｌ．５７：１〜１６４（非特許文献２）を参照のこと）。熱および触覚のような侵害刺激
によって、皮膚の専門的な感覚受容体が中枢神経系（「ＣＮＳ」）にシグナルを送るよう
になる。このプロセスは痛覚と呼ばれ、それを媒介する末梢感覚神経は侵害受容器である
。侵害受容器（単数または複数）からのシグナルの強度、ならびにＣＮＳによるそのシグ
ナルの抽象作用および同化作用に依存して、侵害性刺激は人にとって疼痛と受け取られる
こともそうでないこともあり得る。ある人による疼痛の知覚が刺激の強度まで適切に校正
された場合、疼痛はその意図どおりの防御機能を果たす。しかし、特定のタイプの組織障
害は、その人の痛覚閾値が低下しているため、比較的非侵害性の刺激が強度に疼痛性とし
て知覚される、痛覚過敏または痛覚亢進（ｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）として公知の
現象を生じる。炎症および神経障害の両方が痛覚過敏を誘発し得る。炎症性状態、例えば
、日焼け、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病（関節リ
ウマチおよび狼瘡を含む）などに罹患している人は、多くの場合、疼痛が増強された感覚
を経験する。同様に、外傷、外科手術、切断、膿瘍、カウザルギー、膠原血管病、脱髄疾
患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、ヘルペス
感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、および化学療法は、過剰な疼痛を
生じる神経の損傷をもたらす。
侵害受容器が、正常な状態および痛覚過敏の状態のもとで外部シグナルを変換する機構
はさらによく理解されてきているので、痛覚過敏に関与するプロセスは、疼痛閾値の低下
を阻害して、それによって受け取る疼痛の量を減少することを目標とされ得る。
神経栄養因子は、生理学的疼痛および病理学的疼痛の伝達において重大な役割を果たす
ことが示されている。神経成長因子（ＮＧＦ）は、特に重要であると考えられる（概説に
ついては、ＭｃＭａｈｏｎ，１９９６、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．
３５１：４３１〜４０（非特許文献３）；およびＡｐｆｅｌ，２０００，Ｔｈｅ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６：Ｓ７−Ｓ１１（非特許文献４）を
参照のこと）。ＮＧＦの局所的投与および全身的投与の両方が、痛覚過敏および異痛症を
誘発することが示されている（Ｌｅｗｉｎら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
．６：１９０３〜１９１２（非特許文献５））。ヒトでのＮＧＦの静脈内注入は、全身の
筋肉痛を生じるが、局所投与は、全身的な効果に加えて、注射部位の痛覚過敏および異痛
症を誘発する（Ａｐｆｅｌら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５〜７０２（
非特許文献６））。疼痛が顕著な特徴である状態では内因性のＮＧＦに関与するかなりの
一連の証拠がやはり存在する。例えば、ＮＧＦは、末梢神経の損傷後少なくとも２ヶ月間
、後根神経節（ＤＲＧ）シュワン細胞において上方制御され、そして種々の関節炎モデル
を罹患している動物の関節でレベルの増大が報告されている（例えば、Ａｌｏｅら，１９
９３，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９：１４９〜１５５（非特許文献７））。ヒトで
は、ＮＧＦレベルは、関節リウマチまたは他のタイプの関節炎を有する患者由来の滑液中
で上昇している（例えば、Ａｌｏｅら，１９９２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅ
ｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１〜３５５（非特許文献８））。さらに、ＮＧＦ機能の拮抗
によって、神経障害性疼痛および慢性炎症性疼痛のモデルにおける痛覚過敏および異痛症
が防止されることが実証されている。例えば、神経障害性疼痛の動物モデルでは（例えば
、神経幹または脊髄神経の結紮）、ＮＧＦに対する中和抗体の全身注射は、異痛症および
痛覚過敏の両方を防止する（Ｒａｍｅｒら，１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
１１：８３７〜８４６（非特許文献９）；およびＲｏら，１９９９，Ｐａｉｎ ７９：２
６５〜２７４（非特許文献１０））。当該分野で公知の抗ＮＧＦ抗体の例としては、例え
ば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７８６９８（特許文献１）、ＷＯ０１／６４２４７（特許
文献２）、ＷＯ０２／０９６４５８（特許文献３）およびＷＯ２００４／０３２８７０（
特許文献４）；米国特許第５，８４４，０９２号（特許文献５）、同第５，８７７，０１
６号（特許文献６）および同第６，１５３，１８９号（特許文献７）；Ｈｏｎｇｏら，２
０００，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５〜２２７（非特許文献１１）；Ｈｏｎｇｏら
，１９９３、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９〜５６８（非特許文献１２）；
およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８またはＬ１７
０７７が挙げられる。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７８６９８ ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６４２４７ ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６４５８ ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０３２８７０ 米国特許第５，８４４，０９２号 米国特許第５，８７７，０１６号 米国特許第６，１５３，１８９号
ＪｅｓｓｅｌｌおよびＫｅｌｌｙ，１９９１「Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ」ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，第３版，（Ｋａｎｄｅｌ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，およびＪｅｓｓｅｌｌ（編）），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｉｌｌａｎ，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５７：１〜１６４ ＭｃＭａｈｏｎ，１９９６、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．３５１：４３１〜４０ Ａｐｆｅｌ，２０００，Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６：Ｓ７−Ｓ１１ Ｌｅｗｉｎら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３〜１９１２ Ａｐｆｅｌら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５〜７０２ Ａｌｏｅら，１９９３，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９：１４９〜１５５ Ａｌｏｅら，１９９２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１〜３５５ Ｒａｍｅｒら，１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７〜８４６ Ｒｏら，１９９９，Ｐａｉｎ ７９：２６５〜２７４ Ｈｏｎｇｏら，２０００，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５〜２２７ Ｈｏｎｇｏら，１９９３、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９〜５６８
特に、ＮＧＦのような、疼痛の低分子のメディエーター（媒介因子）または悪化因子（
ｅｘａｃｅｒｂａｔｏｒ）を標的にすることによる、疼痛の新規な安全かつ有効な治療の
必要性が、明らかに存在する。
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、重鎖可変領域を有す
る重鎖および軽鎖可変領域を有する軽鎖を含み、該重鎖可変領域は配列番号１０に示され
るアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそ
の抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む
、単離されたヒト抗体。
（項目２）
前記軽鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の
配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記軽鎖が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一である
アミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントを有するヒト軽鎖ＣＤＲ１を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記軽鎖が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一である
アミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントを有するヒト軽鎖ＣＤＲ３を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記重鎖が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である
アミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記重鎖が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である
アミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントを有するヒト重鎖ＣＤＲ２を含む、項目１に記載の抗体。
（項目７）
項目１に記載の抗体であって、
ａ．配列番号１０に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列
番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ．配列番号１４に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列
番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｃ．配列番号１８に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列
番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；または
ｄ．配列番号２２に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列
番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む抗体。
（項目８）
前記重鎖が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントも
しくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そ
して前記軽鎖が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメン
トもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む
、項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記重鎖が可変領域および定常領域を含み、該可変領域が配列番号１０に示されるアミノ
酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目１
に記載の抗体。
（項目１０）
前記重鎖が、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２のいずれかに示されるアミノ酸
配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目９に
記載の抗体。
（項目１１）
前記軽鎖が可変領域および定常領域を含み、該可変領域が配列番号１２に示されるアミノ
酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目１
に記載の抗体。
（項目１２）
前記軽鎖が配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもし
くは免疫原性フラグメントを含む、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
項目１に記載の抗体であって、該抗体は、
ａ．ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、お
よびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；
ｂ．ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およ
びヒト軽鎖ＣＤＲ３領域；
を含み、
該ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１４に示される重鎖ＣＤＲ３領域であり、該ヒト軽
鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１６に示される軽鎖ＣＤＲ３領域である、抗体。
（項目１４）
前記ヒト重鎖ＣＤＲ２領域が配列番号１８に示される重鎖ＣＤＲ２領域であり、かつ前記
ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域が配列番号２０に示される軽鎖ＣＤＲ２領域である、項目１３に記
載の単離されたヒト抗体。
（項目１５）
前記ヒト重鎖ＣＤＲ１領域が配列番号２２に示されるＮＧＦの重鎖ＣＤＲ１領域であり、
かつ前記ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域が配列番号２４に示される軽鎖ＣＤＲ１領域である、項目
１３に記載の単離されたヒト抗体。
（項目１６）
前記抗体が約１×１０ −９ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的な
インビトロアッセイにおいて、約１×１０ −８ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物活性を
中和する、項目１３に記載の抗体。
（項目１７）
前記抗体が約１×１０ −１０ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物活性
を中和する、項目１６に記載の抗体。
（項目１８）
前記抗体が約１×１０ −１１ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物
活性を中和する、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
前記重鎖および軽鎖がフレキシブルなリンカーによって接続されて単鎖抗体を形成する、
項目１に記載の抗体。
（項目２０）
単鎖Ｆｖ抗体である、項目１９に記載の抗体。
（項目２１）
Ｆａｂ抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２２）
Ｆａｂ’抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２３）
（Ｆａｂ’） ２ 抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体が完全ヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２５）
前記抗体がＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目１に記載の抗体。
（項目２６）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目２５に記載の抗体の薬学的に有効な量を患者に投与
する工程を包含する、方法。
（項目２７）
前記状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じ
る疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視
床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的
頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般
的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過
敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成
分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状
態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏
もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持される疼痛
、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系
領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレル
ギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運
動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、または臓器痛である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目２５に記載の抗体を含む、薬学的組
成物。
（項目２９）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目２８に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を
包含する、方法。
（項目３０）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、
ａ．該サンプルと項目１に記載の抗体とを、ＮＧＦへの該抗体の結合を可能にする条件
下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目３１）
神経成長因子に特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖
を含み、該重鎖が配列番号１０、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号
８５もしくは配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントも
しくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、抗体
。
（項目３２）
前記重鎖が、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７もしくは配列番
号７９のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸
配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラ
グメントを含む重鎖可変領域を含む、項目３１に記載の抗体。
（項目３３）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み
、該軽鎖が、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６
、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１もしくは配列番号１３１に
示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免
疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
（項目３４）
前記軽鎖が、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０
、配列番号９１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６もしくは配列番号１３１の
いずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、ま
たはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント
を含む軽鎖可変領域を含む、項目３３に記載の単離された抗体。
（項目３５）
項目３３に記載の抗体であって、前記軽鎖が軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が：
ａ．配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８９％もしくは９４
％同一であるか；
ｂ．配列番号８８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも９１％もしくは９４
％同一であるか；
ｃ．配列番号８９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％もしくは８７
％同一であるか；
ｄ．配列番号９０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８７％、９１％もし
くは９４％同一であるか；
ｅ．配列番号９１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９
６％もしくは９９％同一であるか；
ｆ．配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも９１％、９５％、も
しくは９６％同一であるか；
ｇ．配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９
５％、９８％もしくは９９％同一であるか；
ｈ．配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９
５％、９８％もしくは９９％同一であるか；または
ｉ．配列番号１３１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、８９％、
９１％、もしくは９６％同一である；
アミノ酸配列を含む、抗体。
（項目３６）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み
、該重鎖が、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号９２、配列番号９３
、配列番号９４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０４、配列
番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列
番号１１６、配列番号１１７もしくは配列番号１１８に示されるアミノ酸配列、またはそ
の抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む
、抗体。
（項目３７）
項目３６に記載の単離されたヒト抗体であって、前記重鎖が、ヒト重鎖ＣＤＲ２を含み、
該重鎖ＣＤＲ２が、配列番号９９、配列番号１０６、配列番号１１７、配列番号１１１に
示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免
疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列である、抗
体。
（項目３８）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み
、該軽鎖が、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号９５、配列番号９６
、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０７、
配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、
もしくは配列番号１１９〜１３４のいずれか、に示されるアミノ酸配列、またはその抗原
結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体
。
（項目３９）
項目３８に記載の単離されたヒト抗体であって、該抗体はヒト軽鎖ＣＤＲ１を含み、該Ｃ
ＤＲ１が、配列番号１０１、配列番号９５、配列番号１１９、配列番号１２２、配列番号
１２５、配列番号１０７、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合
フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくと
も８５％同一であるアミノ酸配列である、抗体。
（項目４０）
項目３８に記載の単離されたヒト抗体であって、該抗体はヒト軽鎖ＣＤＲ３を含み、該Ｃ
ＤＲ３が、配列番号１０３、配列番号９７、配列番号１２１、配列番号１２７、配列番号
１３０、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列、ま
たはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント
に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である、抗体。
（項目４１）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、ＣＤＲ３を含む重鎖または重鎖
のフラグメントを含み、該ＣＤＲ３が、配列番号１４、配列番号１６、配列番号９４、配
列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列
番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列
番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３４からなる配列の群から選択されるアミノ酸
配列、およびその改変体を含み、該改変体が、１つ以下のアミノ酸置換、挿入または欠失
を含む、抗体。
（項目４２）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、配列番号１０、配列番号１２、
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる
配列の群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、ならび
にその改変体を含み、該改変体は、１つ以下のアミノ酸置換、挿入または欠失を含む、抗
体。
（項目４３）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体であって、前記重鎖および軽
鎖がフレキシブルなリンカーによって接続されて単鎖抗体を形成する、抗体。
（項目４４）
単鎖Ｆｖ抗体である、項目４３に記載の抗体。
（項目４５）
Ｆａｂ抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４６）
Ｆａｂ’抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４７）
（Ｆａｂ’） ２ 抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体
。
（項目４８）
前記抗体が完全ヒト抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の
抗体。
（項目４９）
前記抗体が、ＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目３１、３３、３６、３８、４１または
４２に記載の抗体。
（項目５０）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目４９に記載の抗体の薬学的に有効な量を患者に投与
する工程を包含する、方法。
（項目５１）
前記状態が急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる
疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床
痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭
痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的
炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏
性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分
による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態
、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏も
しくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、灼熱痛、交感神経的に維持される疼痛、求心路
遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿
生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮
膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性
鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流
、膵炎、または臓器痛である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目４９に記載の抗体を含む、薬学的組
成物。
（項目５３）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目５２に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を
包含する、方法。
（項目５４）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、該方法は、
ａ．該サンプルと項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体とを、Ｎ
ＧＦへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目５５）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体をコードする、核酸分子。
（項目５６）
項目５５に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目５７）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２のいずれかに記載の抗体を産生する、単離
された細胞株。
（項目５８）
配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２
０、配列番号２２、および配列番号７９〜１３０のいずれか、から選択される少なくとも
１つのアミノ酸配列を含むＮＧＦ特異的結合因子であって、該結合因子はＮＧＦに結合し
得る、ＮＧＦ特異的結合因子。
（項目５９）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目５８に記載の結合因子を含む、薬学
的組成物。
（項目６０）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目５８に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を
包含する、方法。
（項目６１）
タンパク質である、項目５８に記載の結合因子。
（項目６２）
項目６１に記載の結合因子をコードする、核酸分子。
（項目６３）
項目６２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目６４）
項目６３の結合因子を産生する、単離された細胞株。
（項目６５）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされ
る状態を処置する方法であって、項目５８に記載の結合因子の薬学的に有効な量を患者に
投与する工程を包含する、方法。
（項目６６）
前記状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じ
る疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視
床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的
頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般
的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過
敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成
分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状
態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏
もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、灼熱痛、交感神経的に維持される疼痛、求心
路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、
尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性
皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経
性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆
流、膵炎、または臓器痛である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、該方法は、
ａ．該サンプルと項目５８に記載の結合因子とを、ＮＧＦへの該結合因子の結合を可能
にする条件下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目６８）
単離された核酸分子であって、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１
６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号４０、配列番
号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４のいずれか、または配列番号７９〜
１３４のいずれか、に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子
。
（項目６９）
ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、該抗体またはフラグメント
は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
ａ．式：
ａ １ ａ ２ ａ ３ ａ ４ ａ ５
のアミノ酸配列であって、
ａ １ が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ ２ が芳香族アミノ酸残基であり；
ａ ３ が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基であり；
ａ ４ が中性の疎水性アミノ酸残基または脂肪族アミノ酸残基であり；そして
ａ ５ が脂肪族アミノ酸残基または極性親水性アミノ酸残基である；
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ．式：
ｂ １ ｂ ２ ｂ ３ ｂ ４ ｂ ５ ｂ ６ ｂ ７ ｂ ８ ｂ ９ ｂ １０ ｂ １１ ｂ １２ ｂ １３ ｂ １４ ｂ １５ ｂ １
６ ｂ １７
のアミノ酸配列であって、
ｂ １ が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であ
り；
ｂ ２ が脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ ３ が極性親水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ ４ が極性親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり
；
ｂ ５ −ｂ ９ が独立して極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ １０ が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基
であり；
ｂ １１ が芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ １２ が脂肪族の疎水性アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ １３ が脂肪族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、または極性の親水性のアミノ酸残
基であり；
ｂ １４ およびｂ １６ が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｂ １５ が脂肪族アミノ酸残基または芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；そして
ｂ １７ が脂肪族酸性のアミノ酸残基である
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ．式：
ｃ １ ｃ ２ ｃ ３ ｃ ４ ｃ ５ ｃ ６ ｃ ７ ｃ ８ ｃ ９ ｃ １０ ｃ １１ ｃ １２ ｃ １３ ｃ １４ ｃ １５ ｃ １
６ ｃ １７
のアミノ酸配列であって、
ｃ １ が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；
ｃ ２ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ ３ およびｃ ４ が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族ア
ミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ ５ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは
芳香族アミノ酸残基であり；
ｃ ６ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基
であり；
ｃ ７ が極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ ８ が極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基
であり；
ｃ ９ が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ １０ が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の
疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １１ −ｃ １３ が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ １４ が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １５ が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １６ が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｃ １７ が芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、該抗体またはフラグメントは、約１×１０ −９ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプ
チドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −８ Ｍ以下のＩＣ
５０ でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、
抗体またはフラグメント。
（項目７０）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ １ が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ ２ が芳香族疎水性アミノ酸残基であり；
ａ ３ が脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；
ａ ４ が中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ａ ５ が極性親水性アミノ酸残基であり；
ｂ １ が脂肪族または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ ２ がＩｌｅであり；
ｂ ３ が極性親水性アミノ酸残基であり；
ｂ ４ が極性親水性アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ ５ −ｂ ９ が独立して極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ １０ が脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ １１ がＴｙｒであり；
ｂ １２ が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ １３ が脂肪族アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ １４ およびｂ １６ が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｂ １５ が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ １７ が脂肪族酸性のアミノ酸残基であり；
ｃ １ が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；
ｃ ２ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ ３ およびｃ ４ が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族ア
ミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ ５ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｃ ６ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基
であり；
ｃ ７ が極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ ８ が極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基
であり；
ｃ ９ が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ １０ が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の
疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １１ −ｃ １３ が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ
酸残基であり；
ｃ １４ が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １５ が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ １６ が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｃ １７ が芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である、
抗体またはフラグメント。
（項目７１）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ １ がＳｅｒ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ａ ２ がＴｙｒであり；ａ ３ がＡｌａ、Ｓｅ
ｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；ａ ４ がＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ ５ がＨｉｓ、Ｇｌ
ｙまたはＡｓｎであり；ｂ １ がＴｙｒ，Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｐであり；ｂ ２ がＩｌ
ｅであり；ｂ ３ がＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ ４ がＴｒｐ、Ａｒｇま
たはＰｒｏであり；ｂ ５ がＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙであり；ｂ ６ がＳｅｒ、Ａｒｇ、
ＡｓｐまたはＧｌｙであり、ｂ ７ がＳｅｒ、ＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ ８ がＳｅｒ、
Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ｂ ９ がＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ １０
がＧｌｙ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；ｂ １１ がＴｙｒであり；ｂ １２ がＡｌａまたはＳ
ｅｒであり；ｂ １３ がＡｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；ｂ １４ がＳｅｒであり；ｂ １
５ がＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ １６ がＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ １７ がＧｌｙで
あり；ｃ １ が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ ２ が存在しないか、ま
たはＴｙｒであり；ｃ ３ およびｃ ４ が独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｖａｌ
またはＧｌｕであり；ｃ ５ が存在しないか、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり；ｃ ６ が
存在しないかまたはＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｕもしくはＬｅｕであり；ｃ ７ がＧｌｙ、Ａｒ
ｇまたはＡｓｐであり；ｃ ８ がＴｒｐ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ ９ がＨｉ
ｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり；ｃ １０ がＶａｌ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；ｃ １１ −
ｃ １３ が独立して、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；ｃ １４ がＰｈ
ｅ、ＶａｌまたはＧｌｙであり；ｃ １５ がＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ １６ が存在しな
いかＡｓｐまたはＡｓｎであり；そしてｃ １７ がＴｙｒまたはＶａｌである、
抗体またはフラグメント。
（項目７２）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ １ がＳｅｒまたはＡｓｐであり；ａ ２ がＴｙｒであり；ａ ３ がＡｌａまたはＳｅｒで
あり；ａ ４ がＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ ５ がＨｉｓまたはＡｓｎであり；ｂ １ がＴｙ
ｒまたはＧｌｙであり；ｂ ２ がＩｌｅであり；ｂ ３ がＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓ
ｎであり；ｂ ４ がＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ ５ がＳｅｒまたはＡｓｎであり
；ｂ ６ がＳｅｒまたはＡｒｇであり、ｂ ７ がＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ ８ がＩｌｅま
たはＴｈｒであり；ｂ ９ がＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ １０ がＧｌｙまたはＰ
ｈｅであり；ｂ １１ がＴｙｒであり；ｂ １２ がＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ １３ がＡｓ
ｐまたはＧｌｙであり；ｂ １４ がＳｅｒであり；ｂ １５ がＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ
１６ がＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ １７ がＧｌｙであり；ｃ １ が存在しないか、または
Ｇｌｙであり；ｃ ２ が存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ ３ およびｃ ４ が独立して、
存在しないか、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＶａｌであり；ｃ ５ が存在しないかまたはＳｅｒで
あり；ｃ ６ がＳｅｒまたはＧｌｙであり；ｃ ７ がＧｌｙまたはＡｒｇであり；ｃ ８ がＴｒ
ｐまたはＰｒｏであり；ｃ ９ がＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり；ｃ １０ がＶａｌまた
はＴｙｒであり；ｃ １１ −ｃ １３ が独立して、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＡｓｐであ
り；ｃ １４ がＰｈｅまたはＶａｌであり；ｃ １５ がＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ １６ が
存在しないかまたはＡｓｐであり；そしてｃ １７ がＴｙｒまたはＶａｌである、
抗体またはフラグメント。
（項目７３）
項目６９に記載の抗体であって：
ａ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２
が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１４
に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｂ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２
が配列番号９３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号９４
に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｃ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号９８に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２
が配列番号９９に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０
０に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｄ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ
２が配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号
１０６に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｅ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ
２が配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号
１１２に示されるアミノ酸配列を有するか；または
ｆ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１１６に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ
２が配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号
１１８に示されるアミノ酸配列を有する、
抗体。
（項目７４）
ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、該抗体またはフラグメント
が軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、
ａ．式：
ａ １ ａ ２ ａ ３ ａ ４ ａ ５ ａ ６ ａ ７ ａ ８ ａ ９ ａ １０ ａ １１ ａ １２
のアミノ酸配列であって、
ａ １ が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ ２ 、ａ １１ およびａ １２ が独立して脂肪族アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基で
あり；
ａ ３ 、ａ ５ 、ａ ７ およびａ ８ が独立して脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残
基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ａ ４ が極性の親水性アミノ酸残基であり；
ａ ６ が脂肪族または疎水性のアミノ酸残基であり；
ａ ９ が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基で
あり；そして
ａ １０ が脂肪族アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基である
；
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ．式：
ｂ １ ｂ ２ ｂ ３ ｂ ４ ｂ ５ ｂ ６ ｂ ７
のアミノ酸配列であって、
ｂ １ が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基で
あり；
ｂ ２ が脂肪族アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ ３ およびｂ ４ が独立して極性親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性
のアミノ酸残基であり；
ｂ ５ が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ ６ が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｂ ７ が極性の親水性のアミノ酸残基である、アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ．式：
ｃ １ ｃ ２ ｃ ３ ｃ ４ ｃ ５ ｃ ６ ｃ ７ ｃ ８ ｃ ９ ｃ １０ ｃ １１ ｃ １２ ｃ １３ ｃ １４ ｃ １５ ｃ １
６ ｃ １７
のアミノ酸配列であって、
ｃ １ およびｃ ２ が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｃ ３ が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基
であり；
ｃ ４ 、ｃ ５ およびｃ ６ が独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、
もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ ７ が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは
脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ ８ が極性の親水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｃ ９ が極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、
該抗体またはフラグメントは約１×１０ −９ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解
離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −８ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒト
ＮＧＦ生物活性を中和する、
抗体またはフラグメント。
（項目７５）
項目７４に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ １ 、ａ ３ 、ａ ４ 、ａ ７ およびａ ８ が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ａ ２ 、ａ ６ 、ａ １１ およびａ １２ が独立して脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ａ ５ が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ａ ９ が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基で
あり；
ａ １０ が脂肪族アミノ酸残基または芳香族のアミノ酸残基であり；
ｂ １ が脂肪族アミノ酸残基、極性の疎水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基
であり；
ｂ ２ が脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ ３ 、ｂ ４ 、およびｂ ７ が独立して、極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ ５ およびｂ ６ が独立して極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性のアミノ
酸残基であり；
ｃ １ およびｃ ２ が独立して極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｃ ３ が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基で
あり；
ｃ ４ 、ｃ ５ 、およびｃ ６ が独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性のアミノ酸残
基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ ７ が存在しないかまたは脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ ８ が疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｃ ９ が極性の親水性アミノ酸残基である、
抗体またはフラグメント。
（項目７６）
項目７５に記載の抗体またはフラグメントであって、
ａ １ 、ａ ３ 、ａ ４ およびａ ７ がそれぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり
；
ａ ２ がＡｌａであり；
ａ ５ がＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ａ ８ がＳｅｒまたはＩｌｅであり；
ａ ９ が存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；
ａ １０ がＡｌａ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｂ １ がＡｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＶａｌであり；
ｂ ２ およびｂ ３ がそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；
ｂ ４ がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｂ ５ がＬｅｕまたはＡｒｇであり；
ｂ ６ がＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；
ｂ ７ がＳｅｒまたはＴｈｒであり；
ｃ １ およびｃ ２ がＧｌｎであり；
ｃ ３ がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
ｃ ４ がＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ｃ ５ がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｃ ６ がＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｃ ７ が存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；
ｃ ８ がＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そして
ｃ ９ がＴｈｒである、
抗体またはフラグメント。
（項目７７）
項目７５に記載の抗体またはフラグメントであって、
ａ １ 、ａ ３ 、ａ ４ およびａ ７ がそれぞれ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅ
ｒであり；
ａ ５ がＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ａ ８ がＳｅｒまたはＩｌｅであり；
ａ ９ が存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；
ａ １０ がＡｌａまたはＴｙｒであり；
ｂ １ がＡｓｐまたはＧｌｙであり；
ｂ ２ およびｂ ３ がそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；
ｂ ４ がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｂ ５ がＬｅｕまたはＡｒｇであり；
ｂ ６ がＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；
ｂ ７ がＳｅｒまたはＴｈｒであり；
ｃ １ およびｃ ２ がＧｌｎであり；
ｃ ３ がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
ｃ ４ がＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ｃ ５ がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｃ ６ がＴｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｃ ７ が存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；
ｃ ８ がＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そして
ｃ ９ がＴｈｒである、
抗体またはフラグメント。
（項目７８）
項目７４に記載の抗体であって、
ａ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２
が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１６
に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｂ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２
が配列番号９６に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号９７
に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｃ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１０３に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｄ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１０９に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｅ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１１５に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｆ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１２１に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｇ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１２３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１２４に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｈ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１２７に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｉ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２８に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１２９に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１３０に示されるアミノ酸配列を有するか；または
ｊ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ
２が配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号
１３４に示されるアミノ酸配列を有する、
抗体。
（項目７９）
項目６９〜７８のいずれかに記載の抗体またはフラグメントをコードする、ポリヌクレオ
チド。
（項目８０）
項目７９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目８１）
項目８０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目８２）
前記細胞が真核生物細胞である、項目８１に記載の宿主細胞。
（項目８３）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目８２に記載の宿主細胞。
（項目８４）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大と関連する疼痛性の障害または状態を
処置するための医薬であって、該医薬は、薬学的に有効な量のモノクローナル抗体もしく
はその免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント、または該モノクローナル抗体も
しくは該フラグメントの薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリア、希
釈剤または賦形剤を含み、該モノクローナル抗体は、項目１に記載のモノクローナル抗体
のうちの少なくとも１つである、医薬。
（項目８５）
項目８４に記載の医薬であって、前記モノクローナル抗体が、
ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および
配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｃ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；あるいは
ｄ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的
に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番
号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機
能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む医薬。
（項目８６）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大に関連する疼痛性の障害または状態を
治療するための医薬であって、該医薬は、薬学的に有効な量のモノクローナル抗体もしく
はその免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント、ならびに薬学的に受容可能なキ
ャリア、希釈剤または賦形剤を含み、該抗体もしくは該フラグメントは、配列番号１０に
示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ま
たは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含む、医薬。
（項目８７）
前記モノクローナル抗体が約１×１０ −９ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離
して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −８ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮ
ＧＦ生物活性を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目８８）
前記抗体が約１×１０ −１０ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物活性
を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目８９）
前記抗体が約１×１０ −１１ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物
活性を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目９０）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大に関連する疼痛性の障害または状態を
処置するために適切な医薬の製造のための、薬学的に有効な量の項目１に記載の抗体の使
用。
（項目９１）
前記モノクローナル抗体が約１×１０ −９ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離
して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −８ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮ
ＧＦ生物活性を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９２）
前記抗体が約１×１０ −１０ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約１×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物活性
を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９３）
前記抗体が約１×１０ −１１ 以下のＫ Ｄ でヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的
なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０ −９ Ｍ以下のＩＣ ５０ でヒトＮＧＦ生物
活性を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９４）
前記疼痛性障害または状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もし
くは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中
毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、
化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、
緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、
炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害
、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管
病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛およ
び関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的
に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、
単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創
傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二
指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難
症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、状態からなる群より選択される
、項目９３に記載の使用。
（項目９５）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、
（ａ）配列番号７９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、およ
び配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫
学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｂ）配列番号８１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、およ
び配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫
学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｃ）配列番号８３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、およ
び配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫
学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；あるいは
（ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、およ
び配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫
学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む、抗体。
（発明の要旨）
本発明は、疼痛を管理するために治療上有用である新規なヒトモノクローナル抗体を提
供する。詳細には、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するモノクローナル抗体を
提供する。好ましくはこのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、ＮＧ
Ｆの生物学的活性を中和して、ＮＧＦ媒介性疼痛応答の影響を緩和するのに有用である。
また本発明によって、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞、最も好ましくは本発
明のモノクローナル抗体を細胞培養培地中に分泌する細胞も提供される。疼痛を処置およ
び管理するためのその使用に加えて、本発明の抗体は、神経障害性のおよび炎症性の疼痛
関連応答を処置するために有用である。
本発明はさらに、ある抗体のＦｃ領域の配列ならびに配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２および配列番号
７９〜１３０として特定される１つ以上の配列を含む融合タンパク質を提供する。このよ
うな分子は、例えば、参照として援用される、国際特許出願公開番号ＷＯ００／２４７８
２に記載されるような方法を用いて調製され得る。このような分子は、例えば、哺乳動物
細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において、または細菌細胞（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）において発現され得る。
特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはモノクローナル
抗体、最も好ましくはヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を提供し、この重鎖は、配
列番号２、配列番号４もしくは配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合
フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして重
鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメン
トもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。好ましくは、この重
鎖は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはヒト抗体、そし
てさらに好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体を提供
し、この重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇ
Ｅ重鎖定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域、またはその任意の対立遺伝子改
変体を含み（参照によって本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら，１９９１、Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅ
ｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａ
ｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２に考察
されるとおり）、そしてこの重鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメン
トを含む。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号４に示されるＩｇＧ２重鎖定常領域の
アミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントを含む。
特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはヒト抗体、そし
てさらに好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体を提供
し、この軽鎖は、配列番号８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメント
もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてこの軽鎖の可変
領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
特定の態様では、本発明の抗体は重鎖および軽鎖を含み、この重鎖の可変領域は、配列
番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の態様では、この軽鎖可変領域は、配列
番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に
機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。さらなる態様では、上記重鎖は、配列番号
１４、配列番号１８または配列番号２０のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその
抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。
なおさらなる態様では、上記軽鎖は、配列番号１６、２０、２４のいずれかに示されるア
ミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリ
ンフラグメントを含む。
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を提供するが、この重鎖は、配列番号１
０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的
な免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を含み、そしてこの軽鎖は、配列番号１２
に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な
免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を含む。
本発明はさらに、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体を提供するが、この抗
体は：
（ａ）配列番号７９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、お
よび配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；
（ｂ）配列番号８１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、お
よび配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；
（ｃ）配列番号８３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、お
よび配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；ある
いは
（ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしく
は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、お
よび配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む。
特定の態様では、本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含む抗体を提供するが、ここで、この
重鎖は重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列
に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８
５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、
少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一である配列を含み、そし
てこの軽鎖は、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミ
ノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少な
くとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９
４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そし
て最も好ましくは約９９％同一である配列を含み、そしてこの抗体は、ＮＧＦに特異的に
結合する。
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を提供するが、ここで、この重鎖は、配
列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的
に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてこの軽鎖は、配列番号１６に示さ
れるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グ
ロブリンフラグメントを含む。
特定の態様では、本発明は、重鎖と軽鎖とを含む抗体を提供するが、ここで、この重鎖
は重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域は、配列番号１４、配列番号１８または配列番
号２２のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なく
とも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％
、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なく
とも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好まし
くは約９９％同一である配列を含み、そしてこの軽鎖は、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖
可変領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましく
は少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも
９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、
少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一であるアミノ酸
配列を含み、そしてこの抗体は、ＮＧＦに特異的に結合する。
本発明はまた、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）’抗体および（
Ｆａｂ’）２抗体を提供する。
特定の態様では、本発明は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結
合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖を提
供する。
さらに、本発明は、配列番号１４、配列番号１８もしくは配列番号２２のいずれかに示
されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫
グロブリンフラグメントを含む重鎖を提供する。
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体に関するが、ここでこの
抗体は、（ａ）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２
領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽
鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域を含む。特定の態様
では、このヒト重鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号２２に示されるような４Ｄ４と命名される
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖ＣＤＲ１領域であってもよく、そしてこのヒト軽鎖
ＣＤＲ１領域は、配列番号２４に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１領域であ
ってもよい。他の態様では、このヒト重鎖ＣＤＲ２領域は、配列番号１８に示されるよう
なｍＡｂ ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２領域であってもよく、そしてこのヒト軽鎖ＣＤＲ２領域
は、配列番号２０に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２領域であってもよい。
さらに他の態様では、このヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１４に示されるようなｍＡ
ｂ ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３領域であり、そしてこのヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１
６に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３領域である。
本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含む、神経成長因子に特異的に結合する単離されたヒト
抗体を提供するが、ここでこの重鎖は、配列番号１０、配列番号７９、配列番号８１、配
列番号８３、配列番号８５または配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原
結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可
変領域を含む。
本発明はさらに、重鎖と軽鎖とを含む、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体
を提供するが、ここでこの軽鎖は、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番
号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１もし
くは配列番号１３１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む。
本発明の抗体は、ＮＧＦポリペプチドに関連する少なくとも１つのインビトロおよび／
またはインビボの活性をアンタゴナイズする能力によって特徴付けられる。好ましくは、
本発明は、ＮＧＦポリペプチドに対して高親和性の結合を有する単離された抗ヒトＮＧＦ
ヒト抗体を提供するが、ここでこの抗体は、ヒトＮＧＦポリペプチドに結合して、Ｋｉｎ
ＥｘＡを用いて決定される場合、約５０×１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＮ
ＧＦポリペプチドから解離するか、またはインビトロ中和アッセイにおいて、約１×１０
−８Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する。
好ましい実施形態では、本発明は、以下の特徴を有する単離された抗ヒトＮＧＦヒト抗
体を提供する：
ａ）インビトロ中和アッセイにおいて約１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でＮＧＦ誘導性
生存を阻害する；
ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する；そして
ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
本発明はまた、高い親和性でＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体、または
その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを提
供するが、ここでこの抗体またはフラグメントは、約１×１０−９以下のＫＤでヒトＮＧ
Ｆポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０−８Ｍ
以下のＩＣ５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和し、そしてこの抗体またはフラグメントは、
以下を含む重鎖可変領域を含む：
ａ）式：
ａ１ａ２ａ３ａ４ａ５
のアミノ酸配列であって、
ａ１が極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２が芳香族アミノ酸残基であり；ａ３が脂肪
族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基であり；ａ４が中性の疎
水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；そしてａ５が脂肪族アミノ酸残基
または極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ）式：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ｂ１０ｂ１１ｂ１２ｂ１３ｂ１４ｂ１５ｂ１
６ｂ１７
のアミノ酸配列であって、
ｂ１が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であ
り；ｂ２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｂ３が極性の親水性アミノ酸残基、また
は芳香族アミノ酸残基であり；ｂ４が極性親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基また
は芳香族アミノ酸残基であり；ｂ５−ｂ９が独立して、極性の親水性アミノ酸残基または
脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基
または脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ１１が芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ
酸残基であり；ｂ１２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基
であり；ｂ１３が脂肪族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、または極性の親水性のアミ
ノ酸残基であり；ｂ１４およびｂ１６が独立して、極性の親水性アミノ酸残基であり；ｂ
１５が脂肪族アミノ酸残基または芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；そしてｂ１７が脂
肪族の酸性アミノ酸残基である、アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ）式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１
６ｃ１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ１が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２が存在しないか、または
極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ３およびｃ４
が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性のアミノ酸
残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ５が存在しないか、または極性の親水性
アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族アミノ酸残基であり；ｃ６が存在しな
いか、または極性の親水性もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ７が極性の親水性ア
ミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ８が極性の親水性アミノ酸残基、疎
水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基であり；ｃ９が極性の親水性アミノ酸残
基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１０が極性の親
水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基
であり；ｃ１１−ｃ１３が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性
アミノ酸残基であり；ｃ１４が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基
であり；ｃ１５が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ１６が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてｃ１７が芳香族の
疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である、アミノ酸配列を含むＣ
ＤＲ３領域。
１態様では、ａ１は極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ２は芳香族疎水性のアミノ酸
残基であり；ａ３は脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ａ４は中性の疎水性アミノ酸残
基であり；ａ５は極性親水性のアミノ酸残基であり；ｂ１は脂肪族アミノ酸残基または芳
香族のアミノ酸残基であり；ｂ２はＩｌｅであり；ｂ３は極性の親水性アミノ酸残基であ
り；ｂ４は極性の親水性アミノ酸残基アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ
５−ｂ９が独立して、極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ
１０は脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ１１はＴｙｒであり；ｂ１２は脂肪族の疎水性ア
ミノ酸残基であり；ｂ１３は脂肪族アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であ
り；ｂ１４およびｂ１６は独立して、極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてｂ１５は
脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｂ１７が脂肪族の酸性のアミノ酸残基であり；ｃ１
は存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２は存在しないか、または極性の
親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ３およびｃ４は独立
して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族疎水性のアミノ酸残基、も
しくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ５は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸
残基であり；ｃ６は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のア
ミノ酸残基であり；ｃ７は極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であ
り；ｃ８は極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残
基であり；ｃ９は極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水
性アミノ酸残基であり；ｃ１０は極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残
基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１１−ｃ１３は独立して、極性の親
水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１４は脂肪族アミノ酸
残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１５は極性の親水性もしくは中性の
疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１６は存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であ
り；そしてｃ１７は芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基で
ある。
特定の態様では、ａ１はＳｅｒ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ａ２はＴｙｒであり；ａ
３はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；ａ４はＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ
５はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＡｓｎであり；ｂ１はＴｙｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｐで
あり；ｂ２はＩｌｅであり；ｂ３はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ４は
Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ５はＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙであり；ｂ６は
Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、ｂ７はＳｅｒ、ＨｉｓまたはＧｌｙであり
；ｂ８はＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ｂ９はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈ
ｒであり；ｂ１０はＧｌｙ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；ｂ１１はＴｙｒであり；ｂ１２
はＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ１３はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；ｂ１４はＳ
ｅｒであり；ｂ１５はＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ１６はＬｙｓまたはＧｌｎであり；
ｂ１７はＧｌｙであり；ｃ１は存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ２は
存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ３およびｃ４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ
、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＧｌｕであり；ｃ５は存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＴ
ｒｐであり；ｃ６は存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＬｅｕであり；ｃ７は
Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；ｃ８はＴｒｐ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり
；ｃ９はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、ｃ１０はＶａｌ、ＴｙｒまたはＡｒｇであ
り；ｃ１１−ｃ１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；
ｃ１４はＰｈｅ、ＶａｌまたはＧｌｙであり；ｃ１５はＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ１
６は存在しないか、ＡｓｐであるかまたはＡｓｎであり；そしてｃ１７はＴｙｒまたはＶ
ａｌである。
別の特定の態様では、ａ１はＳｅｒまたはＡｓｐであり；ａ２はＴｙｒであり；ａ３は
ＡｌａまたはＳｅｒであり；ａ４はＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ５はＨｉｓまたはＡｓ
ｎであり；ｂ１はＴｙｒまたはＧｌｙであり；ｂ２はＩｌｅであり；ｂ３はＳｅｒ、Ｔｈ
ｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ４はＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ５はＳｅ
ｒまたはＡｓｎであり；ｂ６はＳｅｒまたはＡｒｇであり；ｂ７はＨｉｓまたはＧｌｙで
あり；ｂ８はＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ９はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ
１０はＧｌｙまたはＰｈｅであり；ｂ１１はＴｙｒであり；ｂ１２はＡｌａまたはＳｅｒ
であり；ｂ１３はＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ１４はＳｅｒであり；ｂ１５はＶａｌま
たはＰｈｅであり；ｂ１６はＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ１７はＧｌｙであり；ｃ１は
存在しないか、またはＧｌｙであり；ｃ２は存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ３お
よびｃ４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＶａｌであり；ｃ５は存在し
ないかまたはＳｅｒであり；ｃ６はＳｅｒまたはＧｌｙであり；ｃ７はＧｌｙまたはＡｒ
ｇであり；ｃ８はＴｒｐまたはＰｒｏであり；ｃ９はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり
；ｃ１０はＶａｌまたはＴｙｒであり；ｃ１１−ｃ１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｐ
ｈｅまたはＡｓｐであり；ｃ１４はＰｈｅまたはＶａｌであり；ｃ１５はＭｅｔまたはＡ
ｓｐであり；ｃ１６は存在しないかまたはＡｓｐであり；そしてｃ１７はＴｙｒまたはＶ
ａｌである。
他の特定の態様では：
ａ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配
列番号１８に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１４に示され
るアミノ酸配列を有し；
ｂ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配
列番号９３に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号９４に示され
るアミノ酸配列を有し；
ｃ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号９８に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配
列番号９９に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１００に示さ
れるアミノ酸配列を有し；
ｄ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１０６に
示されるアミノ酸配列を有し；
ｅ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は
配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１１２に
示されるアミノ酸配列を有し；そして
ｆ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１１６に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は
配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１１８に
示されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フ
ラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを提供するが、ここ
でこの抗体またはフラグメントは、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、以下：
ａ）式：
ａ１ａ２ａ３ａ４ａ５ａ６ａ７ａ８ａ９ａ１０ａ１１ａ１２
のアミノ酸配列であって、
ａ１が極性親水性アミノ酸残基であり；ａ２、ａ１１およびａ１２が独立して、脂肪族
アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基であり；ａ３、ａ５、ａ７およびａ８が独立して
、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり
；ａ４が極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ６が脂肪族アミノ酸残基または疎水性のア
ミノ酸残基であり；ａ９が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水
性アミノ酸残基であり；そしてａ１０が脂肪族アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または
疎水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ）式：
ｂ１ｂ２ｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７
のアミノ酸配列であって、
ｂ１は脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基で
あり；ｂ２は脂肪族アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ３およびｂ４
は独立して、極性親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基
であり；ｂ５は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ６は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；そしてｂ
７は極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ）式： ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ
１５ｃ１６ｃ１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ１およびｃ２は独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；ｃ３は極性の親水性アミ
ノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ４、ｃ５および
ｃ６は独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、もしくは疎水性のア
ミノ酸残基であり；ｃ７は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪
族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ８は極性の親水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミ
ノ酸残基であり；そしてｃ９は極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、
この抗体またはフラグメントは約１×１０−９以下のＫＤでヒトＮＧＦポリペプチドから
解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でヒ
トＮＧＦ生物活性を中和する。
１態様では、ａ１、ａ３、ａ４、ａ７およびａ８は独立して極性の親水性アミノ酸残基
であり；ａ２、ａ６、ａ１１およびａ１２は独立して脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり
；ａ５は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ａ９は存在しな
いか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ１０は脂
肪族アミノ酸残基または芳香族のアミノ酸残基であり；ｂ１は脂肪族アミノ酸残基、極性
の疎水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ２は脂肪族の疎水性のア
ミノ酸残基であり；ｂ３、ｂ４、およびｂ７は独立して、極性の親水性のアミノ酸残基で
あり；ｂ５およびｂ６は独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性の
アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は独立して極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｃ
３は極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり
；ｃ４、ｃ５、およびｃ６は独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性のアミノ酸残
基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ７は存在しないかまたは脂肪族の疎水性のア
ミノ酸残基であり；ｃ８は疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ９は極性の親水性アミノ酸残
基である。
特定の態様では、ａ１、ａ３、ａ４およびａ７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎお
よびＳｅｒであり；ａ２はＡｌａであり；ａ５はＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ８はＳｅ
ｒまたはＩｌｅであり；ａ９は存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；ａ１０はＡｌ
ａ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｂ１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＶａｌで
あり；ｂ２およびｂ３はそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；ｂ４はＳｅｒまたはＡｓｎ
であり；ｂ５はＬｅｕまたはＡｒｇであり；ｂ６はＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；
ｂ７はＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ１およびｃ２はＧｌｎであり；ｃ３はＰｈｅ、Ｔｙ
ｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；ｃ４はＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ｃ５はＳｅ
ｒまたはＡｓｎであり；ｃ６はＴｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｃ７は存在
しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；ｃ８はＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであ
り；そしてｃ９はＴｈｒである。
別の特定の態様では、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４およびａ７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ａｌａ
、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり；ａ５はＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ８はＳｅｒ
またはＩｌｅであり；ａ９は存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；ａ１０はＡｌａ
またはＴｙｒであり；ｂ１はＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ２およびｂ３はそれぞれＡｌ
ａおよびＳｅｒであり；ｂ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ５はＬｅｕまたはＡｒｇで
あり；ｂ６はＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；ｂ７はＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ
１およびｃ２はＧｌｎであり；ｃ３はＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；ｃ４
はＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ｃ５はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｃ６はＴｙｒ
、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｃ７は存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり
；ｃ８はＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そしてｃ９はＴｈｒである。
別の特定の態様では：
ａ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１６に示さ
れるアミノ酸配列を有し；
ｂ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は
配列番号９６に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号９７に示さ
れるアミノ酸配列を有し；
ｃ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０３
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｄ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０９
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｅ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１１５
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｆ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２１
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｇ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１２３に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２４
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｈ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２７
に示されるアミノ酸配列を有し；
ｉ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２８に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１２９に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３０
に示されるアミノ酸配列を有し；そして
ｊ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２
は配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３４
に示されるアミノ酸配列を有する。
また本発明の一部は、新規な抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列
、抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、抗ヒトＮＧ
Ｆヒト抗体をコードするポリヌクレオチドを組み込むベクターで形質転換された宿主細胞
、抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含む処方物、ならびにこれらを作製および用いる方法である。
本発明はまた、生物学的サンプル中のＮＧＦのレベルを検出するための方法であって、
このサンプルと本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させる工程を包含
する方法を提供する。本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦの検出および定量について、任意
の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接的なサンドイッチア
ッセイ、免疫沈降アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用
され得る（Ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７〜１５８頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．を参照のこと）。この抗体は、使用されているアッセイ方法に適切である親和性で
ＮＧＦに結合し得る。
さらに、本発明は、ＮＧＦの産生増大またはＮＧＦに対する感度の増大を伴う疾患を処
置するための方法を提供するが、ここでこの方法は、本発明の少なくとも１つの抗体、ま
たはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント
を含む薬学的組成物の薬学的に有効な量を、そのような処置を必要としている個体に投与
する工程を包含する。
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のさらに詳細な説
明および特許請求の範囲から明らかになる。
図１は、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ハイブリドーマ馴化培地から精製された４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。 図２は、ヒトＮＧＦ活性によって刺激されたＶＲ１発現、およびＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ハイブリドーマ馴化培地から精製された抗ＮＧＦモノクローナル抗体（４Ｄ４）による、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。 図３は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかとして発現され、そして細胞中でローラーボトル培養（Ｒ）中またはスピナーフラスコ（Ｓ）のいずれかで増殖された場合の、一過性に発現された組み換え抗ＮＧＦ ４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。 図４は、ニューロトロフィンの配列のアラインメントを示す。この配列の上のナンバリングおよび二次構造エレメントは、成熟ヒトＮＧＦを指す。保存された残基には星でマークをつけており、低い配列相同性の領域は影付きにしている。ＮＧＦヒトは、配列番号１３５であり；ＮＧＦマウスは配列番号１３６であり；ＢＤＮＦは配列番号１３７であり；ＮＴ３は配列番号１３８である。 図５は、１４Ｄ１０（配列番号９８）、６Ｈ９（配列番号１０４）、７Ｈ２（配列番号１１０）、４Ｇ６（配列番号１１６）、１４Ｄ１１（配列番号９２）および４Ｄ４（配列番号２２）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ１重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。 図６は、１４Ｄ１０（配列番号９９）、６Ｈ９（配列番号１０５）、７Ｈ２（配列番号１１１）、４Ｇ６（配列番号１１７）、１４Ｄ１１（配列番号９３）および４Ｄ４（配列番号１８）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ２重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。 図７は、１４Ｄ１０（配列番号１００）、６Ｈ９（配列番号１０６）、７Ｈ２（配列番号１１２）、４Ｇ６（配列番号１１８）、１４Ｄ１１（配列番号９４）および４Ｄ４（配列番号１４）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ３重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。 図８は、１４Ｄ１０（配列番号９５）、６Ｈ９（配列番号１０７）、７Ｈ２（配列番号１１３）、４Ｇ６ａ（配列番号１１９）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２２）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２５）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２８）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３２）、１４Ｄ１１（配列番号９５）および４Ｄ４（配列番号２４）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ１軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。 図９は、１４Ｄ１０（配列番号９６）、６Ｈ９（配列番号１０８）、７Ｈ２（配列番号１１４）、４Ｇ６ａ（配列番号１２０）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２３）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２６）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２９）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３３）、１４Ｄ１１（配列番号９６）および４Ｄ４（配列番号２０）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ２軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。 図１０は、１４Ｄ１０（配列番号９７）、６Ｈ９（配列番号１０９）、７Ｈ２（配列番号１１５）、４Ｇ６ａ（配列番号１２１）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２４）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２７）、４Ｇ６ｄ（配列番号１３０）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３４）、１４Ｄ１１（配列番号９７）および４Ｄ４（配列番号１６）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ３軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。 図１１は、１４Ｄ１０（配列番号８２）、６Ｈ９（配列番号８４）、７Ｈ２（配列番号８６）、４Ｇ６ａ（配列番号８８）、４Ｇ６ｂ（配列番号８９）、４Ｇ６ｃ（配列番号９０）、４Ｇ６ｄ（配列番号９１）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３１）、１４Ｄ１１（配列番号８０）および４Ｄ４（配列番号１２）の抗体についての抗ＮＧＦ軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。 図１２は、４Ｄ４（配列番号１０）、４Ｇ６（配列番号８７）、１４Ｄ１０（配列番号８１）、１４Ｄ１１（配列番号７９）、７Ｈ２（配列番号８５）、および６Ｈ９（配列番号８３）の抗体についての抗ＮＧＦの重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す。
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に用いられるセクション見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載され
る主題に限定されると解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての引用文献は、
任意の目的のために本明細書において参照として明白に援用される。
（定義）
従来の技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形
質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために用いてもよい。
酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該分野で通常達成され
るように、もしくは本明細書に記載されるように、行うことができる。前述の技術および
手順は一般に、当該分野で周知の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用か
つ考察されている種々の一般的引用文献およびさらに詳細な引用文献に記載されるような
方法に従って、行うことができる。例えば、いずれかの目的で参照として本明細書に援用
されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．，を参照のこと。特に規定しない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化
学、ならびに医学および薬学の化学と関連して利用される命名法、そしてその実験室手順
および技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に用いられるものである。同様に、従来
の技術が、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方および送達、ならびに患者の処置のた
めに用いられ得る。
本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有す
ると理解されるべきである：本発明の抗体に関して、「生物学的特性（ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」、「生物学的特徴（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｓｔｉｃ）」という句、および「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、本明
細書において互換可能に用いられ、これらには、限定はしないが、エピトープ親和性およ
び特異性（例えば、ヒトＮＧＦに結合する抗ヒトＮＧＦヒト抗体）、標的のポリペプチド
の活性（例えば、ＮＧＦ活性）をアンタゴナイズする能力、この抗体のインビボ安定性、
およびこの抗体の免疫原性特性が挙げられる。当該分野で理解される抗体の他の特定可能
な生物学的特性または特徴としては、例えば、交差反応性（すなわち、一般的には、標的
されたポリペプチドの非ヒトホモログとの交差反応性、または他のタンパク質もしくは組
織との交差反応性）、および哺乳動物細胞においてタンパク質の高い発現レベルを保存す
る能力が挙げられる。前述の特性または特徴は、当該分野で認識される技術を用いて観察
または測定され得、これらの技術としては、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩ
ＳＡ、表面プラズモン共鳴分析、インビトロおよびインビボの中和アッセイ（例えば、実
施例２）、およびヒト、霊長類または必要に応じて任意の他の供給源を含む種々の供給源
由来の組織切片での免疫組織化学が挙げられる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の特定の活性およ
び生物学的特性は、以下の実施例にさらに詳細に記載される。
本明細書において用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐ
ｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、ゲノムのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡの
ポリヌクレオチドまたは合成由来のポリヌクレオチドもしくはそれらのいくつかの組み合
わせを意味しており、その起源によって、この単離されたポリヌクレオチドは、（１）そ
の単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの、全てまたは一部
を伴わないか、（２）天然には連結されないポリヌクレオチドと連結されるか、または（
３）より大きい配列の一部として天然には存在しない。
本明細書において言及される、「単離されたタンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）」という用語は、該当のタンパク質が、（１）通常見出される少なくともいくつ
かの他のタンパク質を含まないか、（２）同じ供給源由来、例えば同じ種由来の他のタン
パク質を本質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、（４）
天然において会合している、少なくとも約５０％のポリヌクレオチド、脂質、炭水化物も
しくは他の物質から分離されているか、（５）この「単離されたタンパク質」が天然には
会合しているタンパク質の一部と（共有的な相互作用によっても、または非共有的な相互
作用によっても）会合していないか、（６）天然には会合していないポリペプチドと作動
可能に会合している（共有的な相互作用または非共有的な相互作用によって）か、または
（７）天然には存在しない、ということを意味する。このような単離されたタンパク質は
、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは合成に由来する他のＲＮＡ、またはそれら
の任意の組み合わせによってコードされてもよい。好ましくは、この単離されたタンパク
質は、その用途（治療上用途、診断上用途、予測用途、研究用途など）を妨げる、天然の
環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」抗体とは、同定されて、その天然の環境の成分か
ら分離され、そして／または回収されているものである。その天然の環境の混入成分とは
、この抗体の診断または治療的な使用を妨害する物質であり、そしてこれには、酵素、ホ
ルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。好ま
しい実施形態では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合、抗体の９５重量
％を超えるまで、そして最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニング・カ
ップ・シークエネーターの使用によって、Ｎ末端アミノ酸配列もしくは内部のアミノ酸配
列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマーシー・ブルー（
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）もしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還
元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一にまで、精製される。単離された抗体としては
、組み換え細胞内のインサイチュの抗体が挙げられる。なぜなら、この抗体の天然の環境
のうちの少なくとも１つの成分が存在しないからである。
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）
」という用語は、天然のタンパク質、すなわち、天然に存在する細胞および特異的には非
組み換え細胞によって産生されるタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組み
換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する分子を意味し、そしてこの天然の
タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはこの天然の配列からの１つ以上のアミノ
酸の欠失、この天然の配列への１つ以上のアミノ酸の付加および／もしくはこの天然の配
列の１つ以上のアミノ酸の置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク
質」という用語は、特に抗ＮＧＦ抗体、または抗ＮＧＦ抗体からの１つ以上のアミノ酸の
欠失、抗ＮＧＦ抗体への１つ以上のアミノ酸の付加および／または抗ＮＧＦ抗体の１つ以
上のアミノ酸の置換を有する配列を包含する。
「ポリペプチドフラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という
用語は、アミノ末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペ
プチドをいう。特定の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５〜約５００アミノ酸
長である。特定の実施形態では、フラグメントは少なくとも５、少なくとも６、少なくと
も８、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも
７０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少
なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００または少なく
とも４５０アミノ酸長であると理解される。特に有用なポリペプチドフラグメントとして
は、結合ドメインを含む機能的なドメインが挙げられる。抗ＮＧＦ抗体の場合、有用なフ
ラグメントとしては、限定はしないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗
体鎖の一部または２つのＣＤＲを含むちょうどその可変領域、などが挙げられる。
「特異的結合因子（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」という用語は
、標的に特異的に結合する天然または非天然の分子を指す。特異的な結合因子の例として
は、限定はしないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および脂質が挙げられる。
特定の実施形態では、特異的な結合因子は抗体である。
「ＮＧＦに対する特異的な結合因子（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ
ｔｏ ＮＧＦ）」という用語は、ＮＧＦの任意の部分に特異的に結合する特異的な結合
因子をいう。特定の実施形態では、ＮＧＦに対する特異的な結合因子とは、ＮＧＦに特異
的に結合する抗体である。
本明細書において用いる場合「免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント（ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｆｒａｇｍｅｎｔ」という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の少なくともＣＤＲを
含むポリペプチドフラグメントをいう。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラ
グメントは、抗原に結合し得る。好ましい実施形態では、この抗原はレセプターに特異的
に結合するリガンドである。これらの実施形態では、本発明の免疫学的に機能的な免疫グ
ロブリンフラグメントの結合は、そのレセプターへのリガンドの結合を防止し、このレセ
プターへのリガンドの結合から生じる生物学的応答を遮断する。好ましくは、本発明の免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、ＮＧＦに特異的に結合する。最も好ま
しくは、このフラグメントはヒトＮＧＦに特異的に結合する。
「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、本明
細書において使用されて物体に対して適用する場合、その物体が天然に見出され得るとい
う事実をいう。例えば、天然の供給源から単離可能であり、人によって意図的に改変され
ていない、有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの
配列は、天然に存在する。
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、その用
語をあてはめられる成分が、適切な条件下でその固有の機能を行うことを可能にする関係
であることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」制御
配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でこのタンパク質コード配列の発現が達成
されるように、そこに連結されている。
「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、本明細書において
用いられる場合、それらが連結されるコード配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在
化を達成し得るポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に
依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列としては、プロモーター、リボソ
ーム結合部位および転写終止配列を挙げることができる。他の特定の実施形態では、真核
生物の転写制御としては、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転
写エンハンサー配列、転写終止配列およびポリアデニル化配列を挙げることができる。特
定の実施形態では、「制御配列」とは、リーダー配列および／または融合パートナー配列
を含んでもよい。
「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、本明細書にお
いて言及する場合、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマー
を意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレ
オチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変
型であってもよい。このような改変型としては、ブロムウリジンのような塩基改変型、ア
ラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースのようなリボース改変型、、ならびに
ヌクレオチド間連結改変型、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニ
ラデートおよびホスホロアミデートが挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語は詳
細には、ＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を包含する。
本明細書で言及する「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とい
う用語は、天然に存在するか、および／または天然には存在しないオリゴヌクレオチド連
結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチ
ドを包含する。オリゴヌクレオチドは、一般的に一本鎖であり、かつ２００ヌクレオチド
以下の長さを有するメンバーを含むポリヌクレオチドサブセットである。特定の実施形態
では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、
オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０
〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築での
使用のために、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは
、タンパク質コード配列に関連してセンスオリゴヌクレオチドであってもアンチセンスオ
リゴヌクレオチドであってもよい。
「天然に存在するヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包
含する。「改変されたヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とい
う用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを包含する。「オリゴヌ
クレオチド連結（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、
オリゴヌクレオチド連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホ
ロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデ
ート、ホスホロアミデートなどを包含する。例えば、それらの開示は任意の目的のために
参考として本明細書に援用される、ＬａＰｌａｎｃｈｅら，１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１４：９０８１；Ｓｔｅｃら，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．，１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６
：３２０９；Ｚｏｎら，１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ
６：５３９；Ｚｏｎら，１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡ
ＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａ
ｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３
を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイ
ゼーションの検出を可能にする検出可能な標識を含んでもよい。
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、その核酸分子が連結されている別の核酸
を輸送できる核酸分子を包含する。ベクターの１タイプは「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ
）」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループ
を指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここではさらなるＤＮＡセ
グメントがウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、それらが導入されてい
る宿主細胞において自律性に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター
およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベ
クター）は、宿主細胞への導入の際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによっ
てその宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に
連結されている遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書においては
「組み換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ）」（または単に、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」）と呼
ばれる。一般には、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミド
の形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられ
得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる形態であるからであ
る。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、このような他の形態の発現ベクター、例え
ばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随
伴ウイルス）を含むものとする。
「組み換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」（または単に
、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」）という句は、組み換え発現ベクターが導入され
ている細胞を包含する。このような用語は、特定の該当の細胞だけでなく、このような細
胞の子孫も指すことを意図することが当業者に理解される。変異または環境的影響のいず
れかに起因して、特定の改変が後継世代において生じ得るので、このような子孫は、実際
には、親細胞に対して同一でないかもしれないが、本明細書に用いられる「宿主細胞」と
いう用語の範囲内には依然として包含される。広範な種々の宿主発現系（細菌、酵母、バ
キュロウイルスおよび哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む）
が、本発明の抗体を発現するために用いられ得る。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ
１９である。抗体を組み換え的に発現するためには、宿主細胞は、その抗体の免疫グロブ
リン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを担持する１つ以上の組み換え発現
ベクターでトランスフェクトされ、その結果、その軽鎖および重鎖はこの宿主細胞中で発
現され、好ましくはこの宿主細胞が培養される培地中に分泌されて、この抗体はこの培地
から回収され得る。標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて、抗体の重鎖および軽鎖の遺
伝子を得て、これらの遺伝子を組み換え発現ベクター中に組み込み、そしてこのベクター
を宿主細胞、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）およびＢｏｓｓらの米国特許第４
，８１６，３９７号記載されたような宿主細胞中に導入する。
「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」という用語を用いて、核酸配列で形質転換された
細胞、または核酸配列で形質転換され得、その後、目的の選択された遺伝子を発現するこ
とが可能である細胞を指す。この用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、この子
孫が、形態学的に、またはもとの親に対する遺伝的作製において、同一であるか否かにか
わらず、親細胞の子孫を包含する。
「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語を用いて、一般にはファージに
よる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移入をいう。「形質導入」とはまた、レトロ
ウイルスによる、真核生物細胞配列の獲得および移入を指す。
「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語を用いて、細胞に
よる外因性または内因性のＤＮＡの取り込みをいい、細胞は、外因性のＤＮＡがその細胞
膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」され
ている。多数のトランスフェクション技術が当該分野で周知であり、本明細書に開示され
ている。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ；Ｄａｖｉｓら，１９８６，ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１
９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に
導入するために用いることができる。
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用い
る場合、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変さ
れている場合、その細胞は形質転換されている。例えば、細胞はその天然の状態から遺伝
的に改変されている場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の
後、この形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体への物理的な組みこみによって細胞のＤＮＡと
組み換えられてもよいし、または複製されることなしにエピソームエレメントとして一時
的に維持されてもよいし、またはプラスミドとして独立して複製されてもよい。細胞の分
裂とともにＤＮＡが複製される場合、細胞は安定に形質転換されていると考えられる。
「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」または「天然の（ｎ
ａｔｉｖｅ）」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的
物質に関連して用いられる場合、天然に見出され、かつ人によって操作されていない物質
をいう。同様に、「天然に存在しない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ
）」または「非天然の（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」とは、本明細書において用いる場合、
天然に見出されない物質、または人によって構造的に改変されているかもしくは合成され
ている物質をいう。
「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、選択的な結合因子、例えば抗体によって結
合され得、そしてさらに動物において用いられ得てその抗原のエピトープに結合できる抗
体を産生することができる、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトー
プを有してもよい。
「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、当該分野で公知であるとおり、２つ以
上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係であって、これらの分
子の配列を比較することによって決定される関係をいう。当該分野では、「同一性（ｉｄ
ｅｎｔｉｔｙ）」とはまた、核酸分子の間またはポリペプチドの間の配列の関連性の程度
を意味し、場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列
のストリングスの間の一致によって決定されてもよい。「同一性」とは、特定の数学的モ
デルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）
」）によってアドレスされるギャップアラインメント（もしあれば）と２つ以上の配列の
うちより小さい配列の間での同一性の一致の割合を測定する。
「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」という用語は、関連の概念に関して当該分野で用
いられるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一性の一致および保存的置換の
一致の両方を包含する、関連性の指標をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、アミ
ノ酸２０個のうち１０個の同一アミノ酸を有し、この残りが全て非保存的置換であれば、
同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的
置換がさらに５つの位置にあれば、同一性パーセントは、５０％のままであるが、ただし
類似性パーセントは、７５％である（１５／２０）。従って、保存的置換がある場合、２
つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチドの間の同一性
パーセントよりも高い。
関連の核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に算
出できる。このような方法としては、限定はしないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（編）），１９８８，Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩ
ＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｄ．Ｗ．（編）），１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；
ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ
１，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．（編）），１９９４，
Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳＥ
ＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８
７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥ
Ｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，（編）），１９９１，Ｍ
．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら，１９８８，Ｓ
ＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３；ならびにＤｕｒｂｉｎら，
１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載される方法が挙げられる。
同一性を決定するために好ましい方法は、試験された配列の間で最大の一致を得るよう
に設計される。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記
載される。２つの配列の間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法として
は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），Ｂ
ＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｂ
ＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２
０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０（前出））から公的に入手可能である。周知の
Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するのに用いることができ
る。
２つのアミノ酸配列をアライメントするための特定のアラインメントスキームでは、２
つの配列の短い領域のマッチングを得ることしか可能ではなく、そしてこの短い整列され
た領域は、２つの全長配列の間も有意な関係がなくても極めて高い配列同一性を有し得る
。従って、特定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）によ
って、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続アミノ酸にまたがるアラインメントが
得られる。
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
を用いて、配列同一性パーセントを決定すべき２つのポリペプチドを、そのそれぞれのア
ミノ酸の最適マッチングについてアライメントする（アルゴリズムによって決定される場
合「マッチしたスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。特定の実施形態において、ギ
ャップオープニングペナルティ（これは、３回の平均対角として算出される；「平均対角
（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、用いられる比較行列の対角の平均であり；
「対角（ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、特定の比較行列により各々の完全アミノ酸マッチに対
して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャ
ップオープニングペナルティの十分の一）、ならびに比較マトリックス、例えば、ＰＡＭ
２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２を、このアルゴリズムと組み合わせて用いる。特定の実
施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａ
ｙｈｏｆｆら，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５〜３５２を参照のこと；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マ
トリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９；を参照のこと）も、アルゴリズムによ
って用いられる。
特定の実施形態では、ポリペプチド配列比較についてのパラメーターとしては以下が挙
げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４
３〜４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２、前出より、ＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターとともに用いられ得る。特定の実施形態では
、前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（エンドギャッ
プについてのペナルティを伴わない）のためのデフォルトパラメーターである。
「相同性（ホモロジー、ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、タンパク質または核酸の
配列の間の類似性の程度を指す。相同性情報は、特定のタンパク質または核酸種の遺伝的
関連性を理解するために有用である。相同性は、配列を整列（アラインメント）させるこ
とおよび比較することによって決定され得る。代表的には、アミノ酸相同性を決定するた
めには、タンパク質配列を、公知のタンパク質配列のデータベースと比較する。相同な配
列は、その配列にそってどこかで共通の機能的同一性を共有する。高い程度の類似性また
は同一性が一般に相同性の指標であるが、低い程度の類似性または同一性は、必ずしも相
同性の欠如を示すわけではない。
一方の配列由来のアミノ酸をもう一方の配列のアミノ酸とを比較して相同性を決定する
ためには、いくつかのアプローチを用いることができる。一般には、このアプローチは、
以下の２つの範疇におさまる：（１）類似性マトリックスを作成するための極性、荷電お
よびファン・デル・ワールス容積のような物理的特徴の比較；ならびに（２）公知の相同
なタンパク質由来の多くのタンパク質配列の観察に基づき、ポイント・アクセプティッド
・ミューテーション・マトリクス（Ｐｏｉｎｔ Ａｃｃｅｐｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｍａｔｒｉｘ）（ＰＡＭ）を作成するための、任意の他のアミノ酸による、配列中のアミ
ノ酸の適当な置換の比較。
同一性のパーセンテージはまた、デフォルトパラメーター（例えば、ＧＡＰペナルティ
５、ＧＡＰオープニングペナルティ１５、ＧＡＰ伸長ペナルティ６．６）を用い、ベクタ
ーＮＴＩスイート９．０．０ソフトウェアパッケージのモジュールとして、ニードルプロ
グラム（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはストレッチャープログラム（ＥＭＢＯＳＳパッ
ケージ）またはプログラム整列Ｘを用いることによって、算出され得る。
本明細書において用いる場合、２０個の従来のアミノ酸およびその省略形は従来の用法
に従う。任意の目的のために参考として本明細書に援用される、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−
Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ（編））
，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ，１９９１を参
照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）；非天然のアミ
ノ酸、例えば、α−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、およ
び他の従来とは異なるアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。
従来とは異なるアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ
−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジ
ン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒス
チジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ
酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書において用いられるポ
リペプチドの表記法においては、標準的な用法および慣習に従って、左手側の方向がアミ
ノ末端方向であり、そして右手側の方向がカルボキシ末端方向である。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けることができる：
１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐ
ｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
２）極性の親水性；Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ，Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ；
３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
４）脂肪族の疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
５）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
８）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；そして
１０）芳香族の疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、同じクラスの別の
メンバーでの交換を包含し得る。保存的アミノ酸置換は、天然には存在しないアミノ酸残
基を包含し得る。この天然には存在しないアミノ酸残基は代表的には、生物系における合
成ではなく、化学的なペプチド合成によって取り込まれる。これらとしては、ペプチド模
倣物およびアミノ酸部分の他の反転型または逆位型が挙げられる。
非保存的置換としては、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来の
メンバーでの交換を挙げることができる。このような置換残基は、非ヒト抗体と相同であ
るヒト抗体の領域に導入されても、または分子の相同でない領域に導入されてもよい。
このような変化を作製することにおいて、特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性
親水性指標を考慮してもよい。各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電の特徴に基づく
疎水性親水性指標を割り当てられている。この疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４
．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；
システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；
グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン
（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）
；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；
アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である
。
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するのにおいて、アミノ酸の疎水性親水
性指標の重要性は当該分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら，１９８２，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３１を参照のこと）。特定のアミノ酸が、類似の疎水
性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換可能であり、そしてそれで
も類似の生物学的活性を保持し得ることが、公知である。疎水性親水性指標に基づいてこ
のような変化を作製することにおいて、特定の実施形態では、その疎水性親水性指標が±
２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±１
以内であるアミノ酸の置換が含まれ、そして特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±
０．５以内である置換が含まれる。
特に、生物学的に機能的なタンパク質またはそれによって作製されるペプチドが、本明
細書に開示されるように免疫学的な実施形態での使用について意図される場合、同様なア
ミノ酸の置換が親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解される。
特定の実施形態では、あるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸
の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の免疫原性および抗原性（すなわちそ
のタンパク質の生物学的特性）と、相関する。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０
）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±
１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリ
シン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５
）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリ
ン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．
３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性
値に基づく変化を作製するのにおいて、特定の実施形態では、親水性値が±２以内である
アミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置
換が含まれ、そして特定の実施形態では、親水性値が±０．５以内である置換が含まれる
。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することができる。これらの
領域はまた、「エピトープコア領域（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ）」と
も呼ばれる。
例示的なアミノ酸置換を表１に示す。
Figure 2010162028
Figure 2010162028
当業者は、周知の技術を用いて本明細書に記載のポリペプチドの適切な改変体を決定す
ることができる。特定の実施形態では、当業者は、活性に重要であるとは考えられない領
域を標的することによって活性を破壊することなく、変化され得る分子の適切な領域を同
定することができる。他の実施形態では、当業者は、同様のポリペプチドの間で保存され
ている分子の残基および部分を同定することができる。さらなる実施形態では、生物学的
活性または構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、
またはポリペプチド構造に有害に影響することもなく、保存的なアミノ酸置換に供するこ
とができる。
さらに当業者は、活性または構造に重要な類似のポリペプチドにおける残基を同定する
構造−機能の研究を概説することができる。このような比較の観点では、当業者は、類似
のタンパク質における活性または構造について重要なアミノ酸残基に相当する、タンパク
質中のアミノ酸残基の重要性を推測することができる。当業者は、このように推測された
重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。
当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似のポリペプチドにおけるその構
造に関して解析することができる。このような情報の観点では、当業者は、抗体のアミノ
酸残基のアラインメントをその三次元構造に関して推測することができる。特定の実施形
態では、当業者は、タンパク質の表面にあることが推定されるアミノ酸残基に対してラジ
カルな変化を作製しないように選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との
重要な相互作用に関与し得るためである。さらに、当業者は、各々の所望のアミノ酸残基
において単一のアミノ酸置換を含む、試験改変体を生成することができる。次いで、この
改変体を、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングしてもよい。このような
改変体を用いて、適切な改変体についての情報を集めることができる。例えば、特定のア
ミノ酸残基に対する変化によって、活性の破壊、活性の所望されない減少または不適切な
活性が生じるということが発見されている場合、このような変化を有する改変体は、回避
され得る。言い換えれば、このような慣用的実験から収集された情報に基づいて、当業者
は、さらなる置換が単独、または他の変異と組み合わせて回避されるべきアミノ酸を、容
易に決定することができる。
二次配列の予測に対して多数の科学的刊行物がでている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２〜４２７；Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２〜２４５；Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ １１３：２１１〜２２２；Ｃｈｏｕら，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ
．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５〜１４８；Ｃｈｏｕら，１９
７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１〜２７６；およびＣｈｏｕら，１
９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７〜３８４を参照のこと。さらに、二次構造を
予測することを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測
する１方法は、ホモロジー（相同性）モデリングに基づく。例えば、３０％より大きい配
列同一性または４０％より大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク
質は多くの場合、類似の構造的トポロコーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤ
Ｂ）の近年の成長によって、ポリペプチドの構造またはタンパク質の構造内の潜在的な折
り畳み回数を含む、二次構造の予想性の向上が得られている。Ｈｏｌｍら，１９９９，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４〜２４７を参照のこと。所定のポリペプチドま
たはタンパク質において折り畳み回数は限定されていること、および一旦構造の決定的な
数が解明されれば、構造の予測は劇的にさらに正確になることが示唆されている（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９〜３７６
）。
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）
」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７
〜８７；Ｓｉｐｐｌら，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５〜１９）、「プロフィ
ール分析（ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」（Ｂｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５３：１６４〜１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍ．１８３：１４６〜１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５〜４３５８）および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａ
ｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，１９９９，前出；およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９
７，前出を参照のこと）が挙げられる。
特定の実施形態では、抗体改変体としては、グリコシル化部位の数および／またはタイ
プが、親のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されているグリコシル化改変体が
挙げられる。特定の実施形態では、タンパク質改変体は、ネイティブのタンパク質よりも
多いかまたは少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配
列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここではＸと
して指定されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であってもよい。こ
の配列を生じるアミノ酸残基の置換によって、Ｎ連結糖鎖の付加のための潜在的な新規な
部位が得られる。あるいは、この配列を排除する置換によって、既存のＮ連結糖鎖が除か
れる。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的には天然に存在する部位）が排除され
て、１つ以上の新規なＮ連結部位が作成されている、Ｎ連結糖鎖の再配列もまた提供され
る。さらなる好ましい抗体改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、親のアミノ酸
配列と比較して欠失されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されて
いるシステイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、不溶性の封入体の単離後のよ
うな生物学的に活性な高次構造に抗体が再折り畳みさせられなければならない場合、有用
であり得る。システイン改変体は一般的に、ネイティブなタンパク質よりも少ないシステ
イン残基を有し、そして代表的には、不対のシステインから生じる相互作用を最小化する
ために、偶数のシステイン残基を有する。
さらなる実施形態では、抗体改変体は、改変Ｆｃフラグメントまたは改変重鎖定常領域
を含む抗体を包含し得る。「結晶化するフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｉｚｅ）」を意味するＦｃフラグメント、または重鎖定常領域は、抗体に
対して変化した結合特徴を付与するような変異によって改変されてもよい。例えば、Ｂｕ
ｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５１：１〜８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５〜９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１〜６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕ
ｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２４５〜２５１；Ｍｅｄｅｓ
ａｎら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２〜２１００（その全て
が参考として本明細書に援用される）を参照のこと。このような変異は、置換、付加、欠
失またはそれらの任意の組み合わせを包含し得、そして代表的には、本明細書に記載の方
法に従って、および当該分野で公知の方法に従って（例えば、参照によって本明細書に援
用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲ
ＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹ
ＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）１つ以上の変異原性のオリゴヌクレオチド（
単数または複数）を用いて、部位指向性の変異誘発によって生成される、。
特定の実施形態によれば、アミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低
下するか、（２）酸化に対する感受性を低下するか、（３）タンパク質複合体を形成する
ための結合親和性を変更するか、（４）結合親和性を変更するか、そして／または（５）
このようなポリペプチドに他の物理化学的特性または機能的特性を付与するかまたは改変
する、アミノ酸置換である。特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（
特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において（特定の実
施形態では、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外側のポリペプチドの
一部において）作製されてもよい。好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は代表的
には、親の配列の構造的特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親の配
列に存在するヘリックスを破壊する傾向でも、親の配列を特徴付ける他のタイプの二次構
造を破壊する傾向でもあってはならない）。当該分野で認識されるポリペプチドの二次構
造および三次構造の例は、各々が参考として本明細書に援用される、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ（Ｃｒｅｉ
ｇｈｔｏｎ編，１９８４，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）；ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（Ｃ．
ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ（編）），１９９１，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら，１９９１，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載されている。
ペプチドアナログは一般に、鋳型のペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬
として製薬産業において用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド
模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄ
ｅｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と名付けられる。任意の目的のために参考として本明細書に援用
される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；Ｖｅｂ
ｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎ
ｓら，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）を参照のこと。このような化
合物は多くの場合、コンピュータによる分子モデリングの補助によって開発される。治療
上有用なペプチドに対して構造的に類似であるペプチド模倣物を用いて、同様の治療効果
または予防効果を得ることができる。一般には、ペプチド模倣物は、パラダイム（ｐａｒ
ａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち、生化学的な特性または生理学的な活性を有するポ
リペプチド）、例えばヒト抗体に対して構造的に類似であるが、当該分野で周知の方法に
よって、以下から選択される連結により必要に応じて置換される１つ以上のペプチド連結
を有する：−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（
シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ
−。同じタイプのＤアミノ酸での、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置
換（例えば、Ｌ−リジンの代わりに、Ｄ−リジン）を特定の実施形態で用いて、さらに安
定なペプチドを生成することができる。さらにコンセンサス配列または実質的に同一のコ
ンセンサス配列のバリエーションを含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（
任意の目的のために参考として本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ
，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）によって；例えば、ペプ
チドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加すること
によって、生成することができる。
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体ペプチド（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｐｔｉ
ｄｅ）（単数または複数）」とは、インタクトな抗体、または特定の結合についてそのイ
ンタクトな抗体と競合するその結合フラグメントをいう。特定の実施形態では、結合フラ
グメントは、組み換えＤＮＡ技術によって生成される。さらなる実施形態では、結合フラ
グメントは、インタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、産生される。
結合フラグメントとしては、限定はしないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）
２、Ｆｖ、および単鎖抗体が挙げられる。
「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」という用語は、ＮＧＦに対する特異性を付与する
のに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを包含する。「軽鎖
（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」という用語は、ＮＧＦに対する特異性を付与するのに十分
な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを包含する。全長重鎖は、可
変領域ドメイン、ＶＨおよび３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む
。このＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端であり、ＣＨ３ドメインは、カルボキ
シ末端である。「重鎖」という用語は、本明細書において用いる場合、全長重鎖およびそ
のフラグメントを包含する。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および定常領域ドメイ
ンＣＬを含む。重鎖と同様、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端であ
る。「軽鎖」という用語は、本明細書において用いる場合、全長軽鎖およびそのフラグメ
ントを包含する。Ｆ（ａｂ）フラグメントは、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１お
よび可変領域からなる。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形
成できない。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、１つの軽鎖および１つの重鎖を含み、この重
鎖がＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にさらに定常領域を含み、その結果、鎖間ジ
スルフィド結合が２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成され得る。こ
のＦｖ領域は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域は欠く。単鎖抗
体は、Ｆｖ分子であり、ここでは重鎖および軽鎖の可変領域がフレキシブルなリンカーに
よって接続されて、抗原結合領域を形成する単鎖ポリペプチド鎖を形成している。単鎖抗
体は国際特許出願公開番号ＷＯ８８／０１６４９、ならびに米国特許第４，９４６，７７
８号および同第５，２６０，２０３号に詳細にて考察されている。
特定の実施形態では、「多価特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」抗体または「多
機能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」抗体以外の二価抗体は、同一の抗原特異性
を有する結合部位を含むことが理解される。
本発明に従って抗体結合および抗体特異性を評価するのにおいて、抗体は、過剰の抗体
がレセプターに結合するリガンドの量を（とりわけ、インビトロ競合結合アッセイを用い
て測定した場合）少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも
８０％、少なくとも８５％もしくはそれ以上まで低下させる場合、レセプターへのリガン
ドの結合を実質的に阻害する。
「中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、それが結合する
標的抗原のエフェクター機能をブロックし得るかまたは実質的に低下させ得る抗体分子を
意味する。従って、「中和」抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦのレセプター結合および／または細
胞応答の誘発のような、エフェクター機能をブロックし得るかまたは実質的に低下させ得
る。「実質的に低下させる（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅ）」とは、標的
抗原（例えば、ヒトＮＧＦ）のエフェクター機能の少なくとも約６０％、好ましくは少な
くとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおさらに好ましくは少なくとも
約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０
％の低下を意味するものとする。
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプ
ターに特異的に結合し得る、任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を包含する。
特定の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面集団、例えばアミ
ノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含み、そして特定の実施形態では、特
異的な三次元構造特徴および／または特異的な荷電特徴を有し得る。エピトープは、抗体
によって結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および
／または高分子の複雑な混合物において、その抗体がその標的抗原を優先的に認識する場
合、抗原に特異的に結合すると言われる。好ましい実施形態では、抗体は、平衡解離定数
が１０−８Ｍ以下である場合、より好ましくは平衡解離定数が１０−９Ｍ以下である場合
、そして最も好ましくは平衡解離定数が１０−１０Ｍ以下である場合に、抗原に特異的に
結合すると言われる。
２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、参照抗
体と「本質的に同じエピトープ（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｐｉｔ
ｏｐｅ）」に結合する。２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープに結合する
か否かを決定するための、最も広範に用いられ、かつ迅速な方法は、標識された抗原また
は標識された抗体のいずれかを用いて、多くの異なる形式で構成され得る、競合アッセイ
である。通常は、抗原は基板上に固定されて、未標識の抗体が標識された抗体の結合をブ
ロックする能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。
「因子（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書において用いる場合、化合物、化合物
の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を意味する。
本明細書において用いる場合、「標識（ｌａｂｅｌ）」または「標識された（ｌａｂｅ
ｌｅｄ）」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の組み込み、または標識さ
れたアビジン（例えば、光学的な方法または比色定量的な方法によって検出可能である、
蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは酵素活性などの検出可能なマーカーを好ましくは
含むストレプトアビジン）によって検出可能であるビオチン部分のポリペプチドに対する
結合による、検出可能なマーカーの組み込みをいう。特定の状況では、この標識はまた治
療剤であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分
野で公知であり、かつ本明細書に開示された方法において有利に用いることができる。ポ
リペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射
性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴ
ｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシ
アネートすなわちＦＩＴＣ、ローダミン、またはランタニド蛍光物質）、酵素標識（例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホス
ファターゼ）、化学発光標識、ハプテン標識、例えば、ビオチニル基、および二次レポー
ターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッ
パー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、またはエピトープタグ）。特定の
実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎ、こ
こでｎ＜約２０）によって結合されて、可能性のある立体障害を減らす。
「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、本明細
書において用いる場合、生存物または以前に生存していた物由来の任意の量の物質を包含
するが、これらに限定されない。このような生存物としては、限定はしないが、ヒト、マ
ウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物が挙げられる。このような物質としては、限
定はしないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚が挙
げられる。
「薬学的因子または薬物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ ｏｒ ｄｒｕ
ｇ）」という用語は、本明細書において用いる場合、患者に適切に投与されたとき、所望
の治療効果を誘導し得る化合物または組成物をいう。本発明の抗体の１つまたは複数を含
む薬学的組成物に関して、「薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅ
ｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という表現は、本発明によれば、考慮される患者に
おいて、外部刺激に対する感度閾値の低下を無効にし得るこの薬学的組成物の量であって
、健康な被験体において観察される閾値に匹敵するレベルへの感度閾値の復元を伴う量を
意味することが理解される。
「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、本発明による処置から恩恵を受ける任意の状態で
ある。「障害」および「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、本明細書において交換可能に
用いられ、そして哺乳動物を該当の障害に罹り易くさせる病理的状態を含む、慢性および
急性のＮＧＦ媒介性障害、またはＮＧＦ媒介性疾患を包含する。
「ＮＧＦ媒介性疾患（ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」および「ＮＧＦ
媒介性状態（ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、ＮＧＦ
のレベルの増大またはＮＧＦの感度の増大を伴う任意の医学的状態または障害を包含し、
これには限定はしないが、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは
膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症
、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素および
化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群および非脈管性症候群（
ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ
）、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸
障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、
炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性
炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の
痛覚過敏および異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持され
る疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、
呼吸系、尿生殖器、胃腸系もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性
皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経
性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆
流、膵炎、および臓器痛が挙げられる。
本明細書において用いる場合、「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」お
よび「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｔ
）」という用語は、１つ以上の抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含むビヒクルまたは薬学的組成物
に関して用いる場合、所望の結果（すなわち、本発明のビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト
抗体での治療の場合、所望の効果とは、例えば、炎症および／または疼痛の所望の低下で
ある）を生じるのに十分な、またはＮＧＦの１つ以上の生物学的活性のレベルにおける観
察可能な低下を支持するのに十分な、量または投薬量を指す。さらに詳細には、治療有効
量とは、上記因子を用いてインビボで処置される被験体において、問題の状態、例えば、
炎症または疼痛に関連する臨床的に規定される病理学的プロセスの１つ以上を、ある期間
にわたって阻害するのに十分な、抗ヒトＮＧＦヒト抗体（単数または複数）の量である。
本発明では、抗ＮＧＦ抗体の「治療有効量」は、任意の疼痛性の医学的状態に関連する疼
痛の知覚を防止、停止、制御、または軽減し得る。本発明の方法では、「制御（ｃｏｎｔ
ｒｏｌ）」という用語およびその文法上の変化を用いて、望ましくない事象、例えば、疼
痛の、予防、部分的もしくは完全な阻害、軽減、遅延または緩徐化をいう。有効な量は、
選択される特定のビヒクルまたは抗ＮＧＦヒト抗体（単数または複数）に依存して変化し
得、そしてまた、治療されるべき被験体に関連する種々の要因および状態、ならびに障害
の重篤度に依存する。例えば、ビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト抗体（単数または複数）
がインビボで投与される場合、とりわけ、患者の年齢、体重および健康状態のような要因
、ならびに前臨床動物試験において得られた用量応答曲線および毒性データが、考慮され
るものである。この因子が、インビトロで細胞と接触される場合、当業者はまた、取り込
み、半減期、用量、毒性などのようなパラメーターを評価するために、種々の前臨床イン
ビトロ研究を設計する。所定の因子についての有効な量または治療有効量の決定は、当業
者の能力の十分に範囲内である。
本明細書において用いる場合、「神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ）」および「ＮＧＦ」という用語は、配列番号３０に示される、組み換えヒトＮＧＦ
１−１２０を含む、全ての哺乳動物種のネイティブ配列ＮＧＦと定義される。
本明細書において用いる場合、「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕ
ｒｅ）」または「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
）」とは、主な種である化合物または種が存在する（すなわち、モル基準で、この組成物
における任意の他の個々の種よりもそれが豊富である）ことを意味する。特定の実施形態
では、実質的に精製された画分とは、存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約５０
パーセント（モル基準で）をこの種が構成する組成物である。特定の実施形態では、実質
的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全ての高分子種のうち約８０％、８５％、
９０％、９５％または９９％より多くを、この種が構成する。特定の実施形態では、この
種は、本質的に均一まで精製され（混入する種は、従来の検出法ではこの組成物中で検出
できない）、ここでこの組成物は本質的に、単一の高分子種からなる。
「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、ヒトおよび動物の被験体を包含する。
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔ）」とは、治療的処置
および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖ
ｅ）手段の両方を指す。処置の必要なものとしては、既に障害を有するもの、ならびに障
害を有する傾向にあるもの、または障害が防止されるべきものが挙げられる。
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を包含し、そして複数
形の用語は単数形を包含する。
本発明の特定の実施形態によれば、ＮＧＦに対する抗体は、限定はしないが上記で言及
したものを包含する、神経障害性の疼痛および炎症性の疼痛、ならびにＮＧＦ媒介性疾患
を処置するために用いられ得る。
本発明の１態様では、ヒトＮＧＦに対して惹起され、かつヒトＮＧＦへの結合について
生物学的特異性および免疫学的特異性を有する、完全ヒトモノクローナル抗体が提供され
る。本発明の別の態様では、重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子のア
ミノ酸配列、特にその可変領域に相当する配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
が提供される。本発明のこの態様の特定の実施形態は、本発明によって提供される重鎖お
よび軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）特にＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に相当する配列である。
本発明のさらに別の態様では、免疫グロブリン分子および抗体、好ましくは本発明のモノ
クローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞および細胞株が提供される。本発明はま
た、生物学的におよび免疫学的に精製された抗体の調製物、好ましくはヒトＮＧＦに対し
て惹起されて、ヒトＮＧＦへの結合について生物学的および免疫学的特異性を有するモノ
クローナル抗体の調製物を提供する。
酵母人工染色体（ＹＡＣ）におけるメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングお
よび再構築して、マウス生殖系列にそれらを導入する能力によって、極めて大きいかまた
はおおまかにマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明し、そしてヒト疾患の有
用なモデルを生成するために有利なアプローチが得られる。さらに、ヒトの等価な産物で
のマウス遺伝子座の置換にこのような技術を利用することによって、発生の間のヒト遺伝
子産物の発現および調節、他の系とのそれらの関連、ならびに疾患誘導および進行におけ
るその関与に対する固有の洞察が得られる。
このようなストラテジーの重要な実際的な適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化（ｈ
ｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへの
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入によって、抗体のプログラムされた発現およ
びアセンブリの背景にある機構、ならびにＢ細胞発生におけるその役割を研究する機会が
得られる。さらに、このようなストラテジーによって、完全ヒトモノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂｓ）の産生の供給源が得られる。
「ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロ
ブリン配列に実質的に相当する可変領域および定常領域を有する抗体を包含する。特定の
実施形態では、ヒト抗体は、限定はしないが、マウスおよびラットのようなげっ歯類、な
らびにウサギのようなウサギ目の動物を含む非ヒト哺乳動物において産生される。特定の
実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞において産生される。特定の実施形態で
は、ヒト抗体は、組み換え的に産生される。
抗体に関連して「組み換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、組み換え手
段によって調製、発現、作製または単離される抗体を包含する。代表的な例としては、宿
主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組み換
え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン
遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（
例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：６２８７〜
６２９５（１９９２）を参照のこと）；または他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリ
ン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の方法によって、調製、発現、作製または単離
された抗体が挙げられる。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン
配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
ヒト抗体は、ヒトの治療において用いるために、非ヒト抗体およびキメラ抗体を上回る
少なくとも３つの利点を有する：
１）抗体のエフェクター部分がヒトであるので、ヒト抗体は、ヒト免疫系の他の部分と
良好に相互作用し得る（例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞毒
性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊する）；
２）ヒト免疫系は、ヒト抗体を外来性としては認識しないはずであり、従ってこのよう
な注射された抗体に対する抗体応答は、完全に外来性の非ヒト抗体または部分的に外来性
のキメラ抗体に対してよりも少ないはずである；
３）注射された非ヒト抗体は、ヒト抗体の半減期よりもかなり短いヒトの循環での半減
期を有することが報告されている。注射されたヒト抗体は、天然に存在するヒト抗体に対
して本質的に同一の半減期を有し、より小さくかつ少ない頻度の用量で与えることが可能
になる。
従って、完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来ＭＡｂｓに固有の免疫原性およびア
レルギー性の応答を最小化すること、そしてそれによって投与された抗体の有効性および
安全性を増大することが期待される。従って、本発明の完全ヒト抗体は、慢性および再発
性の疼痛の処置において用いることができ、その処置は反復性の抗体投与を必要とする。
従って、本発明の抗ＮＧＦ抗体の１つの特定の利点は、この抗体が完全ヒト抗体であり、
ヒト抗マウス抗体または他の以前に記載された非ヒト種由来の不完全ヒト抗体と共通に関
連する有害反応を最小限にしながら、非急性の方式で患者に投与できるということである
。
当業者は、ヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いてマウス抗体産生を欠損した
マウス株を操作することが可能であち、その結果このようなマウスは、マウス抗体の非存
在下でヒト抗体を産生する。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変性の大きい遺伝子多様
性、ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存し得る。抗体多様化および選択なら
びにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠失についてマウス細胞機構を利用すること
によって、これらのマウス株において再生されたヒト抗体レパートリーにより、ヒト抗原
を含む目的の任意の抗原に対する高親和性抗体を得る。ハイブリドーマ技術を用いて、所
望の特異性を有する抗原特異性ヒトＭＡｂを生成および選択することができる。
内因性の免疫グロブリン産生のない状況でヒト抗体の完全レパートリーを免疫の際に産
生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用してもよい。この
ような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入に
よって、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生が生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１〜２５５５（１９
９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３；
Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，７：３３（１９９３）；Ｎａ
ｔｕｒｅ １４８：１５４７〜１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０
４：９９５〜９９９（２０００）；ならびに米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，
８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第、５，
７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６
２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号および同第５，５４５，８０６号（その各々
が全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。ヒ
ト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーで産生することもできる（Ｈｏｏｇｅ
ｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９２）
；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅらおよ
びＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能であ
る（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６〜９５（１９９１））。
組み換えヒト抗体はまた、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトラン
スジェニックな動物を用いる場合、インビボ体細胞変異）に供され得、従って、組み換え
抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に関連
するアミノ酸配列に由来するが、インビボではヒト抗体の生殖系列レパートリー内には天
然には存在し得ない配列である。
特定の実施形態では、当業者は、ヒト以外の種由来の定常領域をヒト可変領域（単数ま
たは複数）とともにこのようなマウスで用いてキメラ抗体を産生することができる。
（天然に存在する抗体構築物）
天然に存在する抗体構築物単位は代表的には、四量体を含む。各々のこのような四量体
は代表的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各々の対が１つの全長「
軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖（代表的には約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「
重（ｈｅａｖｙ）」鎖（代表的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。各
々の軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は代表的には、代表的には抗原認識を担う、約１０
０〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は代表的に
は、エフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は代表的には、κ軽鎖および
λ軽鎖として分類される。重鎖は代表的には、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され
、そしてそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタ
イプを規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が挙げられる
がこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇ
Ｍ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは同様に、ＩｇＡ
１およびＩｇＡ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスに分割される。全長の
軽鎖および重鎖内では、代表的には可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の
「Ｊ」領域によって連結され、ここでこの重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領
域を含む。例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｃｈ．７，第２版
（Ｐａｕｌ，Ｗ．（編）），１９８９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（全ての目的
のためにその全体が参考として援用される））を参照のこと。各々の軽鎖／重鎖の対の可
変領域は代表的には、抗体結合部位を形成する。
可変領域は代表的には、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領
域に連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す
。各々の対の２つの鎖由来のＣＤＲは代表的には、フレームワーク領域によってアライメ
ントされ、これが特定のエピトープに結合し得る。Ｎ末端からＣ末端において、軽鎖可変
領域および重鎖可変領域の両方は、代表的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、Ｃ
ＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各々のドメインに対するアミノ酸の割り
当ては代表的には、免疫学的に重要なタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅ
ｒｅｓｔ）（１９８７および１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９
８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３の定義に従っている。
（二重特異性または二機能性の抗体）
二重特異性抗体または二機能性抗体は代表的には、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および
２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定
はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含む種々の
方法によって産生されてもよい。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎ
ｎ，１９９０ Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；Ｋｏｓｔｅ
ｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。
（抗体の調製）
本発明は、ヒトＮＧＦに結合する抗体を提供する。これらの抗体は、全長ＮＧＦまたは
そのフラグメントを用いた免疫によって産生され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル
抗体であっても、もしくはモノクローナル抗体であってもよく、そして／または組み換え
抗体であってもよい。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生
し得るトランスジェニック動物の免疫によって調製されるヒト抗体である（例えば、国際
特許出願公開ＷＯ９３／１２２２７を参照のこと）。
本発明の抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、
同じ種または別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲｓ）に接合されてもよい。特定の実
施形態では、抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲｓは、コンセンサスなヒ
トＦＲに接合されてもよい。コンセンサスなヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト
重鎖または軽鎖のアミノ酸配列由来のＦＲをアライメントさせて、コンセンサスなアミノ
酸配列を同定する。抗ＮＧＦ抗体重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来の
ＦＲで置換されてもよい。抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおけるまれなアミノ酸
は代表的には、置換されないが、残りのＦＲアミノ酸は置換されてもよい。まれなアミノ
酸とは、ＦＲにおいて通常はみいだされない位置にある特定のアミノ酸である。本発明の
抗ＮＧＦ抗体由来の移植された可変領域は、抗ＮＧＦ抗体の定常領域とは異なる定常領域
とともに用いられてもよい。あるいは、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部であ
る。ＣＤＲ移植は、任意の目的のために参考として本明細書に援用される、例えば、米国
特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、
同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号に記載されている。
本発明の抗体は好ましくは、マウスの抗体産生細胞に挿入されたヒト抗体産生遺伝子座
の実質的な一部を有しており、そして内因性マウス抗体を産生するのにおいて異なるよう
にさらに操作されている、トランスジェニックマウスを用いて調製される。このようなマ
ウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生可能であり、そしてマウスの免疫グロ
ブリン分子および抗体を産生しないかまたはその実質的に少ない量を産生する。この結果
を達成するために利用される技術は、本明細書に開示された特許、出願および引用文献に
開示されている。好ましい実施形態では、当業者は、任意の目的のために参考として本明
細書に援用される、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２４８９３に開示されるような方法
を使用してもよい。任意の目的のために参考として本明細書に援用される、Ｍｅｎｄｅｚ
ら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６も参照のこと。
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例え
ば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）
の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の技術によって産生されてもよ
い。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則的には、モノクローナル抗体
を産生するための他の技術（例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換）を使
用することもできる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウスである。マウスにおけるハイ
ブリドーマ産生はきわめてよく確立されており、そして免疫プロトコール、および融合の
ための免疫された脾細胞の単離のための技術は、当該分野で周知である。融合パートナー
（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順はまた公知である。
好ましい実施形態では、ＮＧＦに指向するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではな
くヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。これら
のトランスジェニックマウスは、本明細書において「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれるが、
これは、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖の免疫グロブリン配列
をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を
不活性化する標的化変異とともに含む（Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３
６８：８５６〜８５９）。従って、上記マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を
示し、そして免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラスの切
り替えおよび体細胞性の変異を受けて高い親和性のヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を
産生する（Ｌｏｎｂｅｒｇら，前出；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉ
ｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎ
ｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６〜５４６）。
ＨｕＭａｂマウスの調製は、その全ての内容全体が参考として本明細書に援用されている
、Ｔａｙｌｏｒら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７〜
６２９５；Ｃｈｅｎら，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５：６４７〜６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：
２９１２〜２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８
５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ １１３：４９〜１０１；Ｔａｙｌｏｒら，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９〜５９１；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ
，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；Ｈａｒｄｉｎ
ｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３
６〜５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １４：８４５〜８５１に詳細に記載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよ
びＫａｙに対する、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第
５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５
，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，
８７４，２９９号および同第５，７７０，４２９号、ならびにその全ての開示全体が参考
として本明細書に援用されている、１９９３年６月２４日公開のＳｕｒａｎｉらの米国特
許第５，５４５，８０７号；１９９３年６月２４日公開、国際特許出願公開番号ＷＯ９３
／１２２７；１９９２年１２月２３日公開ＷＯ９２／２２６４６；および１９９２年３月
１９日公開ＷＯ９２／０３９１８を参照のこと。あるいは、以下の実施例に記載されたＨ
Ｃｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭのトランスジェニックマウス株が、ヒト抗ＮＧＦ抗体を産
生するために用いられてもよい。
本発明は、生物活性のヒトＮＧＦポリペプチドに特異的であり、かつこれを中和するヒ
トモノクローナル抗体を提供する。また、ＮＧＦポリペプチドに高度に特異的であり、か
つＮＧＦポリペプチドに結合したとき、これを中和する、抗体の重鎖および軽鎖のアミノ
酸配列も提供される。この高い特異性によって、抗ヒトＮＧＦヒト抗体および同様の特異
性を有するヒトモノクローナル抗体は、ＮＧＦ関連性疾患のための免疫療法に有効になり
得る。
１態様では、本発明は、本明細書において提供される４Ｄ４抗体と同じエピトープまた
は本質的に同じエピトープに結合する、単離されたヒト抗体を提供する。
１態様では、本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４お
よび７９〜１３０に示される少なくとも１つのアミノ酸を含む単離されたヒト抗体であっ
て、高い親和性でＮＧＦポリペプチドエピトープに結合し、かつＮＧＦポリペプチド活性
をアンタゴナイズする能力を有する抗体を提供する。好ましくは、これらの抗体は、本明
細書に提供される４Ｄ４抗体と同じかまたは本質的に同じエピトープに結合する。
好ましい実施形態では、上記単離されたヒト抗体は、１×１０−９Ｍ以下という解離定
数（ＫＤ）でＮＧＦポリペプチドに結合して、１×１０−７Ｍ以下というＩＣ５０でイン
ビトロ中和アッセイにおいてＮＧＦ誘導性生存を阻害する。さらに好ましい実施形態では
、この単離されたヒト抗体は、１×１０−１０Ｍ以下という解離定数（ＫＤ）でＮＧＦポ
リペプチドに結合して、１×１０−８Ｍ以下というＩＣ５０でインビトロ中和アッセイに
おいてＮＧＦ誘導性生存を阻害する。さらにより好ましい実施形態では、この単離された
抗ＮＧＦヒト抗体は、１×１０−１１Ｍ以下という解離定数（ＫＤ）でヒトＮＧＦポリペ
プチドに結合して、１×１０−９Ｍ以下というＩＣ５０でインビトロ中和アッセイにおい
てＮＧＦ誘導性生存を阻害する。前述の結合および中和基準を満たす抗ヒトＮＧＦヒト抗
体の例は本明細書に提供される。
本発明の最も好ましい抗ヒトＮＧＦヒト抗体は、本明細書において４Ｄ４と呼ばれ、そ
してそれぞれ配列番号１２および配列番号１０に示されるようなＶＬポリペプチド配列お
よびＶＨポリペプチド配列を有する。４Ｄ４のＶＬおよびＶＨをコードするポリヌクレオ
チド配列は、それぞれ配列番号１１および配列番号９に示される。本発明の抗ヒトＮＧＦ
ヒト抗体の特性は、実施例に詳細に開示される。特に著しいのは、ＮＧＦポリペプチドに
ついての高い親和性、および本明細書に実証されるＮＧＦポリペプチド活性をアンタゴナ
イズする高い能力である。
抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（ＫＤ）は、実施例９に一般的に記載されるような表
面プラズモン共鳴によって決定され得る。一般には、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡ
ｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、リガンド（バイオセンサーマト
リックス上に固定された組み換えＮＧＦポリペプチド）と分析物（溶液中の抗体）との間
のリアルタイムの結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオ
センサーマトリックス上の抗体）を固定して、リガンド（溶液中の組み換え体Ｖ）を呈す
ることによっても行うことができる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（ＫＤ）はまた、
ＫｉｎＥｘＡ方法論を用いることによって決定され得る。本発明の特定の実施形態では、
この抗体は、約１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのＫＤでＮＧＦに結合する。本明細書において
用いる場合「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとす
る。本発明の目的については、ＫＤは、実施例９に示されるように決定した。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイ
プ、ＩｇＧ３アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプの抗体である。好ましくはこの抗
体はＩｇＧ３アイソタイプの抗体である。さらに好ましくは、この抗体は、ＩｇＧ１アイ
ソタイプの抗体である。最も好ましくはこの抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体である
。他の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、Ｉｇ
ＥアイソタイプまたはＩｇＤアイソタイプの抗体である。本発明の好ましい実施形態では
、この抗体は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、ヒトＩｇＧ３重
鎖またはヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ２重鎖定常領域を
含む本発明の抗体の発現は、以下の実施例に記載されている。特定の実施形態では、この
抗体の可変領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイ
プまたはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域以外の定常領域に連結される。特定の実施形態
では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされている。
特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖に対する保存的改変（そしてヌク
レオチドをコードする対応する改変）は、本明細書において開示される抗ＮＧＦ抗体の特
徴と類似の機能的および化学的特徴を有する抗ＮＧＦ抗体を生成する。対照的に、抗ＮＧ
Ｆ抗体の機能的および／または化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）置換の領域に
おける分子骨格の構造、例えばシートまたはらせん高次構造として、（ｂ）標的部位にお
ける分子の変化もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対する効果が有意
に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の置換を選択することによって、達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、その位置でのアミノ酸残基の極性または荷電に対し
て影響がほとんどないかまたは全くないような、天然ではない残基による天然のアミノ酸
残基の置換を包含し得る。さらに、ポリペプチド中の任意の天然の残基はまた、「アラニ
ンスキャニング変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
）」について以前に記載されているとおり、アラニンで置換されてもよい。
所望のアミノ酸置換（保存的であっても、または非保存的であっても）は、このような
置換が所望される時点で当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ
酸置換を用いて、抗ＮＧＦ抗体の重要な残基を同定すること、または本明細書に記載され
る抗ＮＧＦ抗体の親和性を増大もしくは低下させることができる。
周知のとおり、アミノ酸配列におけるわずかな変化、例えば、１つ、２〜３（ａ ｆｅ
ｗ）またはさらには数個のアミノ酸の欠失、付加または置換は、実質的に同一の特性を有
する、もとのタンパク質の対立遺伝子型をもたらし得る。従って、本明細書に詳細に記載
される抗体に加えて、他の「実質的に相同な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌ
ｏｇｏｕｓ）」抗体は、当業者に周知の種々の組み換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計
および製造され得る。一般には、遺伝子の改変は、部位指向性変異誘発のような種々の周
知の技術によって容易に達成され得る。従って、本発明は、本明細書に開示される抗ＮＧ
Ｆヒト抗体に実質的に類似の特徴を有する「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体
（ｍｕｔａｎｔ）」の抗ＮＧＦヒト抗体を企図する（例えば、その全てが参考として本明
細書に援用されるＷＯ００／５６７７２を参照のこと）。従って、抗ＮＧＦヒト抗体に関
して「改変体」または「変異体」という用語は、任意の結合分子（分子Ｘ）を意味し、こ
こでは（ｉ）重鎖の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または軽鎖の超可変領
域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を全体としてとれば、それぞれ、配列番号１４、配
列番号１８および配列番号２２、または配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４
に示される超可変領域に対して、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相
同、さらに好ましくは少なくとも９５％相同であり、そして（ｉｉ）この改変体または変
異体は、分子Ｘのフレームワーク領域と同一のフレームワーク領域を有する参照の抗ＮＧ
Ｆヒト抗体と同じ程度まで、ヒトＮＧＦの活性を阻害し得る。
通常は、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲであって、それ
を全体としてとった場合、それぞれ配列番号１４、配列番号１８および配列番号２２、な
らびに／または配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４に示されるアミノ酸配列
に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配
列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、さらにより好まし
くは少なくとも約９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の配列
同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらにより好ましく
は少なくとも約９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同
一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の酸配列同一性、さらにより好ましくは
少なくとも約９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の配列同一
性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖およ
び／または軽鎖のＣＤＲを有する。
さらに好ましくは、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、軽鎖可変領域であって、それを全体と
してとった場合、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号
８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０もしくは配列番号９１に示されるアミ
ノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少な
くとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、さらに
より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８
４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらにより
好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８７％
の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、さらにより好ま
しくは少なくとも約８９％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の配
列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、さらにより好ましく
は少なくとも約９２％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の配列
同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、さらにより好ましくは
少なくとも約９５％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の配列同
一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少
なくとも約９８％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸
配列同一性を有する、軽鎖可変領域、ならびに／または重鎖可変領域であって、それを全
体としてとった場合、配列番号１０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５もしく
は配列番号８７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一
性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の
配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは
少なくとも約８２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８３％の配列同一
性、さらにより好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、さらにより好ましくは少な
くとも約８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、
さらにより好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくと
も約８８％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、さら
により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも
約９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、さらに
より好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約
９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、さらによ
り好ましくは少なくとも約９６％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９
７％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の酸配列同一性、さらに
より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖可変領域を有す
る。
ポリヌクレオチドに関して「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、本発明のポリヌクレオ
チド配列と少なくとも約７５％の核酸配列同一性を有する核酸分子を指すものとする。通
常は、ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に開示される新規な核酸配列と少なくとも約
７５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の核酸配列同一性、なおよ
り好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８２
％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、さら
により好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくと
も約８５％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一
性、さらにより好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは
少なくとも約８８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８９％の核酸
配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、さらにより好
ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２
％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらに
より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも
約９５％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の核酸酸配列同一
性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の核酸酸配列同一性、さらにより好ましく
は少なくとも約９８％の核酸酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の
核酸配列同一性を有する。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書の実施例１０および図５〜１０に示されよう
に、本発明の抗体に対してある割合の同一性を有する抗体、または本発明の重鎖可変領域
、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域に対してある割合の同一性を
有する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域を含む抗
体を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、重鎖と軽鎖とを含む
単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸
配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグ
メントに対して少なくとも７０％もしくは７５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８１
に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免
疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％もしくは９５％相
同であるアミノ酸配列；配列番号８３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグ
メントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０
％、８０％、８５％もしくは９５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８５に示されるア
ミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン
フラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列
；配列番号８７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％もしくは８
０％同一であるアミノ酸配列；配列番号７９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合
フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくと
も５６％同一であるアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、重鎖と軽鎖とを含む
単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸
配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグ
メントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配
列；配列番号８０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫
学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％もしくは
９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号８８に示されるアミノ酸配列またはその抗原結
合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なく
とも７０％、７４％、９０％もしくは９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号８９に示
されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グ
ロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％もしくは８７％同一で
あるアミノ酸配列；配列番号９０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメン
トもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、
８５％、９０％もしくは９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号９１に示されるアミノ
酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラ
グメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である
アミノ酸配列；配列番号８２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントも
しくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０
％、９０％、９５％もしくは９６％同一であるアミノ酸配列；配列番号８４に示されるア
ミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン
フラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９
％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号８６に示されるアミノ酸配列またはその抗
原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少
なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配
列、を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト重鎖ＣＤＲ１を
含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖ＣＤＲ１は、配列番号９８、配列
番号１０５、配列番号１１０もしくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはその抗
原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少
なくとも４０％もしくは６０％同一であるアミノ酸配列である。
他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト重鎖ＣＤＲ２を含
む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖ＣＤＲ２は、配列番号９９に示され
るアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブ
リンフラグメントに対して少なくとも７０％８２％もしくは９４％同一であるアミノ酸配
列；配列番号１０６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７６％
同一であるアミノ酸配列；配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラ
グメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも５
９％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結
合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なく
とも７０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１１に示されるアミノ酸配列ま
たはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント
に対して少なくとも７０％、７５％、もしくは８０％同一であるアミノ酸配列である。
さらに他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ
１を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ１は、配列番号１０１に示
されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グ
ロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列
；配列番号９５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学
的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％も
しくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１９に示されるアミノ酸配列またはそ
の抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対し
て少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２２に
示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫
グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一であるア
ミノ酸配列；または配列番号１２５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメ
ントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８０％
同一であるアミノ酸配列；配列番号２４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラ
グメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７
５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０７に示されるアミノ
酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラ
グメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配
列番号１１３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的
に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一で
あるアミノ酸配列である。
さらなる実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ２
を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ２は、配列番号１０２に示さ
れるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロ
ブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；
配列番号９６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的
に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配
列；配列番号１２０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免
疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミ
ノ酸配列；配列番号１２３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもし
くは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であ
るアミノ酸配列；または配列番号１２６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラ
グメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７
０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２９に示されるアミノ酸配列ま
たはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント
に対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号２０に示さ
れるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロ
ブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０８
に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免
疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸
配列；配列番号１３３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは
免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるア
ミノ酸配列；あるいは配列番号１１４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグ
メントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０
％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列である。
他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ３を含
む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ３は、配列番号１０３に示される
アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリ
ンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列
番号９７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機
能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一である
アミノ酸配列；配列番号１２１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメント
もしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もし
くは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２７に示されるアミノ酸配列またはその
抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して
少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３０に示されるア
ミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリン
フラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番
号１６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能
的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるア
ミノ酸配列；配列番号１０９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントも
しくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしく
は８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３４に示されるアミノ酸配列またはその抗
原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少
なくとも７８％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１５に示されるアミノ酸配
列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメ
ントに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である。
４Ｄ４抗体重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、それぞれ配列番号１０および１２に示
される。しかし、多くの潜在的なＣＤＲ接触残基は、他のアミノ酸による置換の影響を受
けやすく、そしてそれでも抗体が抗原に対する実質的な親和性を保持することを可能にし
ている。同様に、重鎖および軽鎖におけるＣＤＲと接触していない多くのフレームワーク
残基によって、ヒト抗体の親和性または非免疫原性の有意な損失なしに、ヒトコンサンサ
スアミノ酸での、他のヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換、または他のマウス
抗体からのアミノ酸の置換が適応され得る。種々の別のアミノ酸の選択を用いて、親和性
、特異性、非免疫原性、製造の容易さ、および他の所望の特性の種々の組み合わせを有す
る、開示された抗ＮＧＦ抗体およびそのフラグメントのバージョンを生成することができ
る。
別の実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現されて
もよい。これらの実施形態では、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために特定の抗体
をコードする配列を用いてもよい。これらの実施形態によれば、米国特許第４，３９９，
２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９
，４５５号（その全てが任意の目的のために参考として本明細書に援用される）に例示さ
れているとおり、例えばウイルスへ（またはウイルスベクターへ）ポリヌクレオチドを組
み込んで、このウイルス（またはベクター）によって宿主細胞を形質導入する方法、また
は当該分野で公知のトランスフェクション手順による方法、などを含む、宿主細胞にポリ
ヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法を用いて、形質転換を達成することがで
きる。一般的に、用いられる形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。哺
乳動物細胞へ異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該分野で周知であり、そ
してこれには、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリ
ブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リ
ポソームへのポリヌクレオチド（単数または複数）の封入、および核へのＤＮＡの直接マ
イクロインジェクションが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のＮＧＦ抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または軽鎖可変領
域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的な連結技術を用いて適切な発現ベクタ
ー中に挿入される。好ましい実施形態では、抗ＮＧＦ抗体重鎖または軽鎖の定常領域を、
適切な可変領域のＣ末端に付加して、そして発現ベクター中に連結する。このベクターは
代表的には、使用される特定の宿主細胞において機能的である（すなわち、このベクター
は、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞の機構に適切で
ある）ように選択される。発現ベクターの概説に関しては、ＭＥＴＨ．ＥＮＺ．１８５（
Ｇｏｅｄｄｅｌ（編））１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
代表的には、任意の宿主細胞において用いる発現ベクターは、プラスミド維持のため、
ならびに内因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このよ
うな配列は総称的に、「隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ばれ、
特定の実施形態では、このような配列は代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を
含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーお
よびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のための
リーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現される
べきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能
なマーカーエレメント。これらの配列の各々は以下に考察される。
必要に応じて、ベクターは、「タグ（ｔａｇ）」コード配列、すなわち、抗ＮＧＦ抗体
ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を
含んでもよい；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）
、または別の「タグ」、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）、
またはｍｙｃ（これについては、市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは代表
的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、そして宿主細胞からのＮＧ
Ｆ抗体のアフィニティ精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製
は、例えば、アフィニティマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマト
グラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、種々の手段によって、例えば
、切断のために特定のペプチダーゼを用いる手段によって、精製された抗ＮＧＦ抗体ポリ
ペプチドから引き続いて除去されてもよい。
隣接配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すな
わち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源
由来の隣接配列の組み合わせ）、合成または天然であってもよい。従って、隣接配列の供
給源は、この隣接配列が機能的であり、宿主細胞の機構によって活性化され得る条件下で
は、任意の原核生物であっても、または真核生物であっても、任意の脊椎動物もしくは無
脊椎動物であっても、または任意の植物であってもよい。
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法
によって達成され得る。代表的には、本明細書において有用な隣接配列は、マッピングに
よって、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従
って適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織供給源から単離可能である。ある
場合には、隣接配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。ここでは、隣接配列は、核
酸合成またはクローニングのために本明細書において記載された方法を用いて合成され得
る。
隣接配列の全てが公知であるか一部のみが公知であるかにかかわらず、これは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ならびに／または適切なプローブ、例えば、同じも
しくは別の種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくは隣接配列フラグメントを用いて
ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。隣接配列が
公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列またはさ
らに別の遺伝子（単数または複数）を含み得る、ＤＮＡのさらに大きい小片から単離する
ことができる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレア
ーゼ消化を行い、その後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマ
トグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）または当業者に公知の他の方法を用いて単
離することによって、達成できる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業
者に容易に明らかである。
複製起点は代表的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は宿主細
胞においてベクターの増幅を補助する。選り抜きのベクターが複製起点の部位を含まない
場合、既知の配列に基づいて化学的に合成して、ベクターに連結してもよい。例えば、プ
ラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、種々のウイルス起点（
例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ま
たはポリオーマウイルス、例えば、ＨＰＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクロ
ーニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクタ
ーには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターをも含むので
、多くの場合単独で用いられる）。
転写終結配列は代表的には、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置して
、転写を集結するように機能する。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃ
リッチフラグメントであり、ポリＴ配列が続く。この配列はライブラリーから容易にクロ
ーニングされるかまたはベクターの一部として市販さえされているが、本明細書に記載の
方法のような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は、選択性の培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増
殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿
主細胞については、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン
もしくはカナマイシンに対する耐性を付与するか；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完す
るか；あるいは（ｃ）複合培地または規定の培地から利用できない重要な栄養物を供給す
る、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子およびテトラマイシン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシ
ン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物の宿主細胞の両方における選択のために用
いることができる。
発現される遺伝子を増幅するために、他の選択遺伝子が用いられてもよい。増幅とは、
増殖または細胞の生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組み換え細胞の連続
的世代の染色体内において縦列で反復されているプロセスである。哺乳動物細胞のための
適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子およびプロ
モーターなしのチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。ベクターに存在する選択遺伝子に
よって形質転換体のみが生存するように固有に適合されるという選択圧力下に、哺乳動物
細胞形質転換体を置く。選択圧力は、培地中の選択因子の濃度が連続的に増大される条件
下で形質転換細胞を培養することによって付与され、これによって、選択可能遺伝子と、
別の遺伝子（例えばＮＧＦポリペプチドに結合する抗体）をコードするＤＮＡとの両方の
増幅がもたらされる。結果として、抗ＮＧＦ抗体のようなポリペプチドの増大した量は、
増幅されたＤＮＡから合成される。
リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ
（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）
によって特徴付けられる。このエレメントは代表的には、プロモーターの３’側および発
現されるべきポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合のような、ある場合
には、グリコシル化または収率を改善するために種々のプレ配列またはプロ配列を操作し
てもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更してもよいし
、またはグリコシル化に影響し得るプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、
（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）−１位に、発現に付随する１つ以上のさらな
るアミノ酸を有してもよく、これは完全に取り除かれていなくてもよい。例えば、最終タ
ンパク質産物は、アミノ末端に結合されたペプチダーゼ切断部位に見出される１つまたは
２つのアミノ酸残基を有してもよい。あるいは、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような
領域で切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用によって、所望のポリペプチドのわ
ずかに短縮された形態が生じ得る。
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは代表的には、宿主生物によって認
識され、かつ抗ＮＧＦ抗体をコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを
含む。プロモーターは、その構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンに対し
て上流（すなわち、５’側）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ内）に位置する非転写
配列である。プロモーターは以下の２つのクラスのうちの１つに慣用的に分類される：誘
導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養物の有無また
は温度の変化のような培養条件におけるいくつかの変化に応答して、それらの制御下でＤ
ＮＡから増大したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、それらが作動
可能に連結されている遺伝子を均一に転写し、すなわち、遺伝子発現に対する制御はほと
んどないかまたは全くない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモー
ターは周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源のＤＮＡからプ
ロモーターを除去して、そしてこのベクターに所望のプロモーター配列を挿入することに
よって、本発明の抗ＮＧＦ抗体を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連
結される。
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野で周知である。酵母エンハン
サーは、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞とともに使用す
るための適切なプロモーターは周知であり、そしてウイルス、例えば、ポリオーマウイル
ス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイ
ルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスお
よび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られたプロモータ
ーが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、
異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモータ
ーが挙げられる。
該当し得るさらなるプロモーターとしては、限定はしないが以下が挙げられる：ＳＶ４
０初期プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ
２９０：３０４〜１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８４，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８１：６５９〜６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’
長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２
２：７８７〜９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８
１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４〜４５）；メ
タロチオネイン遺伝子由来のプロモーターおよび調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８
２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９〜４２）；ならびに原核生物プロモーター、例えば、β
ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７〜３１）；またはｔａｃプロ
モーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ
．Ａ．，８０：２１〜２５）。また目的のものは、組織特異性を示して、トランスジェニ
ック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域である：膵臓の腺房細胞にお
いて活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３
８：６３９〜４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎ
ａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５〜５１５）；膵臓β細胞において
活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：
１１５〜２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓ
ｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７〜５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５
，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３〜３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６〜４４）；精巣、乳房、リンパ系細胞および肥満細胞
において活性なマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌ
ｌ ４５：４８５〜９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら
，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜７６）；肝臓において活性
なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９〜４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３５：５３〜５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓ
ｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜７１）；骨髄性細胞
において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１５：３３８〜４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９〜９４）；
脳におけるオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）において活性なミエリン塩基性タンパ
ク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３〜１２）
；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１４：２８３〜８６）；ならびに視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出
ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２
〜７８）。
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等な真核生物によって本発明の抗ＮＧＦ抗
体を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増大し得る。エンハンサーは、プロ
モーター上で転写を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用
性エレメントである。エンハンサーは比較的、方向および位置に依存し、転写単位の５’
および３’の両方の位置で見出されている。哺乳動物遺伝子から利用可能ないくつかのエ
ンハンサー配列は公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェト
プロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーを用
いる。当該分野で公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター
エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生
物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベク
ター中でコード配列の５’または３’のいずれに位置してもよいが、代表的にはプロモー
ターから５’部位に位置する。
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築されてもよい。
このようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含んでも含まなくてもよい。本明細書に
記載される隣接配列の１つ以上は既にはベクターに存在しないが、その隣接配列を個々に
入手してベクターに連結してもよい。隣接配列の各々を得るために用いた方法は、当業者
に周知である。
ベクターが構築され、そして軽鎖、重鎖、または抗ＮＧＦ抗体を含む軽鎖および重鎖を
コードする核酸分子がこのベクターの適切な部位に挿入された後、この完成したベクター
を増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞中に挿入してもよい。選
択された宿主細胞への抗ＮＧＦ抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェ
クション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェ
クション、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、また
は他の公知の技術を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部は、
用いられる宿主細胞のタイプに依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者
に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、抗ＮＧＦ抗体を合成し、この抗体は引き
続いて、培養培地から（宿主細胞が培地中にこの抗体を分泌する場合）、またはこの抗体
を産生する宿主細胞から直接（この抗体が分泌されない場合）、収集できる。適切な宿主
細胞の選択は、種々の要因、例えば、所望の発現レベル、活性のために所望されるかまた
は必要であるポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的
に活性な分子への折り畳みの容易さに依存する。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そして
これには、限定はしないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられ、これには限定はしない
が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター仔の腎臓（
ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）お
よび多数の他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態では、どの細胞株が高い発現レベル
を有し、ＮＧＦ結合特性を有する抗体を構成的に生成するかを決定することを通じて、細
胞株を選択することができる。別の実施形態では、それ自体の抗体を生成しないが、異種
の抗体を作製および分泌する能力を有するＢ細胞系列由来の細胞株を選択することができ
る。
本発明の抗体は、生物学的サンプル中のＮＧＦを決定するため、およびＮＧＦタンパク
質を産生する細胞または組織の同定のために、有用である。ＮＧＦに特異的に結合する本
発明の抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患の治療において有用であり得る。このような抗体は、Ｎ
ＧＦを検出するため、およびＮＧＦがＮＧＦレセプターとの複合体を形成することを阻害
するための結合アッセイにおいて用いられ得る。ＮＧＦに結合して、他の結合化合物との
相互作用をブロックするこのような抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患を調節することにおいて治
療的な用途を有し得る。好ましい実施形態では、ＮＧＦに対する抗体は、そのレセプター
に対するＮＧＦ結合をブロックし得、これによってＮＧＦ誘導性シグナル伝達カスケード
の破壊を生じ得る。
本発明はまた、本明細書に開示される障害または状態のいずれか１つのような、患者に
おける、ＮＧＦの発現増大、またはＮＧＦに対する感度の増大によって生じる疼痛性の障
害または状態の処置のための薬物の製造における本発明の１つ以上の抗体の使用に関する
。
好ましい実施形態では、本発明は、薬学的組成物であって、治療有効量の１つまたは複
数の本発明の抗体を、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤
および／またはアジュバントとともに含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、受容可
能な処方物質は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性で
ある。好ましい実施形態では、治療有効量の抗ＮＧＦ抗体を含む薬学的組成物が提供され
る。
特定の実施形態では、受容可能な処方物質は好ましくは、使用される投薬量および濃度
でレシピエントに対して非毒性である。
特定の実施形態では、上記薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色
調、等張性、臭気、無菌性、安定性、分解もしくは放出の速度、組成物の吸着もしくは浸
透を、改変、維持または保存するための処方物質を含んでもよい。このような実施形態で
は、適切な処方物質としては、限定はしないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミ
ン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アルコルビ
ン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭
酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）；バルク剤（例えば
、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリン
またはヒドロキシプロピルβシクロデキストリン）；賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖類；
二糖類；ならびに他の糖類（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タ
ンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味料
および希釈剤；乳化剤；親水性のポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量
ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンズア
ルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラ
ベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例
えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコー
ル（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例
えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソル
ベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール
、チロキサポール）；安定性強化剤（例えば、スクロースまたはソルビタール）；等張化
剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、
マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）お
よび／または薬学的アジュバントが挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡ
ＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎ
ａｒｏ（編）），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照の
こと。
特定の実施形態では、最適の薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式
および所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯ
Ｎ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，前出を参照のこと。特定の
実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボでの
放出の速度、およびインビボでのクリアランスの速度に影響し得る。
特定の実施形態では、薬学的組成物における主なビヒクルまたはキャリアは、現実には
水性であっても非水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、非経
口投与のための組成物中に共通の他の物質で補充された可能性がある、注射用水、生理学
的生理食塩水または人工的な脳脊髄液であってもよい。中性の緩衝化生理食塩水、または
血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。好ましい実
施形態では、本発明の薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または
約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、そしてさらにソルビトール、スクロース、
Ｔｗｅｅｎ−２０および／またはその適切な代替物を含んでもよい。本発明の特定の実施
形態では、抗ＮＧＦ抗体組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を最適の
処方剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、
前出）とともに、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することによって貯蔵のため
に調製され得る。さらに、特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体産物は、スクロースのよう
な適切な賦形剤を用いて凍結乾燥剤として処方されてもよい。
本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、この組成物は
、吸入のために、または経口のような消化管を通じた送達のために選択され得る。このよ
うな薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内である。
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在することが好ましい。特定の実施形態
では、緩衝剤を用いて、この組成物を生理学的なｐＨで、またはわずかに低いｐＨで、代
表的には約５〜約８のｐＨ範囲内で維持する。
非経口的投与を考慮する場合、本発明における使用のための治療組成物は、所望の抗Ｎ
ＧＦ抗体を薬学的に受容可能なビヒクル中に含む、発熱物質なしの、非経口的に受容可能
な水溶液の形態で提供されてもよい。非経口注射のために特に適切なビヒクルは滅菌蒸留
水であり、この滅菌蒸留水中に、抗ＮＧＦ抗体が、適切に保存された無菌の等張性溶液と
して処方されている。特定の実施形態では、この調製物は、デポ注射を介して送達できる
産物の制御放出または徐放性放出を提供し得る、ある因子、例えば、注射用マイクロスフ
ェア、生分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ酪酸
またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームとともに、所望の分子の処方物を含
んでもよい。特定の実施形態では、循環中の持続期間を延長する効果を有する、ヒアルロ
ン酸も用いることができる。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを用いて
、所望の抗体分子を導入することができる。
本発明の薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。これらの実施形態では、抗ＮＧ
Ｆ抗体は、乾燥した吸入可能な粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、抗
ＮＧＦ抗体吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに処方されてもよい。
特定の実施形態では、溶液は噴霧され得る。従って、肺投与および処方の方法はさらに、
参考として援用されており、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載する、国際特
許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に記載されている。
処方物は経口的に投与できることも意図される。この様式で投与される抗ＮＧＦ抗体は
、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の配合に習慣的に用いられるキャリアと一緒
に、またはそのキャリアなしで、処方され得る。特定の実施形態では、カプセルは、バイ
オアベイラビリティーが最大化されて予備的な全身性の分解が最小化される場合、腸管に
おけるポイントでこの処方物の活性部位を遊離するように設計され得る。抗ＮＧＦ抗体の
吸着を促進するためにさらなる因子が含まれてもよい。希釈剤、香味料、低融点ワックス
、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合因子も使用され得る。
本発明の薬学的組成物は好ましくは、１または複数の抗ＮＧＦ抗体の有効量を、錠剤の
製造に適切な非毒性賦形剤と混合して含んで提供される。滅菌水、または別の適切なビヒ
クルに錠剤を溶解することによって、単位用量形態で溶液を調製し得る。適切な賦形剤と
しては、限定はしないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまた
は重炭酸塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム；または結合因子、例えばデンプン、
ゼラチンもしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステア
リン酸、もしくは滑石が挙げられる。
さらなる薬学的組成物は、当業者には明白であり、これには、持続送達または徐放性送
達の処方物中に抗ＮＧＦ抗体を含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達または徐放
性送達の手段、例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子または多孔性ビーズおよび
デポ注射剤を処方するための技術も当業者には公知である。例えば、参考として援用され
ており、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の徐放性放出を記載している
、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続放出調製物は、成
形された物質の形態で、半透過性ポリマー物質、例えばフィルムまたはマイクロカプセル
を含んでもよい。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（
参考として各々が援用される、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開
番号ＥＰ０５８４８１に開示される）、Ｌグルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートと
のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７〜５
５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，
Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７およびＬａｎｇｅｒ，１
９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅ
ｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開番号ＥＰ１
３３，９８８）を含んでもよい。持続放出組成物はまた、当該分野で公知の任意のいくつ
かの方法によって調製され得るリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら
，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８〜３６９
２；参考として援用される、欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０
４６およびＥＰ１４３，９４９を参照のこと。
インビボ投与のために用いられる薬学的組成物は代表的には、滅菌調製物として提供さ
れる。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される
場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行われて
もよい。非経口的な投与のための組成物は、凍結乾燥形または溶液として保存されてもよ
い。非経口的な組成物は一般には、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液
バッグ、または皮下注射針によって穿通可能な栓を有するバイアルに入れられる。
一旦薬学的組成物が処方されると、この薬学的組成物は、滅菌バイアル中に、溶液、懸
濁物、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として
貯蔵されていてもよい。このような処方物は、レディー・ツー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔ
ｏ−ｕｓｅ）の形態、または投与の前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された形態
）のいずれで貯蔵されてもよい。
本発明はまた、単回用量投与単位を生成するためのキットを提供する。本発明のキット
は各々が、所望のタンパク質を有する第一の容器、および水性処方物を有する第二の容器
の両方を備え得る。本発明の特定の実施形態では、単一および複数のチャンバを有する事
前充填（プレフィルド）シリンジ（例えば、液体シリンジおよびライオシリンジ（ｌｙｏ
ｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットが提供される。
治療上使用されるべき、有効な量の抗ＮＧＦ抗体を含有する薬学的組成物は、例えば、
治療の状況および目的に依存する。治療のために適切な投薬レベルは部分的には、送達さ
れる分子、抗ＮＧＦ抗体が用いられている徴候、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重
、体表面または器官サイズ）および／または状態（年齢および全身健康状態）に依存して
変化することが当業者には理解される。特定の実施形態では、最適の治療効果を得るため
に、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。代表的な投薬量は、上述の
要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上までに及んでもよい。好ま
しい実施形態では、投薬量は０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μ
ｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；またはそれより好ましくは５μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋ
ｇにおよんでもよい。
投与頻度は、用いられる処方物中の特定の抗ＮＧＦ抗体の薬物動態的パラメーターに依
存する。代表的には、所望の効果を達成する投薬量が得られるまで、臨床医はこの組成物
を投与する。従って、この組成物は単回用量として、または２回以上の用量（これは同じ
量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイスもし
くはカテーテルを介した連続注入として、投与されてもよい。適切な投薬量のさらなる工
夫は当業者によって慣用的に行われ、そして当業者によって慣用的に行われる課題の範囲
内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて得ることができる。特
定の実施形態では、本発明の抗体は、長期間にわたって患者に投与されてもよい。本発明
の抗体の慢性投与によって、非ヒト動物においてヒト抗原に対して惹起された抗体、例え
ば、ヒト以外の種で産生された不完全ヒト抗体に一般に関連する有害な免疫応答またはア
レルギー応答が最小化される。
薬学的組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、公
知の方法、例えば、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動
脈内、門脈内または病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。特定の実施形態
では、組成物は、ボーラス注射によって投与されても、もしくは注入によって連続的に投
与されても、または移植デバイスによって投与されてもよい。
この組成物はまた、所望の分子がその上に吸着されるかまたは封入されている、膜、ス
ポンジまたは別の適切な物質の移植によって局所投与されてもよい。移植デバイスを用い
る特定の実施形態では、デバイスは任意の適切な組織または器官に移植されてもよく、そ
して所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続的投与を介してもよい。
本発明による抗ＮＧＦ抗体の薬学的組成物をエキソビボで用いることもまた所望され得
る。このような場合、患者から除去されている細胞、組織または器官を、抗ＮＧＦ抗体の
薬学的組成物に曝露して、その後に細胞、組織および／または器官を患者に引き続き移植
して戻す。
詳細には、抗ＮＧＦ抗体は、本明細書において記載される方法のような方法を用いて、
ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作されている特定の細胞を移植するこ
とによって送達できる。特定の実施形態では、このような細胞は、動物細胞であってもま
たはヒト細胞であってもよく、そして自家性、非相同性または異種性であってもよい。特
定の実施形態では、細胞は不死化されてもよい。他の実施形態では、免疫学的応答の機会
を低下させるために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために封入されてもよい。さ
らなる実施形態では、封入物質は代表的には、タンパク質産物（単数または複数）の放出
を可能にするが、患者の免疫系によるか、または周囲の組織からの他の有害な要因による
、細胞の破壊を妨げる生体適合性、半透性のポリマー封入物または膜である。
以下の実施例は、行った実験および得られた結果を含んでいるが、これは、例示目的の
ためにのみ提供しており、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
（実施例１）
（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのヒトＮＧＦタンパク質の生成）
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）のクローニング）
配列番号２７および配列番号２８に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ー、ならびに標準的なＰＣＲ技術を用いてｃＤＮＡからヒトＮＧＦをコードするヌクレオ
チド配列を増幅した。この５’プライマーは、成熟配列のコドン１（セリン）のすぐ前に
ＮｄｅＩ制限部位およびメチオニン開始コドンを作成する。３’プライマーは、終止コド
ンの直前にＢａｍＨＩ制限部位を作成する。得られたＰＣＲ産物をゲル精製して、制限エ
ンドヌクレーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ
で消化したベクターｐＣＦＭ１６５６中に連結した。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株６
５７のコンピテントな宿主細胞に形質転換した。組み換えタンパク質産物を生成する能力
および正確なヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２９）を有するプラスミドを保有す
る能力について、クローンをスクリーニングした。組み換えヒトＮＧＦ１−１２０のアミ
ノ酸配列は、配列番号３０に示す。
発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）を米国特許第４，７１０，４
７３号に記載される発現ベクター系から誘導した。ｐＣＦＭ１６５６プラスミドは、（ａ
）Ｔ４ポリメラーゼ酵素での末端充填その後の平滑末端ライゲーションによって２つの内
因性ＮｄｅＩ制限部位を破壊して；（ｂ）ＰＬプロモーターを含むｐＣＦＭ６３６（米国
特許第４，７１０，４７３号）から得られた同様のフラグメントを用いて、合成ＰＬプロ
モーターを含む固有のＡａｔＩＩとＣｌａＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を置換して、次
いで（ｃ）配列番号３１および配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を有する２つの
プローブのアニーリングから得られたオリゴヌクレオチドを用いて、固有のＣｌａＩ制限
部位とＫｐｎＩ制限部位との間の小さいＤＮＡ配列を置換することによって、記載された
ｐＣＦＭ８３６プラスミド（米国特許第４，７１０，４７３号）から誘導され得る。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２宿主株（Ａｍｇｅｎ株６５７）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ
，ＣＴ（ＣＧＳＣ株６１５９）から得られた、Ｅ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５（Ｋ１２株）の
誘導体である。
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）の発現）
ＮＧＦ発現構築物（上記のような）を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、流加方式（ｆｅｄ−ｂ
ａｔｃｈ ｍｏｄｅ）でリッチな培地中で発酵させた。細胞は６００ｎｍでのＯＤが４９
になるまで３０℃で増殖させ、次いで４２℃への温度変更によって誘導した。細胞を、誘
導後４時間遠心分離することによって回収した。最終のＯＤは７５であった。発現収率は
約０．１５ｇ／Ｌであることが確認された。
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）の再折り畳みおよび精製）
細胞ペーストをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ中で溶解して、１０，０００×ｇで３０
分間遠心分離し、ペレットを１％のデオキシコール酸で洗浄して、上記のように遠心分離
して、次いで得られたペレットを冷水で洗浄して再遠心分離した。この得られたペレット
（ＷＩＢｓ−洗浄された封入体）を、変性剤（８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．５（１０ｍＭ ＤＴＴ含有））中に再懸濁して、室温で１時間可溶化して、
１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、その上清を注意深くデカントし、次いで４℃
の酸化還元対を含む水性緩衝液中に、５日間、２５倍希釈した。次いで、この得られた再
折り畳みをｐＨ３．０にまで滴定して、０．４５μＭのフィルターを通して濾過した。標
準的なＮａＣｌ勾配を用いるＳｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムを用いて、この再折り
畳みを精製した。陽イオン交換カラムからのプールを引き続いて濃縮して、アリコートを
−８０℃で凍結させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
によって、このタンパク質の純度を評価し、そしてクマーシー・ブルー染色によって分析
した。精製されたタンパク質は、この方法によって主要バンドが９０％を超える純度であ
った。
（実施例２）
（神経成長因子ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体の産生）
（トランスジェニックＨｕＭａｂおよびＫＭマウス）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々がヒト抗体遺伝子を発現する、ト
ランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２、およびＫＭ系
統を用いて調製された。これらのマウス系統の各々において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子
は、Ｃｈｅｎらに記載されたとおりホモ接合性に分裂されており（１９９３，ＥＭＢＯ
Ｊ．１２：８１１〜８２０）、そして内因性マウス重鎖遺伝子は、国際特許出願公開番号
ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例１に記載のようにホモ接合性に
分裂されていた。これらのマウス系統の各々は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１）に記載されているとおり
、ヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を担持する。ＨＣｏ７系統は、米国特許第５，５４５，
８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号（参考として援用
される）に記載のとおりＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。ＨＣｏ１２株は、国際
特許出願番号ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例２に記載のとおり
ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２系統は、ＨＣｏ７およ
びＨＣｏ１２の両方の重鎖導入遺伝子を担持し、そして各々の導入遺伝子について半接合
性である。ＫＭマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．
１６，１３３〜１４３および２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９７，
７２２−７２７）に記載されるようにＳＣ２０重鎖導入遺伝子を含む。この導入遺伝子は
、マウス染色体には組み込まれないが、代わりに独立した染色体フラグメントとして増殖
される。このフラグメントは、約１５ＭＢのヒト第１４染色体を含む。これは、ヒト重鎖
遺伝子座全体を含み、これには全てのＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントおよび全ての
重鎖定常領域アイソタイプを含む。これらの株の全てが本明細書においてＨｕＭａｂマウ
スと呼ばれる。
（ＨｕＭａｂ免疫：）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するため、ＨｕＭａｂマウスを、抗
原としてＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の精製組み換えヒトＮＧＦを用いて免疫した（実施例１）
。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇらに記載されている（各
々の教示が参考として援用されている、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５
９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（前出）および国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２４８８４）。
マウスは、抗原の第一回の注入の際に６〜１６週齢であった。ＮＧＦ抗原の精製組み換え
調製物（２５〜１００μｇ）を用いて、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内（ＩＰ）または皮下（
Ｓｃ）で免疫した。
ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスの免疫は、完全フロイントアジュバントおよび２
つの注射物に含まれる抗原を用いて、続いて、不完全フロイントアジュバントに含まれる
抗原を用いた、２〜４週のＩＰ免疫（全部で９免疫まで）によって行った。数ダースのマ
ウスを各々の抗原について免疫した。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２およ
びＫＭ系統の全部で１１８匹のマウスをＮＧＦ抗原で免疫した。免疫応答を後眼窩採血に
よってモニターした。
ヒトＮＧＦに結合する抗体を産生するＨｕＭａｂマウスを選択するため、免疫したマウ
ス由来の血清をＦｉｓｈｗｉｌｄら（前出）に記載されるとおりＥＬＩＳＡによって試験
した。要するに、マイクロタイタープレートを、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の精製された組み換え
ＮＧＦ（実施例１）をＰＢＳ中に１〜２μＬ／ｍＬで用いてコーティングして、５０μＬ
／ウェルで、４℃で一晩インキュベートし、次いで５％ニワトリ血清を含むＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎ（０．０５％）の２００μＬ／ウェルを用いてブロックした。ＮＧＦ免疫したマウ
スからの血漿の希釈物を、各々ウェルに添加して、周囲温度で１〜２時間インキュベート
した。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄して、次いで西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬と
ともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し
て、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異
的ポリクローナル試薬とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、このプレート
をＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カ
タログ番号Ａ−１８８８，０．２２ｍｇ／ｍＬ）を用いて発色させて、４１５〜４９５ｎ
ｍの波長で光学密度（ＯＤ）を決定することによって分光光度的に分析した。抗ＮＧＦヒ
ト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて下記のとおりモノクローナル抗体
を産生した。
（ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成）
抗原を用いて静脈内にブースト（追加免疫）することによるモノクローナル抗体産生の
ためにマウスを準備して、２日後に屠殺し、その後に脾臓を取り出した。ＨｕＭａｂマウ
スからマウス脾臓を単離して、標準的なプロトコールを用いてＰＥＧとともにマウス骨髄
腫細胞株に融合した。代表的には、各々の抗原について１０〜２０の融合を行った。
要するに、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧ（
Ｓｉｇｍａ）を用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，
登録番号ＣＲＬ１５８０）の数の四分の一に融合した。細胞を平底マイクロタイタープレ
ート中に約１×１０５／ウェルでプレートして、続いて１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３
８８Ｄ１−（ＡＴＣＣ，登録番号ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）馴化培地、３〜５％ｏｒｉｇｅ
ｎ（ＩＧＥＮ）を、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＣＲＬ１００１３、高
いグルコース、Ｌグルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）、ならびに５ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン
および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号、ＣＲＬ Ｐ−７１８５）を含有する選択
培地中での約２週間のインキュベーションを続けた。１〜２週後、ＨＡＴをＨＴに置き換
えた培地中で細胞を培養した。
得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。個々の
ウェルをＥＬＩＳＡ（上記）によって、ヒト抗ＮＧＦモノクローナルＩｇＧ抗体について
スクリーニングした。一旦、過剰のハイブリドーマ増殖が生じれば、通常１０〜１４日後
に培地をモニターした。抗体分泌するハイブリドーマを再度プレートして、再度スクリー
ニングして、依然としてヒトＩｇＧについて陽性である場合、抗ＮＧＦモノクローナル抗
体を少なくとも２回、限界希釈によってサブクローニングした。次いで、安定なサブクロ
ーンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地中で少量の抗体を生成させ
た。
（ＮＧＦに結合するヒトモノクローナル抗体の選択）
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＮＧＦ免疫原と正の反応性を示したハイブ
リドーマをスクリーニングした。ＮＧＦに対して高い結合活性で結合するモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマをサブクローニングしてさらに特徴付けた。液体窒素中に
保持した５〜１０バイアルの細胞バンクを作製するために、親細胞の反応性を保持してい
る（ＥＬＩＳＡによって決定した場合）、各々のハイブリドーマ由来の１つのクローンを
選択した。
アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡを行って、本明細書に開示されたとおり産生したモノク
ローナル抗体のアイソタイプを決定した。これらの実験では、マイクロタイタープレート
ウェルを、ＰＢＳ中のマウス抗ヒトκ軽鎖の溶液１μｇ／ｍＬを１ウェルあたり５０μＬ
で用いてコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。５％ニワトリ血清を用いた
ブロッキング後、このプレートを各々の試験したモノクローナル抗体由来の上清および精
製されたアイソタイプコントロールと反応させた。プレートを周囲温度で１〜２時間イン
キュベートした。次いで、このウェルを種々のヒトＩｇＧ特異性西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合体化ヤギ抗ヒトポリクローナル抗血清と反応させて、プレートを発色させ、上記
のように分析した。
ＥＬＩＳＡによって検出した場合ＮＧＦに対する有意な結合を示したハイブリドーマ上
清から精製したモノクローナル抗体をさらに、下記のような種々のバイオアッセイを用い
て生物学的活性について試験した。
（実施例３）
（強力なＮＧＦ中和活性を有する抗ＮＧＦ抗体の選択およびクローニング）
ＮＧＦ活性（すなわち、ＮＧＦ「中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）」）のインヒ
ビターとして、実施例２で最初に同定された抗体の有効性は、各々の改変されたペプチド
がバニロイドレセプター−１（ＶＲ１）発現のＮＧＦ誘導をブロックする能力を測定する
ことによって評価した。
（後根神経節神経細胞培養）
妊娠期の終末に麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の子宮から外科的に取り出した、胚性の１９日齢
（Ｅ１９）ラットの全ての脊髄セグメントから、後根神経節（ＤＲＧ）を無菌条件下で１
つずつ切り取った。５％熱不活化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む氷冷Ｌ−１５培地
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中にＤＲＧを収集して、疎性結
合組織および血管を取り除いた。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なしのダルベッコリン酸緩衝化
生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で、ＤＲＧを２回リンスし
た。次いでパパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて単独の細胞懸濁液中にＤＲＧを解離させた。要
するに、２０Ｕ／ｍＬのパパインをアール（Ｅａｒｌｅ）の平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）に含
有する消化溶液中において３７℃で５０分間、ＤＲＧをインキュベートした。ＭＥＭ／ハ
ムＦ１２、１：１、１ｍｇ／ｍＬオボムコイドインヒビターおよび１ｍｇ／ｍＬオボアル
ブミン、および０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）から構成される
解離培地中で、微細研磨したパスツールピペットを通した倍散によって細胞を解離させた
。
解離された細胞を５分間２００×ｇでペレット化して、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドイ
ンヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンおよび０．００５％ＤＮａｓｅを含有するＥ
ＢＳＳ中で再懸濁した。細胞懸濁液は、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１
０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンを含有する勾配溶液を通じて２００×ｇで６分間遠心分離
して、細胞細片を除去し、次いで８８μｍのナイロンメッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を通じて濾過して、クランプを除去した。
血球計算器を用いて細胞数を決定して、細胞を、ポリ−オルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ）でコーティングした９６ウェルプレート中に、完全培地中において、１０×１０３
細胞／ウェルで播種した。この完全培地は、最小基本培地（ＭＥＭ）およびハムのＦ１２
、１：１、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）お
よび１０％熱不活性化ウシ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から構成された。この培養物を、３
７℃、５％ＣＯ２および１００％の湿度で維持した。非ニューロン細胞の増殖を制御する
ために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（７５μＭ）およびウリジン（１８０μ
Ｍ）を培地中に含んだ。
（ＮＧＦおよび抗ＮＧＦでの処理）
プレートの２時間後、組み換えヒトβ―ＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）または組み換えラットβ
−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を１０ｎｇ／ｍＬ
の濃度（０．３８ｎＭ）で用いて細胞を処理した。段階希釈した抗ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む陽性コントロールを各々の培養プレートに添加した。３．１６倍
の段階希釈を用いて１０の濃度で試験抗体を添加した。全てのサンプルを完全培地中で希
釈して、その後に培養物に添加した。インキュベーション時間はＶＲ１発現の測定の前４
０時間であった。
（ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現の測定）
培養物をハンクスの平衡塩溶液に含まれる４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し
て、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でブロックして、
０．２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓ
ｉｇｍａ）緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて１時間室温で透過化処理した。０．１％
Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）含有ＴＢＳを用いて培養物を１回リンスして、ウサギ抗
ＶＲ１ ＩｇＧを用いて、１時間半、室温でインキュベートして、続いてＥｕ標識した抗
ウサギ第二抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を室温で１時間イ
ンキュベーションした。ＴＢＳでの洗浄を（ゆっくり振盪しながら３×５分）各々の抗体
インキュベーション後に行った。強化溶液（ｅｎｈａｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１５
０μＬ／ウェル，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）をこの培養物に添加した。次いで、蛍光シグナル
を時間分解蛍光計（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）中で測定した。０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＮＧ
Ｆ滴定の標準曲線と比較することによって、改変ペプチドで処理したサンプル中のＶＲ１
発現を決定した。ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現に対するＮＧＦ効果の阻害パーセ
ント（最大可能阻害に対して比較）は、ＮＧＦ処理されていないコントロールと比較する
ことによって決定した。結果を表２および表５に示す。
細胞株は、＃１１０〜＃１２９と表示した。細胞株＃１１９、＃１２４および＃１２５
由来の抗体は、極度に強力なＮＧＦ中和活性を示した（図１）。＃１２４細胞株は、４Ｄ
４とも呼ばれる、平行細胞株であった。＃１１９および＃１２５細胞株は、４Ｄ４の親の
サブクローンであった。ハイブリドーマ＃１２４（４Ｄ４）を含むもとのウイルスからさ
らなるサンプルを増殖して、＃１６７（４Ｄ４）と表示した。
ハイブリドーマ＃１６７（４Ｄ４）によって生成された抗体を、前のサンプルと同じＤ
ＲＧニューロンベースのＮＧＦ中和アッセイに供した。抗体＃１６７（４Ｄ４）は、サン
プル＃１１９、＃１２４および＃１２５の活性と一致した、０．５０ｎＭというＩＣ５０
を有する強力な抗ＮＧＦ活性を示した（図２）。４つのサンプルの活性を表２に示す。
Figure 2010162028
（Ｎ末端配列決定および質量分析）
タンパク質配列決定およびＬＣ／ＭＳ分析のために、精製した抗ＮＧＦハイブリドーマ
抗体サンプルを調製した。容積が１５ｍＬ未満になるまで、Ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ−３０を用いて培地を濃縮することによって、馴化培地から抗体を精製した。ｒ
ＰｒｏＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂のバッチを、ＰＢＳを用いて４回洗浄して、最終洗
浄後、ＰＢＳ中で５０％スラリーを作製した。ｒＰｒｏＡ樹脂の適切な量（樹脂１μＬあ
たり約５μｇの抗体、ただし少なくとも５０μＬの樹脂を用いる）を抗体サンプルに添加
して、４℃で一晩インキュベートした。Ａｂ−樹脂混合物を遠心分離して、未結合の画分
を収集した。０．５ｍＬ ＰＢＳを添加して０．４５μｍ Ｓｐｉｎ−Ｘ（ＣｏＳｔａｒ
）チューブに移した後、サンプルを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離した。樹脂を次に
少なくとも３回、０．５ｍＬ ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで０．１Ｍのグリシン（ｐＨ
２．７）を１．５培容積の樹脂に添加して、室温で１０分間インキュベートし、続いて３
分間１００００ｒｐｍでさらに遠心分離をし、上清を回収した。この溶出工程をさらに２
回繰り返し、次いで合わせた上清を、１／２５倍の容積の１．０Ｍ ｔｒｉｓ（ｐＨ９．
２）で中和した。
新しいＳｐｉｎ−Ｘチューブ（０．２μｍ）を通す最終濾過後、標準としてヒトＩｇＧ
、あるいは、より大きいサンプルについては２８０の吸光度を用いる、標準Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄアッセイを用いて抗体を定量した。ゲルはまた、２μｇの各々のサンプルと並行して
２μｇのヒトＩｇＧ１，ｋ（Ｓｉｇｍａ）を用いて泳動させた。質量分析のために、４μ
ｇのサンプルを脱グリコシル化し、還元して、Ｆｉｎｉｎｇａｎ ＬＣＱ質量分析にオン
ライン連結したＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０）にロードした。逆相ＨＰＬＣによって重鎖から
軽鎖を分離した。軽鎖および重鎖をまた、Ｎ末端タンパク質配列決定分析のために収集し
た。
抗ＮＧＦ＃１６７（４Ｄ４）抗体のサンプルの軽鎖および重鎖の両方のＮ末端配列が、
抗ＮＧＦ＃１１９（４Ｄ４）抗体のサンプルの両方のＮ末端配列にマッチした。さらに、
抗体の測定された質量によって、＃１６７および＃１１９ハイブリドーマからの単離され
た抗体が同じであったことが示された。抗ＮＧＦ＃１６７の軽鎖の測定された逆重畳質量
（２３０９６）は、抗ＮＧＦ Ａｂ＃１１９の軽鎖の測定された質量（２３０９６）にマ
ッチした。
（抗ＮＧＦ抗体重鎖および軽鎖のクローニング）
最も強力なＮＧＦ結合モノクローナル抗体４Ｄ４．Ｄ７を発現するハイブリドーマを供
給源として用い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて総Ｒ
ＮＡを単離した。第一鎖のｃＤＮＡを、伸長アダプター（５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ
ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＮ ＮＮＮ ＮＮＴ−３’）（配列番号３３）とともにランダム
プライマーを用いて合成し、そして５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）分取アッセ
イを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の指
示に従って行った。完全な軽鎖コードｃＤＮＡを調製するために、フォワードプライマー
は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭネスト化プライマーであって、リバースプライマーは５’−
ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’（配列番号３４）であ
った。重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを調製するために、フォワードプライマーは
ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭネスト化プライマーであって、リバースプライマーは５’−ＴＧ
Ａ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＡ ＣＣＡ ＣＡＣ Ｇ−３’（配列番号３５）であった。Ｒ
ＡＣＥ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、その
配列を決定した。コンセンサス配列を用いて全長抗体鎖ＰＣＲ増幅のプライマーを設計し
た。
抗ＮＧＦ４Ｄ４．Ｄ７κ軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、５’ＰＣＲプラ
イマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ
配列（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧ
Ａ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ−３’
；配列番号３６）をコードした。３’プライマーは、カルボキシ末端および終止コドン、
ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＣ
ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ Ｃ−３’；配列番号３７）をコードした。得
られたＰＣＲ産物のフラグメントを精製して、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、
次いでゲル単離して、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲα２０に連結した（任意の目的のた
めに参考として本明細書に援用される国際出願公開番号ＷＯ９０／１４３６３を参照のこ
と）。ｐＤＳＲα２０は、部位指向性変異誘発によって、ｐＤＳＲａ１９において「Ｇｕ
ａｎｏｓｉｎｅ（グアノシン）」から「Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（アデノシン）」へヌクレオ
チド２５６３を変化することによって産生した。
抗ＮＧＦ ４Ｄ４．Ｄ７重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するため、５’ＰＣＲプライ
マーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ配
列（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ
ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＣＴ ＴＧＴ Ｔ−３
’；配列番号３８）をコードした。３’プライマーは、カルボキシル末端および末端コド
ン、ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＧＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＡ
Ｃ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ Ｇ−３’；配列番号３９）をコードした
。得られた産物を精製して、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、ゲル単離して、ｐ
ＤＳＲα２０ベクターに連結した。
抗ＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４クローンの軽鎖のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を予測される
アミノ酸に翻訳すること、およびそのアミノ酸の分子量を計算することによって決定され
る、算出された質量（２３０９９）は、質量分析によって決定される測定された質量にマ
ッチした。抗ＮＧＦ Ａｂ＃１６７の重鎖の測定された逆重畳質量（４９４７９）は、装
置偏差内で、抗ＮＧＦ Ａｂ＃１１９の重鎖の測定された質量（４９４８４）にマッチし
、そしてまた抗ＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４クローンの重鎖のＤＮＡ配列の理論的質量（４９４
８４）にマッチした（表３）。
Ｎ末端タンパク質配列およびＬＣ／ＭＳのデータによって、ハイブリドーマ＃１１９が
ハイブリドーマ＃１６７と同じ抗体を発現したことが確認された。さらに配列に基づく抗
体の算出された質量によってさらにこの観察が確認された。
Figure 2010162028
（実施例４）
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における抗ＮＧＦ抗体の発現）
リン酸カルシウム法を用いて、４Ｄ４−重鎖／ｐＤＳＲα１９ ＩｇＧ２または４Ｄ４
重鎖／ｐＤＳＲα１９ ＩｇＧ１およびＮＧＦ−κ／ｐＤＳＲα１９プラスミドを、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）無血清適合チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞中に同時トランスフェクションすることによって、４Ｄ４抗ＮＧＦ ｍＡｂの安定な
発現を得た。トランスフェクトされた細胞を、透析血清を含むが、ヒポキサンチン−チミ
ジンを含まない培地中で選択して、ＤＨＦＲ酵素を発現する細胞の増殖を確保した。トラ
ンスフェクトされたクローンをＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてスクリーニングして
、馴化培地中で４Ｄ４抗ＮＧＦ ｍＡｂの発現を検出した。最高の発現クローンを、ＤＨ
ＦＲ増幅のためのメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度増大に供した。ＭＴＸ増幅したクロ
ーンをＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてスクリーニングして、馴化培地中で４Ｄ４抗
ＮＧＦ ｍＡｂのさらに高い発現を検出した。最高の発現クローンをサブクローニングに
供して、相同な集団および細胞バンクの作成を行った。
本発明の組み換え抗ＮＧＦ抗体は、抗ＮＧＦモノクローナル抗体について上記したプロ
トコルと同じプロトコルを用いて、ＤＨＦＲの欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞
において生成してもよい。本発明の各々の抗ＮＧＦ抗体の完全重鎖または軽鎖をコードす
るＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングする。ＣＨＯｄ−細胞を、適切な抗ＮＧＦ
抗体の完全重鎖を発現できる発現ベクターおよび完全軽鎖を発現できる発現ベクターを用
いて、同時トランスフェクトする。例えば、抗ＮＧＦ抗体を生成するために、配列番号４
０に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現できるベクターおよび配列番号４４に示
されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現できるベクターを用いて、細胞を同時トランス
フェクトする。表４は、種々のＩｇＧ重鎖定常領域を有する４Ｄ４抗体についての完全重
鎖および完全軽鎖をまとめる。
Figure 2010162028
（実施例５）
（抗ＮＧＦ ４Ｄ４抗体の活性の特徴付け）
スピナー（Ｓ）またはローラー（Ｒ）条件下で増殖した細胞で生成した、一過性に発現
された抗ＮＧＦ ４Ｄ４抗体を、上記（実施例３）のように行われる、ＤＲＧニューロン
ベースのＮＧＦ中和バイオアッセイにおいて、それらの抗体がＮＧＦを中和する能力を確
認するために試験した。
ＮＧＦ抗体は、２９３Ｔ細胞に適合した無血清懸濁液中で一過性に発現された。トラン
スフェクションを５００ｍＬまたは１Ｌの培養物のいずれかとして行った。要するに、細
胞接種物（５．０×１０５細胞／ｍＬ×培養容積）を２，５００ＲＰＭで、１０分間４℃
で遠心分離して、馴化培地を除いた。細胞は、無血清ＤＭＥＭ中で再懸濁して、再度２，
５００ＲＰＭで、１０分間４℃で遠心分離した。洗浄溶液を吸引した後、１Ｌまたは３Ｌ
のスピナーフラスコ培養物において、細胞を増殖培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）＋１
×インスリン−トランスフェリン−セレニウム補充＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔ
＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．０１％ プルロニック Ｆ６８
］中で再懸濁した。スピナーフラスコ培養物を、３７℃および５％ＣＯ２で維持される湿
潤インキュベーターに入れた１２５ＲＰＭの磁気撹拌プレート上で維持した。プラスミド
ＤＮＡを５０ｍＬ円錐管中のトランスフェクション試薬に複合化させた。ＤＮＡ−トラン
スフェクション試薬複合物を無血清のＤＭＥＭ中で最終培養容積の５％に調製した。培養
物１ｍＬあたり１μｇのプラスミドＤＮＡを最初に無血清ＤＭＥＭに添加して、続いて培
養物１ｍＬあたり１μＬのＸ−ＴｒｅｍｅＧｅｎｅ ＲＯ−１５３９を添加した。この複
合物を室温で約３０分間インキュベートし、次いでスピナーフラスコ中の細胞に添加した
。トランスフェクション／発現は、７日間で行い、その後、この馴化培地を４℃で６０分
間の４，０００ＲＰＭでの遠心分離によって回収した。
ローラーボトル一過性トランスフェクションのために、本発明者らは、２９３Ｔ接着細
胞を増殖させて、５％ＦＢＳ＋１×非必須アミノ酸＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔ
＋１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ中で維持した。約４〜５×１０７個の２
９３Ｔ細胞を、８５０ｃｍ２のローラーボトル中で一晩、播種した。次いで、前に播種し
た細胞を、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて翌日トランスフェクトした
。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬混合物を、約６．７５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で適
切に調製した。６７５μＬ ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を最初に添加して
、続いて１１２．５μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。この複合物を室温で３０分間イ
ンキュベートした。次いで混合物全体をローラーボトル中に添加した。このローラーボト
ルを５％ＣＯ２ガス混合物で満たし、緊密にキャップして、０．３５ＲＰＭで回転するロ
ーラーラック上の３７℃のインキュベーターにおいた。トランスフェクションを２４時間
行い、その後に培地を１００ｍＬ ＤＭＥＭ＋１×インスリン−トランスフェリン−セレ
ニウム補充＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕ＋１×非必須アミノ酸＋１×ピルビン酸ナ
トリウムで置換した。代表的には、２つの１００ｍＬ ４８時間ハーベストを各々のロー
ラーボトルから得た。この回収された無血清馴化培地を一緒にプールして、４，０００Ｒ
ＰＭで３０分間４℃で遠心分離した。
４Ｄ４．ＩｇＧ１および４Ｄ４．ＩｇＧ２の両方が、ヒトＮＧＦに対して約０．１４ｎ
Ｍ〜約０．２ｎＭというＩＣ５０値を有する強力な活性を示した（図２）。活性アッセイ
の結果は表５にまとめる。この抗体は、ラットＮＧＦに対してほとんど活性を示さなかっ
た（図３）。この結果は、上記のハイブリドーマから直接試験された抗体の活性と似てい
る。
Figure 2010162028
ｈＮＧＦ＝ヒトＮＧＦ、ｒＮＧＦ＝ラットＮＧＦ、Ｒ＝ローラー培養、Ｓ＝スピナー培養
。
（実施例６）
（抗ＮＧＦ抗体の産生）
ＣＨＯ細胞のクローン株における発現によって抗ＮＧＦ抗体を産生する。各々の産生を
行うために、単一のバイアル由来の細胞を無血清細胞培養培地中に溶かした。この細胞を
Ｔフラスコ中で最初に、続いてスピナーフラスコ中で増殖させて、次いで２０００Ｌのバ
イオリアクターまで大規模化するステンレス鋼リアクター中で増殖させた。流加培養法を
用いて２０００Ｌのバイオリアクター中で産生を行い、この中に、濃縮された媒体成分を
含む栄養源を加えて、細胞の増殖および培養生存度を維持する。産生は約２週間続き、こ
の間に上記細胞によって抗ＮＧＦ抗体を構成的に産生して、細胞培養培地に分泌させた。
産生リアクターを予め決定したｐＨ、温度および溶存酸素レベルで制御する：ｐＨは二
酸化炭素ガスおよび炭酸ナトリウムの添加によって制御する；溶存酸素は、空気、窒素お
よび酸素のガスフローによって制御する。
産生の終わりに、細胞ブロスをディスクスタック遠心分離に供して、培養上清を細胞か
ら分離する。さらにこの濃縮物をデプスフィルター、続いて０．２μｍのフィルターを通
して清澄化する。次いで、清澄化した馴化培地を接線流の限外濾過によって濃縮する。馴
化培地を１５〜３０倍に濃縮する。次いで、得られた濃縮された馴化培地を、精製によっ
て処理するか、または後日精製するために凍結する。
（実施例７）
（他のニューロトロフィンとの交差反応性）
ヒトＮＴ３についてのＤＲＧニューロン生存アッセイ、およびヒトＢＤＮＦについての
培養されたＤＡニューロンにおけるＤＡ取り込みのアッセイを含む種々のバイオアッセイ
において、４Ｄ４抗体を、ヒトＮＴ３またはヒトＢＤＮＦに対するその交差反応性につい
て試験した。
（ＮＴ３、抗ＮＴ３および抗ＮＧＦ抗体でのＤＲＧ培養物の治療）
プレートの２時間後、ＤＲＧ細胞（実施例３において上記された単離手順）を、組み換
えｈＮＴ−３ １００ｎｇ／ｍＬ（３．８ｎＭ）で処理した。連続希釈した抗ｈＮＴ３抗
体（Ｒ＆Ｄ）を陽性コントロールとして用いた。未知（抗ＮＧＦ Ａｂサンプル）を、１
０ポイントの３．１６倍連続希釈で種々の濃度で添加した。全てのサンプルを完全培地中
で希釈して、その後に培養物に添加した。
（ＤＲＧニューロンにおけるＭＡＰ２の測定）
培養物を４％パラホルムアルデヒドを含むハンクス平衡塩溶液を用いて１５分間固定し
て、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１時間ブロックし、０．２５％ Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝
化生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて１時間室温（ＲＴ）で透過化処理した。０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＢＳで培養物を１回リンスして、マウス抗ＭＡＰ２
ＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）とともに１．５時間室温でイン
キュベートし、続いてＥｕ標識した抗マウス二次抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ
，Ｆｉｎｌａｎｄ）を室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳでの洗浄（おだやか
に振盪しながら３×５分）を各々の抗体インキュベーション後に行った。強化溶液（１５
０ｍＬ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）を培養物に添加して、次いで蛍光シグナルを時間
分解蛍光光度計で測定した（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）。
（胚性中脳培養）
胚性の１９日齢（Ｅ１９）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌ
ａｂｓ）を用いた。ドーパミン作動性ニューロンについて富化された腹側中脳組織を取り
出して、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない、冷却したダルベッコリン酸緩衝化生理食塩
水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）に移した。組織フラグメントは、パパイン解
離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌ
ｄ，ＮＪ）を用いて単独の細胞懸濁液中に解離させた。要するに、組織フラグメントを、
アールの平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）中に２０単位／ｍＬのパパインを含有する消化溶液中に
おいて３７℃で５０分間インキュベートした。ＭＥＭ／ハムＦ１２、１：１、１ｍｇ／ｍ
Ｌオボムコイドインヒビターおよび１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および０．００５％デ
オキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）から構成される解離培地中で、微細研磨したパ
スツールピペットを通した倍散によって細胞を解離させた。解離された細胞を５分間２０
０×ｇでペレット化して、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオ
ボアルブミンおよび０．００５％ＤＮａｓｅを含有するＥＢＳＳ中に再懸濁した。細胞懸
濁液は、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミン
を含有する勾配溶液を通じて２００×ｇで６分間遠心分離して、細胞細片を除去し；２５
μｇＮｉｔｅｘナイロンメッシュ（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．）を通じて濾過して、クランプ
を除去した。この解離された細胞を、１００，０００／ｃｍ２の密度で組織培養プレート
にプレートした。このプレートは、前に記載のとおり（Ｌｏｕｉｓ ＪＣら，Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９２；２６２：１２７４〜１２８３）、ポリ−オ
ルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ）で事前にコーティングした。この培養培地は、最小基本培地（ＭＥＭ）／ハ
ムのＦ１２、１：１、１２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬトランスフェリ
ンおよび２．５μｇ／ｍＬのインスリン（Ｓｉｇｍａ）から構成された。この培養物を、
３７℃、５％ＣＯ２および１００％の湿度で６日間保持した。
（ＢＤＮＦおよび抗ＢＤＮＦまたは抗ＮＧＦでの中脳培養物の治療）
プレートの２時間後、ＢＤＮＦを１０ｎｇ／ｍＬで細胞に添加し、続いて連続濃度の抗
ＮＧＦ Ａｂサンプルを添加した。抗ＢＤＮＦ抗体（Ａｍｇｅｎで生成）を陽性コントロ
ールとして用いた。
（中脳ニューロンにおけるＤＡ取り込み）
前に記載されたとおり（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｌ．およびＭｙｔｉｌｉｎｅｏｕ，Ｃ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８７；７９：６５〜７２）、ドーパミン
取り込みアッセイを行った。６日の時点で、５．６ｍＭグルコース、１．３ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよびモノアミンオキシダーゼインヒビターである０．５ｍＭパージリンを含む、予め
温めたクレブス−リンゲルリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて培養物を１回洗浄した。
この培養物を５０ｎＭ［３Ｈ］ＤＡ（ＮＥＮ）を含む取り込み緩衝液中において６０分間
３７℃でインキュベートした。取り込み緩衝液を除去することによって取り込みを停止さ
せて、培養物をクレブス−リンゲルリン酸緩衝液を用いて３回洗浄した。細胞を溶解して
、この培養物に直接、液体シンチレーションカクテル、オプチクファーゼ・スーパーミッ
クス（ｏｐｔｉｃｐｈａｓｅ ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（Ｗａｌｌａｃ）を添加することによ
って、［３Ｈ］ＤＡを放出させた。次いで、この細胞溶解物を、マイクロベータ−プラス
液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）中で放射活性についてカウ
ントした。取り込み緩衝液に対して、高親和性のＤＡ取り込み部位の特異的なインヒビタ
ーである（Ｈｅｉｋｋｉｌａ ＲＥおよびＭａｚｉｎｏ Ｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８４；１０３：２４１〜８）０．５ｍ
Ｍ ＧＢＲ１２９０９を添加することによって低親和性のＤＡ取り込みを評価して、総取
り込み量から引いて高親和性ＤＡ取り込み値を得た。
Figure 2010162028
（実施例８）
（抗ＮＧＦ抗体のエピトープの同定）
（限定タンパク質分解によるエピトープマッピング）
５マイクログラム（μｇ）のＮＧＦを４Ｄ４（１１μｇ）とともに、０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ緩衝液ｐＨ７．５中で３０分間、４℃でインキュベートした。次いで、この複合体をプ
ロテアーゼ（サブチリシン）１μｇを用いて３７℃で１時間および２時間消化した。４Ｄ
４抗体によって保護されたペプチドを見出すために、ＨＰＬＣペプチドマップピングを互
いに比較した。ＮＧＦの限定タンパク質分解によって、いくつかの主要なペプチドが最初
にＮＧＦから放出されたことが示された。なかでも特に重要なペプチドＳ１８．３、Ｓ１
８．５およびＳ３４．４が生成されて、タンパク質分解から抗体で保護された。他のピー
クは有意に形成も保護もされなかった。２つの実験由来の保護されたペプチド（１時間お
よび２時間の消化）は、表７に示す。
Figure 2010162028
保護のパーセンテージは、ペプチドピーク高さから算出した。Ｓ１８．５は、２つのペ
プチドを含んだが、１つのペプチド（ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ；配列番号４６）だけが、４Ｄ
４抗体で保護された。なぜなら他のペプチドピーク（ＨＷＮＳＹ；配列番号４７）は、２
８０ｎｍの吸収で検出されるとおり、４Ｄ４抗体の添加によって変化されなかったためで
ある。ペプチドＳ１８．３は、両方とも同じループ領域由来の、Ｓ３４．４のＣ末端部分
であった。Ｎ末端および中央のループ領域もまた可能なエピトープであった。
（消化されたペプチドのＭｉｃｒｏｃｏｎ分離）
サブチリシン消化物質（各々３μｇ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で
、活性の４Ｄ４抗体および不活性なモノクローナル抗体（＃１６２）（８μｇ）とともに
３０分間４℃でインキュベートした。結合／未結合のペプチドをＭｉｃｒｏｃｏｎ １０
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）によって分離して、両
方の画分（結合および未結合）をＨＰＬＣによって分析して、抗体に結合したペプチドを
見出した。４Ｄ４抗体および＃１６２で処理した後の未結合の画分のＨＰＬＣ比較によっ
て２つの枯渇したピークを同定して、抗体結合ペプチドを示す、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ分離物
を回収した。４Ｄ４結合ペプチドは以下であった：
Ｓ１（４．４）−−−−ＳＲＫＡＶＲＲ（１１３〜１１９）（配列番号４９）、Ｃ末端
；および
Ｓ２（２８．３）−−−−ＥＶＭＶＬ（３５〜３９）（配列番号５０）、ループ領域。
ＮＧＦサンプルを、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｋ）を用いて２４時間代替的に消化した。システイン
残基を変性剤を用いずに還元して、カルボキシメチル化した。サンプルをモノクローナル
抗体４Ｄ４およびＡＭＧ１６２とともにインキュベートし、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎ １
００で分離した。結合および未結合の画分を逆相ＨＰＬＣによって分析した。２つのペプ
チドのみが、以下に示されるように抗体結合Ｋペプチドとして同定された。ペプチドの配
列分析および質量分析によって決定した、ペプチドの算出された質量は一貫していた。以
下に示されるとおり、ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端領域にマッピングした。
Ｋ１（３７．６）−−−−ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫ（配
列番号５１）
算出された質量＝２８２１；観察された質量＝２８２８．２；Ｎ末端
Ｋ２（３９．５）−−−−ＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫ（配列番号５２
）
算出された質量＝２４５２；観察された質量＝２４５９．５；Ｃ末端
先行するエピトープマッピング実験によって、少なくとも３つの領域が、Ｎ末端（１−
９）、内部（４６−５７）およびＣ末端（９６−９８）領域を含む、４Ｄ４抗体について
の可能性のあるエピトープであることが示された。さらに、Ａｓｐ消化によって、−−−
ＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ−−−（配列番号５３）から構成されるペプチドフラグメ
ントが４Ｄ４抗体によって保護されることが明らかになり、一方、トリプシン消化によっ
ては、−−−ＳＳＨＰＩＦＨＲ−−−（配列番号５４）から構成されるペプチドフラグメ
ントが４Ｄ４抗体によって保護されないことが示された。このように、Ｎ末端では、ＧＥ
ＦＳＶＣ（配列番号５５）の配列は、４Ｄ４抗体への結合について最も重要である。
抗ＮＧＦ抗体４Ｄ４．ＩｇＧ１についてのエピトープをさらに明確に規定するために、
ヒト成熟ＮＧＦ（ｈＮＧＦ）配列全体に基づき標準的な技術を用いて、全部で２３個のペ
プチドを合成的に生成した（表８）。このペプチドは、１０アミノ酸ずつ重複する１５ア
ミノ酸長であって、マトリックスへの結合を可能にするようにＣ末端にシステインテール
があった。上記のヒト抗ｈＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４．ＩｇＧ１を、マッピング実験のために
用いた。
Figure 2010162028
ヒトＮＧＦペプチドフラグメントを、５％ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．２３
を有するＰＢＳ中で希釈した。最終ペプチド濃度は、５５μＭ（約１００μｇ／ｍＬ）の
同じモル濃度に正規化した。ペプチドを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ
活性化９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号１５１５０）中
で、１００μＬ／ウェルで、室温で２時間インキュベートし、次いで４℃で一晩撹拌した
。ヒトＮＧＦ（１００μｇ／ｍＬ）を陽性コントロールとして用いた。このプレートを、
洗浄緩衝液（ＫＰＬ）で洗浄して、０．２％脱脂粉乳（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ６
．２３）を用いて室温で２時間ブロックし、次いでさらに５％ ＢＳＡを用いて１時間ブ
ロックした。次いで、プレートを、種々の濃度（０、３、１０、３０μｇ／ｍＬ）のヒト
抗ＮＧＦ抗体とともにインキュベートし、その後にヤギ抗ｈＦｃ Ａｂ−ＨＲＰ（ＫＰＬ
）とともに２時間インキュベートした。シグナルをＴＭＢ基質で発色させて、停止溶液（
ＫＰＬ）の添加後に４５０ｎｍで読み取った。
２３個のヒトＮＧＦペプチドにまたがって、４Ｄ４結合を示す、少なくとも４つの主な
ピークが観察された。これらのピークは、以下のペプチドに相当した：ペプチド番号１（
配列番号５６）、ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ（１〜１５）；ペプチド番号１０（配
列番号６５）、ＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＡＲＤ（４０〜６０）；ペプチド番号１６〜１
７（配列番号７１〜配列番号７２）、ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ−−−（７６〜９
５）；およびペプチド番号１８〜２１（配列番号７３〜配列番号７６）、ＴＴＴＨＴ−−
−ＬＳＲＫＣ（１００〜１１５）。
４Ｄ４の４つの結合ピークは、Ｗｅｉｓｍａｎｎら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１
：１８４〜８）に記載されるとおり、Ｎ末端、Ｃ末端、内部ドメイン、ならびにＮＧＦ中
のループＬ２およびＬ４にマッピングした。これらの結果を表９にまとめる。
Figure 2010162028
Ｗｉｅｓｍａｎｎらは、ｔｒｋＡレセプターに結合したｈＮＧＦの結晶構造を解明した
が、これによってＮ末端（残基２〜９）がレセプター結合に重要であったことが示される
（Ｗｉｅｓｍａｎｎら，１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８４〜８）。ＮＧＦ中のこ
のセグメントの残基はまた、ｔｒｋＢレセプターまたはｔｒｋＣレセプターよりもｔｒｋ
Ａについての親和性に重要である。抗体４Ｄ４は、最も可能性が高い理由として、ヒトＮ
ＧＦと他のニューロトロフィンとの間のＮ末端相違の理由で、マウス／ラットＮＧＦ、な
らびにＢＤＮＦおよびＮＴ−３よりもヒトＮＧＦに選択性である。
抗体４Ｄ４は、ニューロトロフィンの間の平均の配列多様性よりも高い配列多様性を有
する７つの別個の領域のうちの２つに相当する、それぞれループＬ２およびＬ４に相当す
る、ペプチド番号１０（配列番号６５）（ＮＳＶＦＫ−−−、４６〜６０）およびペプチ
ド番号１７（配列番号７２）（ＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＣ、８１〜９５）に結合
する。これらの７つの領域のうちのＮＧＦとＢＤＮＦとの間のスワッピング実験によって
、Ｌ２およびＬ４は、ＮＧＦの生物学的活性について重要であったことが示された。さら
に、ＮＧＦの残基を有するループＬ２およびＬ４における５つのＮＴ３残基の置換によっ
て、ＮＴ３活性を維持したままで、ＮＧＦ様活性が誘導された。従って、Ｌ２およびＬ４
は同様に、抗体４Ｄ４がＢＤＮＦまたはＮＴ−３に対してではなくＮＧＦに選択的に結合
する領域である。
抗体４Ｄ４はまた、ＮＧＦ結晶構造の内部ドメインにマッチする、ペプチド番号１６（
配列番号７１）（ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ、７６〜９０）に結合する。この領域
は、ヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間で１００％相同であるが、他のニューロトロフィン
とは異なる。４Ｄ４は、ラット／マウスＮＧＦに対しては、ヒトＮＧＦに対するその活性
と比較した場合、かなり弱い活性を示した。従って、ＮＧＦのこの部分への結合は、種特
異性については最も重要ではないようであるが、ニューロトロフィンのなかで選択性につ
いて最も重要である。
抗体４Ｄ４はまた、他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦおよびＮＴ３）からＮＧＦを識
別するヒトＮＧＦの領域の１つである、ＮＧＦのＣ末端領域（ペプチド番号１９〜２１（
配列番号７４−配列番号７６）ＴＭＤＧ−−−ＬＳＲＫＣ、９１〜１１５）に結合する。
この領域への結合によって、４Ｄ４が他のニューロトロフィンに対して活性でない理由を
説明することが助けられる。さらに、Ｃ末端ではヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間に単独
のアミノ酸の相違があり、これによって、４Ｄ４が、種相違が観察されるＮ末端と同様に
、ラット／マウスＮＧＦよりもヒトＮＧＦについて選択性である理由の１つがこの単独の
アミノ酸であり得ることが示唆される。
最後に、４Ｄ４はまた、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣではなくｔｒｋＡへのＮＧＦ結合の優
先性について重要な領域である、ヒトＮＧＦのペプチド番号１０（配列番号６５）（−−
−ＫＡＲＤＣ、５０〜６０）によって記載される内部ドメインとも相互作用し、このこと
はヒトＮＧＦに対するその選択性の中和活性をさらに説明する。
（実施例９）
（ＫｉｎＥｘＡによるモノクローナル抗体の親和性測定）
ｈｕＮＧＦ（２９７１４−９１）へのＡｂ ４Ｄ４（３８８５９−８０）の結合を、Ｋ
ｉｎＥｘＡにおいて試験した。要するに、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ ６×（Ｐｉｅｒｃｅ）
をｈｕＮＧＦで事前コーティングして、ＢＳＡでブロックした。１０ｐＭおよび３０ｐの
Ａｂ ４Ｄ４サンプルＭを、種々の濃度のｈｕＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）とともに室温で８時
間インキュベートして、その後にｈｕＮＧＦでコートしたビーズを通して流した。ビーズ
結合した抗体の量を、蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量した。結合シグナルは、平衡状態で、遊
離の抗体の濃度に対して比例した。解離平衡定数（ＫＤ）は、二重曲線一部位相同性結合
モデル（ｄｕａｌ−ｃｕｒｖｅ ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＫｉｎＥｘＴＭソフトウェア）を用いて競合曲線の非直線回帰から
得られた。ＫＤはｈｕＮＧＦに対するＡｂ ４Ｄ４結合について約４ｐＭであった。
（実施例１０）
（さらなる抗ＮＧＦ抗体の同定）
上記の実施例２および３に記載されるように生成かつ同定された、さらなる抗ＮＧＦ抗
体（１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２，１４Ｆ１１および４Ｇ６と命名）をさらなる研究のた
めに選択した。要するに、結合活性について馴化培地を試験した。培地由来の抗体を精製
して配列決定した。予想される質量を、馴化培地由来の抗体の質量分析データと比較した
。この抗体をクローニングした。クローンのうちの２つはＣＨＯ細胞で発現され、上記の
ように活性について試験した。この結果を表１０に示す。
Figure 2010162028
次いで、これらの抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を４Ｄ４抗体配列と比較し、
そして互いと比較した（図５および６）。これらの比較から同定された重鎖可変領域の相
同性パーセントを表１１に示す。軽鎖可変領域の相同性パーセントを表１２に示す。さら
に、種々の抗体のＣＤＲ領域の相同性パーセントを図５〜１０に示す。
Figure 2010162028
Figure 2010162028
前述の開示は本発明の特定の実施例を包含すること、そしてその全ての改変または代替
の等価物が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の趣旨および範囲内であるこ
とが理解されるべきである。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の単離されたヒト抗体。
JP2010030722A 2003-07-15 2010-02-15 選択的ｎｇｆ経路インヒビターとしてのヒト抗ｎｇｆ中和抗体 Expired - Fee Related JP5264798B2 (ja)

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